HUT64421A - Method for detecting irregularities of bone and other connective tissues in human beings and in animals - Google Patents
Method for detecting irregularities of bone and other connective tissues in human beings and in animals Download PDFInfo
- Publication number
- HUT64421A HUT64421A HU9202178A HU217892A HUT64421A HU T64421 A HUT64421 A HU T64421A HU 9202178 A HU9202178 A HU 9202178A HU 217892 A HU217892 A HU 217892A HU T64421 A HUT64421 A HU T64421A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- pyd
- dpd
- crosslinks
- antibodies
- free
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
- G01N2800/108—Osteoporosis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
- Y10S436/813—Cancer
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
- Slide Fasteners, Snap Fasteners, And Hook Fasteners (AREA)
- Mechanical Coupling Of Light Guides (AREA)
- Window Of Vehicle (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus For Radiation Diagnosis (AREA)
Description
A találmány egészségügyi, és állatgyógyászati összefüggésben vizsgálja a diagnózis eljárását. Ezen belül a csont, és más kötőszövetek metabolizmusának vizsgálatára vonatkozik a biológiai folyadékokban, például a vizeletben a kollagén degradáció hatására képződő szabad keresztkötések meghatározása által.
A találmány háttere
A szövetek, így a csont, a porc, a bőr, a fogállomány, az ín, és a különböző lágy szövetek fő szerkezeti anyaga, a kollagén asszociációja jól ismert. Szintén jól ismert az a tény, hogy a rostszálakat a kollagénben keresztkötések stabilizálják. A kollagénben található fluoreszcens piridinium gyűrű rendszerről, mint nem redukálható • · · · · · ·
-2keresztkötések jelenlétéről számolnak be Fujimoto D. és társai [J Biochem (1978) 83:863-867]. A cikk fluoreszcens peptid izolálásról számol be, szarvasmarha Achilles-ínból, pronázos feltárással. Úgy hitték, hogy az izolált, hidrolizált piridinolin (Pyd) három hidroxilizin gyököt tartalmaz, és felismerték, hogy a hidrolízis előtt a peptid fragmentumok a piridinolin részhez kapcsolódnak. A témához kacsolódó további munkákat Gunja-Smíth Z. és társai [Biochem J (1981) 197:759-762] folytatták, hidrolizált vizelet alkalmazásával a piridinolin vizeletben levő jelenlétének előnyeit ismertette Robbins S. P. [Biochem J (1982) 207:617-620], aki az antitestek fokozása céljából hidrolizált vizeletből kapott piridinolint kötött hordozóhoz. Ezután az antitesteket egy immunoassay-ben alkalmazták a hidrolizált vizeletben található piridinolin koncentrációjának meghatározására. A fiziológiás folyadékok analízisével történő eljárást, mint az érett kollagén bizonyos formái degradációjának indexét, Robins ismerteti.
A fenti esetekben az összes piridinolin kinyerésére hidrolizátumokat alkalmaztak, mivel a hidroxil-gyökök keresztkötéseit fenntartó peptid-növekedés felelős azok képződéséért. így a piridinium-gyürűt tartalmazó homogén készítmény létrehozásához egy előzetes hidrolízises lépés szükséges.
1982-re két út volt ismeretes a keresztkötések kialakítására, attól függően, hogy a keresztkötést nyújtó telopeptidekben lizin-, vagy hidroxilizin-gyök volt jelen [Robins, S. P.„ Collagen in Health and Disease (1982),
-3• · • · ·
Weiss, J. B., és társai, eds., 160-178. oldal, Churchill Livingstone, Edinburgh]. Ezt a keresztkötések specifitására alapozták, ami által a lágy szövetekben, például a bőrben az oxidált lizil-gyökökből redukálható aldimin-kötés keletkezik, míg a porcok és csontok esetében ezek a kötések kezdetben hidroxilizin aldehidekből képződnek, majd egy spontán átrendeződés folytán sokkal stabilabb oxo-imin keresztkötésekké alakulnak. Ezekből a kötésekből a további reakciók során 3-hidroxi-piridinium keresztkötések keletkeznek. A stabil keresztkötéseket alkotó piridinolinanalóg a hélix részben több inkább lizint tartalmaz, mint hidroxilizint, amint azt Ogawa T. és társai [Biochem Biophys Rés Commune (1982) 107:1251-1257], valamint Eyre D. R. és társai [Anal Biochem (1984) 137:380-388] azonosították, az eredményeket mennyiségivé tették, és deoxi-piridinolinként (Dpd) jelölték. Úgy vélték, hogy ez az anyag hasad el a csont kollagénjévé, bár a mennyiségek az egyes fajok között erőteljesen változtak.
Robins S. P. további munkái [Biochem J (1983) 215:167173] a csontban glikozilezett piridinolin jelenlétét bizonyították. Robins egy olyan szerkezetet ismertetett, mely a hidroxilizin három gyökének gyűrűjéből való származást mutatott, valamint azt, hogy a kollagén alkalihidrolizátumai egy O-galaktozil-gyököt adnak, melynek oldallánca hidroxi-csoporttal van szubsztituálva. Mivel ez az anyag rendkívül érzékeny az enyhén savas kezelésekre, nem lehet jelen a hidrolizált szövetek, illetve testfolyadékok mintáiban.
• · « · · · ·
-4Fujimoto D. és társai [J Biochem (1983) 94:1133-1136] nem-hidrolizált vizelet mintákat kromatografáltak, és azt állapították meg, hogy a 3-hidroxi-piridinium-gyűrű rész lényeges mennyisége szabad formában volt jelen, azaz az azt alkotó három hidroxilizil eredetű gyök nem tartalmazott további peptid növekedést. Az aminosav analízis·; mely a
Ά’..) kollagén savas hidrolizátumából izolálta a piridinolint, egy asszimmetrikus csúcsot adott, míg a szabad vizelet eredetű piridinolin szimmetrikus csúcsot adott. A szerzők ezt a hidrolízis során a piridinolin rendszer hidroxilizin része epimerizációja izomerizációjának tulajdonították. Az említett szerzők továbbá az elhasználódott összes piridinolin mennyiségének a változását határozták meg (a hidrolízis után), mint a kreatin színt arányát. Úgy találták, hogy a gyerekek esetében a vizeletben ez az arány magas volt, de a korral a növekedés során csökkent. Továbbá úgy találták, hogy ez az arány felnőtteknél viszonylag állandó, de idősebb korban kis mértékben növekszik. A szerzők szerint ez az idős korban megfigyelhető csonttömeg csökkenésnek felel meg.
Megpróbálták jellemezni a fent említett peptid növekedést. Robins S. P. és társai [Biochem J (1983) 215:175-182] azt állapították meg, hogy a porc eredetű II típusú kollagénben a piridinolin két szén-terminális telopeptid láncot köt meg egy egyláncú helikális pepiiddel. Egy további hidroxilizil kereszkötésről, azaz a más peptidekhez derivatizált gyűrűről azt állapították meg, hogy két nem helikális N-terminális pepiidhez kapcsolódik egy ···· ···«
-5harmadik lánc által a molekula helikális részén. A vizsgálatot fluoreszcens piridinolin kereszkötéseknek a szövetekből specifikus CNBr-el való hasítás által történő izolálásával folytatták, az ilyen konzerváló peptldek (preserving peptide) a hidroxilizll-gyökök növekedése során képezték a gyűrűt. A keresztkötések a növekedés’· aminosav szekvenciájának meghatározása szerint a kollagén rostokban helyezkedtek el.
Egy a Robinséhoz (lásd fent) hasonló megközelítésű beszámolóban Wu J.„ J. és társai [Biochemistry (1984) 23:1850-1857] az érett porc CNBr-es hasítását végezték el, és meghatározták a hidroxilizil rész peptidje növekvő gyökének a szekvenciáját a piridinium-gyűrűben. Az általuk levont következtetések hasonlóak voltak Robinséhoz.
Robins S. P. és társai [Biochim Biophys Acta (1987) 914:233-239] a kollagén eredetű csont feltárása során CNBr-t alkalmaztak az I típusú kollagén szerkezetében elhelyezkedő keresztkötések helyének meghatározására. A szerzők arra következtettek, hogy a keresztkötések lényeges része lizinből származott, és a hidroxilizinből származó rész ugyanolyan arányban volt jelen mindegyik izolált peptid forma esetében. A szerzők szerint ez azt mutatja, hogy a két keresztkötés analóg a kollagén rost ugyanazon szakaszán helyezkedik el, és megjelenési formájuk egy lizil-részböl származik, ami úgy tűnik, hogy a hélix megfelelő lizingyökei nem teljes hidroxilezése során keletkezik. Az aminosav analízis eredménye szerint a keresztkötéseknek két helyen kell elhelyezkedniük, beleértve mind az N-, mind a
-6C-terminális telopeptid részt.
Henkel W. és társai [Eur J Biochem (1987) 165:427-436] az aortából izolált I típusú kollagénben található keresztkötések asszociációjának aminosav szekvenciáját határozták meg. A kapott szekvenciák eltérnek a II típusú kollagén esetében kapott szekvenciáktól. Hasonló eredményeket kaptak Eyre D. R. és társai [FEBS (1987) 2:337-341], akik azt mutatták be, hogy a IX, és a X típusú kollagénben található keresztkötések jellegzetes peptíd kapcsolódást mutatnak a piridinolín keresztkötésekkel.
A W089/04491 számú PCT szabadalmi leírás (Washington Research Foundation) a csont reszorpció mérésére egy vizelet assay-t ismertet, a vizeletben levő specifikus keresztkötések detektálására alapozva, azoknak a csont kollagénnel asszociált peptíd növekedése által jellemezve. Az assay a testfolyadékban levő peptidek koncentrációjának mennyiségivé tételére épül, ahol a testfolyadékban a peptid fragmentumok a csont kollagén reszorpciójából származó piridinium keresztkötésekkel rendelkeznek. A csont kollagénhez kapcsolódó peptid növekedés két specifikus entitását már ismertették. Ezt a csont képződését, és pusztulását erőteljesen befolyásoló, Paget-féle betegségben szenvedő betegekből származó vizeletből határozták meg.
Macek J. és társai [Z Rheumatol (1987) 46:237-240] az oszteoartrózis mérésére javasoltak egy assay-t, a kollagén bomlás (collagene breakdown) keresztkötéseihez asszociált peptidek alapján. Ebben a megközelítésben a vizelet mintából méret szerint szeparálták a 10 kd-nél nagyobb molekulatömegü « ·
-7peptideket, melyeket ezután HPLC-vel, fluoreszcens detektorral szeparáltak tovább a piridinium-gyűrű következtében fellépő fluoreszcenciával rendelkező frakciók meghatározása céljából. Az oszteoartrózisben szenvedő betegek esetén kapott spektrumot egészséges egyének esetén kapott spektrummal összehasonlítva jól látható,:hogy a beteg állapothoz kapcsolódó nagy mennyiségű fluoreszcens csúcs hiányzott az egészséges mintákból. Továbbá az azonos betegből származó vizelet két héttel a beteg csípő teljes teljes endoprosztézise után, ezáltal csökkenteve az oszteoartrózis termékét, a normálishoz sokkal inkább hasonló fluoreszcens csúcsot adott. Továbbá az oszteoartrózis spektruma könnyen megkülönböztethető a rheumatoid arthitisben szenvedő betegek esetében kapott spektrumtól. A rheumatoid arthitis esetében kapott spektrumnak a normál kontroll spektrumhoz való hasonlósága a szerzők szerint a rheumatoid arthitis esetében megfigyelhető erőteljesebb proteáz aktivitásnak tulajdonítható. Ez feltehetőleg az adott rendszerben nem detektálható kisebb fragmentumokra bontja a kollagén szerkezetét.
Egy tanulmány a rheumatoid arthitisben szenvedő betegek esetében kapott vizelet minták összes 3-hidroxi-piridinium gyűrű keresztkötéseinek fokozott szintjét javasolta a betegség diagnosztizálására [Black D. és társai, Annals of Rheumatic Diseases (1989) 48:641-644], A rheumatoid arthitisben szenvedő betegek esetében kapott hidrolizált keresztkötések szintje (a vegyület kreatininhez viszonyított arányában kifejezve) a kontrolihoz képest 5-szörös faktorral ·· «·««
-8nőtt. Ebben az eljárásban a hidroxilizinből származó keresztkötések megkülönböztethetőek voltak a lizinből származóktól; mérhetően csak a hidroxilizinből származó keresztkötések mennyisége nőtt. Egy hidrolizált vizeletet alkalmazó, sokkal részletesebb tanulmány [Seibel és társai, J Rheumatol (1989) 16:964-970] a csont-specifikus keresztkötések exkréciója szignifikáns fokozódását mutatta ki a kontrolihoz képest, mind a rheumatoid arthitis, mind az oszteoartrózis esetében, de a hidroxilizin eredetű piridinium mennyiségének növekedése a rheumatoid arthitisben szenvedő betegek esetében feltűnőbb volt.
Míg a kollagén eredetű keresztkötések jelenlétéhez kapcsolódó méréseket a specifikus kollagén típusok, beleértve a csontot, degradációja mértékének meghatározására alkalmazták, lépéseket tettek a csontképződés markereinek azonosítására. Delmas, P. D. és társai [J Boné Míneral Rés (1986) 1:333-337] a szérum GLA-protein szintjét alkalmazták a csontképződés markereként gyerekek esetében, Brown J. P. és társai ugyanezt a csoportot alkalmazták egy hasonló méréshez, a poszt-menopauzális oszteoporózis esetén fellépő csontképződés meghatározására [Láncét (1984) 1091-1093].
Mind humán esetekben, mind állatoknál számos állapot jellemezhető a csontfelszívódás magas szintjével, illetve a csontfelszívódás és a csontképződés közötti felborult egyensúllyal. Ezek közül legismertebbek az oszteoporózis, és a Paget-féle betegség,. Ugyanakkor számos más esetben is előfordulhat a csont metabolizmusának felborulása, így például a jóindulatú, és a rosszindulatú daganatok • 4*4 . « ··* ···< · •· · * ·· • · · * ... : *·· ···
-9klfejlődése a csontban, és a metastatikus tumorok, melyek a csontsejtekbe például az éppen kezdődő prosztata-, vagy mellrák útján kerülnek. Más, ilyen állapot lehet még például az oszteoporózis, a csontlágyulás, az angolkór, a gyermekek abnormális növekedése, a vese oszteodisztrópia, és a drog által előidézett oszteopénia. A csont metabolizmus irregulációja számos esetben lép fel tiroid kezelés (thyroid conditions per se) mellékhatásaként, mint például a primer hipotiroidizmus és tirotoxicózis, éppúgy, mint a Cushingféle betegség esetén. Egy olyan diagnózis felállítása lenne hasznos, mellyel a paciens állapota, mint a csont metabolizmus irregulációja könnyen felismerhető lenne, anélkül, hogy meghatározná a pontos szindrómát, például a fent felsorolt lehetőségek közül. Az ismert csont betegségek további vizsgálata is végrehajtható, amint kiderült, hogy ez jelenti a felmerült problémák alapját.
A találmány ilyen, a csont metabolizmus rendellenességeinek vizsgálatára alkalmas általános ellenőrző tesztet nyújt.
A találmány ismertetése
A jelen találmány közvetlen, és kívánt esetben nemtámadó jellegű vizsgálati eljárást nyújt a csontképződési, és a csontfelszívódási rendellenességben, és ezek egyensúlyának rendelllenességében szenvedő betegek állapotának jelllemzésére. A teszt a biológiai eredetű • · · ·
-10folyadékokban, például a szérumban, és a vizeletben jelenlevő kollagén degradációjából származó natív, szabad piridinolin-, és deoxipiridinolin-keresztkötések mennyiségi meghatározásán alapul. A teszt specifikusan a fenti nedvekben a lizil-, illetve a hidroxilizil-gyököket alkotó kondenzált kollagén eredetű keresztkötésekkel asszociált további aminosav szekvenciáktól függetlenül előforduló keresztkötések egyes, illetve összes formájának mérésére irányul.
Ennek megfeleően a találmány eljárást nyújt a csont metabolizmus rendellenességeihez kapcsolódó rendelllenességek jelenlétének diagnosztizálására, amely eljárás a paciens biológiai folyadék eredetű mintájában található natív szabad keresztkötések szintjének meghatározására irányul. Ezt a szintet összehasonlítjuk a normál alanyok mintájában található natív szabad keresztkötések szinttel. A található natív szabad keresztkötések szintjének fokozódása az említett rendellenességekre utal.
Az eljárás a csontképződés indikátoraival összehasonlítva az említett degradációs termékek jól összahangolt felbecsülésére alkalmas. A paciens állapotára vonatkozólag további információkat kaphatunk, amennyiben úgy találjuk, hogy a csontfelszívódás szintjének eltérése, amit a biológiai folyadék mintában jelenlevő natív szabad keresztkötések jelenlétével jellemezhetünk, és a csontképződés szintjének eltérése, amit az indikátor szintjével jellemezhetünk, azonos a normál esetekkel, vagy
-11eltér azoktól. Általánosan azok szenvednek a rendellenességekben, akik a csont szerkezetet kimerítik, amit a képződési, és felszívódási arányok közötti nagyobb eltérések szemléltetnek abban az esetben, amikor a reszorpció predominál.
A találmány továbbá eljárást nyújt a fent említett metabolízmus rendellenességek jelenlétének diagnosztizálására, azáltal, hogy összehasonlítja a biológiai folyadék mintában levő indikátor szintjét az azonos egyén biológiai folyadék mintájában található natív szabad keresztkötések szintjével, és összehasonlítja az ezen szintek különbséget, valamint valamint a normál esetektől való eltérését. A csontfelszívódás és a csontképződés közötti fokozott eltérés a csontváz integritásának fenntartásában jelentkező problémákat jelzi.
A jelen szerzők úgy találták, hogy a szövetekből, vagy biológiai mintákból savas kezeléssel kapott hidrolízált szabad keresztkötésekhez kötődő antitestek a natív szabad keresztkötésekkel, illetve azokkal, melyek liziloldalláncot, illetve hidroxilizil-oldalláncot tartalmaznak, nem lépnek keresztreakcióba. Ugyanakkor olyan antitesteket hozhatunk létre, melyek ezekre a szabad keresztkötésekre nézve specifikusak. Ezek az antitestek nem léphetnek keresztreakcióba a hidrolízált formákkal; ez nem lényeges a biológiai minták közvetlen felbecsülésében, mivel hidrolízált formák nincsenek jelen. Ezeket az antitesteket kívánt esetben úgy állíthatjuk elő, hogy különbséget tegyenek a lizil-oldalláncot, illetve hidroxilizil • · · ·
-12oldalláncot tartalmazó natív szabad keresztkötéses formák között. A fenti kísérletre alapozva, melyet hidrolizált piridinolin ellen termelt poliklonális antitestekkel végeztünk, megállapíthatjuk, hogy az antitestek valószínűleg megkülönböztetik a szabad formákat a natív peptidet tartalmazó formáktól.
A találmány továbbá olyan antitestekre irányul, melyek specifikus immunreaktivitást mutatnak a natív szabad keresztkötésekkel, vagy a natív szabad keresztkötések lizil-, illetve hidroxilizil-formáival, vagy ezek glikozilezett formáival.
A találmány továbbá eljárást nyújt arthritiszes betegségek egy részének azonosítására az egyéb kötőszövetek, beleértve a porcot is, bomlásának meghatározása által, mely eljárás a hidroxilizil-oldallánc keresztkötéseinek a liziloldallánc keresztkötéseihez való arányának (Pyd/Dpd) a biológiai folyadék mintából történő meghatározásából áll, és az említett arány normál kontrollal történő összehasonlításából, ahol az említett egyén mintájából származó említett aránynak a normál kontrollal szemben mutatott növekedése az említett egyénben a porc bomlását mutatja.
A találmány továbbá eljárást nyújt a kapcsolódó szövet-képződmények indikátora jelenlétének meghatározására, ami a szabad keresztkötések szintjével kapcsolódva az egyén metabolikus állapotára nyújt információt.
Továbbá a találmány kitet nyújt az a biológiai folyadék mintákban levő natív szabad keresztkötések mennyiségének,
-13vagy koncentrációjának immunoassay-vel történő meghatározására, ahol az említett keresztkötések mint összes szabad keresztkötések határozhatók meg, vagy a Pyd, Dpd, Gal-Pyd, és Glc.Gal-Pyd csoportokból szelektálhatok. A kit konténer sorozatot tartalmaz, amely legalább egy olyan antitest készítményt tartalmaz, mely anatív szabad keresztkötésekkel, illetve egy, vagy több Pyd-del, Dpd-vel, Gal-Pyd-del, és Glc.Gal-Pyd-del specifikusan immunreaktív, és legalább egy közülük egy további reagenst tartalmaz az immunoassay irányítására, mint például egy jelzést (label), utasítással az assay kivitelezéséhez. A szabad keresztkötéseket ezután mint natív szabad keresztkötéseket határozhatjuk meg. Ugyanakkor a szabad keresztkötéseket önmagukban mint a lizil-oldallánc keresztkötéseit (Dpd), vagy mint a hidroxilizil-oldallánc keresztkötéseit (Pyd) vagy mint glikozilezett Pyd-et, illetve mint ezek kombinációját határozhatjuk meg.
A találmány továbbá a találmány szerinti antitesteket, vagy ezek fragmentumait, mint a keresztkötések meghatározására alkalmas specifikus reagenseket alkalmazó assay kit alkalmazására irányul.
Az ábrák rövid ismertetése
Az 1. ábra a hidrolizálatlan vizeletből kapott piridinolin tracerre egy savas hidrolizátumból rávitt kromatográfiás piridinolin csúcsot mutat be. Az ábra továbbá
-14a fluoreszcenciával meghatározott elúciós mintákat hasonlítja össze, amit a hidrolizátumból előállított antipiridinolin antitesttel való reakcióban határoztunk meg.
Eljárások a találmány kivitelezésére A találmány a csont rendellenességekkel, és egyéb kollagén metabolizmus rendellenességekkel jellemezhető betegségek jelenlegi diagnosztizálását fejleszti tovább. A találmány szerinti eljárás a biológiai eredetű folyadékokban levő kollagén eredetű piridinium keresztkötések szintjének változását alkalmazza a rendellenességek mutatójaként. Az eljárások során kezdetben a minta, jellemzően a vizelet hidrolízisét alkalmaztuk, így a minta peptid oldallánc mentes, hidrolizált keresztkötéseket tartalmazott, melyek mennyiségi meghatározása immunoassay-vel történt, a hidrolizált keresztkötésekkel szemben termelt antitestek alkalmazásával. Az eljárás ugyan megfelelő információkat nyújt, előzetes hidrolízis szükséges annak megakadályozására az assay során, hogy az közvetlenül a biológiai mintán futó klinikai assay-hoz legyen hasonló.
A jelen feltalálók megállapították, hogy a piridinium keresztkötés hidrolizált formájának hatására képződő antitestek sem a vizeletben jelenlevő szabad keresztkötésekkel, sem a hidrolízis előtt ezekkel a keresztkötésekkel konjugáló peptidekkel nem lépnek keresztreakcióba. így a jelenleg elérhető antibiotikumokat a
-15kezeletlen mintában nem alkalmazhatjuk közvetlenül.
A jelen találmány legyőzi ezeket a hátrányokat, mégpedig olyan reagensek alkalmazásával, melyek a biológiai mintával közvetlenül reagálva teszik lehetővé a szabad formában jelenlevő keresztkötések meghatározását, mint a hidrolízis előtt jelenlevő diasztereomerekét. Ahiint azt alábbi példákban bemutatjuk, ezeknek a szabad, és hidrolizálatlan keresztkötéseknek a közvetlen mérése olyan adatokat nyújt, melyek összehasonlíthatók a csak a jelen eljárással kapható, teljesebb mérés eredményeivel.
A továbbiakban az alkalmazott keresztkötések szerkezetéről ismertetünk néhány információt.
A keresztkötések természete
A Dpd, éa a Pyd rövidítéseket itt maguknak az izolált keresztkötéseknek a megjelölésére alkalmazzuk. A Pyd, vagy piridinolin a képződött keresztkötésekre vonatkozik, ahol a gyűrű N-je a hidroxilizin-gyök e-amino-csoportja. (Számos eljárás alkalmazza ezeket a megjelöléseket; így például a HP-t a hidroxilizil forma, és az LP-t a lizil forma megjelölésére alkalmazzák.)
A Dpd feltehetőleg az (I) általános képletnek felel meg, míg a Pyd feltehetőleg a (II) általános képletnek felel meg.
Láthatjuk, hogy a keresztkötések minden formája 1,4,5triszubsztituált 3-hidroxi-piridinium-gyök. A Pyd az ··
-16oldalláncán egy szabad hidroxil-csoportot tartalmaz, ami az egyes szövetekben tudvalevőleg glikozilezve van. A glikozilezés savakra és bázisokra érzékeny, de az utóbbiakra kevésbé. A Pyd Gal-Pyd fordul elő; a jelen találmány feltalálói a vizeletben Glc.Gal-Pyd jelenlétét is bemutatták (lásd a WO 89/00715 számú PCT találmányt). A szabad Pyd ezen formái a (III), és a (IV) általános képletnek megfelelő acetálok, melyek hidoxil oldallánchoz vannak konjugálva.
Láthatjuk, hogy a Dpd három királis központot tartalmaz
- az oldalláncokon három α-amino pozícióval. A Pyd négy ilyen központot tartalmaz, mivel itt egy további királis központ található az oldallánc hidroxil-pozíciójában. Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a hidrolizálatlan mintákban, attól függően, hogy a peptideket tovább derivatizáljuk, vagy nem, három α-amino-csoport származik a natív állapotban előforduló L-enantiomerektől, és az OHcsoport szintén a biológiai rendszer által meghatározható konfigurációban van jelen.
Amint a fenti A találmány háttere című fejezetben ismertettük, a keresztkötések jelentős része a vizeletben szabad keresztkötés formájában fordul elő (felnőtteknél körülbelül 40 %), azaz, amint fent bemutattuk, nincs a Pyd, a glikozilezett Pyd, vagy a Dpd szerkezethez peptid lánc konjugálva a minta hidrolízisének végrehajtása előtt. így a szabad keresztkötés megfelel a fent említett általános képleteknek.
Mind a Pyd-re, és a Dpd-re való tekintettel meg kell jegyeznünk, hogy a királis központok kíralitása nem • ·
-17specifikus. így a szabad kifejezés ezekre a keresztkötésekre vonatkozik, attól függően, hogy a hidrolízis körülményeinek alávetettük azokat, vagy nem. A jelen találmány ezeknek a szabad keresztkötéseknek a kiralitási eltérését szemlélteti, amennyiben azokat a hidrolizált formával összehasonlítva szabad·formában kapjuk. A találmány során a natív szabad keresztkötések kifejezés a Dpd-re, a Pyd-re, vagy azok glikozilezett formájára vonatkozik, ahogyan azok a biológiai mintában előfordulnak; a hidrolizált szabad keresztkötés kifejezés ezekre a hidrolizátumokban előforduló szerkezetekre vonatkozik. Természetesen, mivel a glikozides kötések a hidrolízis körülményei között labilisak, a hidrolizált szabad keresztkötések nem tartalmaznak cukrokat.
Mivel a biológiai rendszer termékei natív szabad keresztkötések, feltételezhető, hogy a biológiailag előnyben részesített kiralitás mind a három, vagy négy kiralitási centrumban megvan. Az oldallánc α-amino-csoportjai által reprezentált három kiralitási központ a természetes aminosavakhoz hasonlóan L-konfigurációval rendelkezik, és a szénatomot tartalmazó Pyd oldallánc hidroxil-csoportjának kiralitása is egy jellemző, egyedülálló konfiguráció. Ezt az 1. ábrán látható eredmények is megerősítik, ahol a pontozott vonalak az előzőleg izolált Pyd natív szabad formájával végrehajtott, nátrium-citráttal ekvilibrált szulfonátozott polisztirén gyöngyökön végrehajtott ioncserélő kromatográfia eredményeit szemléltetik. Amint az 1. ábrán is láthatjuk, a közvetlenül az ureából eluált Pyd egyedülálló csúcs • ·
-18formájában jelenik meg. Ez annak felel meg, hogy a rendszerben csak egy diasztereomer van jelen.
A hidrolízis után a hidrolizált szabad Pyd eluátum elegyét az 1. ábrán folyamatos vonallal ábrázoltuk. Ez azon diasztereomerek elegyénél kapott királis központok racemizációjának felel meg, melyek a továbbiakban nem mutatnak ugyanolyan kromatográfiás viselkedést. Hasonló eredményeket kaptunk a natív szabad Pyd, és a hidrolizált szabad Pyd esetén.
így a natív szabad keresztkötések különböznek a keresztkötések hidrolizált szabad formáitól. Úgy tűnik, hogy a hagyományos savas hidrolízisnél végbemenő racemizáció esetén az egyes molekulák konfigurációja megváltozik.
Ugyanakkor az összes natív szabad keresztkötések hozamának fokozása a biológiai rendszerben az összes natív Pyd és Dpd proteolitikus kezelésével, ami a natív szabad keresztkötések formáját hozza létre, is elérhető. Továbbá a fajok keresztkötései azonosíthatók, és a humán mellett más fajok is alkalmazhatók a natív szabad keresztkötés standardok előállítására, melyeket a mérési rendszerben, vagy immunogénként alkalmazhatunk. A sertés vizelet a natív szabad keresztkötések rendkívül nagy mennyiségét tartalmazza. Kiindulási anyagként a biológiailag fontos diasztereomerek is alkalmazhatók.
A jelen találmány feltalálói bemutatták, hogy a hidrolízis eredményeként - azaz ahol az immunogént a biológiai eredetű folyadék, vagy szövet tömény savas kezelésével kaptuk, melynek során a peptid kötés ♦ · • · · · · 4 ············· -19elroncsolódott, és a Pyd a Dpd-től szeparálódott keletkezett szabad Pyd-del szemben termelt antitestek nem mutatnak, vagy csak nagyon kis mértékben mutatnak keresztreaktivitást a Pyd, vagy a Dpd natív szabad formáival. Továbbá a hidrolizátumban a Pyd-del szemben termelt antitestek csak kis mértékben lépnek keresztreakcióba az így keletkezett Dpd-vel. A csont vagy porc savas hidrolizátumában a Pyd-del szemben termelt antitestek keresztreakcióban lépnek a vizeletben levő keresztkötésekkel a savas hidrolízis után.
Az eredmények jellemző sorozatát mutatjuk be az 1. táblázatban. Az 1. táblázat egy ELISA mérés eredményeit szemlélteti, melyben a csontból izolált Pyd hidrolizátummal végzett immunizálás során kapott antiszérumot alkalmaztuk. Az ELISA a hidrolizátumot mint antigént alkalmazza, és az eredményeket az adott keresztkötéseknek azon képessége alapján adjuk meg, hogy mennyire gátolják a hidrolizátum antigénnek az antiszérumhoz kötődését. Ezt a kritériumot alkalmazva a csont vagy a porc savas hidrolizátumából izolált Pyd-del szemben immunizált nyulakból kapott antitestek a Pyd-nek a vizeletből származó natív szabad formájával csak 50 %-ban léphetnek keresztreakcióba, míg az ureából izolált tisztított natív szabad keresztkötések savas hidrolízise után a Pyd-del teljes mértékű keresztreakciót mutattak. Ezek az antitestek 20 %-os keresztreakciót mutattak a Dpd ugyanazon csont eredetű hídrolizátumból izolált formájával, és 1 %-nál kisebb keresztreakciót mutattak a Dpd vizeletben levő natív szabad formájával (U-20Dpd); a natív szabad forma savas hidrolízise után az említett antitestekkel mutatott keresztreaktivitásnak körülbelül 70 %-a nyerhető vissza (1. táblázat).
-211. táblázat
| az 50%-os gátláshoz | Keresztreakció % | |
| szükséges menny. pmol | ||
| Hidrolizált csont | ||
| eredetű Pyd | 1.6 | 100 |
| Urea eredetű | ||
| szabad Pyd | 29.6 | 5 |
| Savval hidrolizált | vizelet | |
| eredetű U-Pyd | 1.5 | 107 |
| Hidrolizált csont | ||
| eredetű Dpd | 8.1 | 20 |
| Urea eredetű | ||
| szabad Dpd (UDpd) | >260 | <1 |
| Savval hidrolizált | vizelet | |
| eredetű U-Dpd | 11.5 | 14 |
4ά· ·»*|
-22Αζ 1. ábra továbbá, amint fent már említettük, a nátrlum-citráttal ekvilibrált szulfonátozott polisztirén gyöngyökön (7μ) végrehajtott ioncserélő kromatográfia eredményeit szemlélteti. A szabad Pyd, és a savval hidrolizált vizelet elúciós mintáját fluoreszcenciával határoztuk meg. A savas hidrolizátummal szemben4termelt antitestek csak a hidrolizátummal reagálnak jelentős mértékben. A két fő hidrolizátum csúcs reaktivitásában tapasztalható ellentmondás a két frakció immunogenitásában mutatkozó eltérésnek tulajdonítható.
Antitestek létrehozása a natív szabad keresztkötésekhez
Az antitesteket a natív szabad keresztkötésekhez vagy mint teljes frakciót hoztuk létre, vagy, előnyös esetben mint a frakció egyes komponenseit. A piridinium-kötéseknek a fehérjét tartalmazó fragmentumtól szabad formában való teljes szeparálása például Fujimoto D. eljárásával érhető el [J Biochem (1983) 94:1133-1136]. Az eljárás során tömény ureát viszünk fel Sephadex G-10 oszlopra, és az összes píridiniumot tartalmazó frakciót eluáljuk. Az eluátumot ezután nátrium-citráttal ekvilibrált foszfocellulóz oszlopra visszük fel, és sóval eluáljuk. Ennek az egyszerű eljárásnak az eredményeképpen a szabad keresztkötések egyedülálló csúcs formájában jelennek meg. Mivel a mintát nem hidrolizálják, a csúcs nem csak a Pyd, és a Dpd formát tartalmazza, hanem a glikozilezett Pyd-et is, beleértve a “••‘J *·*χ
-23Gal-Pyd-et, és a Glc.Gal-Pyd-et is, lásd fent. Az így kapott natív szabad keresztkötés frakció további szeparálása ezután standard eljárásokkal történik, így például szulfonátozott polisztirén gyöngyökön végrehajtott ioncserével, vagy HPLCvel. Általánosan jellemző szeparálás! eljárásokat találhatunk például az alábbi leírásokban: Black D. és társai [Anal Biochem (1988) 169:197-203] Seibel M. J. és társai [J. Rheumatol (1989) 16:964-970].
Az antitest készítményt általánosan ismert eljárásokkal, így például az elegy injektálásával, vagy az egyes komponensek hordozóhoz kötött elegyének injektálásával megfelelő emlős alanyokba visszük, mint például nyulakba, vagy egerekbe, az ismert immunológiai eljárás szerint. Az anyagokat az immunogenicitás fokozása céljából hordozókhoz, például BSA-hoz, vagy tetanusz toxoidhoz kapcsolhatjuk.
A szérumokat az immunogénre való válaszként keletkező antitest képződés meghatározása céljából titráljuk. Kívánt esetben összegyűjthetjük a lépsejteket, vagy a perifériális vérsejteket, és elölhetjük azokat, így olyan tenyészeteket kapunk, melyek képesek a kívánt komponenssel immunoreaktív monoklonális antitestek folyamatos termelésére. A készítmények az egyes komponensekre nézve fokozottan specifikusak.
így poliklonális antiszérumot kapunk, mely specifikusan immunoreaktív a biológiai eredetű folyadékokban, különösképpen a vizeletben előforduló keresztkötések natív szabad formájával. A specifikusan immunoreaktív kifejezés azt jelenti, hogy a szérum képes a biológiai eredetű • ·«·· ·«·· • · · • · · * · • · · · · • ·>· ♦·· · ·· ···
-24folyadékokban előforduló keresztkötések natív szabad formájával komplexet képezni, mely megfelelően nagy affinitással rendelkezik ahhoz, hogy összehasonlítva a folyadékban jelenlevő többi anyaggal, egy immunoassay során lehetővé tegye a natív szabad formák meghatározását. A natív szabad formákkal, vagy az egyes komponensekkel szemben termelt poliklonális antitestek egy része keresztreakcióba léphet a kapcsolódó peptid lánccal rendelkező natív formákkal; a mérések standardizálása vagy keresztreakcióba nem lépő monoklonális antitestek létrehozásával történhet, vagy az említett keresztreakció mértékének standardizálásával.
A monoklonális antitestek létrehozására irányuló rutin eljárások alkalmassága a kívánt specifitással rendelkező antitestek reprodukálható létrehozását teszi lehetővé. így, ellenőrző eljárások alkalmazásával, melyek feltétele az, hogy az elölt sejt felülúszó immunoreaktivitást mutasson például a natív szabad Pyd-del, de reaktivitása csökkent mértékű legyen, vagy egyáltalán ne legyen a natív szabad Dpd-vel, vagy a további peptidekhez konjugált keresztkötések formáival, olyan antigének kaphatók, melyek a natív szabad Pyd-del reagálnak. Ugyanakkor a biológiai minták értékelése során előnyös lehet az ilyen különleges specifitással rendelkező antitest koktélok alkalmazása, melyekkel minden natív szabad forma meghatározható.
A kívánt specifitású antitesteket szekretáló elölt sejtvonalakat in vitro tenyészthetjük a kívánt monoklonális antitest gyakorlati termelése céljából, a szakmában
-25általánosan ismert, emlősök esetén alkalmazott sejt technikákkal. Az ilyen tenyésztési eljárások általánosan ismert utakon történnek. Az elölt sejtvonalakat egerekbe injektálhatjuk, és a monoklonális antitestek nyers készítményét, mint aszcitesz folyadékot (ascites fluid) izolálhatjuk. Az antitest készítményt kívánt esetben affinitásos úton tisztíthatjuk, az immunogén, mint affinitási ligandum alkalmazásával.
Meg kell jegyezni, hogy míg az antitesteket a szabad formákkal csökkent reaktivitást mutató kollagén eredetű keresztkötések hidrolizált szabad formáira való tekintettel állítjuk elő, nem érdekes az, hogy létrejön-e a kapcsolat, mivel a nem-hídrolizált biológiai mintában a hidrolizált formák nincsenek jelen. így az ezen keresztreaktivitások jelenlétét bizonyító ellenőrző eljárások szükségtelenek.
Az immunoassav kivitelezése
A fent előállított antitesteket alkalmazó immunoassay alkalmazásával lehetségessé válik a biológiai eredetű folyadék frakcionálás, vagy hidrolízis nélküli mérése. A natív szabad Pyd, vagy Dpd, illetve mindkettő kívánt formáinak specifitását az antitest készítmények által hozzuk létre.
Maguknak az immunoassay-knak a kivitelezése során számos, a szakmában jól ismert mérési eljárást alkalmazunk. Az assay kialakítása a specifikus antitest, és a kívánt •4 4 ···· «*·« · • · ·· · ♦ ·· • · · * · • · · » · ··«· ··· · 9· *··
-26analit közötti kapcsolat specifítására, és az analit, és antitest által létrehozott komplex detektálását alkalmazó módszerekre alapozva történik. A komplex képződés magával az anitesttel, vagy ennek egy immunológiailag reaktív fragmentumával, például Fab-bal, vagy Fab'-bal, illetve F(ab')2 fragmentummal történhet. Az antitest, vágy ennek immunológiailag reaktív fragmentuma komplex képzése szilárd vázon történhet, és az analitra nézve mint befogó antitestet alkalmazhatjuk. Az eljárást közvetlenül futtathatjuk, vagy az analit/antitest komplex képződését fluoreszcens, enzimes, vagy radioaktív jelzéssel detektálhatjuk, illetve kompetitív úton futtathatjuk, ahol a jelzett standard verseng az analittal az antitestért. A formátum mint agglutinációs mérési eljárás is kialakítható, vagy a komplexet megfelelő csapadékképző anyagnak,a reakcióelegyhez adásával csaphatjuk ki. Az immunoassay eljárás során számos lehetőség közül választhatunk, sokféle klinikai mérési módszer, és eljárás alkalmazható.
A standard detektálási eljárásokat alkalmazó immunoassay kivitelezése során felhasznált reagensek és antitestek - azaz például a fluoreszcens, az enzimes, vagy a radioaktív jelzés, illetve az ELISA, közvetlen vagy kompetitív formában - megfelelő módon alkalmazhatók, mint a méréshez szükséges komponenseket, és utasításokat tartalmazó kit.
Mivel az antitesteket specifikusan a natív szabad keresztkötésekhez, és ezek egyes formáihoz termeljük, az említett komponensek arányát, azok egyéni, és teljes ·« ··»« »·· • · ·* · ^ ·· · · · · • · · · · ··<«· ··· · ·· »··
-27mennyiségét meghatározhatjuk.
így az assay tervezése során az olyan antitesteket, vagy' ezek immunológiailag reaktív fragmentumait tartalmazza, melyek az összes natív szabad keresztkötés meghatározását, vagy a natív szabad Pyd., Dpd, Gal-Pyd, vagy Glc.Gal-Pyd meghatározását, illetve ezek valamely kívánt kombinációjának meghatározását teszik lehetővé. Mivel az egyes szövetekben a Pyd és Dpd keresztkötések szintje meghatározható, egymáshoz viszonyított mennyiségük megváltozását, mint az egyes szövetek lebomlásának mutatóját alkalmazhatjuk. így például normál felnőttek esetén a Dpd/Pyd arány az egész felnőttkor alatt állandó marad. A csontban a Dpd/Pyd arány 4/1, és úgy tűnik, hogy ez a felszabaduló Dpd fő forrása, a Dpd/Pyd arány növekedése a csont degradációjának mutatója. (Bár az aorta is tartalmaz Dpd-t, ennek körforgási aránya alacsony.) A biológiai eredetű folyadékok Dpd szintjének értékelése csont-specifikus eredményt ad. Ugyanakkor egyes esetekben, amikor csont rendellenesség gyanúja lép fel, az összes szabad keresztkötések szintjét (Dpd+Pyd) alkalmazhatjuk a mérésre, amennyiben további információk is rendelkezésünkre állnak. Amennyiben a szimptómák nem porc betegségre, például rheumatoid arthitisre utalnak, a szabad formában jelelevő keresztkötések feleslegének nagy része a csont reszorpciója következtében a biológiai eredetű folyadékban lesz.
Mivel az egyéb kötőszövetek, például a porc, a legtöbb esetben csak Pyd-et tartalmaznak, de Dpd-t nem, a Pyd/Dpd arány növekedése az ilyen károsodáshoz kapcsolódó betegségek jelenlétére utal.
-28Mivel a találmány szerinti antitesteket alkalmazó immunoassay-k általánosan ismertek, a natív szabad Pyd, és Dpd keresztkötések meghatározása számos úton történhet. A piridinolin-kötés fluoreszcens, így megvalósítható a biológiai folyadék minta általánosan ismert, közvetlen kromatografálása, ami a Dpd-nek a Pyd-től, és a'· Pyd glikozilezett formájától való szeparálását eredményezi, és a csúcs fluoreszcenciájának fokozódása az eredményt mennyiségivé teszi.
így a találmány szerinti eljárással a kromatografált anyag fluoreszcenciája intenzitásának meghatározása által a natív szabad keresztkötéseket határozhatjuk meg önmagukban, vagy csoportosan.
Amint a fent említett WO 89/04491 számú PCT találmány említi, a keresztkötések mennyiségét specifikus elektródákkal, a gyűrűrendszerre nézve megfeleő redoxpotenciál alkalmazásával is meghatározhatjuk.
A natív szabad keresztkötés, mint a csont reszorpció indikátora alkalmazásával a csont metabolikus egyensúlyát előnyösen határozhatjuk meg, mégpedig úgy, hogy egyesítjük ezt a meghatározást az azonos egyénből származó azonos, vagy más biológiai folyadék markerének meghatározásával. Ilyen marker lehet például az I típusó prokollagén, a csont oszteokalcin (csont GLA protein, vagy BGP); a pro-csont GLA protein, a mátrix GLS protein (MGP), a csont-specifikus proteinek, például a csont-specifikus szialoproetin, a foszfoproteinek, az alkalikus foszfatáz, az oszteonektin (osteonectin), vagy más nem-kollagénes csont-proteinek. Az
-29említett markerek meghatározására alkalmas eljárások a szakmában jól ismertek. Az említett markerek meghatározására alkalmas eljárást ismertetnek például Delmas és társai [J Boné Min Rés (1986) 1:333-337].
A már említett mérések, melyek a degradáció esetén fellépő kollagén-eredetű keresztkötések keletkezése metabolikus állapotának mutatóját adják meg, számos összefüggésben alkalmazhatók. Először is alkalmasak az alany rendellenes állapotának, amilyen például a túlzott csont reszorpció, megállapítására. Ez például oszteoporotikus állapotra, vagy rosszindulatú daganat metastatikus kifejlődésére utalhat. Más, ismert állapotokra jellemző például a fokozott csont reszorpció, ilyen például a Pagetféle betegség, és a hiperparatiroidizmus. Mivel a paciens állapota folyamatosan ellenőrizhető, ezeknek a méréseknek az alkalmazásával az említett, illetve az egyéb állapotok kezelésére alkalmazott terápia folyamatát ellenőrizhetjük. A méréseket a toxicitás vizsgálatára is alkalmazhatjuk, mivel a toxikus anyagokkal való kezelés gyakran okoz szövetdegradációt.
így az említett méréseket olyan esetekben alkalmazhatjuk, amikor a kollagén keresztkötéseket tartalmazó szövetek metabolikus állapotát alkalmazzuk az állapot, a kezelés, vagy azon anyagok mutatójaként, melyekkel a pacienst közvetlenül kezeltük, vagy melynek a paciens a környezet hatására van kitéve.
Az alábbi példák a találmányt korlátozások nélkül illusztrálják.
-301. példa
Mérési eliárás a natív szabad keresztkötéseknek a vizeletből történő meghatározására
A. Az U-Pvd, és az U-Dpd izolálása
A vizelet mintákat Paget-féle betegségben, vagy hiperparatiroidizmusban szenvedő betegekből (akiknél a szabad keresztkötések fokozott mennyiségben fordulnak elő), és növekvő gyermekekből (akiknél a keresztkötések koncentrációja körülbelül tízszer nagyobb, mint a normál felnőtteknél) gyűjtöttük. Miután rotációs bepárlással körülbelül tízszeresre töményítettük a mintát, a vizelet tételeket (20 liter) tételszerüen elválasztó kromatográfiának vetettük alá, cellulóz CF-l-en, mozgó fázisként butanol:ecetsav:víz (4:1:1 v:v:v) alkalmazásával. A piridinium-keresztkötéseket tartalmazó frakciót, mely a vizes fázisból eluálódott, 0.2 M ecetsavval eluált Sephadex G-10 oszlopon (3.2 x 150 cm) kromatografáltuk. A keresztkötéseket tartalmazó poolozott frakciókat Na+-ban 67 mM-ra állítottuk be, és 67 mM nátrium-citrát pufferrel (pH 2.75) ekvilibrált Dowex 50X-X8 ioncserélő gyantát tartalmazó oszlopra (1.7 x 35 cm) vittük fel. Az oszlop hőmérsékletét 60°C-ra emeltük, majd 500 ml 67 mM nátrium-citrát puffer alkalmazásával lineáris pH gradienst hoztunk létre (pH 2.75-5.50). Az oszlopról lejövő anyagot fluoreszcenciásan
-31ellenőríztük (ex 325 nm/ emm 400 nm), és az U-Pyd-et (364377 ml) és U-Dpd-t (397-416 ml) tartalmazó frakciókat gélszűréssel Sephadex G-10-en kisóztuk, bepároltuk, és megszárítottuk. 20 liter ureából 2.5 μΜ U-Pyd-et, és 0.6 μΜ. U-Dpd-t kaptunk.
B. Eredmények
A minta 1. fejezetben ismertetett izolálási eljárását az egyes paciensek vizelet mintáján végeztük el, az U-Pyd, és az U-Dpd mennyiségi meghatározását a kreatíninhez viszonyítva a szakmában jól ismert fluoreszcens mérésekkel hajtottuk végre (lásd fent). A normál esetekben, és a hét csont rendellenességben, vagy arthritiszes betegségben szenvedő paciens esetében kapott eredményeket a 2. táblázatban mutatjuk be. Az eredményeket mint főérték +- SEM adjuk meg (n=6 az egyes csoportokra).
« ··*·*··« ·
2. táblázat
Betegek csoportja
U-Pyd
U-Dpd (nmol/mmol kreatinin)
| Normál kontroll | 10.3 +- 1.0 | 3.27 +- 0.57 |
| Osteoporózis | 19.3 +- 2.3 | 5.90 +- 0.68 |
| Paget-féle betegség | 62.5 +-11.2 | 19.30 +- 3.83 |
| Hyperparatiroidizmus | 55.9 +-14.2 | 16.30 +- 4.81 |
| Rheumatoid arthitis | 38.8 +- 8.36 | 8.92 +- 2.08 |
| Osteoarthritis | 25.8 +- 3.22 | 6.10 +- 0.83 |
Az eredmények a kötőszövetek túlzott lebomlásával jellemzett betegségekben szenvedő paciensek esetén a szabad keresztkötések erőteljes növekedését mutatják.
A 3. táblázat az U-Pyd, és az U-Dpd arányát mutatja be, a különböző csoportok esetén végrehajtott hidrolízis utáni összes mért keresztkötés mennyiségének %-os aránya szerint.
-333. táblázat
| Betegek csoportja | % | U-Pyd* | % | U-Dpd* | |
| Normál kontroll | 43.8 | +-2.5 | 501 1 | +- | 5.4 |
| Osteoporosis | 41.7 | +- 2.0 | 42.7 | 4— | 2.6 |
| Paget-féle betegség | 46.5 | +-2.4 | 47.4 | H— | 4.1 |
| Hyperparatiroidizmus | 48.7 | +-6.8 | 46.2 | + - | 6.9 |
| Rheumatoid arthitis | 38.1 | +-2.6 | 43.3 | + - | 1.8 |
| Osteoarthritis | 43.4 | +-3.9 | 47.0 | + - | 2.2 |
*Meghatározás:
(U-Pyd/összes Pyd) x 100, és (U-Dpd/összes Pyd) x 100. Minden elegyített csoport esetén (n=36) az U-Pyd, és az összes Pyd közötti korrelációs koefficiens 0.929 (p<0.0001), míg az U-Dpd, és az összes Dpd közötti korrelációs koefficiens 0.952 (p<0.0001).
Mivel, amint az a 3. táblázatban is látható, a kontroliokkal összehasonlítva az U-Pyd, és az U-Dpd %-os aránya viszonylag állandó a rendellenességekben szenvedő paciensek esetében, a vizeletben jelenlevő szabad keresztkötések koncentrációja a betegségek esetén ugyanazt a növekedést mutatja, mint a kontrolloknál, amint azt a vizelet hidrolízise után az összes mért keresztkötés mennyisége mutatja.
Ezáltal az U-Pyd, és az U-Dpd a kollagén degradáció * · · « · · ♦ t
-34megfelelő mutatójává válik, megkönnyíti a diagnózist, és a betegségek ellenőrzését, beleértve a kötőszövetek metabolizmusának rendellenességeit.
C. Immunoassav
Az A. fejezetben ismertetett eljárás által izolált natív szabad keresztkötések az antigéneket előállítására alkalmaztuk. Az U-Pyd, és az U-Dpd további tisztítása ioncserélő kromatográfiával történt, 67 mM nátrium-citrát pufferrel (pH 4.25), egy aminosav analizátor nagy felbontású gyanta oszlopának alkalmazásával (Locarte Co. Ltd., London, UK) .
Az immunizálás céljából az izolált keresztkötéseket kovalensen szarvasmarha szérum albuminhoz kapcsoltuk, karbodiimid alkalmazásával, a szakmában jól ismert eljárásokkal.
Mind a monoklonális, mind a poliklonális antitesteket a vizelet keresztkötés komponenseivel szemben termeltük. A monoklonális antitestek termelése céljából Balb/c egereket immunizáltunk vizelet eredetű keresztkötés-BSA konjugátum (urinary crosslink-BSA conjugates) alkalmazásával, és a lép, vagy nyirokcsomó sejtek Ag8 mielóma sejtekkel történő fúziója után a hibridóma sejtvonalakat standard eljárásokkal hoztuk létre. A poliklonális antitesteket nyulakban termeltük. Az antitestek, és a hibridóma sejtközeg ellenőrzése ELISA eljárással történt, a megfelelő vizelet eredetű keresztkötés-zselatin konjugátummal bevont ι
-35mikrotiter lemezek alkalmazásával [lásd Robins, Biochem J (1982) 217:617-620].
Az ureában szabad formában jelenlevő keresztkötés komponensek ELISA gátlással történő mérése az alábbiak szerint történik.
A mintákat (5, vagy 20 μΐ), vagy a 0.2-20 pmol tisztított vizelet keresztkötés standardot tartalmazó oldatot 0.05 % Tween-20 detergenst (PBS-T) tartalmazó foszfát pufferes fiziológiás sóoldattal 11 μΐ-re hígítottuk, és 110 μΐ elsődleges antitesthez (primary antibody), immunoreaktív fragmentumhoz, vagy PBS-el 1:5000 - 1:20.000szeresre hígított antiszérumhoz adtuk. Minden mintából három párhuzamos mérést végeztünk, gömbölyű fenekű, 96 lyukú mikrotiter lemezeken (96-well microtiter plate), melyeket ezután egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten inkubáltunk.
A minták részleteit (200 μΐ) lapos fenekű mikrotiter lemezekre vittük, melyeket előzőleg a megfelelő vizelet eredetű keresztkötés zselatin konjugátumával vontuk be. 30 perc után a lemezeket PBS-T-vel mostuk, és a kötött antitesteket standard eljárásokkal detektáltuk, sztreptavidin-peroxidázzal elegyített elsődleges antitestekkel szemben termelt biotinillel jelzett antitestek alkalmazásával, peroxidáz-szubsztrát detektálási rendszerben. A színfejlődést 492 nm-en mértük, automata mikrotiter lemez leolvasó alkalmazásával. Az analitokat tartalmazó mintákban csökken az elsődleges antitesteknek a lemezen való megkötődése, és így csökken a színfejlődés. A
-36mintában levő szabad keresztkötések mennyiségét standardok szerint tettük mennyiségileg értékelhetővé, az egyes lemezeken levő standardok görbéi szerint, log-log görbékkel.
Az említett mérés azáltal tökéletesíthető, hogy a feltételezetten antigént tartalmazó mintával közvetlenül vonjuk be a lapos fenekű mikrotiter lemezeket, és a lemezekhez közvetlenül adjuk a jelzett elsődleges antitestet. Mosás után meghatározzuk a vizsgált oldatban megmaradt jelzett antitest mennyiségét. A színt csökkenése a jelenlevő antigén mennyiségét jelzi.
2. példa
A natív szabad keresztkötések forrásai
A találmány szerinti mérés során standardként alkalmazható natív szabad keresztkötések eredetének meghatározása céljából számos nagy méretű állat vizeletét analizáltuk. A szarvasmarha eredetű vizeletben a Pyd/Dpd arány 12 +- 2 volt, és körülbelül csak 15 % szabad keresztkötést tartalmazott; birkáknál hasonló eredményt kaptunk, azzal az eltéréssel, hogy a szabad keresztkötések mennyisége 20-25 %. A sertés eredetű vizeletben a Pyd/Dpd arány 5 +- 1 körüli érték, és a szabad keresztkötések aránya az összeshez képest 42 +- 5 %. A szabad keresztkötések koncentrációja Pyd-re nézve 380 nM, és Dpd-re nézve 70 nM.
Úgy tűnik, hogy a gyerekek vizelete több Dpd-t
-37»··: ···; .: . · · : ·..· .:· tartalmaz, mint a felnőtteké. A sertés vizeletben némi kedvező Dpd csökkenés lép fel, amikor a tisztítási eljárás során CF-1 cellulózt alkalmazunk, és a Pyd teljes visszanyerése a Pyd-re nézve 40-50 %, míg az U-Dpd-re nézve csak 20 %. Amennyiben kiindulási anyagként gyerekek vizeletét alkalmazzuk, minden keresztkötésre nézve körülbeül 55 % a visszanyerés.
Ennek megfelelően mind a gyerekek, mind a sertések vizelete a szabad keresztkötés standardok megfelelő forrásának bizonyult.
Amint fent elmondtuk, a keresztkötések hozama a natív szabad keresztkötésekre jellemző diasztereomer formák esetén az említett forrásokban levő összes keresztkötés felszabadításával fokozható, enzimes hidrolizálási eljárással, mint például exopeptidázok, vagy glikozidázok alkalmazásával.
3. példa
A Pvd/Dpd aránya humán szövetekben
A különböző szövetek sorozatának analízise azt mutatta, hogy a kortikális csont keresztkötés tartalma valamivel magasabb, mint a trabekuláris csonté, körülbelül 4.2 körüli érték. Bár a Dpd-t a porcban nem detektáltuk, a keresztkötés az aortában, és az ínszalagokban jelen volt.
-384. táblázat
Szövetek
Pyd
• ·
Dpd (gyök/molekula)
| Artíkuláris porc | 15 | 1.47 +- 0.23 | N.D. |
| Kortíkális csont | 15 | 0.35 +- 0.09 | 0.08 +- 0.02 |
| Trabekuláris csont | 7 | 0.26 +- 0.08 | 0.06 +- 0.02 |
| Aorta | 14 | 0.30 +- 0.07 | 0.07 +- 0.01 |
| Invertebrális korong | 25 | 1.14 +- 0.11 | N.D. |
| ínszalagok | 10 | 0.47 +- 0.35 | 0.05 +- 0.03 |
Mind a Pyd, mind a Dpd teljes mértékben hiányzott a normál bőr kollagénekből, és az éretlen, valamint az újonnan szintetizált kollagénekben sem volt jelen.
4. példa
A szabad keresztkötések meghatározása oszteoporózisban (osteoporosis) szenvedő betegek vizeletében posztmenopauzális, gerinctörésben (vertebral fractures) szenvedő (I típusú oszteoporózis), 53-74 év közötti nőt vizsgáltunk meg. Mindegyiküknek ágyéktáji orsócsont ásványi érzékenysége (lumbar spin boné mineral • ·
-392 density) a 0.98 g/cm küszöb érték alatt volt, amint azt duál-foton abszorpciometriával (dual-photon absorptiometry) meghatároztuk, és a spin radiográfok (spin radiographs) három vagy több 1. törési fokozatban, illetve egy vagy több
2. törési fokozatban szenvedő beteget mutattak. Az oszteoporőzis egyéb másodlagos okozóját nem azonosítottuk.
Kontroll csoportként 67 posztmenopauzális nőt vizsgáltunk meg, koruk 65 +- 6 év volt (főérték +- SD) . Mindegyik nőnél normális spin radiográfokát kaptunk, és ágyéktáji orsócsont ásványi érzékenységük a normális értéken belül volt. Egyikük sem volt beteg, és nem szedtek drogot, ami a csont metabolizmusát befolyásolhatta volna.
A hidroxiprolin mérése céljából a vizsgált egyéneket a vizsgálat előtt három napig zselatin-mentes diétán tartottuk. Az vizelet minták összegyűjtése után az aliquot mennyiségeket az analízisig -70°C-on tároltuk. Az összes keresztkötés mennyiségét a fent már ismertetett eljárással határoztuk meg [Black D. és társai, Anal Biochem (1988) 169:197-203; Seibel M. J. és társai J. Rheumatol (1989) 16:964-970]. A nem-hidrolizált vizelet U-Pyd, és U-Dpd tartalmának meghatározása céljából a minta 0.5 ml-es részleteit elválasztó kromatográfiával CF1 cellulózon közvetlenül dolgoztuk fel (ami elválasztja a három peptideredetű formát a HPLC lépés előtt; a HPLC-t úgy végeztük, mint a hidrolizált mintákon) Az vizelet savas hidrolizátumában a hidroxiprolint HPLC-vel mértük meg (Dawson C. és társai, [Clin Chem (1988) 34:1572-1574].
A natív szabad piridinium-keresztkötések, és az összes
-40hidroxiprolin vizeletből történő mérésének eredményeit a kontroll, és az oszteoporotikus csoport esetén az 5. táblázatban foglaltuk össze. Az eredmények szerint a csontspecifikus keresztkötések, az U-Dpd kiürülése az oszteoporotikus csoport esetén jelentősen magasabb, mint a kontroll csoportnál. <
5. táblázat
Oszteoporotikus csop. Kontroll csop.
| nmol/mmol nmol/24h kreatinin kreatinin | nmol/mmol | nmol/24h | |
| U-Pyd | 21.4+-6.6** 170+-47 | 18.4+-5.8 | 151+-49 |
| U-Dpd | 5.7+-2.0*** 45+-14*** | 4.6+-1.7 | 37+-13 |
| U-Pyd.Gál.Glc | 5.2+-2.1 41+-15 | 4.6 + -2.0 | 38+-16 |
| Hidroxiprolin | 21.4+-7.4** 175+-66 | 18.2+-6.7 | 156+-77 |
A megfelelő kontroll csoportokkal összehasonlítva a statisztikai szignifikancia (Student-féle t-teszt) az alábbi volt:
* p < 0.05; * * p < 0.01; * * * p < 0.001
A különbségek az U-Pyd-re nézve kisebbek voltak; a glikozilezett származék, az U-Pyd.Gál.Glc esetén kapott értékek nem különböztek jelentős mértékben. A lineáris regressziós analízis eredménye erőteljesen szignifikáns korrelációt mutatott a kreatinin arányban, és az összes U-
-41Pyd (r=0.80), valamint U-Dpd (r=0.82) teljes mennyiségének 24 órás kiürülése szerint kifejezett értékek között. Ez a megfigyelés megfelel annak az észrevételnek, mely szerint az egészséges hím, és nőnemű jelentkezők mindennapos keresztkötés kiürítésében nem volt szignifikáns változás (A. M McLaren és S. P. Robins, nem publikált eredmények).
Szignifikáns korrelációt tapasztaltunk az U-Dpd, és a hidroxiprolin között, ami az oszteoporotikus csoportnál jóval szembeszökőbb volt (r-0.53; p < 0.001), mint a kontroll csoportnál (r=0.21; N.S.). Az U-Dpd, és a hidroxiprolin közötti kapcsolat korrelációs koefficiense hasonló volt az oszteoporotikus csoport, és a kontrollok esetén, értéke r=0.45 (p < 0.001), illetve r=0.34 (p < 0.01) .
Mind az összes, mind a szabad keresztkötések vizsgálatának alávetett minták esetében a kapott értékek szignifikáns korrelációt mutattak. A deoxipiridinolin esetén a korrelációs koefficiens az oszteoporotikus csoportnál (n=25) 0.90 volt, míg a kontroll csoport esetén (n=24) 0.84;
piridinolinra nézve a megfelelő korrelációs értékek r=0.96, illetve r=0.85 voltak.
Claims (15)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. A találmány tárgya eljárás a kötőszövet metabolizmus rendellenességével járó betegségek jelenlétének' diagnosztizálására, azzal jellemezve, hogy az eljárás során a paciens biológiai eredetű folyadékában jelenlevő kollagén eredetű natív szabad keresztkötések szintjét összehasonlítjuk normális egyének hasonló keresztkötései szintjével, és így diagnosztizáljuk az említett keresztkötések szintjének növekedését, ami az említett rendellenesség jelenlétére utal.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett biológiai folyadékban meghatározzuk a csontképződés indikátorának szintjét, meghatározzuk a különbséget a natív szabad keresztkötések szintje és az említett indikátor szintje között, és ezt a különbséget összehasonlítjuk a normál egyéneknél kapott megfelelő különbséggel, így diagnosztizáljuk az említett keresztkötések szintjének növekedését, ami az említett rendellenesség jelenlétére utal.
- 3. Az 1., és a 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett biológiai folyadék szérum, vagy vizelet.
- 4. Az 1., és a 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett szabad keresztkötéseket mint összes natív szabad keresztkötéseket határozzuk meg.
- 5. Az 1., és a 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett szabad keresztkötéseket a Pydet, a Dpd-t, és a glikozilezett Pyd-et tartalmazó csoport részeként szelektáljuk.
- 6. Az 1., és a 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a natív szabad keresztkötések detektálását egy immunoassay-ben alkalmazzuk, melynek során a biológiai folyadékot, vagy ennek egy frakcióját egy antitestet, vagy annak egy immunológiailag reaktív fragmentumát tartalmazó készítménnyel hozzuk kapcsolatba, mely készítmény specifikusan immunoreaktív a natív szabad keresztkötésekkel.
- 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett az említett szabad keresztkötéseket mint összes natív szabad keresztkötéseket határozzuk meg.
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett szabad keresztkötéseket a Pyd-et, a Dpd-t, és a glikozilezett Pyd-et tartalmazó csoport részeként szelektáljuk.
- 9. A találmány tárgya egy antitesteket, vagy ezek immunológiailag reaktív fragmentumát tartalmazó készítmény, ·* Λ ”·· ·’*” ϊ · · ·....... ·-44azzal jellemezve, hogy az említett készítmény specifikusan immunoreaktív a Dpd-t, Pyd-et, Gal-Pyd-et, vagyGlc.Gal-Pyd-et tartalmazó csoportból szelektált egy, vagy több natív szabad keresztkötéssel.
- 10. A találmány tárgya egy monoklonális antitesteket, vagy ezek immunológiailag reaktív fragmentumait tartalmazó készítmény, azzal jellemezve, hogy az specifikusan immunoreaktív a Dpd-t, Pyd-et, Gal-Pyd-et, vagyGlc.Gal-Pyd-et tartalmazó csoportból szelektált egy, vagy több natív szabad keresztkötéssel.
- 11. A találmány tárgya egy antitesteket, vagy ezek immunológiailag reaktív fragmentumait szekteráló, elölt sejtvonal előállítása, azzal jellemezve, hogy az specifikusan immunoreaktív a Dpd-t, Pyd-et, Gal-Pyd-et, vagy Glc.Gal-Pyd-et tartalmazó csoportból szelektált egy, vagy több natív szabad keresztkötéssel.
- 12. A találmány tárgya eljárás monoklonális antitestek termelésére, azzal jellemezve, hogy azok specifikusan immunoreaktívak a Dpd-t, Pyd-et, Gal-Pyd-et, vagy Glc.GalPyd-et tartalmazó csoportból szelektált egy, vagy több natív szabad keresztkötéssel, és az eljárás az alábbi lépésekből áll:a.) a 11. igénypont szerinti antitesteket olyan körülmények között tenyésztjük, hogy azok az említettV * · •· • · « ···♦ .:. : *··* ·*·-45antitesteket szeklektálják, és az említett antitesteket visszanyerjük a sejttenyészetből, vagyb.) a 11. igénypont szerinti sejteket emlősökbe injektáljuk, és így az emlősök az említett antitesteket tartalmazó aszcitesz folyadékot (ascites fluid) termelnek, és az említett antitesteket visszanyerjük a aszcitesz folyadékból.
- 13. A találmány tárgya a biológiai folyadékban jelelevő - a Dpd-t, Pyd-et, Gal-Pyd-et, vagy Glc.Gal-Pyd-et tartalmazó csoportból szelektált - egy, vagy több natív szabad keresztkötés mennyiségének, vagy koncentrációjának meghatározására alkalmas kit, azzal jellemezve, hogy az konténerek sorozatát tartalmazza, melyek közül legalább egy egy antitestet, vagy ennek immunológiailag reaktív fragmentumát tartalmazó készítmény, mely specifikusan immunoreaktív az említett Dpd, Pyd, Gal-Pyd, vagy Glc.GalPyd közül eggyel, vagy többel, és legalább egy további reagenst tartalmaz az említett immunoassay kivitelezésére, valamint a mérés kivitelezéséhez szükséges utasításokat tartalmazza.
- 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további konténerek sorozatát tartalmazza, melyek közül legalább egy egy antitesteket, vagy ezek immunológiailag reaktív fragmentumát tartalmazó készítmény, mely specifikusan immunoreaktív a csontképződés egy, vagy több indikátorával.
- 15. A találmány tárgya eljárás a kötőszövetek, például a porc bomlásának meghatározására, azzal jellemezve>',-hogy az eljárás az alany biológiai folyadékában levő Pyd/Dpd arány meghatározásából áll, ahol az említett alanynál kapott aránynak a normállal szemben mutatott növekedése az említett alanyban a kötőszövetek lebomlását jelzi.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB898929366A GB8929366D0 (en) | 1989-12-30 | 1989-12-30 | Method to detect connective tissue disorder in humans and animals |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9202178D0 HU9202178D0 (en) | 1992-10-28 |
| HUT64421A true HUT64421A (en) | 1993-12-28 |
Family
ID=10668604
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9202178A HUT64421A (en) | 1989-12-30 | 1990-12-28 | Method for detecting irregularities of bone and other connective tissues in human beings and in animals |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5700693A (hu) |
| EP (2) | EP0618448B1 (hu) |
| JP (3) | JPH087212B2 (hu) |
| KR (1) | KR0138503B1 (hu) |
| AT (2) | ATE191976T1 (hu) |
| AU (2) | AU648774B2 (hu) |
| BR (1) | BR9007969A (hu) |
| CA (2) | CA2069611C (hu) |
| DE (2) | DE69019375T2 (hu) |
| DK (1) | DK0507831T3 (hu) |
| ES (2) | ES2071979T3 (hu) |
| FI (1) | FI923028A (hu) |
| GB (1) | GB8929366D0 (hu) |
| GR (1) | GR3016998T3 (hu) |
| HU (1) | HUT64421A (hu) |
| NO (1) | NO304760B1 (hu) |
| WO (1) | WO1991010141A1 (hu) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6121002A (en) * | 1990-12-26 | 2000-09-19 | The Rowett Research Institute | Method to detect bone and other connective tissue disorders in humans and animals |
| GB9202139D0 (en) * | 1992-01-31 | 1992-03-18 | Sandoz Ltd | Improvements in or relating to organic compounds |
| EP0561297B1 (en) * | 1992-03-19 | 1998-10-14 | Hoechst Marion Roussel, Ltd. | Tissue antigen and diagnostic method for human osteoporosis using the same |
| US5620861A (en) * | 1992-07-31 | 1997-04-15 | Metra Biosystems, Inc. | Method and kit for pyridinium crosslink assay |
| US5527715A (en) * | 1992-07-31 | 1996-06-18 | Metra Biosystems, Inc. | Method and kit for pyridinoline assay |
| AU2481992A (en) * | 1992-08-28 | 1994-03-29 | Rowett Research Institute, The | Method to monitor drug therapy and assess metastasis |
| US5756361A (en) * | 1992-12-17 | 1998-05-26 | Metra Biosystems, Inc. | Screening method for periodontal disease |
| US5736344A (en) * | 1992-12-17 | 1998-04-07 | Metra Biosystems, Inc. | Serum pyridinium crosslinks assay |
| JPH0792165A (ja) * | 1993-09-21 | 1995-04-07 | Hoechst Japan Ltd | 骨粗鬆症診断剤 |
| US5661039A (en) * | 1995-03-01 | 1997-08-26 | Metra Biosystems, Inc. | Perspiration assay for bone resorption |
| JP2001512143A (ja) * | 1997-07-31 | 2001-08-21 | メトラ バイオシステムズ， インコーポレイテッド | コラーゲン−ペプチドアッセイ法 |
| US6033918A (en) * | 1997-11-10 | 2000-03-07 | Bayer Corporation | Method and device for the detection of analyte in a fluid sample |
| EP1064554A1 (en) * | 1998-03-27 | 2001-01-03 | Markus Seibel | Determination of the probability of bone metastases in patients with primary carcinomas |
| US6197592B1 (en) * | 1999-07-15 | 2001-03-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Clinical control materials for detection of bone resorptive markers |
| WO2002029409A2 (en) * | 2000-10-03 | 2002-04-11 | Rowett Research Institute | Method of assaying pyrrole-containing biological compounds |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5300434A (en) * | 1987-11-06 | 1994-04-05 | Washington Research Foundation | Hybridoma cell line producing an antibody to type-I collagen amino-terminal telopeptide |
| US4973666A (en) * | 1987-11-06 | 1990-11-27 | Washington Research Foundation | Peptide fragments containing HP and LP cross-links |
| US5283197A (en) * | 1988-06-25 | 1994-02-01 | The Rowett Research Institute | Method of monitoring collagen degradation |
| GB8815174D0 (en) * | 1988-06-25 | 1988-08-03 | Rowett Research Inst | Method of monitoring collagen degradation |
| GB8927377D0 (en) * | 1989-12-04 | 1990-01-31 | Univ Edinburgh | Improvements in and relating to amperometric assays |
| US5620861A (en) * | 1992-07-31 | 1997-04-15 | Metra Biosystems, Inc. | Method and kit for pyridinium crosslink assay |
| FI106326B (fi) * | 1996-09-23 | 2001-01-15 | Tellabs Oy | Kytkentä kaiunpoistavan moninopeusmodeemin sovittamiseksi linjalle sekä kytkentämenetelmä |
-
1989
- 1989-12-30 GB GB898929366A patent/GB8929366D0/en active Pending
-
1990
- 1990-12-28 ES ES91901884T patent/ES2071979T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-28 DE DE69019375T patent/DE69019375T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-28 BR BR909007969A patent/BR9007969A/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-12-28 CA CA002069611A patent/CA2069611C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-28 DE DE69033511T patent/DE69033511T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-28 WO PCT/GB1990/002030 patent/WO1991010141A1/en active IP Right Grant
- 1990-12-28 EP EP94108293A patent/EP0618448B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-28 AT AT94108293T patent/ATE191976T1/de active
- 1990-12-28 EP EP91901884A patent/EP0507831B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-28 JP JP3502284A patent/JPH087212B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-28 ES ES94108293T patent/ES2147761T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-28 HU HU9202178A patent/HUT64421A/hu unknown
- 1990-12-28 AU AU70659/91A patent/AU648774B2/en not_active Expired
- 1990-12-28 AT AT91901884T patent/ATE122467T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-12-28 DK DK91901884.6T patent/DK0507831T3/da active
- 1990-12-28 CA CA002271544A patent/CA2271544C/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-06-29 NO NO922084A patent/NO304760B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-06-30 FI FI923028A patent/FI923028A/fi unknown
- 1992-06-30 KR KR92701562A patent/KR0138503B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-07-21 AU AU68648/94A patent/AU682188B2/en not_active Expired
-
1995
- 1995-06-06 US US08/471,364 patent/US5700693A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-06 US US08/485,823 patent/US5700694A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-02 GR GR950402115T patent/GR3016998T3/el unknown
-
1997
- 1997-04-30 JP JP11243097A patent/JP3224356B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-07-05 JP JP2000204308A patent/JP2001050958A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2139541C1 (ru) | Способы определения разрушения коллагена in vivo и наборы для осуществления способов, гибридома, моноклональное антитело и его фрагмент, пептиды, происходящие из коллагена, и способ анализа | |
| JP3790727B2 (ja) | 体液中のコラーゲン断片を測定する方法、該方法を実施するためのテストキット及び手段、並びにコラ−ゲンの代謝に関連する疾患の存在を診断するために該方法を使用する方法・用途 | |
| HUT64421A (en) | Method for detecting irregularities of bone and other connective tissues in human beings and in animals | |
| US6210902B1 (en) | Estimation of the fragmentation pattern of collagen in body fluids and the diagnosis of disorders associated with the metabolism of collagen | |
| AU752227B2 (en) | Collagen-peptide assay method | |
| US6117646A (en) | Assaying protein fragments in body fluids | |
| EP0787301B1 (en) | Estimation of the fragmentation pattern of collagen in body fluids and the diagnosis of disorders associated with the metabolism of collagen | |
| JPH0780913B2 (ja) | 完全無傷なプラコラーゲンペプチド（▲ｉｉｉ▼型）およびプロコラーゲン（▲ｉｉｉ▼型）の選択的な免疫学的測定法 | |
| US6121002A (en) | Method to detect bone and other connective tissue disorders in humans and animals | |
| WO1996027134A1 (en) | Perspiration assay for assessing bone resorption | |
| US6420125B1 (en) | Assaying fragments of collagen in body fluids | |
| Robins | Biochemical markers of bone resorption | |
| Robins | Biochemical markers of bone turnover | |
| US20100233737A1 (en) | Marker specific to an oxidative degradation of tissues containing type iii collagen, means and methods and kits for the diagnosis, monitoring or prognosis of pathologies targeted by this marker | |
| KR100460292B1 (ko) | 체액중의단백질파편검정 | |
| JPH10300749A (ja) | コラーゲン断片を認識する抗体 | |
| WO1994006015A1 (en) | Method to monitor drug therapy and assess metastasis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFC4 | Cancellation of temporary protection due to refusal |