JPH09318627A - 腎不全またはバセドウ病における骨組織の代謝異常をスクリーニングする方法 - Google Patents
腎不全またはバセドウ病における骨組織の代謝異常をスクリーニングする方法Info
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- JPH09318627A JPH09318627A JP15491496A JP15491496A JPH09318627A JP H09318627 A JPH09318627 A JP H09318627A JP 15491496 A JP15491496 A JP 15491496A JP 15491496 A JP15491496 A JP 15491496A JP H09318627 A JPH09318627 A JP H09318627A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 腎不全またはバセドウ病における骨組織
の代謝異常をスクリーニングするための特異的なマーカ
ーを見いだすとともに、該マーカーの特異的な測定法を
提供する。 【解決手段】 腎不全またはバセドウ病の患者から得ら
れた生体試料中のピリジニウム架橋成分（ピリジノリン
および／またはデオキシピリジノリン）を測定し、得ら
れた測定値を健常人の測定値と比較することを特徴とす
る、腎不全またはバセドウ病における骨組織の代謝異常
をスクリーニングする方法に関する。
の代謝異常をスクリーニングするための特異的なマーカ
ーを見いだすとともに、該マーカーの特異的な測定法を
提供する。 【解決手段】 腎不全またはバセドウ病の患者から得ら
れた生体試料中のピリジニウム架橋成分（ピリジノリン
および／またはデオキシピリジノリン）を測定し、得ら
れた測定値を健常人の測定値と比較することを特徴とす
る、腎不全またはバセドウ病における骨組織の代謝異常
をスクリーニングする方法に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、腎不全またはバセ
ドウ病における骨組織の代謝異常をスクリーニングする
方法および血中に存在する遊離のピリジノリンおよび／
またはデオキシピリジノリンをイムノアッセイにより測
定する方法に関するものである。
ドウ病における骨組織の代謝異常をスクリーニングする
方法および血中に存在する遊離のピリジノリンおよび／
またはデオキシピリジノリンをイムノアッセイにより測
定する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】人体は常に、骨を作ったり（骨形成）、
壊したりしており（骨吸収）、そのバランスを保持して
いる。しかしながら、何らかの原因でそのバランスが崩
れたとき、骨代謝が異常を来し種々の骨疾患を生じるこ
とになる。しかし、このような骨組織の代謝異常を早期
に発見することは必ずしも容易なことではない。ピリジ
ニウム架橋は、骨、軟骨、椎間板、腱、ぞうげ質および
他の様々な軟骨組織を含む多様な組織において、主要な
構成成分であるコラーゲンの成熟架橋であり、骨吸収に
よって切断されたコラーゲンから遊離の状態もしくはペ
プチド断片に結合した状態で血中に放出され、尿を経て
対外に排泄される。
壊したりしており（骨吸収）、そのバランスを保持して
いる。しかしながら、何らかの原因でそのバランスが崩
れたとき、骨代謝が異常を来し種々の骨疾患を生じるこ
とになる。しかし、このような骨組織の代謝異常を早期
に発見することは必ずしも容易なことではない。ピリジ
ニウム架橋は、骨、軟骨、椎間板、腱、ぞうげ質および
他の様々な軟骨組織を含む多様な組織において、主要な
構成成分であるコラーゲンの成熟架橋であり、骨吸収に
よって切断されたコラーゲンから遊離の状態もしくはペ
プチド断片に結合した状態で血中に放出され、尿を経て
対外に排泄される。
【０００３】ピリジノリン、デオキシピリジノリンなど
のピリジニウム架橋成分の測定法としては、高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法やピリジニウム架橋成
分に特異的な抗体を用いるイムノアッセイ（特表平４−
５０１００２号、特開平６−２０１６９５号、特表平７
−５０９７８０号、特公平８−７２１２号）が知られて
いる。また最近、ピリジノリンまたはデオキシピリジノ
リンが骨組織の代謝異常の診断、特に骨吸収を反映する
特異的マーカとして有用であることが判明し、たとえば
骨粗鬆症、上皮小体亢進症、慢性関節リューマチ、変形
性関節症またはパジェット病における骨組織の異常代謝
の存在のスクリーニングに使用できることが報告されて
いる（特公平８−７２１２号）。
のピリジニウム架橋成分の測定法としては、高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法やピリジニウム架橋成
分に特異的な抗体を用いるイムノアッセイ（特表平４−
５０１００２号、特開平６−２０１６９５号、特表平７
−５０９７８０号、特公平８−７２１２号）が知られて
いる。また最近、ピリジノリンまたはデオキシピリジノ
リンが骨組織の代謝異常の診断、特に骨吸収を反映する
特異的マーカとして有用であることが判明し、たとえば
骨粗鬆症、上皮小体亢進症、慢性関節リューマチ、変形
性関節症またはパジェット病における骨組織の異常代謝
の存在のスクリーニングに使用できることが報告されて
いる（特公平８−７２１２号）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、腎不全
またはバセドウ病における骨組織の代謝異常をスクリー
ニングするためのマーカーにピリジノリンまたはデオキ
シピリジノリンを利用できるか否かに関しては何等報告
されていない。したがって、本発明は、腎不全またはバ
セドウ病における骨組織の代謝異常をスクリーニングす
るための特異的なマーカーを見いだすとともに、該マー
カーの特異的な測定法を提供することを目的とするもの
である。
またはバセドウ病における骨組織の代謝異常をスクリー
ニングするためのマーカーにピリジノリンまたはデオキ
シピリジノリンを利用できるか否かに関しては何等報告
されていない。したがって、本発明は、腎不全またはバ
セドウ病における骨組織の代謝異常をスクリーニングす
るための特異的なマーカーを見いだすとともに、該マー
カーの特異的な測定法を提供することを目的とするもの
である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、腎不全またはバセ
ドウ病の患者から採取した生体試料中の遊離のピリジノ
リンおよび／またはデオキシピリジノリンが当該疾患に
おける骨組織の代謝異常をスクリーニングするためのマ
ーカーとして利用できることを見いだした。次に、本発
明者らは、生体試料中、特に腎不全患者からは尿試料を
採取することができないため、血液試料中の遊離のピリ
ジノリンおよび／またはデオキシピリジノリンのイムノ
アッセイによる測定法を検討した結果、血液試料をイム
ノアッセイに供する前に加熱処理または有機溶媒処理を
施すことで測定値のばらつきを抑え、遊離のピリジノリ
ンおよび／またはデオキシピリジノリンを特異的かつ安
定的に測定できることを見いだし、本発明を完成させ
た。
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、腎不全またはバセ
ドウ病の患者から採取した生体試料中の遊離のピリジノ
リンおよび／またはデオキシピリジノリンが当該疾患に
おける骨組織の代謝異常をスクリーニングするためのマ
ーカーとして利用できることを見いだした。次に、本発
明者らは、生体試料中、特に腎不全患者からは尿試料を
採取することができないため、血液試料中の遊離のピリ
ジノリンおよび／またはデオキシピリジノリンのイムノ
アッセイによる測定法を検討した結果、血液試料をイム
ノアッセイに供する前に加熱処理または有機溶媒処理を
施すことで測定値のばらつきを抑え、遊離のピリジノリ
ンおよび／またはデオキシピリジノリンを特異的かつ安
定的に測定できることを見いだし、本発明を完成させ
た。
【０００６】すなわち、本発明は、腎不全またはバセド
ウ病の患者から得られた生体試料中のピリジノリンおよ
び／またはデオキシピリジノリンを測定し、得られた測
定値と健常人の測定値を比較することを特徴とする、腎
不全またはバセドウ病における骨組織の代謝異常をスク
リーニングする方法に関するものである。また、本発明
は、加熱処理または有機溶媒処理を施した血液試料を使
用することを特徴とする、血液試料中のピリジノリンお
よび／またはデオキシピリジノリンのイムノアッセイに
よる測定法に関するものである。
ウ病の患者から得られた生体試料中のピリジノリンおよ
び／またはデオキシピリジノリンを測定し、得られた測
定値と健常人の測定値を比較することを特徴とする、腎
不全またはバセドウ病における骨組織の代謝異常をスク
リーニングする方法に関するものである。また、本発明
は、加熱処理または有機溶媒処理を施した血液試料を使
用することを特徴とする、血液試料中のピリジノリンお
よび／またはデオキシピリジノリンのイムノアッセイに
よる測定法に関するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明のスクリーニングに使用す
る生体試料としては、腎不全またはバセドウ病の患者か
ら採取した生体試料（たとえば、血液、血清、尿など）
であれば特に制限されない。しかし、腎不全患者の場
合、尿試料を採取することができないため、使用できる
生体試料としては血液試料を挙げることができる。ま
た、バセドウ病の場合には尿試料、血液試料の両方を採
取することができるものの、他の検査の主体が血液試料
で行われていることから、骨組織の代謝異常のスクリー
ニングも血液試料で行うことができれば検査効率上有用
である。
る生体試料としては、腎不全またはバセドウ病の患者か
ら採取した生体試料（たとえば、血液、血清、尿など）
であれば特に制限されない。しかし、腎不全患者の場
合、尿試料を採取することができないため、使用できる
生体試料としては血液試料を挙げることができる。ま
た、バセドウ病の場合には尿試料、血液試料の両方を採
取することができるものの、他の検査の主体が血液試料
で行われていることから、骨組織の代謝異常のスクリー
ニングも血液試料で行うことができれば検査効率上有用
である。
【０００８】生体試料として血液試料を使用する場合、
血液中に含まれる成分（アルブミンなどのタンパク質成
分と思われる）が測定、特にイムノアッセイにおいて悪
影響を及ぼし、安定した測定値を得られないことが多々
ある。このような場合には、血液試料に加熱処理または
有機溶媒処理を施すことにより測定に悪影響を及ぼす成
分が取り除かれ、安定した測定値を得ることができる。
たとえば、加熱処理は、ｐＨ５．０〜７．０に調整した
緩衝液を血液試料に添加し、７０〜１２０℃、好ましく
は９０〜１００℃で１分〜１時間程度インキュベーショ
ンすることにより実施できる。加熱処理後、血液試料を
遠心分離に供して上清を採取し、この上清を測定用試料
として使用する。また、有機溶媒処理は、アセトニトリ
ル、アセトン、エタノールなどの揮発性の有機溶媒を血
液試料に添加、混合することで実施できる。有機溶媒処
理後、血液試料を遠心分離に供して上清を採取し、上清
中に含まれる有機溶媒を留去後、得られた残渣を緩衝液
に溶解し、この溶解液を測定用試料として使用する。
血液中に含まれる成分（アルブミンなどのタンパク質成
分と思われる）が測定、特にイムノアッセイにおいて悪
影響を及ぼし、安定した測定値を得られないことが多々
ある。このような場合には、血液試料に加熱処理または
有機溶媒処理を施すことにより測定に悪影響を及ぼす成
分が取り除かれ、安定した測定値を得ることができる。
たとえば、加熱処理は、ｐＨ５．０〜７．０に調整した
緩衝液を血液試料に添加し、７０〜１２０℃、好ましく
は９０〜１００℃で１分〜１時間程度インキュベーショ
ンすることにより実施できる。加熱処理後、血液試料を
遠心分離に供して上清を採取し、この上清を測定用試料
として使用する。また、有機溶媒処理は、アセトニトリ
ル、アセトン、エタノールなどの揮発性の有機溶媒を血
液試料に添加、混合することで実施できる。有機溶媒処
理後、血液試料を遠心分離に供して上清を採取し、上清
中に含まれる有機溶媒を留去後、得られた残渣を緩衝液
に溶解し、この溶解液を測定用試料として使用する。
【０００９】本発明において、試料中の遊離のピリジノ
リンおよび／または遊離のデオキシピリジノリンを測定
するための方法としては、ＨＰＬＣ法、イムノアッセイ
など従来それらの測定に採用されていた方法であれば特
に制限されないが、操作の簡便性などの点からイムノア
ッセイを利用するのが好ましい。イムノアッセイに使用
する抗体としては、遊離のピリジノリンおよび／または
遊離のデオキシピリジノリンに結合し、それらを特異的
に測定できるものであれば特に限定されない。そのよう
な抗体（モノクローナル抗体を含む）は常法により取得
することが可能であり、その取得法も多数報告されてい
る（特表平４−５０１００２号、特開平６−２０１６９
５号、特表平７−５０９７８０号、特公平８−７２１２
号、Biochem.J., 207,617-620(1982)、Annals of the R
heumatic Diseases, 45, 969-973(1986)）。
リンおよび／または遊離のデオキシピリジノリンを測定
するための方法としては、ＨＰＬＣ法、イムノアッセイ
など従来それらの測定に採用されていた方法であれば特
に制限されないが、操作の簡便性などの点からイムノア
ッセイを利用するのが好ましい。イムノアッセイに使用
する抗体としては、遊離のピリジノリンおよび／または
遊離のデオキシピリジノリンに結合し、それらを特異的
に測定できるものであれば特に限定されない。そのよう
な抗体（モノクローナル抗体を含む）は常法により取得
することが可能であり、その取得法も多数報告されてい
る（特表平４−５０１００２号、特開平６−２０１６９
５号、特表平７−５０９７８０号、特公平８−７２１２
号、Biochem.J., 207,617-620(1982)、Annals of the R
heumatic Diseases, 45, 969-973(1986)）。
【００１０】使用する抗体は、抗体そのものでもよい
が、活性フラグメントを使用することもできる。活性フ
ラグメントとしては、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆａ
ｂなどの各種フラグメントで、測定上の機能が失われて
いないものであればよい。これら活性フラグメントの調
製は、精製抗体に対してパパイン、ペプシン、トリプシ
ン処理などの公知の方法を適用することで行うことがで
きる（例えば、「免疫生化学研究法（続生化学実験講座
５）」、日本生化学会編、８９頁（１９８６年）参
照）。
が、活性フラグメントを使用することもできる。活性フ
ラグメントとしては、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆａ
ｂなどの各種フラグメントで、測定上の機能が失われて
いないものであればよい。これら活性フラグメントの調
製は、精製抗体に対してパパイン、ペプシン、トリプシ
ン処理などの公知の方法を適用することで行うことがで
きる（例えば、「免疫生化学研究法（続生化学実験講座
５）」、日本生化学会編、８９頁（１９８６年）参
照）。
【００１１】このようにして調製された抗体またはその
活性フラグメントは、必要により選択した測定方法に適
した形態に修飾し、本発明のスクリーニングに使用す
る。抗体の修飾は、それぞれ常法に従って行うことがで
きる。例えば、固相化抗体を調製する場合、使用できる
担体の材質としては、抗体との結合性の高いものであれ
ば特に制限されず、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリスチ
レン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン
−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアル
コール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、
ポリプロピレンなどの合成有機高分子化合物、デキスト
ラン誘導体（セファデックスなど）、アガロースゲル
（セファロース、バイオゲルなど）、セルロース（ペー
パーディスク、濾紙など）などの多糖類、ガラス、シリ
カゲル、シリコーンなどの無機高分子化合物が挙げら
れ、これらはアミノ基、アミノアルキル基、カルボキシ
ル基、アシル基、水酸基などの官能基を導入したもので
あってもかまわない。
活性フラグメントは、必要により選択した測定方法に適
した形態に修飾し、本発明のスクリーニングに使用す
る。抗体の修飾は、それぞれ常法に従って行うことがで
きる。例えば、固相化抗体を調製する場合、使用できる
担体の材質としては、抗体との結合性の高いものであれ
ば特に制限されず、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリスチ
レン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン
−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアル
コール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、
ポリプロピレンなどの合成有機高分子化合物、デキスト
ラン誘導体（セファデックスなど）、アガロースゲル
（セファロース、バイオゲルなど）、セルロース（ペー
パーディスク、濾紙など）などの多糖類、ガラス、シリ
カゲル、シリコーンなどの無機高分子化合物が挙げら
れ、これらはアミノ基、アミノアルキル基、カルボキシ
ル基、アシル基、水酸基などの官能基を導入したもので
あってもかまわない。
【００１２】担体の形状としては、マイクロタイタープ
レート、ディスクなどの平板状、ビーズなどの粒子状、
試験管、チューブなどの管状、その他繊維状、膜状など
が例示され、測定法に応じて適宜選択することができ
る。固相担体への抗体の固定化は、物理的吸着法、イオ
ン結合法、共有結合法、包括法など公知の方法（例えば
「固定化酵素」千畑一郎編、昭和５０年３月２０日、
（株）講談社発行参照）を用いて行えばよい。このよう
にして得られた固相試薬は、非特異的結合を抑制するた
めに、ＢＳＡ、糖、スキムミルクなどの通常のブロッキ
ング剤を用いてブロッキング処理を施してもよい。
レート、ディスクなどの平板状、ビーズなどの粒子状、
試験管、チューブなどの管状、その他繊維状、膜状など
が例示され、測定法に応じて適宜選択することができ
る。固相担体への抗体の固定化は、物理的吸着法、イオ
ン結合法、共有結合法、包括法など公知の方法（例えば
「固定化酵素」千畑一郎編、昭和５０年３月２０日、
（株）講談社発行参照）を用いて行えばよい。このよう
にして得られた固相試薬は、非特異的結合を抑制するた
めに、ＢＳＡ、糖、スキムミルクなどの通常のブロッキ
ング剤を用いてブロッキング処理を施してもよい。
【００１３】また、標識化抗体または標識化抗原を調製
する場合、使用する標識体としては、放射性同位体（32
Ｐ、3Ｈ、14Ｃ、125Ｉなど）、酵素（β−ガラクトシダ
ーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼな
ど）、補酵素・補欠分子族（ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、
ビオチン、ヘムなど）、蛍光色素（フルオレセイン誘導
体、ローダミン誘導体など）、金属粒子（金、銀、白金
など）などを使用することができる。抗体または抗原の
標識化は、選択した標識剤に適した公知の方法（例えば
「続生化学実験講座５免疫生化学研究法」（株）東京化
学同人、（１９８６年発行）第１０２〜１１２頁参照）
に従って行えばよい。また、アビジンービオチン等を介
して抗体または抗原を標識することもできる。
する場合、使用する標識体としては、放射性同位体（32
Ｐ、3Ｈ、14Ｃ、125Ｉなど）、酵素（β−ガラクトシダ
ーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼな
ど）、補酵素・補欠分子族（ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、
ビオチン、ヘムなど）、蛍光色素（フルオレセイン誘導
体、ローダミン誘導体など）、金属粒子（金、銀、白金
など）などを使用することができる。抗体または抗原の
標識化は、選択した標識剤に適した公知の方法（例えば
「続生化学実験講座５免疫生化学研究法」（株）東京化
学同人、（１９８６年発行）第１０２〜１１２頁参照）
に従って行えばよい。また、アビジンービオチン等を介
して抗体または抗原を標識することもできる。
【００１４】イムノアッセイで採用する測定手順として
は、競合法、サンドイッチ法、凝集法、プロットオーバ
レイ法など公知の手順のいずれであってもよい。採用し
た測定手順の具体的な操作法に関しては、たとえば下記
の文献を参照することができる。 (a)入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（（株）講
談社、昭和５４年５月１日発行） (b)石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）
（（株）医学書院、１９８２年１２月１５日発行） (c)臨床病理 臨時増刊 特集第５３号「臨床検査のた
めのイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行
会、１９８３年発行） (d)「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシ
ー、１９８６年１０月９日発行）
は、競合法、サンドイッチ法、凝集法、プロットオーバ
レイ法など公知の手順のいずれであってもよい。採用し
た測定手順の具体的な操作法に関しては、たとえば下記
の文献を参照することができる。 (a)入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（（株）講
談社、昭和５４年５月１日発行） (b)石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）
（（株）医学書院、１９８２年１２月１５日発行） (c)臨床病理 臨時増刊 特集第５３号「臨床検査のた
めのイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行
会、１９８３年発行） (d)「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシ
ー、１９８６年１０月９日発行）
【００１５】(e)特公平６−４３９９８号公報、特開昭
５５−１５１００号公報、特開昭５２−１４８６２０号
公報及び特開昭５４−９１２９６号公報 (f)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.70」（Immunochemica
l techniques (Part A)） (g)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」（Immunochemica
l techniques (Part B)） (h)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74」（Immunochemica
l techniques (Part C)） (i)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84」（Immunochemica
l techniques (Part D:Selected Immunoassay)） (j)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」（Immunochemica
l techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and Gen
eral Immunoassay Methods)） ［（ｆ）〜（ｊ）はアカデミックプレス社発行］
５５−１５１００号公報、特開昭５２−１４８６２０号
公報及び特開昭５４−９１２９６号公報 (f)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.70」（Immunochemica
l techniques (Part A)） (g)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」（Immunochemica
l techniques (Part B)） (h)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74」（Immunochemica
l techniques (Part C)） (i)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84」（Immunochemica
l techniques (Part D:Selected Immunoassay)） (j)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」（Immunochemica
l techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and Gen
eral Immunoassay Methods)） ［（ｆ）〜（ｊ）はアカデミックプレス社発行］
【００１６】このような公知の測定手順の中から競合法
を例に挙げて具体的に説明すれば、固相化抗ピリジノリ
ン抗体および／または固相化抗デオキシピリジノリン抗
体に対し、試料中の遊離のピリジノリンおよび／または
遊離のデオキシピリジノリンと一定濃度の標識化ピリジ
ノリンおよび／または標識化デオキシピリジノリンとを
競合反応させ、固相と液相を分離（ＢＦ分離）後、いず
れか一方の相の標識量を測定することで、試料中の遊離
のピリジノリンおよび／または遊離のデオキシピリジノ
リンを検出または定量することができる。
を例に挙げて具体的に説明すれば、固相化抗ピリジノリ
ン抗体および／または固相化抗デオキシピリジノリン抗
体に対し、試料中の遊離のピリジノリンおよび／または
遊離のデオキシピリジノリンと一定濃度の標識化ピリジ
ノリンおよび／または標識化デオキシピリジノリンとを
競合反応させ、固相と液相を分離（ＢＦ分離）後、いず
れか一方の相の標識量を測定することで、試料中の遊離
のピリジノリンおよび／または遊離のデオキシピリジノ
リンを検出または定量することができる。
【００１７】上記競合法を実施するためのキットの構成
試薬としては、たとえば次のものが例示される。 固相化抗ピリジノリン抗体および／または固相化抗デ
オキシピリジノリン抗体 標識化ピリジノリンおよび／または標識化デオキシピ
リジノリン この構成試薬において、標識として酵素を用いる場合に
は、たとえば次の構成をとり得る。 固相化抗ピリジノリン抗体および／または固相化抗デ
オキシピリジノリン抗体 ビオチン化ピリジノリンおよび／またはビオチン化デ
オキシピリジノリン アビジン化酵素 また、抗ピリジノリン抗体および／または抗デオキシピ
リジノリン抗体を固相担体に直接固定化しない場合に
は、次の構成をとり得る。 固相化抗イムノグロブリン抗体 抗ピリジノリン抗体および／または抗デオキシピリジ
ノリン抗体 ビオチン化ピリジノリンおよび／またはビオチン化デ
オキシピリジノリン アビジン化酵素 さらに、上記試薬の他に、必要により、発色試薬、反応
停止用試薬、標準抗原試薬、サンプル前処理試薬などの
各試薬から状況に応じた適当な試薬を適宜選択し、測定
のための構成試薬とすることもできる。
試薬としては、たとえば次のものが例示される。 固相化抗ピリジノリン抗体および／または固相化抗デ
オキシピリジノリン抗体 標識化ピリジノリンおよび／または標識化デオキシピ
リジノリン この構成試薬において、標識として酵素を用いる場合に
は、たとえば次の構成をとり得る。 固相化抗ピリジノリン抗体および／または固相化抗デ
オキシピリジノリン抗体 ビオチン化ピリジノリンおよび／またはビオチン化デ
オキシピリジノリン アビジン化酵素 また、抗ピリジノリン抗体および／または抗デオキシピ
リジノリン抗体を固相担体に直接固定化しない場合に
は、次の構成をとり得る。 固相化抗イムノグロブリン抗体 抗ピリジノリン抗体および／または抗デオキシピリジ
ノリン抗体 ビオチン化ピリジノリンおよび／またはビオチン化デ
オキシピリジノリン アビジン化酵素 さらに、上記試薬の他に、必要により、発色試薬、反応
停止用試薬、標準抗原試薬、サンプル前処理試薬などの
各試薬から状況に応じた適当な試薬を適宜選択し、測定
のための構成試薬とすることもできる。
【００１８】
【発明の効果】生体試料中の遊離のピリジノリンおよび
／または遊離のデオキシピリジノリンを測定することで
腎不全またはバセドウ病の患者の骨組織の代謝異常をス
クリーニングできることは、本発明者ら初めて見いだし
たことである。すなわち、後述実施例に示すように、腎
不全またはバセドウ病の患者の骨組織の代謝異常によ
り、遊離のピリジノリンおよび／または遊離のデオキシ
ピリジノリンの存在量が健常人のそれよりも有意に上昇
するため、これらを測定することにより腎不全またはバ
セドウ病の患者の骨代謝の状態をモニタリングすること
が初めて可能となったのである。また、血液試料中の遊
離のピリジノリンおよび／または遊離のデオキシピリジ
ノリンをイムノアッセイにより測定する際、血液試料を
イムノアッセイに供する前に加熱処理または有機溶媒処
理を施すことで測定値のばらつきを抑え、遊離のピリジ
ノリンおよび／または遊離のデオキシピリジノリンを特
異的かつ安定的に測定できることも本発明者らが初めて
見いだしたことであり、測定値の信頼性を飛躍的に向上
させるものである。
／または遊離のデオキシピリジノリンを測定することで
腎不全またはバセドウ病の患者の骨組織の代謝異常をス
クリーニングできることは、本発明者ら初めて見いだし
たことである。すなわち、後述実施例に示すように、腎
不全またはバセドウ病の患者の骨組織の代謝異常によ
り、遊離のピリジノリンおよび／または遊離のデオキシ
ピリジノリンの存在量が健常人のそれよりも有意に上昇
するため、これらを測定することにより腎不全またはバ
セドウ病の患者の骨代謝の状態をモニタリングすること
が初めて可能となったのである。また、血液試料中の遊
離のピリジノリンおよび／または遊離のデオキシピリジ
ノリンをイムノアッセイにより測定する際、血液試料を
イムノアッセイに供する前に加熱処理または有機溶媒処
理を施すことで測定値のばらつきを抑え、遊離のピリジ
ノリンおよび／または遊離のデオキシピリジノリンを特
異的かつ安定的に測定できることも本発明者らが初めて
見いだしたことであり、測定値の信頼性を飛躍的に向上
させるものである。
【００１９】
【実施例】以下、本発明を実施例をあげて具体的に説明
するが、本発明はこれらによって何等限定されるもので
はない。 実施例１ ＜方法＞ （１）ピリジノリンおよびデオキシピリジノリンの調製 ピリジノリン（Ｐｙｄ）およびデオキシピリジノリン
（Ｄｐｄ）は、ウシの脱灰骨またはアキレス腱のコラー
ゲンを用いて常法により精製した。すなわち、これらを
６Ｎ ＨＣｌにて１００℃、２４時間加水分解した後乾
涸し、水に再溶解してＳＰ−セファデックス Ｃ−２５
カラムに供し、塩酸でグラジェント溶出し、溶出画分を
集め再度乾涸した。得られたＰｙｄとＤｐｄの混合物
を、必要により逆相ＨＰＬＣで分離し、以下の実験に供
した。
するが、本発明はこれらによって何等限定されるもので
はない。 実施例１ ＜方法＞ （１）ピリジノリンおよびデオキシピリジノリンの調製 ピリジノリン（Ｐｙｄ）およびデオキシピリジノリン
（Ｄｐｄ）は、ウシの脱灰骨またはアキレス腱のコラー
ゲンを用いて常法により精製した。すなわち、これらを
６Ｎ ＨＣｌにて１００℃、２４時間加水分解した後乾
涸し、水に再溶解してＳＰ−セファデックス Ｃ−２５
カラムに供し、塩酸でグラジェント溶出し、溶出画分を
集め再度乾涸した。得られたＰｙｄとＤｐｄの混合物
を、必要により逆相ＨＰＬＣで分離し、以下の実験に供
した。
【００２０】（２）抗Ｐｙｄ抗体または抗Ｄｐｄ抗体の
調製 ＰｙｄまたはＤｐｄをＢＳＡにコンジュゲートしたもの
を免疫原として使用し、常法によりマウスに免疫した。
２週間おきに４〜６回追加免疫を行い、摘出したマウス
の脾細胞とミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）を細胞融合し、得られ
たハイブリドーマよりＰｙｄまたはＤｐｄを特異的に認
識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを
選出した。得られたハイブリドーマから常法によりモノ
クローナル抗体ＨＰ１５を産生させ、各種クロマトグラ
フィー法で精製し、以下の実験に供した。 （３）ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体の調製 ヤギ抗マウスＩｇＧ血清は、リン酸緩衝液で平衡化した
ＨＰ１５−セファロース４Ｂカラム（溶出緩衝液：０．
１Ｍ グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０））を用いて
精製し、以下の実験に供した。
調製 ＰｙｄまたはＤｐｄをＢＳＡにコンジュゲートしたもの
を免疫原として使用し、常法によりマウスに免疫した。
２週間おきに４〜６回追加免疫を行い、摘出したマウス
の脾細胞とミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）を細胞融合し、得られ
たハイブリドーマよりＰｙｄまたはＤｐｄを特異的に認
識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを
選出した。得られたハイブリドーマから常法によりモノ
クローナル抗体ＨＰ１５を産生させ、各種クロマトグラ
フィー法で精製し、以下の実験に供した。 （３）ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体の調製 ヤギ抗マウスＩｇＧ血清は、リン酸緩衝液で平衡化した
ＨＰ１５−セファロース４Ｂカラム（溶出緩衝液：０．
１Ｍ グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０））を用いて
精製し、以下の実験に供した。
【００２１】（４）被検体の有機溶媒処理 Ｐｙｄ標準溶液および腎不全またはバセドウ病の患者か
ら採取した血清試料に等量のアセトニトリルを添加し、
よく混合した後、４℃で１５分遠心し、上清を分取し
た。これを遠心乾涸した後、分取量の半量のリン酸緩衝
液（ｐＨ６．０）を加え、残渣を溶解し、測定用サンプ
ルとした。 （５）被検体の加熱処理 腎不全またはバセドウ病の患者から採取した血清試料１
容に対し、３容のリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加え、
９０〜１００℃で１５分間インキュベーションした。イ
ンキュベート後４℃で１５分遠心し、上清を分取して測
定用サンプルとした。有機溶媒処理と異なり、Ｐｙｄ標
準溶液では上記加熱処理を行わない。
ら採取した血清試料に等量のアセトニトリルを添加し、
よく混合した後、４℃で１５分遠心し、上清を分取し
た。これを遠心乾涸した後、分取量の半量のリン酸緩衝
液（ｐＨ６．０）を加え、残渣を溶解し、測定用サンプ
ルとした。 （５）被検体の加熱処理 腎不全またはバセドウ病の患者から採取した血清試料１
容に対し、３容のリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加え、
９０〜１００℃で１５分間インキュベーションした。イ
ンキュベート後４℃で１５分遠心し、上清を分取して測
定用サンプルとした。有機溶媒処理と異なり、Ｐｙｄ標
準溶液では上記加熱処理を行わない。
【００２２】（６）抗体の固相化とブロッキング ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体溶液（1μg/m
l：リン酸緩衝液(pH7.4)で調製）を９６穴プレート（NU
NC Immuno module C8 Maxisorp）に１００μｌ／ウエル
分注し、４℃で一晩反応させた。抗体液を吸引除去後、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）で洗浄し、ブロッキング溶液（５％シュクロース−
０．５％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ））を３００μｌ／
ウエル分注し、室温で１時間インキュベート後、ブロッ
キング溶液を除去し、乾燥させて以下の実験に供した。
l：リン酸緩衝液(pH7.4)で調製）を９６穴プレート（NU
NC Immuno module C8 Maxisorp）に１００μｌ／ウエル
分注し、４℃で一晩反応させた。抗体液を吸引除去後、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）で洗浄し、ブロッキング溶液（５％シュクロース−
０．５％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ））を３００μｌ／
ウエル分注し、室温で１時間インキュベート後、ブロッ
キング溶液を除去し、乾燥させて以下の実験に供した。
【００２３】（７）測定手順 上記（６）で調製した抗体固相化プレートに、Ｐｙｄ標
準溶液、Ｄｐｄ標準溶液あるいは測定用サンプルを５０
μｌ／ウエル分注する。次に常法により調製したビオチ
ン化Ｐｙｄ溶液またはビオチン化Ｄｐｄ溶液を２５μｌ
／ウエル分注して軽く攪拌後、さらに抗Ｐｙｄ抗体溶液
または抗Ｄｐｄ抗体溶液２５μｌ／ウエル分注して再び
攪拌した後、室温で１．５時間反応させる。反応後０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液にてウエルを洗
浄し、アビジン化西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液を１
００μｌ／ウエル加え、室温で１５分間反応させた後、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液にて洗浄
し、ＴＭＢＺ（3,3',5,5',-Tetramethyl-benzidine）溶
液１００μｌ／ウエル分注して発色させる。最後に、１
Ｎ硫酸を１００μｌ／ウエル分注して反応を停止させ、
４５０ｎｍの吸光度を測定する。
準溶液、Ｄｐｄ標準溶液あるいは測定用サンプルを５０
μｌ／ウエル分注する。次に常法により調製したビオチ
ン化Ｐｙｄ溶液またはビオチン化Ｄｐｄ溶液を２５μｌ
／ウエル分注して軽く攪拌後、さらに抗Ｐｙｄ抗体溶液
または抗Ｄｐｄ抗体溶液２５μｌ／ウエル分注して再び
攪拌した後、室温で１．５時間反応させる。反応後０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液にてウエルを洗
浄し、アビジン化西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液を１
００μｌ／ウエル加え、室温で１５分間反応させた後、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液にて洗浄
し、ＴＭＢＺ（3,3',5,5',-Tetramethyl-benzidine）溶
液１００μｌ／ウエル分注して発色させる。最後に、１
Ｎ硫酸を１００μｌ／ウエル分注して反応を停止させ、
４５０ｎｍの吸光度を測定する。
【００２４】＜結果＞ （１）標準曲線 上記測定手順に従い、Ｐｙｄ標準液を用いて標準曲線を
作成した。その結果を図１に示す。図１に示すように安
定した標準曲線が得られ、標準液それぞれの同時再現性
はＣＶ４．３％以下（ｎ＝５）であった。 （２）加熱処理または有機溶媒処理の効果 １５例の健常者血清を用いて、加熱処理および有機溶媒
処理の測定値への影響を調べた。その結果、図２に示よ
うに、未処理のサンプルの測定値と比較して加熱処理で
は約１／７、有機溶媒処理では約１／５に測定値が減少
し、測定値のばらつきを抑え、安定した測定値が得られ
ることが確認された。
作成した。その結果を図１に示す。図１に示すように安
定した標準曲線が得られ、標準液それぞれの同時再現性
はＣＶ４．３％以下（ｎ＝５）であった。 （２）加熱処理または有機溶媒処理の効果 １５例の健常者血清を用いて、加熱処理および有機溶媒
処理の測定値への影響を調べた。その結果、図２に示よ
うに、未処理のサンプルの測定値と比較して加熱処理で
は約１／７、有機溶媒処理では約１／５に測定値が減少
し、測定値のばらつきを抑え、安定した測定値が得られ
ることが確認された。
【００２５】（３）希釈試験 上記（２）で高値を示した血清検体について加熱処理、
有機溶媒処理、未処理の３条件の希釈試験を行ったとこ
ろ、加熱処理（図３）および有機溶媒処理（図４）を施
した検体では、希釈倍率に反比例して測定値が減少し、
希釈直線性が確認された。一方、未処理血清検体（図
５）では原血清が異常高値を示し測定できなかったが、
希釈によって著しく低値化し、正確な定量性が得られな
かった。
有機溶媒処理、未処理の３条件の希釈試験を行ったとこ
ろ、加熱処理（図３）および有機溶媒処理（図４）を施
した検体では、希釈倍率に反比例して測定値が減少し、
希釈直線性が確認された。一方、未処理血清検体（図
５）では原血清が異常高値を示し測定できなかったが、
希釈によって著しく低値化し、正確な定量性が得られな
かった。
【００２６】（４）添加回収試験 任意の健常者血清を使用して添加回収試験を行った。す
なわち、予め血清にＰｙｄを添加し、この血清について
加熱処理、有機溶媒処理および未処理の３条件を設定し
た。 試験１；原血清１容に対し、ピリジノリン標準液を１容
添加し、その回収率の結果を表１に示す。表１から明ら
かなように、未処理血清では添加回収率が２００〜３０
０％と異常高値を示したが、加熱処理および有機溶媒処
理の血清では８０〜１３０％の回収率を示し、回収率の
点でも両処理が有効であることが確認された。 試験２；原血清９容に対し、ピリジノリン標準液を１容
添加し、その回収率の結果を表２に示す。表２から明ら
かなように、未処理血清では回収率が３００〜６５０％
と異常高値を示したが、加熱処理および有機溶媒処理を
行うことにより回収率は６５〜１１０％に改善された。
なわち、予め血清にＰｙｄを添加し、この血清について
加熱処理、有機溶媒処理および未処理の３条件を設定し
た。 試験１；原血清１容に対し、ピリジノリン標準液を１容
添加し、その回収率の結果を表１に示す。表１から明ら
かなように、未処理血清では添加回収率が２００〜３０
０％と異常高値を示したが、加熱処理および有機溶媒処
理の血清では８０〜１３０％の回収率を示し、回収率の
点でも両処理が有効であることが確認された。 試験２；原血清９容に対し、ピリジノリン標準液を１容
添加し、その回収率の結果を表２に示す。表２から明ら
かなように、未処理血清では回収率が３００〜６５０％
と異常高値を示したが、加熱処理および有機溶媒処理を
行うことにより回収率は６５〜１１０％に改善された。
【００２７】
【表１】
【表２】
【００２８】（５）腎不全患者血清の測定 健常者１５例と透析腎不全患者１０例の血中の遊離のピ
リジニウム架橋濃度を有機溶媒処理および加熱処理の条
件下で測定した。測定結果を図６に示す。図６から明ら
かなように、透析を行っている腎不全患者の血清中のピ
リジノリン濃度は健常人の値より有意に高く、透析を続
けることにより骨代謝異常が徐々に進行していることが
示唆された。 （６）バセドウ病患者血清の測定 健常者１５例とバセドウ病患者２４例の血中の遊離のピ
リジニウム架橋濃度を加熱処理の条件下で検討した。測
定結果を図７に示す。
リジニウム架橋濃度を有機溶媒処理および加熱処理の条
件下で測定した。測定結果を図６に示す。図６から明ら
かなように、透析を行っている腎不全患者の血清中のピ
リジノリン濃度は健常人の値より有意に高く、透析を続
けることにより骨代謝異常が徐々に進行していることが
示唆された。 （６）バセドウ病患者血清の測定 健常者１５例とバセドウ病患者２４例の血中の遊離のピ
リジニウム架橋濃度を加熱処理の条件下で検討した。測
定結果を図７に示す。
【００２９】
【図１】図１は、標準曲線を示したものである。
【図２】図２は、加熱処理または有機溶媒処理の測定値
への影響を示したものである。
への影響を示したものである。
【図３】図３は、加熱処理サンプルを用いた希釈試験の
結果を示したものである。
結果を示したものである。
【図４】図４は、有機溶媒処理サンプルを用いた希釈試
験の結果を示したものである。
験の結果を示したものである。
【図５】図５は、未処理サンプルを用いた希釈試験の結
果を示したものである。
果を示したものである。
【図６】図６は、腎不全患者血清サンプル中のピリジノ
リン濃度の測定結果を示したものである。
リン濃度の測定結果を示したものである。
【図７】図７は、バセドウ病患者血清サンプル中のピリ
ジノリン濃度の測定結果を示したものである。
ジノリン濃度の測定結果を示したものである。
Claims (5)
- 【請求項１】 腎不全またはバセドウ病の患者から得ら
れた生体試料中のピリジノリンおよび／またはデオキシ
ピリジノリンを測定し、得られた測定値を健常人の測定
値と比較することを特徴とする、腎不全またはバセドウ
病における骨組織の代謝異常をスクリーニングする方
法。 - 【請求項２】 生体試料が血液またはその画分である、
請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 測定方法が抗ピリジノリン抗体および／
または抗デオキシピリジノリン抗体を利用したイムノア
ッセイである、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 生体試料中のピリジノリンおよび／また
はデオキシピリジノリンを抗ピリジノリン抗体および／
または抗デオキシピリジノリン抗体を利用したイムノア
ッセイにより測定する方法であって、生体試料として加
熱処理した血液試料を使用することを特徴とする方法。 - 【請求項５】 生体試料中のピリジノリンおよび／また
はデオキシピリジノリンを抗ピリジノリン抗体および／
または抗デオキシピリジノリン抗体を利用したイムノア
ッセイにより測定する方法であって、生体試料として有
機溶媒処理した血液試料を使用することを特徴とする方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15491496A JPH09318627A (ja) | 1996-05-27 | 1996-05-27 | 腎不全またはバセドウ病における骨組織の代謝異常をスクリーニングする方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15491496A JPH09318627A (ja) | 1996-05-27 | 1996-05-27 | 腎不全またはバセドウ病における骨組織の代謝異常をスクリーニングする方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09318627A true JPH09318627A (ja) | 1997-12-12 |
Family
ID=15594727
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15491496A Pending JPH09318627A (ja) | 1996-05-27 | 1996-05-27 | 腎不全またはバセドウ病における骨組織の代謝異常をスクリーニングする方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09318627A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006518042A (ja) * | 2003-02-14 | 2006-08-03 | バイエル・ヘルスケア・エルエルシー | ラテックス凝集アッセイについての包括的な方法 |
| JP2009541759A (ja) * | 2006-07-03 | 2009-11-26 | ゼボ ゲゼルシャフト ミット ベシユレンクテル ハフツング | 分析物測定用生物流体加工方法および装置 |
-
1996
- 1996-05-27 JP JP15491496A patent/JPH09318627A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006518042A (ja) * | 2003-02-14 | 2006-08-03 | バイエル・ヘルスケア・エルエルシー | ラテックス凝集アッセイについての包括的な方法 |
| US7935539B2 (en) | 2003-02-14 | 2011-05-03 | Siemens Healthcare Diagnostics, Inc. | Generic method for latex agglutination assays |
| JP2009541759A (ja) * | 2006-07-03 | 2009-11-26 | ゼボ ゲゼルシャフト ミット ベシユレンクテル ハフツング | 分析物測定用生物流体加工方法および装置 |
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