JP3224356B2 - ヒトおよび動物における骨および結合組織の疾患を検出する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、医学および獣医学
関連分野における診断の方法に関する。より詳細には、
コラーゲン分解により形成される遊離の架橋を、尿のよ
うな生物学的液体中に検出することによって骨および他
の結合組織の代謝を評価する方法に関連する。

【０００２】

【従来の技術】骨、軟骨、皮膚、腱、ぞうげ質、および
他の様々な軟部組織を含む多様な組織において、主要な
構造成分としてコラーゲンが関連していることは、よく
知られている。コラーゲンの線維構造が、架橋によって
安定化されていることもまた知られている。コラーゲン
中の非還元性架橋としての蛍光ピリジニウム環系の存在
が、Fujimoto, D.ら、J Biochem (1978) 83:863-867 に
よって報告された。このFujimoto の論文は、ウシアキ
レス腱コラーゲンのプロナーゼ消化による蛍光ペプチド
の単離を報告した。この単離された、加水分解されたピ
リジノリン(Pyd)は、ヒドロキシリシンを３残基含むと
考えられ、このことから、加水分解の前にペプチド断片
がピリジノリン部分に付着していたことが理解された。
特徴付けに関するなおいっそうの研究が、Gunja-Smith,
Z.ら、Biochem J (1981) 197:759-762 によって加水分
解された尿を用いて行われ、そして尿中のピリジノリン
の存在を利用して、Robins, S.P.、Biochem J (1982) 2
07:617-620は加水分解した尿から得られたピリジノリン
を、抗体を作るためにキャリアーと結合させた。そのあ
と、この抗体は加水分解された尿中のピリジノリン濃度
を決定するために、免疫アッセイで使用された。Robins
は、この方法による生理的液体の分析が、成熟したコラ
ーゲンのある型の分解の指標を与えるのに役立つと記述
している。

【０００３】前述したもの全てで、加水分解物が全ピリ
ジノリン量を得るために用いられた。なぜなら、その架
橋構造の多くが、その形成の要因となるヒドロキシリシ
ン残基の、ペプチド延長部分を保持しているからであっ
た。従って、ピリジニウム環を含有する均一な調製物を
得るために、予備的な加水分解の過程が必要であった。

【０００４】1982年までに、これらの架橋が由来するテ
ロペプチド中にリシン残基、あるいはヒドロキシリシン
残基のどちらが存在するかに依存して、架橋形成に２つ
の経路が存在することが確立された(Robins, S.P.、「Co
llagen in Health and Disease」(1982) Weiss, J.B.ら
編、160-178頁、Churchill Livingstone, Edinburgh)。
それによると皮膚のような軟部組織では還元性アルジミ
ン結合が酸化リシン残基から形成され、一方、軟骨およ
び骨ではこれらの結合は、最初にヒドロキシリシンアル
デヒドから形成され、自動的な再構成を受けてより安定
なオキソイミン架橋となる架橋の特異性となることが述
べられている。これらの結合は、さらに反応をうけて、
3-ヒドロキシ−ピリジニウム架橋が形成される。ヘリッ
クス部分にヒドロキシリシンではなくてリシンを含む安
定に架橋しているピリジノリン類似体は、Ogawa, T.
ら、Biochem Biophys Res Commune (1982) 107:1251-12
57; Eyre, D.R.ら、Anal Biochem (1984) 137:380-388
によって同定および定量され、そしてデオキシピリジノ
リン(Dpd)と命名された。その後この物質は、その含有
量は種間で様々であるけれども、骨コラーゲンに局在す
ると考えられた。

【０００５】Robins, S.P.、Biochem J (1983) 215:167
-173によるいっそうの研究は、骨中にグリコシル化ピリ
ジノリンが存在する証拠を提出した。Robinsは、ヒドロ
キシリシンの３つの残基からのピリジニウム環の誘導を
示す化学構造を提案し、さらに、コラーゲンのアルカリ
加水分解物が側鎖のヒドロキシ基の部位で置換されたO-
ガラクトース誘導体を与えることを示した。この物質
は、穏和な酸処理にも非常に不安定なので、この物質は
加水分解された組織または体液の試料中に存在しなかっ
たであろう。

【０００６】Fujimoto, D.ら、J Biochem (1983) 94:11
33-1136が、加水分解されていない尿の試料をクロマト
グラフィーにかけ、そして3-ヒドロキシピリジニウム環
部分がかなりの割合で「遊離の」形で存在する、すなわ
ち、それを構成している３つのヒドロキシリシン由来の
残基はそれ以上のペプチド延長部分を含まないことを示
した。アミノ酸分析では、コラーゲンの酸加水分解物か
ら単離されたピリジノリンは非対称のピークを描くが、
他方、尿中の「遊離の」ピリジノリンは対称のピークを描
いた。著者達は、これは加水分解の間にピリジノリンシ
ステムのヒドロキシリシン部分がエピマー化により異性
体化されることによるものであると結論した。さらに、
総ピリジノリン量(加水分解後)のレベルと年齢との関係
が、これらの研究者達によって、クレアチニンレベルに
対する比率として決定された。この比率は小児の尿中で
高いが、成長期が終了するまで年齢とともに減少するこ
とが見出された。この比率が成人では相対的に一定であ
るが、高齢者では僅かに上昇することも、さらに見出さ
れた。著者達は、これは高齢者に観察される骨の量の減
少に対応し得ると推測している。

【０００７】上述のペプチド延長部分の特質を明らかに
する試みもまたなされた。Robins,S.P.ら、Biochem J
(1983) 215:175-182は、軟骨由来のII型コラーゲン中
で、ピリジノリンは２つのＣ末端のテロペプチド鎖を螺
旋ペプチドの単一の鎖に結合していることを提案した。
さらにもう一つのピリジノリン架橋が、即ち他のペプチ
ドに誘導された環によって、２つのＮ末端の非螺旋ペプ
チドを分子の螺旋部分の第三の鎖に結合していると考え
られた。これらの研究は、CNBrを用いた特異的切断によ
って組織から蛍光ピリジノリン架橋を単離することによ
ってなされ、従って環を形成するヒドロキシリシン残基
の延長部分としてのペプチド配列を保持していた。この
架橋は、これらの延長部分のアミノ酸配列を決定するこ
とにより、コラーゲン線維中での位置が突き止められ
た。

【０００８】Robins(上記)とアプローチにおいて類似し
ている論文の中で、Wu, J.J.ら、Biochemistry (1984)
23:1850-1857は、成熟型軟骨のCNBr切断をおこない、ピ
リジニウム環に参与するヒドロキシリシンのペプチド延
長部分の残基の配列を決定した。彼らの結論は、Robins
の結論と同様であった。

【０００９】Robins, S.P.ら、Biochim Biophys Acta
(1987) 914:233-239は、Ｉ型コラーゲン構造中の架橋の
位置を決定するのに、骨由来コラーゲンのCNBr消化物を
用いた。これらの著者達は、リシン由来の架橋の比率お
よびヒドロキシリシン由来の比率は、単離されたペプチ
ドの状態でそれぞれが同じ比率で存在すると結論した。
彼らはまた、これにより、これらの２つの架橋アナログ
がコラーゲン線維中で同じ位置を占めること、および、
参与する１つのリシンに明らかに由来するその形態は、
ヘリックス中の適切なリシン残基の不完全な水酸化によ
り生じるようであることを結論した。アミノ酸分析は、
架橋がＮ末端およびＣ末端のテロペプチド領域の両方を
含む２つの箇所に位置するにちがいないことを示した。

【００１０】Henkel, W.ら、Eur J Biochem (1987) 16
5: 427-436 は、大動脈から分離されるＩ型コラーゲン
中の架橋と関連するアミノ酸配列を決定した。これらの
配列は、II型コラーゲンで得られるものとは異なってい
る。同様の結果がEyre, D.R.ら、FEBS (1987) 2:337-34
1 によって見出された。彼らは、IX型とII型コラーゲン
の架橋が、ピリジノリン架橋に付着する個別のペプチド
を示すことを明かにした。

【００１１】ワシントン研究財団へのPCT出願第WO89/04
491号は、骨コラーゲンに付随する、ペプチド延長部分
によって特徴づけられる特定の架橋を、尿中に検出する
ことによる、骨の吸収を測定するための尿アッセイを提
案している。このアッセイは、ピリジニウム架橋を有す
るペプチド断片が骨コラーゲンの吸収に由来している体
液中の、該ペプチド濃度の定量に基づいている。骨のコ
ラーゲンに付随すると推測されるペプチド延長部分を有
する、２つの特定の物質が記載されている。これらは、
骨の形成および破壊の速い速度をその病態に含んでい
る、パジェット病に履患している患者の尿から得られ
る。

【００１２】Macek, J.ら、Z Rheumatol (1987) 46:237
-240は、コラーゲン分解からの架橋に付随するペプチド
に基いた変形性関節症のためのアッセイを提案した。こ
のアプローチにおいて、尿試料は、10kd以上の分子量ペ
プチドを大きさでふるい分けられ、これらのペプチドが
次に、ピリジニウム環による蛍光を有する画分を決定す
るために蛍光検出機を用いて、HPLCにより分離された。
変形性関節症の患者から得られたスペクトラムを、健康
な患者のものと比較した。そしてこの比較から、疾病状
態と関連する複数の蛍光ピークが、健常者の相当位置で
存在しないことが容易に明示し得た。さらに、疾患部の
股関節を体内型人工関節へ全置換後２週間の同じ患者の
尿は、従って変形性関節症からの生成物は減少してお
り、正常者のスペクトラムにさらにより近い蛍光ピーク
のスペクトラムを示した。さらに、変形性関節症のスペ
クトラムは、慢性関節リューマチの患者から得られるス
ペクトラムとも容易に区別された。慢性関節リューマチ
のスペクトラムは正常対照群のスペクトラムとより高い
類似性をもち、著者達によってこの類似は慢性関節リュ
ーマチにおけるプロテアーゼの高い活性に起因すると考
えられた。このことはコラーゲン構造が、彼らのシステ
ム中では検出されない、より小さな断片に消化されるこ
とを推定していた。

【００１３】慢性関節リューマチ患者の加水分解された
尿中における、3-ヒドロキシピリジン環架橋の全量のレ
ベルの上昇に関する研究もまた、この疾病を診断する方
法として Black, D.ら、Annals of Rheumatic Diseases
(1989) 48:641-644によって提案された。慢性関節リュ
ーマチ患者の「加水分解された」架橋のレベル(この化合
物のクレアチニンに対する比率として表現されたもの)
は、対照群と比較して５倍にも上昇した。この方法で
は、ヒドロキシリシン由来の架橋は、リシン由来のもの
と区別し得；ヒドロキシリシン由来の架橋のみが測定さ
れ得る上昇を示した。加水分解された尿を用いた、より
広範な研究において、Seibelら、J Rheumatol (1989) 1
6:964-970は、リューマチおよび変形性関節症の双方に
おいて、骨特異的架橋の排泄が対照群と比較して有意に
増大することを示したが、しかしヒドロキシリシン由来
のピリジニウムについての最も顕著な増大は、慢性関節
リューマチ患者においてであった。

【００１４】コラーゲン由来の架橋の存在に関連する測
定が、骨のものを含む特定のコラーゲン型の分解の指標
として使用されたが、逆に骨形成のマーカーを同定する
ための努力がなされた。Delmas, P.D.ら、J Bone Miner
al Res (1986) 1:333-337は、小児の骨形成のマーカー
として血清中の GLA-タンパク質レベルを使用し；同じ
グループの Brown, J.P.らは閉経後の骨粗鬆症の骨形成
を評価するために同様のアッセイを使用した(Lancet (1
984) 1091-1093)。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】ヒトおよび動物には、
高レベルの骨吸収によって、および骨形成と骨吸収との
異常なバランスによって特徴づけられる多くの病気があ
る。これらの中で最も知られているのが、骨粗鬆症とパ
ジェット病である。しかし、骨代謝の異常は、骨の良性
および悪性腫瘍、および例えば前立腺または乳房の最初
の腫瘍から骨細胞へ転移する転移性癌を含む、様々な他
の病気で起こる。他の病気には、大理石骨病、骨軟化性
疾患、くる病、小児の異常成長、腎性骨形成異常、およ
び薬物誘導型骨減少症が含まれる。骨代謝の異常は、ま
たしばしば、甲状腺治療の副作用でありおよび原発性甲
状腺機能低下症および甲状腺中毒症およびクッシング病
のような甲状腺の病気それ自身でもある。ここに列挙し
たような可能性のある選択肢の中から正確な症候群を明
かにしなくても、患者の病気を骨代謝の異常として、容
易に識別する診断法を有することが有用であろう。これ
が診断で明かになる問題のうちの一部分であることが確
証されたならば、既知の骨疾患の範囲内で追加的な試験
が行われ得る。

【００１６】本発明はちょうどそのような、骨代謝異常
に対する一般的なスクリーニングテストを提供する。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明は、骨の形成およ
び吸収の異常およびそれらの間のバランスの異常によっ
て特徴づけられる病気を持つ患者を同定するための、直
接的および、必要があれば非侵襲的な、テストを提供す
る。このテストは、血清および尿のような生物学的液体
に存在する、コラーゲン分解に由来する天然の遊離ピリ
ジノリンまたはデオキシピリジノリン架橋の定量に基づ
く。このテストは、コラーゲン由来の架橋を構成する縮
合リシル残基またはヒドロキシリシル残基に付随する付
加的なアミノ酸配列とは独立した形態にある、上記のよ
うな体液中に存在する架橋のこれらの片方または両方の
形態に向けられている。

【００１８】従ってある面で、本発明は、骨代謝異常を
伴う疾患の存在を診断する方法に向けられ、そしてその
方法は、患者の生物学的液体中にある天然の遊離架橋の
レベルを評価することを包含する。このレベルは次に、
正常人の天然の遊離架橋のレベルと比較される。天然の
遊離架橋のレベルの上昇は、上述のような異常の存在を
示す。

【００１９】この方法は、これらの分解産物のレベルを
骨形成の指標と比較して評価することによって、細かく
調節され得る。生物学的液体中の天然の遊離架橋の存在
により特徴づけられる骨吸収のレベルと、指標のレベル
により特徴づけられる骨形成のレベルとの間の差異が、
正常人のその差異と同じかあるいは異なるかということ
が見いだされれば、患者の状態に関する追加の情報をさ
らに得ることができる。一般に、骨格構造を消耗する疾
患を患っている人々は、吸収が勝っており、吸収と形成
の速度の間の大きな差異によって特徴づけられる。

【００２０】従って、本発明のもっと進んだ面は、上述
した代謝異常の存在を診断する方法に向けられており、
これは生物学的液体中にある骨形成の指標のレベルを、
その同じ個体の生物学的液体中にある天然の遊離架橋の
レベルと比較すること、およびこれらのレベル間の差異
と、正常人で見出されるこの差異との間で比較すること
を含む。骨吸収と骨形成との間の差異の上昇は、骨格の
本来の姿を維持するのに問題があることを示す。

【００２１】組織あるいは生物学的液体から酸処理によ
り得られる加水分解された遊離の架橋に結合する抗体
は、天然の遊離架橋とは、リシル側鎖を有するものかあ
るいはヒドロキシリシル側鎖を有するもののいずれとも
交差反応しないことが、本発明者によって見出された。
しかしながら、これらの遊離の架橋に対して、特異的な
抗体を作成し得る。これらの抗体は加水分解型とは交差
反応し得ず；生物学的試料を直接に評価する目的のため
には、加水分解型が存在しないので、これは問題になら
ない。所望するなら、リシルおよびヒドロキシリシルの
側鎖を含む天然の遊離架橋型の間を区別するように、こ
れらの抗体を調製し得る。加水分解されたピリジノリン
に対するポリクローナル抗体をつかった以前の研究から
みて、この抗体は天然のペプチド含有型から遊離型のも
のを区別し得るようである。

【００２２】従って、本発明の他の面は、天然の遊離架
橋あるいは、天然の遊離架橋のリシルまたはヒドロキシ
リシルどちらかの型、またはそれらのグリコシル化され
た型に対して、特異的に免疫応答する抗体に向けられ
る。

【００２３】本発明の他の面は、軟骨を含む他の結合組
織の分解を測定することにより、関節炎疾患のサブセッ
トを同定する方法であり、そしてこの方法は、患者の生
物学的液体中にあるヒドロキシリシル側鎖架橋の、リシ
ル側鎖架橋に対する比率(Pyd/Dpd)を測定すること、お
よび該比率を正常対照群の比率と比較すること包含し、
ここで正常対照群に対する該患者の該比率の上昇は、該
患者における軟骨の分解を示している。

【００２４】もう一つの面は、遊離の架橋のレベルとの
組み合わせで、患者の代謝状態の評価を提供する、結合
組織形成の指標の存在を測定する方法である。

【００２５】さらに他の面は、生物学的液体中にある天
然の遊離架橋の量あるいは濃度を免疫アッセイ測定する
ためのキットの提供であり、該架橋は遊離の架橋全体あ
るいは、Pyd、Dpd、Gal-PydおよびGlc.Gal-Pydからなる
群から選択される架橋として測定し得る。このキット
は、一組の容器を含み、少なくともそのうちの１個は、
天然の遊離全架橋、あるいはPyd、Dpd、Gal-PydまたはG
lc.Gal-Pydのうちの一つあるいはそれ以上と特異的に免
疫応答する抗体を内容物として含んでおり、そして少な
くともそのうちの１つは、アッセイを行うための説明と
一緒に、標識のような免疫アッセイを行うための付加的
な試薬を含む。好ましくは、この生物学的液体は血清ま
たは尿である。次に、この遊離の架橋は天然の遊離全架
橋として測定し得る。しかしながら、この遊離の架橋
は、リシル側鎖架橋(Dpd)として、あるいはヒドロキシ
リシル側鎖架橋(Pyd)として、あるいはグリコシル化さ
れた Pyd として、あるいはこれらの任意の組み合わせ
として個々に測定し得る。

【００２６】さらに他の面で、本発明は、検出されるべ
き架橋の特異的試薬として本発明の抗体あるいはその断
片を含む、アッセイキットの使用に向けられる。

【００２７】

【発明の実施の形態】本発明は、コラーゲン代謝の異常
によって特徴づけられる骨疾患あるいは他の疾患を診断
するための現在使用されている方法に対して改良を提供
する。本発明の方法は、これらの異常の指標として、生
物学的液体中にあるコラーゲン由来のピリジニウム架橋
のレベルの多様性を利用する。従来の技術による方法
は、試料、典型的には尿、の加水分解を含んでいるの
で、ペプチド側鎖のない、加水分解された架橋形態で分
析物が提供され、そして次にこれは、この加水分解され
た架橋に対して作られた抗体を使用する免疫アッセイで
定量し得る。この方法は有益な情報を提供するけれど
も、要求される事前の加水分解が、この分析法が未処理
の生物学的試料に対して直接行われる単純な臨床アッセ
イになることを妨げている。

【００２８】ピリジニウム架橋の加水分解型に対して作
られた抗体は、尿または他の生物学的液体中に存在する
遊離の架橋、あるいは加水分解前の、ペプチドと複合し
ているこれらの架橋のどちらとも交差反応しないこと
が、本発明者らによって見出されている。従って、当該
分野で現在利用可能な抗体は、未処理の生物学的試料に
直接には使用し得ない。

【００２９】本発明はこの不利益を、加水分解前に存在
するジアステレオマーとして遊離形態で存在する架橋を
測定するために、生物学的試料と直接反応し得る試薬を
提供することによって、克服する。以下の実施例で示さ
れるように、これらの遊離および加水分解されていない
架橋の直接的な測定は、現在使用できる、より複雑なア
ッセイによってのみ得られるデータと比較し得るデータ
を提供する。

【００３０】関与する架橋構造に関する幾つかの背景情
報が役立ち得る：架橋の性質 略語DpdおよびPydは、本願中では、単離された架橋それ
自身の２つの既知の形態を表す。Pydあるいはピリジノ
リンは、環のＮがリシル残基のε−アミノ基であるよう
に形成された架橋のことを言い；Dpdまたはデオキシピ
リジノリンは、環のＮがヒドロキシリシル残基のε−ア
ミノ基であるように形成された架橋のことを言う。(こ
れらの多様性を表す様々な方法が使用されてきた；例え
ば、HPは「ヒドロキシリシル」型を示すために使用され、
そしてLPは「リシル」型を示すために使用されてきた。) 特に、Dpdは下記式の化合物を表すと考えられている：

【００３１】

【化１】

【００３２】およびPydは下記式の化合物を示すものと
考えられている。

【００３３】

【化２】

【００３４】架橋の両方の型は共に、1,4,5に三置換さ
れた3-ヒドロキシピリジニウム残基であることがわか
る。Pydは、側鎖にグリコシル化し得る遊離のヒドロキ
シル基を有し、そして幾つかの組織ではグリコシル化さ
れているのが知られている。このグリコシル化は酸に不
安定であり、そして塩基に対しても不安定であるが、そ
の程度は少し軽い。PydはGal-Pydとして生じることが示
されている；本発明者は、尿中でのGlc.Gal-Pydの存在
もまた実証している(PCT出願第WO89/00715号参照）。遊
離のＰｙｄのこれらの型は、側鎖のヒドロキシルに共役
しているアセタールをそれぞれ持つ。

【００３５】

【化３】

【００３６】および

【００３７】

【化４】

【００３８】Dpdは、側鎖上の３つのα−アミノ部位に
あたる、３つのキラル中心を含む。Pydは、側鎖のハイ
ドロキシ部位にさらに一つのキラル中心があるので、４
つのそのような中心を含む。たぶん、加水分解されない
試料では、ペプタイドに更に誘導体化されているか否か
にかかわらず、この３つのα−アミノ基は天然に生じる
Ｌ−鏡像異性体に由来し、そしてこのOHもまた、生物学
的システムによって決定される立体的配置にある。

【００３９】上記の背景技術部分で説明したように、尿
中に存在する架橋の相当な部分(成人では約40％)は、
「遊離の」架橋の形態であり、即ち、たとえ試料の加水分
解が行われる前であっても、上に示されるようなPyd、
グリコシル化されたPydあるいはDpd構造にはペプチド鎖
が複合していない。従って、上に示される化学式の化合
物が、「遊離の」架橋を意味する。

【００４０】PydおよびDpdに関して、キラル中心のキラ
リティーは、特定されていないことを言及しておく。従
って、用語「遊離の」は、加水分解条件に供したか否かに
関わらず、これらの架橋のことを言う。ここでの仕事
は、これらの「遊離の」架橋を「天然の」形態で得た場合、
それらの「加水分解された」形態と比較して、キラリティ
ーが異なっていることを示す。本願中で使用するとき、
「天然に遊離の」架橋は、生物学的試料中に遊離型として
存在するようなDpdあるいはPyd、あるいはそれらのグリ
コシル化型のことを言う；「加水分解された遊離の」架橋
は、加水分解物中に生じるようなこれらの構造のことを
言う。もちろん、グリコシド結合は加水分解条件に不安
定であるので、「加水分解された遊離の」架橋は糖を含ま
ない。

【００４１】天然の遊離架橋は、生物学的システムの産
物であるので、生物学的に好ましいキラリティーがすべ
ての３つあるいは４つのキラル中心で生じることが仮定
される。たぶん、側鎖のα−アミノ基によって表される
３つのキラル中心は、天然に存在するアミノ酸としての
Ｌ型の立体的配置にあり、そしてPydの側鎖のヒドロキ
シルを含んでいる炭素のキラリティーもまた単一の立体
的配置を表す。このことは、図１に示された結果によっ
て確認される。図の中で、点線はクエン酸ナトリウムで
平衡化されたスルホン化ポリスチレンビーズ(７μ)を用
いて、予め単離された天然の遊離型のPydについて行わ
れた、イオン交換クロマトグラフィーの結果を表してい
る。図１に示されるように、尿から直接単離されたPyd
は単一のピークで溶出される。これは、ただ一種類のジ
アステレオマーの存在と、一致している。

【００４２】しかし、加水分解の後には、図１の実線で
示されるように、加水分解された遊離Pydは混合物とし
て溶出された。これは、もはやクロマトグラフィーで同
一の挙動を示さないジアステレオマーの混合物を得るよ
うな、キラル中心でのラセミ化と一致している。同様な
結果が天然の遊離Dpdを加水分解された遊離Dpdと比較す
ることから得られる。

【００４３】「天然の遊離の」架橋は、このように架橋の
加水分解された遊離型とは異なっている。従来の酸加水
分解の間に、いくらかの分子の立体的配置を変化させる
ラセミ化が生じると思われる。しかしながら、また、生
物学的試料中での「天然の遊離の」架橋の全収量の促進
は、全ての本来のDpdおよびPydをタンパク分解処理して
「天然の遊離の」架橋の型を遊離することによって得られ
得る。なおその上、架橋それ自体は種間で同一であり、
ヒト以外の種が、アッセイ系にあるいは免疫原として使
用する天然の遊離架橋の標準を調製するのに使用し得
る。特に、ブタの尿は多量の天然の遊離架橋を含む。生
物学的に重要なジアステレオマーの任意の発生源が使用
され得る。

【００４４】本発明者は、加水分解の結果として生じた
遊離のPydに対して作成された抗体(即ち、ペプチド結合
を破壊するように濃い酸で生物学的液体や組織を処理
し、そしてPydをDpdから分離することによって、免疫原
が得られる)は、DpdあるいはPydのどちらの天然の遊離
型とも、ほんの少しかあるいは何の交叉反応も示さない
ことを示した。さらに、加水分解物から作成されたPyd
に対して作成された抗体は、このように作成されたDpd
とわずかしか交叉反応しない。骨あるいは軟骨の酸加水
分解物から得られたPydに対して作成された抗体は、酸
加水分解後の尿中架橋と交叉反応する。

【００４５】典型的な一組の結果を表１に示す。表１
は、骨から単離したPyd加水分解物を用いた免疫で得た
抗血清を使い、ELISAアッセイを行った結果を表す。ELI
SAは、抗原としてこの加水分解物を使用し、そして結果
は、抗血清への加水分解抗原の結合を候補の架橋が阻害
する能力として表現した。この基準を用いると、軟骨ま
たは骨の酸加水分解物から単離されたPydに対するウサ
ギの免疫で得られた抗体は、尿から単離された、精製さ
れた天然の遊離架橋の酸加水分解後のPydとは、完全に
交叉反応するけれども、尿からの天然の遊離型Pyd(U-Py
d)とはたった５％しか交叉反応性しない。これらの抗体
は、さらに、同じ骨の加水分解物から単離したDpdとは2
0％の交叉反応性があり、尿からの天然の遊離型Dpd(U-D
pd)とは１％より少ない交叉反応性しかない；この抗体
との反応性の約70％がこの天然の遊離型を酸加水分解後
に回復した(表１)。

【００４６】

【表１】

【００４７】このことはさらに、前述したように、クエ
ン酸ナトリウムで平衡化したスルホン化ポリスチレンビ
ーズ(７μ)でのイオン交換クロマトグラフィーの結果を
表す図１に、示されている。尿の遊離の Pyd および酸
加水分解産物の溶出パターンは、蛍光で測定した。酸加
水分解物に対して作成された抗体は、加水分解物とのみ
有意に反応することが示されている。２つの主要な加水
分解物のピークの反応性の相違は、これら２つの分画の
異なる免疫原性に起因している。

【００４８】天然の遊離架橋に対する抗体の調製 抗体は、天然の遊離架橋を全分画として、あるいは好ま
しくは、この分画のそれぞれの要素のいずれかに対して
調製される。タンパク質を含むフラグメントからの「遊
離の」型のピリジニウム結合の大ざっぱな分離は、例え
ば、Fujimoto, D., J Biochem (1983) 94:1133-1136(上
記)の方法によって行い得る。この調製法において、尿
の濃縮物がセファデックスG-10カラムにかけられ、そし
て全ピリジウム含有分画が溶出される。この溶出液は、
その後、クエン酸ナトリウムで平衡化されたホスホセル
ロースのカラムにかけられ、そして塩で溶出される。こ
のかなり単純な過程の結果、「遊離の」架橋が単一ピーク
として得られる。この試料が加水分解条件にさらされな
いならば、このピークはDpdおよびPyd型だけでなく上述
したように、Gal-PydおよびGlc.Gal-Pydを含むグリコシ
ル化されたPydをも含む。この天然の遊離架橋分画のな
お一層の分離は、その後、標準的な方法、例えば、上述
したようなスルホン化されたポリスチレンビーズによる
イオン交換の使用、あるいはHPLCの使用によって都合よ
く行われる。この分離の典型的なプロトコールは、例え
ば、Black, D.,ら、Anal Biochem (1988) 169:197-20
3；Seibel,M.J.,ら、J Rheumatol (1989) 16:964-970
の中に見いだせる。

【００４９】抗体の調製は、ウサギあるいはマウスのよ
うな適切な哺乳類の材料に担体を複合された混合物ある
いは個々の成分を、当該技術分野で一般に知られている
免疫学的なプロトコールに従って注射することを包含す
る通常の技術による。材料は、免疫原性を促進させるた
めに、標準的な複合方法を使用してBSAあるいは破傷風
トキソイドのような担体と複合された。抗原に対する抗
体の形成を決定するために、血清を力価測定する。もし
望むならば、所望の成分と免疫反応するモノクローナル
抗体の継続的な産生が可能な細胞の培養を作り出すため
に、脾臓細胞あるいは末梢血リンパ球が、採集され、そ
して不死化される。これらの調製物は個々の成分に対し
てより高い特異性を有している。

【００５０】このようにして、生物学的液体中、特に尿
中、に存在する天然の遊離型の架橋に特異的な免疫反応
性をもつ、ポリクローナル抗血清を得ることができる。
この血清が生物学的液体中の天然の遊離架橋結合型に、
該液体中の他の物質と比較して、免疫アッセイで天然の
遊離型が測定され得るに十分に高い親和性をもって複合
体を形成し得ることを、「特異的な免疫反応性」によって
意味させる。天然の遊離型の混合物に対してかあるいは
個々の成分に対してのどちらかで作成されるポリクロー
ナル抗血清のある部分は、ペプチド鎖の付着した天然型
と交叉反応し得る；アッセイは、このような交叉反応を
しないモノクローナル抗体調製物によるか、この交叉反
応性を清算するような標準化のどちらかによって、標準
化され得る。

【００５１】モノクローナル抗体調製物を得る慣例的な
技術を利用することによって、所望の特異性を有する抗
体の再現性のある再製が可能である。従って、判定基準
として例えば天然の遊離Pydとは免疫反応するが、天然
の遊離Dpdかまたはさらにペプチドと結合した架橋型か
のいずれかとは反応しないような、不死化細胞上清の能
力を利用したスクリーニング法を使用することによっ
て、天然の遊離Pydとだけ反応する信頼できる抗体の産
生源を得ることができる。逆に言えば、生物学的試料の
評価においては、全ての天然の遊離型が測定されるよう
にこれらの固有の特異性を持つ抗体をカクテルで用いる
ことが有利である。

【００５２】所望の特異性の抗体を分泌する不死化細胞
株は、当該技術分野で周知の哺乳動物細胞技術をつかっ
て、所望のモノクローナルの実用的な量の産生のために
in vitroで培養され得る。このような培養の技術は、現
在、商業規模で利用できる。なおその上、不死化細胞株
はマウスに注射され、そしてモノクローナルのいくらか
粗雑な調製物が腹水として単離される。抗体調製物は、
望むならば抗原をアフィニティーリガンドとして使用し
て、アフィティー精製もされ得る。

【００５３】コラーゲン由来の架橋の加水分解された遊
離型に対して作成した抗体が、天然の遊離型と反応しな
かったことが明かであるかぎり、その逆が真であるかど
うかは重要ではないということに注意すべきである。な
ぜなら、加水分解されていない生物学的試料中には加水
分解型は存在しないからである。従って、この交叉反応
性の無いことを確実にするスクリーニング手順は、不必
要である。

【００５４】免疫アッセイの実施 従って、上記のように調製された抗体を用いる免疫アッ
セイを使用することによって、事前の分画あるいは加水
分解なしに生物学的液体試料をアッセイすることが可能
である。天然の遊離PydあるいはDpdあるいは両者の所望
の形態に対する特異性は、抗体調製によってもたらされ
る。

【００５５】免疫アッセイそれ自身は、当該技術分野で
一般に知られている種々の標準的アッセイのプロトコー
ルを使用して行われる。一般的に理解されるように、ア
ッセイは特定の抗体と、その特異性にあう所望の分析物
との間の相互作用を信頼するように、そして分析物およ
び抗体で形成される複合体を検出するためになんらかの
方法を使用するように、構成されている。複合体形成
は、抗体それ自身あるいはその免疫学的に反応性の断
片、例えばFab、Fab'またはF(ab')₂断片、の間でも存在
する。抗体あるいはその免疫学的に反応性の断片は、固
形支持体に複合させて、分析物の捕捉抗体として使われ
得る。このプロトコールは、分析物/抗体複合体の形成
が、蛍光、放射活性、あるいは酵素の標識によって検出
される、直接的な形態で行われることもあり得、あるい
は標識された標準物質が抗体に対して分析物と競合する
競争的形式で行われることもあり得る。この形式は、凝
集分析のようにも構成し得、即ち、反応混合物に適切な
沈澱剤を添加することによってこの複合体を沈澱させ得
る。免疫アッセイのプロトコールの特定の設計は、多種
類の選択に対して開かれており、そして当該技術分野で
利用可能な臨床分析機器およびプロトコールはおびただ
しい数にのぼる。

【００５６】抗体および、標準的な検出プロトコール
(即ち、例えば放射性同位元素標識、蛍光標識、あるい
は直接あるいは競合的形式のどちらかのELISA)をつかっ
た免疫アッセイを実施するための試薬は、アッセイのた
めに必要な成分および指示書を含むキットとして都合よ
く供給され得る。

【００５７】抗体は、種々の型を含む天然の遊離架橋の
型に対して、特異的に作成され得るので、これらの成分
の比率がそれらの個々のレベルおよび全体と同様に測定
され得る。

【００５８】従って、アッセイは天然の遊離架橋全体の
測定、または天然の遊離Pyd、Dpd、Gal-Pyd、あるいはG
lc.Gal-Pyd、あるいはそれらの任意の所望の組合わせの
測定にいたるように、抗体またはその免疫学的に反応性
の断片を包含して設計し得る。種々の組織においてPyd
およびDpdの架橋のレベルが測定され得るので、これら
の相対的な量の相互変化は、問題とされれている特定の
組織に対する分解の指標として使用し得る。例えば、大
部分の正常な成人では、Pyd/Dpdの比率は成人後一定で
ある。骨は４/１のPyd/Dpd比であり、そして遊離される
Dpdの主要な産生源であると思われるので、Dpd/Pyd比の
上昇は骨の分解を示し得る(大動脈もまたDpdを含むけれ
ども、その代謝回転率は低い)。また生物学的液体中のD
pdレベルの評価もまた、比較的骨特異的であるという結
果をもたらす。しかしながら、骨疾患が考えられる多く
の例においては、追加の情報が存在する時には、天然の
遊離架橋全体のレベル(Dpd＋Pyd)が測定としてまた使用
し得るようである。慢性関節リュウマチのように症候が
軟骨の病気を示唆しない時、生物学的液体中に遊離型で
存在する過剰の架橋の大部分は、実際に、骨の吸収によ
る。

【００５９】軟骨のような他の結合組織ではその大部分
としてDpdではなくPydだけを含むので、Pyd/Dpd比の上
昇はこのような障害を伴った疾患を示す。

【００６０】本発明の抗体を使用する免疫アッセイは便
利であるけれども、天然の遊離PydおよびDpdの架橋はま
た種々の方法によっても測定され得る。ピリジノリン結
合が蛍光性であるので、当該技術分野で記載のあるよう
に生物学的液体の試料の直接クロマトグラフィーはPyd
およびグリコシル化型PydからのDpdの分離の結果を得る
ことができる、そして得られたピークの蛍光強度は定量
化の指標を提供する。

【００６１】それ故に本発明の方法では、天然の遊離架
橋がクロマトグラフィーにかけられた材料の蛍光強度を
測定することによって、グループあるいは個々のどちら
としてでも測定され得る。

【００６２】上で参照したPCT出願第WO89/04491号に説
明されているように、架橋の量はその環系に対して適切
な酸化還元電位の特定の電極をつかってもまた測定され
得る。

【００６３】骨の吸収の指標としての天然の遊離架橋の
使用に加えて、同一人からの同じかあるいは他の適切な
生物学的液体中の骨の形成に対するマーカーの測定をこ
の測定に組合わせることによって、骨の代謝のバランス
が有利に測定される。例えば、このような骨形成のマー
カーには、以下のものが含まれる；プロコラーゲンＩ
型、骨オステオカルシン(骨GLAタンパク質あるいはBGP
としても知られている)；プロ骨GLAタンパク質、マトリ
ックスGLAタンパク質(MGP)、骨特異的タンパク質、例え
ば骨特異的シアル酸タンパク質、燐酸タンパク質、アル
カリフォスファターゼ、オステオネクチンあるいは他の
非コラーゲン性骨タンパク質。これらのマーカーの測定
方法は、当該技術分野ではよく知られている。これらの
マーカーの測定のための適切な方法は、例えば、GLAに
ついては Delmas, P.D.,ら、J BoneMin Res (1986) 1:3
33-337(上記)に見いだし得る。

【００６４】分解が生じた時にコラーゲン由来の架橋を
発生する組織の代謝状態を測定するための指標を与える
上述したアッセイは、様々な状況において役立つ。まず
第一にそれは、例えば過剰な骨の吸収を示すことで患者
の異常な状態を評価する方法である。これは例えば、骨
粗鬆症状態の存在あるいは不幸な悪性腫瘍の進行を示
す。過剰な骨の吸収によって特徴づけられる他の既知の
状態は、パジェット病および上皮小体亢進症を含む。患
者の病気を継続して観察し得るので、これらのアッセイ
の適用は、これらまたは他の病気を治療するために施し
た治療の進展をモニターするためにもまた使い得る。こ
のアッセイはまた、しばしば組織の分解をおこす毒性物
質の投与において毒性の測定としても使用し得る。

【００６５】従って、このアッセイは、コラーゲン架橋
を含む組織の代謝状態が、病状、処置、あるいは患者に
直接投与された物質あるいは患者が環境で曝される物質
の効果、の指標として使用され得るあらゆる状況に適用
され得る。

【００６６】以下の実施例は、説明を意図したものであ
り、本発明を限定しようとするものではない。

【００６７】

【実施例】実施例１ 尿中の天然の遊離架橋のアッセイ Ａ．U-PydおよびU-Dpdの単離：尿の試料は、パジェット
病または上皮小体亢進症(これには遊離の架橋レベルの
上昇が含まれる)の患者および成長期の子供(正常成人に
比較して約10倍高濃度の架橋が存在する)から採取し
た。ロータリーエバポレーターで10倍に濃縮した後、何
回分もの尿(20リッター)を、移動相としてブタノール：
酢酸：水(４：１：１ v/v/v)を使ってセルロースCF1の
分配クロマトグラフィーに各回ごとにかけた。水によっ
て固定相より溶出されたピリジニウム架橋を含む分画
を、0.2Ｍ酢酸によって溶出されるセファデックスG-10
のカラム(3.2×150cm)でクロマトグラフィーにかけた。
架橋を含むプールされた分画は、その後Na⁺が67mMにさ
れ、そしてpH2.75の67mMクエン酸ナトリウム緩衝液で平
衡化されたDowex 50X-X8イオン交換樹脂のカラム(1.7×
35cm)にかけた。カラムの温度を60℃に上昇させた後、6
7mMクエン酸ナトリウムの溶出は500mlにわたるpH2.75か
ら5.50への直線的なpH勾配でおこなった。カラムの溶出
液は、蛍光(励起光325nm/測定放出光400nm)でモニター
し、そして U-Pyd(364−377ml)および U-Dpd(397−416m
l)を含むプールされた分画はセファデックスG-10のゲル
濾過によって脱塩され、そして蒸発乾固させた。尿20リ
ットルからの収量は、2.5μmol U-Pydおよび0.6μmol U
-Dpdであった。

【００６８】Ｂ．結果：パラグラフＡで説明したこの試
料の単離方法は、個々の患者からの尿の試料に適用さ
れ、そしてU-PydおよびU-Dpdの量は当該技術分野で知ら
れているように、蛍光測定をつかってクレアチニンとの
比較により定量された(上記)。正常なヒトおよび骨疾患
および関節炎疾患をもつ７人の患者から得られた値を、
表２に示す。数値は、平均値±SEM(各群はｎ＝６)で示
されている。

【００６９】

【表２】

【００７０】これらの結果は、結合組織の過剰な分解に
よって特徴づけられる疾患にかかっていることが知られ
ている患者における、遊離の架橋レベルの上昇を劇的に
示している。

【００７１】表３は、様々な患者グループにおいて加水
分解後に測定された全架橋に対するパーセントとして表
されたU-PydおよびU-Dpdの割合を示す。

【００７２】

【表３】

【００７３】＊は以下のように計算された：(U-Pyd/全P
yd)×100および(U-Dpd/全Pyd)×100。全てのグループを
一緒にして(ｎ＝36)、U-Pydと全Pydとの間の相関係数は
0.929(p<0.0001)であり、U-Dpdと全Dpdとの間では0.952
(ｐ＜0.0001)であった。

【００７４】表３に示したように、U-PydおよびU-Dpdは
異常な状態である患者においても対照と比較して比較的
変化しないので、尿中の遊離の架橋の濃度は対照と比較
して尿の加水分解後に測定された架橋全体についても同
一の病気におけるコラーゲン分解の増大を反映してい
る。

【００７５】それゆえに、U-PydおよびU-Dpdは、結合組
織代謝の異常を含む疾患の診断および観察を促進するた
めの、コラーゲン分解の実行可能な指標を与える。

【００７６】Ｃ．免疫アッセイ：本実施例のパラグラフ
Ａに記述された方法によって単離される天然の遊離架橋
は、抗原の調製に使用される。U-PydおよびU-Dpdは、ア
ミノ酸分析機(Locarte Co. LTD., London, UK)の高分解
能樹脂カラムを使用して、pH4.25の67mMクエン酸ナトリ
ウム緩衝液を用いたイオン交換クロマトグラフィーでさ
らに精製される。

【００７７】免疫感作のために、単離された架橋は、カ
ルボジイミドおよび当該技術分野でよく知られた方法を
使用してウシ血清アルブミンに共有結合的に付けられ
る。

【００７８】モノクローナルおよびポリクローナルの両
方の抗体が、尿の架橋構造成分に対して作成される。モ
ノクローナル抗体の産生には、Balb/cマウスが尿の架橋
−BSA複合体で免疫され、そしてハイブリドーマ細胞株
が脾臓あるいはリンパ節からの細胞とAg8ミエローマ細
胞との融合の後、標準の技術をつかって調製される。ポ
リクローナル抗体は、ウサギで作成される。抗血清およ
びハイブリドーマ細胞液の両方のスクリーニングは、Ro
bins, Biochem J (1982)217:617-620に記載のように調
製される適切な尿の架橋ゼラチン複合体でコートされた
マイクロタイタープレートを使用するELISA法によって
行われる。

【００７９】尿中に遊離型で存在するそれぞれの架橋成
分のアッセイは、阻害ELISAによって以下のように行わ
れる：尿の試料(５あるいは20μl)あるいは参照基準と
して0.2〜20pmolの精製した尿の架橋を含む溶液は、0.0
5％のTween-20界面活性剤を含むリン酸緩衝溶液(PBS-T)
で110μlに希釈され、そして第一抗体、免疫活性な断
片、あるいはPBS-Tで１：5000〜１：20000に希釈された
抗血清を110μl加える。それぞれの試料は、丸底の96穴
マイクロタイタープレートに三反復ずつ用意し、その後
このプレートを室温で一晩反応させる。

【００８０】試料の一部(200μl)を、適切な尿の架橋成
分を含むゼラチン複合体で予めコートした平底のマイク
ロタイタープレートに移す。30分後、プレートをPBS-T
(３回)で洗い、そして結合抗体は、第一抗体の種類に対
して調製したストレプトアビチン−ペロキシダーゼと結
合させたビオチン標識化抗体およびペロキシダーゼ基質
検出系を用いる標準の技術によって検出される。呈色は
自動マイクロタイタープレート読み取り装置を用いて49
2nmで測定する。分析物を含む試料はプレートへの第一
抗体の結合を減少させ、そしてその結果発色の濃度を弱
めた。試料中の遊離の架橋の量は、log-logプロットを
つかって計算された各プレートに含まれる標準曲線に当
てはめて定量化される。

【００８１】上記のアッセイは、平底のマイクロタイタ
ープレートを抗原を含有することが疑われる試料でコー
トし、そして標識された第一抗体を直接ウェルに加える
ことによって直接的に行うように作り変え得る。

【００８２】実施例２ 天然の遊離架橋の発生源 本発明のアッセイに標準として使われ得る天然の遊離架
橋の発生源を確かめるために、多種の大型動物の尿を分
析した。ウシの尿では、約15％のみが遊離の架橋でPyd/
Dpd比は12±２である；ヒツジの値は、約20〜25％のみ
が遊離の架橋である以外は同様である。ブタの尿では、
Pyd/Dpdの比は約５±１であり、そして全体に対する相
対的な遊離の架橋の割合は42±５％である。遊離の架橋
の濃度は、Pydでは約380nMおよびDpdでは70nMである。

【００８３】子供の尿は成人の尿よりもDpdのよりよい
収量をもたらす。ブタの尿からのDpdの優先的な損失
が、精製の過程でCF-1セルロースが使われる時にいくら
か生じ、そしてPydに対する全回収量はPydでは40〜50％
であるがU-Dpdではたった20％である。最初の物質とし
て子供の尿を使用すると、両方の架橋の回収量は約55％
である。

【００８４】それゆえに、子供およびブタの尿は両者と
も遊離の架橋の標準として好適な源となる。

【００８５】上述したように、天然の遊離架橋の特徴と
するジアステレオマー型の架橋の収量は、エキソペプチ
ダーゼおよびグリコシダーゼの使用のように酵素的加水
分解過程によってこれらの発生源における全架橋を遊離
させることにより促進され得る。

【００８６】実施例３ ヒト組織におけるPyd/Dpd 異なった組織の一連の分析は、骨皮質の架橋の含有量
が、Pyd/Dpd比が約4.2の骨海綿質よりも若干高いことを
示している。Dpdは軟骨では検出されなかったけれど
も、この架橋は大動脈および靱帯で存在した。これらの
結果は、表４にまとめられている。

【００８７】

【表４】

【００８８】PydおよびDpdの両者とも正常な皮膚のコラ
ーゲンには完全に存在せず、また未成熟あるいは新しく
合成されたコラーゲンのいずれにも存在しない。

【００８９】実施例４ 骨粗鬆症患者の尿中の遊離型架橋の測定 脊椎骨折(Ｉ型骨粗鬆症)をもつ53歳から74歳(平均±S
D、64±５歳)までの閉経後の64人の女性を研究した。全
女性は、２光子吸光光度定量法で測定された腰椎骨の無
機物密度が骨折閾値0.98g/cm²を下回り、そして脊椎の
Ｘ線写真は３ヶ所あるいはそれ以上のグレード１の骨折
あるいは１ヶ所あるいはそれ以上のグレード２の骨折を
示した。骨粗鬆症についての他の２次的な原因は、何も
見いだされなかった。

【００９０】対照の群として、平均(±SD)65±６歳(範
囲50歳から79歳)の閉経後の67人の女性を研究した。全
女性は、正常な脊椎のＸ線写真を有し、そして２光子吸
光光度定量法で測定された腰椎骨の無機物密度は年齢相
応の正常な範囲であった。誰一人として、何らかの疾病
にかかっていたりあるいは骨の代謝への影響が知られて
いる薬物を摂取したりしていなかった。

【００９１】ヒドロキシプロリン測定のために、被検者
は研究に先だつ３日間はゼラチンなしの特別食を維持し
た。尿の試料は採集され、そして試料の一部は分析まで
−７０℃で保存された。全架橋は、既知の方法(Black,
D.ら、Anal Biochem (1988)169:197-203；Seibel, M.J.
ら、J Rheumatol (1989) 16:964-970)に主に従って測定
された。加水分解されない尿中の U-Pyd および U-Dpd
の測定のために、0.5mlの部分はCF1セルロースでの分配
クロマトグラフィーによって直接処理された(この処理
は、HPLC工程に先立ち遊離型をペプチド誘導型から分離
する；HPLCは、加水分解された試料について行った)。
尿の酸加水分解物中のヒドロキシプロリンは、HPLCで測
定された(Dawson,C.ら、Clin Chem (1988) 34:1572-157
4)。

【００９２】対照および骨粗鬆症群における尿中の天然
の遊離ピリジニウム架橋および全ヒドロキシプロリンの
測定を表５に示す。この結果は、骨特異的な架橋である
U-Dpdの排出は、対照群と比較して骨粗鬆症群において
有意に高かったことを示している。

【００９３】

【表５】

【００９４】相違は、U-Pydについてはあまり顕著では
ない；グリコシル化誘導体、U-Pyd.Gal.Glcについての
値には、統計学的な相違はなかった。直線回帰分析は、
クレアチニン比として表された値と24時間全排出量とし
て表現された値との間に、U-Pyd(ｒ＝0.80)およびU-Dpd
(ｒ＝0.82)両者共に高くて有意な相関があることを示し
た。この観察は、健康な男性と女性の志願者での架橋排
出において有意な日内変動が無いという事実と一致して
いる(A.M.McLaren and S.P.Robins, 未発表データー)。

【００９５】U-Dpdとヒドロキシプロリンとの間には有
意な相関があり、それは対照群(ｒ＝0.21；N.S.)におい
てよりも骨粗鬆症群(ｒ＝0.53；ｐ＜0.001)でより顕著
である。U-Pydとヒドロキシプロリンとの関係もこれに
類似であり、相関係数は骨粗鬆症群および対照群におい
てそれぞれｒ＝0.45(ｐ＜0.001)およびｒ＝0.34(ｐ＜0.
01)であった。

【００９６】遊離のおよび全部の架橋が共に測定された
試料では、これら両者の値の間には高くて有意な相関が
あった。デオキシピリジノリンについては、骨粗鬆症群
(ｎ＝25)および対照群(ｎ＝24)の相関係数が、それぞれ
0.90および0.84であった；ピリジノリンについての対応
する相関係数は、ｒ＝0.96およびｒ＝0.85であった。本
発明は、疾患において結合組織とくに骨の代謝を評価
し、あるいは治療をモニターするための方法に向けられ
ており、この方法は生物学的液体とくに尿中の、天然に
遊離型のコラーゲン由来架橋のレベルを評価することを
包含する。本方法は、これと同時に同一個体の生物学的
液体中の骨形成の指標のレベルを測定することおよび分
解のマーカーと形成の指標との間の相違を評価すること
によって、より高度なものになり得る。生物学的液体中
に遊離で存在する架橋の型に特異的に免疫応答する抗体
もまた、開示されている。

【図面の簡単な説明】

【図１】 尿から加水分解なしに得られたピリジノリン
のトレースの上に重ね合わされた、酸加水分解物から得
られたピリジノリンのクロマトグラフィーのトレースを
示す。この図はさらに、蛍光により測定される溶出パタ
ーンと、加水分解物から調製された抗ピリジノリン抗体
との反応から測定される溶出パターンとを比較する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 597060380 Ｇｒｅｅｎｂｕｒｎ Ｒｏａｄ， Ｂａ ｃｋｓｂｕｒｎ， Ａｂｅｒｄｅｅｎ, ＡＢ２ ９ＳＢ Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉ ｔａｉｎ (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，94，ｐ．1133 −1136（1983) Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｕ ｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，45, ｐ．969−973（1988) Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｍ ｉｓｔｒｙ，169 ｐ．197−203（1988) Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅ ｕｍａｔｏｌｏｇｙ，16：７，ｐ．964 −970（1989) Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉん ｔ．，44，ｐ．343−347（1989) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．207，ｐ．617− 620（1982) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/50

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト被検体において、増大したコラーゲ
   ン分解によって特徴付けられる骨代謝異常についてスク
   リーニングするかまたはこれをモニターするための方法
   であって、ヒト被験体由来の加水分解されていない血清
   サンプルにおける、生物学的組織もしくは液体から加水
   分解することなく得ることができる、ペプチドフリーの
   非グリコシル化ピリジノリン(N-Pyd)、ペプチドフリー
   のデオキシピリジノリン(N-Dpd)、またはその両方のレ
   ベルを測定する工程、およびこのように測定されたレベ
   ルと正常被験体に特徴的なレベルとを比較する工程、を
   包含し、ここで、上昇した測定レベルが骨代謝異常の指
   標となる、方法。
2. 【請求項２】 前記骨代謝異常が、骨粗鬆症、上皮小体
   亢進症、慢性関節リューマチ、変形性関節症、パジェッ
   ト病、または骨ガンである、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記測定されたレベルがN-Pydのレベル
   である、請求項１または２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記測定されたレベルがN-Dpdのレベル
   である、請求項１または２に記載の方法。