NO304760B1 - Fremgangsmaate for aa paavise ben- og andre bindevevsforstyrrelser hos mennesk og dyr et immunanalyse sett for bruk i fremgangsmaten og et monoklonalt antistoff - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår fremgangsmåter for diagnose innen medisin og veterinærmedisin. Mer spesifikt angår den fremgangsmåter for å vurdere ben- og annen bindevevsmetabolisme ved å påvise frie tverrbindinger som ble dannet ved kollagennedbrytning i biologiske fluider slik som urin. Oppfinnelsen angår også et immunanalysesett for bruk i fremgangsmåten, samt et monoklonalt antistoff.

Forbindelsen av kollagen som et hovedstrukturelt materiale i en lang rekke vev, inkludert ben, brusk, hud, sener, tannben og forskjellige myke vev er velkjent. Det er også kjent at fiberstrukturen i kollagen blir stabilisert ved tverrbinding. Tilstedeværelsen av fluorescerende pyridinringsystem som en ikke-reduserbar tverrbinding i kollagen ble rapport av Fujimoto, D. , et al., J. Biochem (1978) 83:863-867. Fujimoto-dokumentet rapporterte isolering av et fluorescerende peptid fra pronasespalting av bovin Achilles-sene kollagen. Isolert hydrolysert pyridinolin (Pyd) ble antatt å inneholde tre residier hydroksylysin og det ble erkjent at forut for hydrolyse ble peptidfragmentene knyttet til pyridinolindelen. Ytterligere arbeid på karakterisering ble gjennomført av Gunja-Smit, Z., et al., Biochem J. (1981) 197:759-762, ved å anvende hydrolysert urin og det ble angitt fordel ved tilstedeværelsen av pyridinolin i urin av Robins, S.P., Biochem J. (1982)207:617-620, som knyttet pyridinolin som ble oppnådd fra hydrolysert urin til en bærer for å øke antallet antistoffer. Antistoffene ble deretter benyttet i en immunoanalyse for å bestemme konsentrasjonen av pyridinolin i hydrolysert urin. Fremgangsmåten ble beskrevet av Robins for å skaffe tilveie en indeks på degradering av visse former for moden kollagen ved analyse av fysiologiske fluider.

I alt det foregående ble hydrolysater benyttet for å oppnå samlet pyridinolin siden mye av tverrbindingen beholdt peptidutstrekningen til hydroksylysylresidiene som var ansvarlig for dannelsen. For således å oppnå en homogen fremstilling som inneholder pyridinringen, var et preliminært hydrolysetrinn nødvendig.

I 1982 ble det fastslått at det var to veier for tverrbind-ingsdannelse avhengig av om lysin eller hydrolysinresidiene var tilstede i telopeptider som disse tverrbindingene var avledet fra (Robins, S.P., i "Collagen in Health and Disease"

(1982) Weiss, J.B., et al., sidene 160-178, Churchill Livingstone, Edinburgh). Dette ble fastslått som resultat i en spesifikk tverrbinding der i mykt vev, slik som hud, ble reduserbare aldiminbindinger dannet fra oksyderte lysyl-residier. I brusk og ben vil disse bindingene, som til å begynne med var dannet fra hydroksylysinaldehyder, gjennomgå en spontan rearrangering til mer stabile oksoimintverrbind-inger. Disse bindingene gjennomgår videre reaksjon for å danne 3-hydroksypyridin tverrbindinger. Den stabilt tverrbindende pyridinolinanalogen som involverer lysin heller enn hydroksylysin i helliksdelen ble identifisert og kvantifisert av Ogawa, T., et al, Biochem Biophys Res Commune

(1982) 107:1251-1257; Eyre, D.R., et al., Anal Biochem (1984) 1237:380:388, og betegnet deoksypyridinolin (Dpd). Dette materialet ble deretter antatt å være begrenset til benkollagen, selv om mengdene varierte mellom artene.

Videre arbeid av Robins, S.P. Biochem J. (1983) 215:167-173, skaffet tilveie bevis for eksistens av glykolysert pyridinolin i ben. Robins foreslo en struktur som viste avledningen av ringen fra tre residier hydroksylysin og viste også at alkalihydrolysater av kollagen skaffet tilveie et 0-galakto-sylderivat substituert i sidekjede hydroksygruppen. Da dette materialet er ekstremt labilt for mild syrebehandling, vil dette materialet ikke være tilstede i prøver av hydrolysert vev eller kroppsfluid.

Fujimoto, D., et al., J. Biochem (1983) 94:1133-1136, kromatograferte uhydrolysert urinprøver og viste at 3-hydroksypyridinringdelen var tilstede i en vesentlig del som "fri" form, dvs. de tre hydroksylysyl-avledede residiene som den var sammensatt av, inneholdt ikke ytterligere peptidforlengelser. I aminosyreanalyse der pyridinolin isolert fra et surt hydrolysat av kollagen ga en asymmetrisk topp, ga "fri" urinpyridinolin en symmetrisk topp. Forfatterne konkluderte at dette skyldes isomerisering ved epimerisering av hydroksylysindelen i pyridinolinsystem under hydrolyse. I tillegg ble forhold av nivåer av total pyridinolin (etter hydrolyse) til alder bestemt i dette arbeidet som et forhold til kreatininnivåer. Det ble funnet at forholdet var høyt i urin hos barn, men avtok med alder inntil veksten avtok. Det ble videre funnet at dette forholdet er relativt konstant hos voksne, men øker svakt ved høyere alder. Forfatterne spekulerer i at dette kan stemme overens med tap av benmasse som ble observert hos eldre.

Forsøk ble også gjort for å få karakterisere de ovenfor-nevnte peptidforlengelsene. Robin, S.P., et al., Biochem J.

(1983) 215:175-182, foreslo at i brusk-avledet type II kollagen, binder pyridinolin to C-terminale telopeptidkjeder med en enkelt kjede av det heliske peptidet. En ytterligere pyridinolintverrbinding, dvs. med ringen derivatisert til andre peptider, var antatt å knytte to N-terminale ikke-heliske peptider med en tredje kjede i den heliske delen av molekylet. Disse studiene ble gjennomført ved isolering av fluorescerende pyridinolintverrbindinger fra vev ved spesifikk kløyving med CNBr, og bevarer således peptidsekven-sene som forlengelser på hydroksylysinresidiene som danner ringen. Tverrbindingen ble lokalisert i kollagenfibre ved bestemmelse av aminosyresekvensene til disse forlengelsene.

I et dokument med tilsvarende problemstilling som den i Robins (over), Wu, J.J., et al., Biochemistry (1984) 23:1850-1857, ble det gjennomført CNBr-kløyving av moden brusk og det ble bestemt sekvensen til peptidforlengelseresidiene i hydroksy-lysyldeltagerne i pyridinringen. Konklusjonen var den samme som i Robins.

Robins, S.P., et al., Biochim Biophys Acta (1987) 914:233-239, anvendte CNBr-spalting av benavledet kollagen for å lokalisere tverrbinding i type I kollagenstruktur. Forfatterne konkluderte at andelen av tverrbinding avledet fra lysin og den som var avledet fra hydroksylysin var tilstede i de samme andeler i hver av de isolerte peptidf ormene. De konkluderte også at dette viste at disse to tverrbindings-analogene okkuperer samme loci i kollagenfiber og at formen tilsynelatende er avledet fra en lysyldeltager som synes å fremkomme gjennom ufullstendig hydroksylering av passende lysinresidier i heliksen. Aminosyreanalyse indikerer at tverrbindingene må være plassert i to lokaliseringer som involverer både N- og C-terminale telopeptidregioner.

Henkel, W., et al., Eur J. Biochem. (1987) 165:427-436, bestemte aminosyresekvensene som er forbundet med tverrbinding i type I kollagen isolert fra aorta. Disse sekvensene er forskjellige fra de som ble oppnådd i type II kollagen. Tilsvarende resultater ble funnet av Eyre, D.R., et al., FEBS

(1987) 2:337:341 som demonstrerte at tverrbinding fra typelX°g "tyPe II kollagener utviser forskjellige peptider knyttet til pyridinolintverrbindingene.

PCT-søknad W089/04491 til Washington Research Foundation foreslår en urinanalyse for å måle benresorpsjon ved påvisning i urinen av spesifikke tverrbindinger, som er kjennetegnet ved deres peptidforlengelser, forbundet med benkollagen. Analysen bygger på kvantifisering av konsen-trasjnen av peptider i et kroppsfluid der peptidfragmentene har en pyridintverrbinding som er avledet fra benkollagen-resorpsjon. To spesifikke entiteter som har peptidforleng-else som er antatt å være forbundet med benkollagen er beskrevet. Disse blir oppnådd fra urinen hos pasienter som lider av Pagets sykdom, en sykdom kjent å medføre høye hastigheter på bendannelse og destruksjon.

Macek, J. , et al., Z. Rheumatol (1987) 46:237:240, foreslår en analyse for osteoartrltt som avhenger av peptider som er forbundet med tverrbindingene fra kollagennedbrytning. I denne problemstillingen ble urinprøven størrelses-separert for peptider med molekylvekter større enn 10 kd, og disse peptidene ble deretter separert ved HPLC ved å anvende en fluorescensdetektor ved å bestemme de fraksjonene som inneholder fluorescensen som skyldes pyridinringen. Spektra oppnådd fra pasienter med osteoartritt ble sammenlignet med de fra friske pasienter, og det ble enkelt demonstrert at størrelsen på fluorescenstoppen som var forbundet med den syke forstyrrelsen, var fraværende hos den friske pasient-delen. Urin fra den samme syke pasienten to uker etter total endoprotese av den syke hoften, derved en nedgang i produktene fra osteoartritt, ga videre et spektrum med fluorescente topper som lignet mer den til normale. Videre ble osteoartrittspektrumet raskt adskilt fra det som ble oppnådd fra pasienter med rheumatoid artritt. Nærmere likhet mellom rheumatoid artrittspektrum og spektrum fra normale kontroller blir av forfatterne angitt å skyldes høyere aktivitet av protease i rheumatoid artritt. Dette ble antatt å skyldes spaltede kollagenstrukturer i mindre fragmenter som ikke kunne påvises i deres system.

Studie av forhøyede nivåer av total 3-hydroksypyridinring-tverrbindinger i hydrolysert urin i pasienter med rheumatoid artritt har også blitt foreslått som en fremgangsmåte for å diagnostisere denne sykdommen av Black, D., et al., Annals of Rheumatic Diseases (1989) 48:641-644. Nivåene av "hydrolysert" tverrbinding for pasienter med rheumatoid artritt

(uttrykt som et forhold av denne forbindelsen til kreatinin)

ble forhøyet med en faktor på 5 sammenlignet med kontroller. I denne fremgangsmåten ble tverrbindinger avledet fra hydroksylysin adskilt fra de avledet fra lysin; bare hydroksylysin-avledede tverrbindinger øket målbart. I en mer omfattende studie som anvendte hydrolyserte uriner, viser Seibel et al., J. Rheumatol (1989) 16:964-970 betydelig

økning i utskillelse av ben-spesifikke tverrbindinger relativt til kontroller i rheumatoid og osteoartritt, men mest markerte økninger for hydroksylysin-avledet pyridin var det hos pasienter med rheumatooid artritt.

Selv om målinger som angår tilstedeværelse av kollagen-avledede tverrbindinger har blitt anvendt som indisier på nedbrytning av spesifikke kollagentyper, som inkluderer ben, har i motsatt fall anstrengelser blitt gjort for å identifisere markører på bendannelse. Delmas, P.D., et al., J. Bone Mineral Res (1986) 1:333-337, anvendte nivået på GLA-protein i serum som en markør for bendannelse hos barn; den samme gruppen, Bronw, J.P., et al., anvendte en tilsvarende analyse for å bestemme bendannelse i post-menopausal osteoporose (Lancet (1984) 1091-1093).

Det er mange tilstander i mennesker og dyr som er kjennetegnet ved ved et høyt nivå av benresorpsjon og av unormal balanse mellom bendannelse og benresorpsjon. Blant de best kjente av disse er osteoporose og Pagets sykdom. Unormal-iteter i benmetabolisme forekommer imidlertid innenfor en lang rekke andre tilstander som innbefatter utvikling av godartede og maligne tumorer i ben og metastasekanser som har blitt overført til benceller for eksempel fra prostata eller brystinitielle tumorer. Andre tilstander innbefatter osteopetrose, osteomalasiale sykdommer, rakitt, unormal vekst hos barn, renal osteodystrofi og en medikament-indusert osteopeni. Uregelmessigheter i benmetabolismen er også sideeffekter av tyroidbehandlinger og tyroidtilstander i seg selv, slik som primær hypotyroidisme og tyrotoksikose så vel som Cushings sykdom. Det vil være nyttig å ha en diagnose som raskt gjenkjenner en forsøkspersons tilstand som en uregelmessighet i benmetabolisme, selv uten å definere det nøyaktige syndrom blant de mulige valg slik som de som er opplistet her. Ytterligere undersøkelser med forskjellige kjente bensykdommer kan bli gjennomført med en gang det er blitt etablert at dette er undermengden av problemer som diagnosen vil utgå fra.

Oppfinnelsen skaffer tilveie en slik screeningstest som er generell for benmetabolisme-abnormiteter.

Oppfinnelsen skaffer tilveie en direkte og ikke-angripende, hvis ønskelig, test for å identifisere forsøkspersoner som hare tilstander som er kjennetegnet ved abnormiteter ved dannelsen og resorpsjon av ben og balansen mellom dem. Testen er basert på kvantifiseringen av nativ fri pyridinolin eller deoksypyridinolin tverrbindinger avledet fra kollagennedbrytning som er tilstede i biologiske fluider slik som serum og urin. Testen er spesifikt rettet mot hver av eller begge former for tverrbindinger som forekommer i slike fluider i former uavhengig av ytterligere aminosyresekvenser som er forbundet med kondensert lysyl eller hydroksylysyl-residier som utgjør de kollagenavledede tverrbindingene.

Således angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for å overvåke eller diagnostisere tilstedeværelse av en forstyrrelse som er forbundet med en bindevevs metabolisme-abnormalitet, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter sammenligning av nivået av native frie tverrbindinger avledet fra kollagen i et ikke-hydrolysert biologisk fluid fra et menneskelig subjekt med nivået av nevnte tverrbindinger i normale subjekter slik at man kan diagnostisere et subjekt som har et forhøyet nivå av tverrbindinger som viser tilstedeværelse av forstyrrelsen, der tverrbindingene blir valgt fra nativ peptid-fri ikke-glykosylert pyridinolin (N-Pyd), nativ peptid-fri deoksypyridinolin (N-Dpd), eller summen av N-Pyd og N-Dpd.

Denne fremgangsmåten kan bli fin-justert ved bestemmelse av nivået av disse degraderingsproduktene sammenlignet med indikatorer på bendannelse. Ytterligere informasjon når det gjelder tilstanden til personen kan bli oppnådd hvis det ble funnet at forskjellen mellom nivået på benresorpsjon, som er kjennetegnet ved tilstedeværelsen av native frie tverrbindinger i biologiske fluider, og nivået av bendannelse, som er kjennetegnet ved nivået på indikator, er likt eller forskjellig fra det hos normale personer. De som lider av sydkommer som uttømmer skjelettstrukturen er generelt kjennetegnet ved større forskjeller mellom resorpsjon og dannelseshastighet, der resorpsjon dominerer.

Det har blitt funnet i oppfinnelsen at antistoffer som binder til hydrolyserte frie tverrbindinger som ble oppnådd fra vev eller biologiske fluider ved behandling med syrer ikke er tverr-reaktive med native frie tverrbindinger - hverken de som inneholder en lysylsidekjede eller de med en hydroksyly-sylsidekjede. Antistoffer kan imidlertid bli fremstilt og disse er spesifikke for de frie tverrbindingene. Disse antistoffene trenger ikke å være tverr-reaktive med hydrolyserte former; når formålet er å bestemme biologiske prøver direktef gjør dette ikke noe ved at de hydrolyserte former ikke er tilstede. Disse antistoffene kan bli fremstilt hvis ønskelig slik at det adskilles mellom lysyl og hydroksylysyl-sidekjede-inneholdende native frie tverrbindingsformer. Basert på tidligere erfaring med polyklonale antistoffer vil hydrolysert pyridinolin sannsynligvis skille mellom de tre formene og native peptidinneholdende former.

Således er et annet trekk ved oppfinnelsen rettet mot antistoffer som spesifikt er immunoreaktive med native frie tverrbindinger eller med enten lysyl eller hydroksylysyl-formene av native frie tverrbindinger, eller med glykosylerte former derav.

Et annet trekk ved oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å identifisere undermengder av artrittsykdommer ved å bestemme nedbryting av andre bindevev, inkludert brusk, der metoden omfatter bestemmelse av forholdet mellom hydroksylysylside-kjede tverrbindinger til lysylsidekjede tverrbindinger

(Pyd/Dpd) i et biologisk fluid til en person og sammenligne nevnte forhold med det i normale kontroller, der en økning i nevnte forhold i nevnte personer i forhold til normale kontroller indikerer brusknedbrytning i nevnte person.

Et annet trekk ved en fremgangsmåte for å bestemme tilstedeværelsen av en indikator på bindevevdannelse, som i kombinasjon med frie tverrbindingsniåver, tilveiebringer en bestemmelse av personens metabolske tilstand.

Et ytterligere trekk ved oppfinnelsen skaffer tilveie et sett for immunoanalysebestemmelse av en mengde eller konsentrasjon av native frie tverrbindinger i et biologisk fluid, der tverrbindingene blir valgt fra N-Pyd og N-Dpd, for bruk i fremgangsmåten, kjennetegnet ved at den omfatter et sett av beholdere der minst en av disse inneholder en sammensetning som inneholder et antistoff eller immunologisk reaktivt fragment derav, hvori sammensetningen er spesifikt immunoreaktiv med en eller flere av de valgte tverrbindinger, og minst en av disse beholderene inneholder et ytterligere reagens for å gjennomføre immunoanalysen sammen med instruk-sjoner for å gjennomføre nevnte analyse.

Fig. 1 viser en kromatografisk skisse av pyridinolin oppnådd fra et surt hydrolysat som var lagt på et spor av pyridinolin oppnådd uten hydrolyse fra urin. Figuren sammenligner videre elueringsmønster som er bestemt ved fluorescens med eluer-ingsmønster som er bestemt ved reaksjon med anti-pyridinolin antistoff fremstilt fra hydrolysat.

Oppfinnelsen skaffer tilveie en forbedring i forhold til de nåværende tilgjengelige fremgangsmåtene for å diagnostisere benforstyrrelser eller andre sykdommer som er kjennetegnet ved abnormiteter i kollagenmetabolisme. Fremgangsmåten i oppfinnelsen utnytter variasjoner i nivåene av kollagen-avledet pyridin tverrbindinger i biologisk fluid som en indeks på disse abnormitetene. Metoder fra kjent teknikk har involvert hydrolyse av en prøve, for eksempel urin, for å fremskaffe en analytt i form av hydrolyserte tverrbindinger, frie for peptidtverrbindinger, som kan bli kvantifisert i en immunoanalyse ved å anvende antistoffer som er oppstått med hensyn på hydrolyserte tverrbindinger.

Det har blitt funnet ifølge oppfinnelsen at antistoffer som øker med hensyn på hydrolyserte former av pyridintverrbinding ikke kryss-reagerer hverken med de frie tverrbindinger som er tilstede i urin eller andre biologiske fluider, eller med disse tverrbindingene konjugert til peptider forut for hydrolyse. Antistoffene som for tiden er tilgjengelige innenfor fagområdet kan således ikke bli anvendt direkte med en ubehandlet biologisk prøve.

Foreliggende oppfinnelse overvinner denne ulempe ved å skaffe tilveie reagenser som kan bli reagert direkte med den biologiske prøve for å bestemme tverrbindingene som er tilstede i den frie formen som diastereomeren som er tilstede forut for hydrolyse. Som vist i eksemplene under, frembringer direkte måling av disse frie og uhydrolyserte tverrbindingene data som kan sammenlignes med de som kan oppnås bare gjennom nåværende tilgjengelige, mer komplekse analyser.

Noe bakgrunnsinformasjon når det gjelder tverrbindingsstruk-turer som er involvert, vil være nyttig:

Egenskapene til tverrbindingene

Forkortelsene DpD og Pyd vil bli anvendt for å betegne de to kjente formene av isolerte tverrbindinger selv. Pyd eller pyridinolin refererer til tverrbindinger dannet der ringen N er E amino til et lysylresidie; Dpd eller deoksypyridinolin refererer til tverrbindinger som blir dannet der ringen N er E amino til et hydroksylysylresidie. (Forskjellige metoder på å betegne disse variasjoner har blitt anvendt; for eksempel har EP blitt anvendt til å betegne "hydroksylysyl"- formen, og LP har blitt anvendt til å referere til "lysyl"-formen.

Spesifikt er DpD antatt å representere forbindelsen med formelen: og Pyd er antatt å beskrive forbindelsene med formelen:

Man kan se at begge former for tverrbindinger er 1,4,5 trisubstituerte 3-hydroksypyridinresider. Pyd har en fri hydroksylgruppe på sidekjeden som kan bli glykosylert, og det er kjent at den er glykolysert i noe vev. Glykosyleringen er labil mot syre, og også mot base, men i en mindre grad. Pyc har blitt vist å forekomme som Gal-Pyd; foreliggende oppfinnelse har også demonstrert tilstedeværelsen av Gle.Gal-Pyd i urin (se PCT-søknad WO 89/00715). Disse formene foi frie Pyd har henholdsvis acetalene

konjugert til sidekjedehydroksyl.

Man kan se Dpd inneholder tre kirale sentra - de i de tre a-amino posisjonene i sidekjedene. Pyd inneholder fire slike sentre da det er et ytterligere kiralt senter i sidekjede-hydroksylposisjonen. I uhydrolyserte prøver, enten derivatisert ytterligere til peptider eller ikke, er de tre a-amino-gruppene avledet fra de nativt forekommende L-enantiomerene, og OH er i en konfigurasjon som også er bestemt ved det biologiske systemet.

Som fremsatt i avsnittet over, er en vesentlig andel av tverrbindingene tilstede i urin (ca. 4056 hos voksne) i form av "frie" tverrbindinger - dvs. det er ingen peptidkjeder konjugert til Pyd, glykolysert Pyd eller Dpd strukturer som er vist over, selv før hydrolyse av prøven er gjennomført. Således med "fri" tverrbinding menes forbindelser med formlene som er vist over.

Det skal bemerkes at med hensyn på Pyd og Dpd, er kiral i teten til de kirale sentrene ikke spesifisert. Således refererer "fri" til de tverrbindingene som har eller ikke har blitt utsatt for hyhrolysebetingelser. Foreliggende arbeid demonstrerer at disse "frie" tverrbindingene adskiller seg i kiralitet som har blitt oppnådd i deres "native" form, sammenlignet med deres "hydrolyserte" form. Som brukt her, refererer "native frie" tverrbindinger til Dpd eller Pyd eller deres glykolyserte former som de forekommer i fri form i den biologiske prøven; "hydrolyserte frie" tverrbindinger refererer til de strukturene som forekommer i hydrolysater. Da glykosidiske bindinger er labile for hydrolysebetingelser, vil naturligvis "hydrolyserte frie" tverrbindinger ikke inneholde sukker.

Da native frie tverrbindinger er produktet fra det biologiske systemet, er det antatt at biologisk gunstig kiralitet foregår i alle tre eller fire kirale sentrene. Antageligvis er de tre kirale sentrene som er representert ved cx-amino-gruppene i sidekjedene i L-konfigurasjon, som i naturlig forekommende aminosyre, og kiraliteten til karbonet som inneholder sidekjedehydroksyl i Pyd er også representativ på en enkel konfigurasjon. Dette blir bekreftet av resultatene som er vist i fig. 1, der den stiplede linjen representerer resultatet fra ione-byttekromatografi på sulfonerte poly-styrenkuler (7 u) ekvilibrert med natriumcitrat gjennomført med tidligere isolert Pyd i sin native frie form. Som man kan se i fig. 1, eluerer Pyd isolert direkte fra urin ved en enkel topp. Dette er i overensstemmelse med tilstedeværelsen av bare en enkel diastereomer.

Etter hydrolyse eluerer den hydrolyserte frie Pyd som en blanding, som er vist ved heltrukken linje i fig. 1. Dette er i overensstemmelse med racemiseringen av de kirale sentrene for å oppnå en blanding av diastereomerer som ikke lenger utviser identisk kromatografisk oppførsel. Tilsvarende resultater ble oppnådd ved å sammenligne nativ fri Dpd med hydrolysert fri Dpd.

"Native frie" tverrbindinger adskiller seg således fra hydrolyserte frie former med tverrbindinger. Det synes at under konvensjonell sur hydrolyse forekommer racemisering som

endrer konfigurasjonen til noen av molekylene. Bedring i utbytte av totale "native frie" tverrbindinger i den biologiske prøven kan imidlertid også bli oppnådd ved proteolyttisk behandling av total nativ Dpd og Pyd for å frigjøre den "native frie" tverrbindingsformen. I tillegg er tverrbindingene i seg selv identiske mellom artene, og andre arter ved siden av mennesket kan bli utnyttet til å fremstille native frie tverrbindingsstandarder til anvendelse i analysesystemet eller til anvendelse som immunogener. Spesielt kan porcinurin inneholde store mengder native frie tverrbindinger. En hvilken som helst kilde på biologisk viktige diastereomerer kan bli anvendt.

Det har i oppfinnelsen blitt vist at antistoffene som øker mot fri Pyd som er generert som resulatet av hydrolyse--dvs. der immonogenet blir oppnådd ved å behandle biologisk fluid eller vev i konsentrert syre slik at den ødelegger peptidbindingene og separerer Pyd fra Dpd — viser liten eller ingen tverr-reaktivitet med native frie former av enten Dpd eller Pyd. Videre vil antistoffer som er øket mot Pyd som er dannet fra hydrolysat tverr-reagere bare svakt med Dpd som er dannet på denne måten. Antistoffer som er øket mot Pyd fra et syrehydrolysat av ben eller brusk vil ikke tverr-reagere med tverrbindingen i urin etter syrehydrolyse.

Et typisk resultatsett er vist i tabell 1. Tabell 1 presenterer resultatene fra en ELISA-analyse som anvender antiserum oppnådd ved immunisering med Pyd hydrolysat isolert fra ben. ELISA anvender dette hydrolysatet som antigen, og resultatene er gitt med basis i tilgjengeligheten av kandidaten å tverrbinde for å hemme binding av hydrolysat-antigenet til antiserumet. Ved å anvende dette kriteriet ble antistoffer som ble oppnådd ved immunisering av kaniner mot Pyd isolert fra et surt hydrolysat av brusk eller ben der bare 5% tverr-reaktiv med Pyd er i sin native frie form fra urin (U-Pyd) selv om den var fullstendig tverr-reaktiv med Pyd etter hydrolyse i syre av renset, nativt, fritt tverrbun- det isolert fra urin. Disse antistoffene var videre 2056 tverr-reaktive med Dpd isolert fra det samme benhydrolysat og var mindre enn 156 tverr-reaktiv med Dpd i sin native frie form fra urin (U-Dpd); ca- 7056 av reaktiv!teten med disse antistoffene ble gjenvunnet etter syrehydrolyse av nativ fri form (tabell 1).

Dette er videre vist i fig. 1, som, som fastslått over, presenterer resultatet fra ione-bytterkromatografi på sulfonerte polystyrenperler (7 p) ekvilibrert med natriumcitrat. Elueringsmønstrene fra fri Pyd og surt hydrolysat av urin ble bestemt ved fluorescens. Antistoffer som økte mot syrehydrolysatet viser seg å reagere signifikant bare med hydrolysatet. Uoverensstemmelse i reaktivitet til hoved-hydrolysattoppene skyldes forskjellig immunogenitet til de to fraksjonene.

Fremstilling av antistoffer til native frie tverrbindinger Antistoffer blir fremstilt til native frie tverrbindinger enten enten som en totalfraksjon, eller fortrinnsvis til hver komponent av denne fraksjonen. Grovseparering av pyridin-bindingen i sine "frie" sluttformer fra fragmenter som inneholder protein kan hl i oppnådd, for eksempel ved metoden til Fujimoto, D., J. Biochem. (1983) 94:1133-1136 (over). I denne fremstillingen blir et konsentrat av urin applisert på en Sephadex G-10 kolonne og de totale pyridininneholdende fraksjonene eluert. Eluatet blir deretter applisert på en kolonne av fosforcellulose ekvilibrert med natriumcitrat og eluert med salt. Denne relativt enkle prosedyren resulterer i "frie" tverrbindinger som en enkel topp. Da prøven ikke er utsatt for hydrolysebetingelser, inneholder denne toppen ikke bare Dpd og Pyd formene, men også glukosylert Pyd som innbefatter Gal-Pyd og Gle.Gal-Pyd som beskrevet over. Videre separasjon av denne native frie tverrbindingsfrak-sjonen blir deretter hensiktsmessig gjennomført ved stan-dardmetoder, for eksempel ved å anvende ionebytting på sulfonerte polystyrenperler som beskrevet over, eller ved å anvende HPLC. Typiske protokoller for denne separasjonen blir for eksempel funnet i Black, D., et al., Anal. Biochem.

(1988) 169:197-203; Seibel, M.J., et al., J. Rheumatol (1989) 16:964-970.

Antistoff-fremstilling skjer ved konvensjonelle teknikker som innbefatter injeksjon av blandingen eller individuelle komponenter konjugert til bærer i velegnede pattedyr-forsøks-subjekter slik som kanin eller mus i henhold til immunolog-iske protokoller som generelt er kjent innenfor fagområdet. Materialene blir konjugert slik som BSA eller tetanus toksoid ved å anvende standard konjugasjonsmetoder for å øke immunogeni si teten. Sera blir titrert for å bestemme anti stoff-dannelse med hensyn på immunogen. Hvis ønsket, kan miltceller eller periferiblodlymfocytter bli høstet og udødeliggjort for å fremstille kulturer av celler som har evnen til kontinuerlig fremstilling av monoklonale antistoffer som er immunoreaktive med den ønskede komponent. Disse fremstillingene har øket spesifisitet med hensyn på individuelle komponenter.

Således kan polyklonale antisera bli oppnådd slik at disse er spesifikt ininiunoreaktive med den native frie formen av tverrbindingene som foregår i biologiske fluider, spesielt i urin. Med uttrykket "spesifikt immunoreaktive" menes det at serum har evne til å danne komplekser med native frie tverrbindingsformer i det biologiske fluidet med tilstrekke-lig større affinitet sammenlignet med andre materialer der fluidet tillater bestemmelse av native frie former i en immunoanalyse. Slike deler av polyklonalt antiserum blir fremstilt enten med hensyn på blanding av native frie former eller med hensyn på individuelle komponenter som kan tverr-reagere med native former som har peptidkjeder tilknyttet; analyser kan bli standardisert enten ved fremstilling av monoklonale antistoffer som ikke tverr-reagerer på den måten, eller ved standardisering som står til regnskap for denne tverr-reaktiviteten.

Tilgjengeligheten for rutineteknikker å oppnå monoklonale antistoff-fremstillinger tillater reproduserbar reproduksjon av antistoffer med ønsket spesifisitet. Ved således å utnytte en screeningprosedyre som utnytter som et kriterium evnen til den forevigede cellesupernatanten å immunoreagere med for eksempel nativ fri Pyd, men som mislykkes i å reagere enten med nativ fri Dpd elelr former av tverrbindinger som ytterligere er konjugert til peptider, kan en pålitelig kilde antistoffer som reagerer bare med nativ fri Pyd bli oppnådd. I motsatt tilfelle kan det være fordelaktig å anvende, til bestemmelse av biologiske prøver, blandinger av antistoffer med disse unike spesifisitetene slik at alle native frie former blir bestemt.

Udødelige cellelinjer som sekrerer antistoffer med den ønskede spesifisiteten kan bli dyrket in vitro i fremstilling av praktiske mengder av de ønskede monoklonalene ved å anvende pattedyrcelleteknikker som er kjent innenfor fagområdet. Slike dyrkningsteknikker er nå tilgjengelige i kommersiell skala. I tillegg kan de udødelige cellelinjene bli injisert i mus og en noe råere fremstilling av monoklo-naler som er isolert som ascites fluid. Antistoff-fremstillingen kan også bli af f initetsrenset hvis ønskelig ved å anvende immunogen som en affinitetsligand.

Det må bemerkes at selv om det er klart at antistoff fremstilt med hensyn på hydrolyserte frie former av kollagen-avledede tverrbindinger mislykker i å reagere med native frie former, er det ikke av viktighet om det motsatte er sant, siden hydrolyserte former ikke er tilstede i uhydrolyserte biologiske prøver. Screeningprosedyrer for å forsikre fravær av denne tverr-reaktiviteten er således unødvendig.

Gjennomføring av immunoanalyser

Ved utnyttelse av en immunoanalyse med antistoffer fremstilt som over er det således mulig å analysere en biologisk fluidprøve uten forutgående fraksjonering eller hydrolyse. Spesifisiteten til den ønskede formen for nativ fri Pyd eller Dpd eller begge blir tilført av antistoff-fremstillingen.

Immunoanalysene i seg selv blir gjennomført ved å anvende en lang rekke standard analyseprotokoller som generelt er kjent innenfor fagområdet. Som man generelt forstår, blir analysen konstruert slik at den bygger på interaksjon mellom spesifikt antistoff og den ønskede analysen for spesifisitet og å utnytte anordninger for å påvise komplekset som er dannet ved analytten og antistoffet. Kompleksdannelsen kan være mellom antistoffet selv og et immunologisk reaktivt fragment derav slik som en Fab, Fab' eller F(ab')2fragmenter. Antistoffet eller det immunologisk reaktive fragmentet derav kan bli kompleksdannet til en fast bærer og anvendt som et fanget antistoff til analytten. Denne protokollen kan bli kjørt i en direkte form, der dannelse av analytt/antistoffkompleks blir påvist ved et fluorescerende middel, radioaktivt eller enzymatisk merket, eller kan bli kjørt i et konkurrerende format der en merket standard konkurrerer med analytten om antistoffet. Formatet kan også bli konstruert som en agglutineringsanalyse eller komplekset kan bli utført ved tilsetning av et velegnet utfellingsmiddel til reaksjons-blandingen. Den spesifikke utformingen av immunoanalyse-protokollen er åpen innenfor et vidt valgområde, og antallet kliniske analyseinnretninger og protokoller som er tilgjengelige innenfor fagområdet er stort.

Antistoffer og reagenser for å gjennomføre en immunoanalyse ved å anvende standard påvisningsprotokoller - dvs. for eksempel radioisotopmerking, fluorescerende merking eller ELISA, enten i direkte eller konkurrende format, kan hensiktsmessig bli anvendt som sett som innbefatter de nødvendige komponentene og instruksjonene til analysen.

Siden antistoffer kan bli øket spesifikt til formene med native frie tverrbindinger som omfatter forskjellige former derav, kan forholdene mellom disse komponentene bli bestemt så vel som deres individuelle nivåer og deres totale.

Analysen kan således bli utformet til å innbefatte antistoffer eller immunologisk reaktive fragmenter derav som vil resultere i bestemmelse av totale native frie tverrbindinger, eller bestemmelse av native frie Pyd, Dpd, Gal-Pyd eller Gle.Gal-Pyd, eller en hvilken som helst ønsket kombinasjon av disse. Siden nivåene av Pyd og Dpd tverrbindinger i forskjellige vev kan bli bestemt, kan endringer i deres relative mengder bli anvendt som en indeks for degradering av det spesielle aktuelle vevet. Hos de fleste voksne forblir for eksempel forholdet mellom Pyd/Dpd konstant gjennom det voksne liv. Da ben har et Pyd/Dpd forhold på 4/1 og synes å være hovedkilde for frigjort Dpd, kan en heving av forholdet mellom Dpd/Pyd være indikativt på bendegradering. (Selv om aorta også innehlder Dpd, er dens turnoverhastighet lav.) Bestemmelse av Dpd nivået i biologiske fluider gir også et resultat som er relativt ben-spesifikt. Det synes imidlertid at i mange tilfeller der man forventer en benforstyrrelse, kan det totale frie tverrbindingsnivået (Dpd + Pyd) også bli anvendt som et mål når ytterligere informasjon er tilstede. Når symptomene ikke antyder en sykdom i brusk slik som rheumatoid artritt, vil hoveddelen av overskudd tverrbinding i fri form i biologiske fluider faktisk skyldes resorpsjon av ben.

Siden annet bindevev, slik som brusk, for det meste bare inneholder Pyd, ikke Dpd, kan en heving av forholdet Pyd/Dpd indikere sykdommer som er forbundet med slik skade.

Selv om immunoanalyser som anvender antistoffer i oppfinnelsen er bekvemme, kan native frie Pyd og Dpd tverrbindinger også bli bestemt på en lang rekke måter. Siden pyridinolin-bindingen er fluorescerende, kan direkte kromatografi av prøven med biologisk fluid som beskrevet innenfor fagområdet, resultere i separasjon av DpD fra Pyd og av glykolyserte former Pyd og intensiteten i fluorescensen til toppene som blir oppnådd, skaffe tilveie en kvantifiseringsindeks.

I fremgangsmåtene i oppfinnelsen kan derfor de native frie tverrbindingene bli bestemt enten som en gruppe eller individuelt ved å bestemme intensiteten til fluorescensen i det kromatograferte materialet.

Som fremsatt i PCT-søknad ¥089/04491 som referert over, kan kvantiteten av tverrbindinger også bli bestemt ved å anvende spesifikke elektroder med passende redokspotensiale til ringsystemet.

I tillegg til anvendelse av native frie tverrbindinger som en indikator på benresorpsjon, blir benmetabolsk balanse fordelaktig bestemt ved å kombinere denne bestemmelsen med bestemmelsen til en markør for dannelse av et ben på samme måte eller annet passende biologisk fluid fra samme individ. Slike markører innbefatter for eksempel prokollagen type I, benosteokalcin (også kjent som ben GLA protein eller BGP); pro ben GLA protein, matriks GLA protein (MGP), benspesifikke proteiner slik som benspesifikk sialoprotein, fosfoproteiner, alkalisk fosfatase, osteonektin eller andre ikke-kollagene benproteiner. Fremgangsmåter for bestemmelse av disse markørene er velkjente innenfor fagområdet. Velegnede metoder for bestemmelse av disse markørene finnes for eksempel i Delmas, P.D., et al., J. Bone Min. Res. (1986), 1:333-337 (over) for GLA.

De foregående analysene som skaffer tilveie en indeks for å bestemme den metabolske status til vev som generer kollagen-avledede tverrbindinger når degradering forekommer, er nyttige i en lang rekke sammenhenger. For det første, er det en metode til å bestemme en unormal tilstand til en person ved å indikere for eksempel omfattende benresorpsjon. Dette kan for eksempel vise tilstedeværelse av en osteoporotisk tilstand eller uheldig metastatisk utvikling av en maligni-tet. Andre kjente tilstander som er kjennetegnet ved omfattende benresorpsjon inkluderer Pagets sykdom og hyperparatyromidisme. Siden tilstanden til en person kan bli overvåket kontinuerlig, kan anvendelse av disse analysene også bli anvendt til å overvåke utvikling av terapi som er administrert for å behandle disse eller andre tilstander. Analysene kan også bli anvendt som et mål på toksisitet da administrering av toksiske substanser ofte resulterer i vevsdegradering.

Således kan analysene bli anvendt i en hvilken som helst situasjon der metaboliske tilstander av kollagen tverrbind-ings-inneholdende vev kan anvendt som indeks på tilstand, behandling, eller effekt av substanser som direkte blir administrert til forsøkspersonen eller som forsøkspersonen er eksponert for i miljøet.

De følgende eksemplene har til hensikt å illustrere, men ikke begrense oppfinnelsen.

Eksempel 1

Analyse for native frie tverrbindinger 1 urin A: Isolering av U- Pyd og U- Dpd: Urinprøver ble samlet fra pasienter med Pagets sykdom eller hyperparatyroidisme (som inneholder forhøyede nivåer av frie tverrbindinger) og fra barn som vokser (der ca. 10-ganger høyere konsentrasjoner av tverrbindinger er tilstede sammenlignet med normale voksne). Etter konsentrering av 10-ganger med rotasjonsinndampning, ble satser av urin (20 liter) utsatt for partisjonskromatografi satsvis på cellulose CF1 ved å anvende butanolreddiksyre:vann (4:1:1 v/v/v) som mobil fase. Pyridintverrbinding-inneholdende fraksjon, eluert fra stasjonær fase med vann, ble kromatografert på en kolonne (3,2 x 150 cm) av Sephadex G-10 eluert med 0,2M eddiksyre. Oppsamlede fraksjoner som inneholder tverrbindingene ble deretter gjort 67 mM i Na<+>og applisert på en kolonne (1,7 c 35 cm) Dowex 50X-X8 ionebytterharpiks ekvilibrert med 67 mM natriumcitratbuffer, pH 2,75. Etter heving av kolonnetemperaturen til 60"C, ble eluering med 67 mM natriumcitrat gjennomført med en lineær pH-gradient fra 2,75 til 5,50 med 500 ml. Kolonneutstrømmen ble overvåket med fluorescens (ex 325 nm/emm 400 nm) og de oppsamlede fraksjonene som inneholdt U-Pyd (364-377 ml) og U-Dpd (397-416 ml) ble avsaltet ved gelfiltrering på Sephadex G-10 og inndampet til tørrhet. Utbyttet fra 20 liter urin var 2,5 jjmol U-Pyd og 0,6 umol U-Dpd.

B. Resultater:

Isoleringsprosedyren som er fremsatt i paragraf A i eksempelet ble anvendt til urinprøver fra individuelle pasienter og mengden U-Pyd og U-Dpd ble kvantifisert ved å anvende fluorescensmålinger relativt til kreatinin som kjent innenfor fagområdet (over). Verdiene som ble oppnådd for normale individer og i 7 pasienter med benforstyrrelser og artritiske sykdommer er vist i tabell 2. Verdier er gitt som gjennom-snitt ± SEM (n = 6 i hver gruppe).

Disse resultatene viser dramatisk forhøyede nivåer av frie tverrbindinger hos pasienter som er kjent å lide av sykdommer som er kjennetegnet ved omfattende nedbrytning av bindevev.

Tabell 3 viser andelen av U-Pyd og U-Dpd som en prosentdel av total tverrbinding målt etter hydrolyse i forskjellige pasientgrupper.

Siden, som vist i tabell 3, prosentdelen av U-Pyd og U-Dpd er relativt uforandret hos pasienter med unormale tilstander sammenlignet med kontroller, reflekterer konsentrasjonene av frie tverrbindinger i urin den samme økning i kollagennedbrytning i sykdommer sammenlignet med kontroller som totale tverrbindinger målt etter hydrolyse av urin.

U-Pyd og U-Dpd frembringer således sterke indisier på kollagendegradering for å forenkle diagnose og overvåking av sykdommer som innbefatter abnormiteter av bindevevsmetabolisme.

C: Immunoanal<y>se:

Native frie tverrbindinger isolert ved fremgangsmåten beskrevet i paragraf A i dette eksempelet blir anvendt for fremstilling av antigen. U-Pyd og U-Dpd blir videre renset ved ione-byttekromatografi med 67 mM-natriumcitrat-buffer, pH 4,25 ved å anvende en høy-oppløsnings harpiks-kolonne av en aminosyreanalysator (Locarte Co. Ltd., London, UK).

For immunisering blir isolerte tverrbindinger kovalent knyttet til bovint serumalbumin ved å anvende karbodiimid-reagenser og fremgangsmåter som er velkjente innenfor fagområdet.

Både monoklonale og polyklonale antistoffer øker mot urin-tverrbindingskomponenten. For fremstilling av monoklonale antistoffer, blir Balb/c mus immunisert med urintverrbindings-BSA konjugatet. Hybridomacellelinjer ble fremstilt ved å anvende standardteknikker etter fusjon med celler fra milt eller lymfenoder med Ag8 myelomaceller. Polyklonale antistoffer stiger hos kaniner. Screening av både antisera og hybridomacellemedia ble gjennomført ved ELISA ved å anvende mikrotiterplater belagt med velegnede urintverrbindings-gelatin konjugat fremstilt som beskrevet av Robins, Biochem. J. (1982) 217:617-620.

Analyse av hver av tverrbindingskomponentene som er tilstede i fri form i urin "blir gjennomført ved en hemmings-ELISA som følger: Urinprøver (5 eller 20 ul) eller oppløsninger som inneholder 0,2-20 pmol med renset urintverrbindings-referansestandard blir fortynnet til 110 ul med fosfatbufret saltvann som inneholder 0, 05% Tween-20 detergent (PSB-T) og blir tilsatt til 110 ul primært antistoff, immunoreaktivt fragment, eller antiserum fortynnet 1:5.000 - 1:20.000 i PBS-T. Hver prøve blir fremstilt tredobbelt i rund-bunnede, 96-brønners mikrotiterplater som deretter blir inkubert over natten ved romtemperatur.

Porsjoner (200 ul) av prøvene ble overført til flate-bunnede mikrotiterplater som tidligere er belagt med gelatinkonjugat som inneholder passende urintverrbindingskomponent. Etter 30 minutter ble platen vasket med PSB-T (3 ganger) og bundede antistoffer påvist ved standardteknikker med biotin-merket antistoff fremstilt mot artene av primært antistoff kombinert med en streptavidin-peroksydase og peroksydasesubstrat-påvisningssystem. Fargeutvikling blir målt ved 492 nm ved å anvende en automatisk mikrotiterplateleser. Prøver som inneholder analytten senker binding av primært antistoff til platen og har således redusert fargekonsentrasjon. Mengden frie tverrbindinger i prøven blir kvantifisert med referanse til kurver fra standarder inkludert på hver plate beregnet ved å anvende log-log plot.

Den foregående analysen kan bli formatert på nytt slik at den blir gjennomført direkte ved å belegge prøven som muligens inneholder antigen i flat-bunnet mikrotiterplate, og tilsetning av primære antistoffer direkte til brønnene. Etter vasking blir mengden merket antistoff i testoppløs-ningen bestemt. En nedgang i nivå indikerer tilstedeværelsen av antigen.

Eksempel 2

Kilder for nativ fri tverrbinding

For å bestemme kilden for nativ fri tverrbinding som kan brukes som standarder i analysen i oppfinnelsen, ble urin fra et stort antall arter store dyr analysert. I bovint urin er Pyd/Dpd forholdet 12±2 med bare ca. 15% som fri tverrbinding; verdiene i sau er tilsvarende med unntagelse for at bare ca.20-25% er fri tverrbinding. I griseurin er forholdet mellom Pyd/Dpd ca. 5±1 og andelen av fri tverrbinding relativt til total er 42±5%. Konsentrasjonene av frie tverrbindinger er ca. 380 nM for Pyd og 70 nM for Dpd.

Urin fra barn synes å gi bedre utbytte med Dpd enn urin fra voksne. Noe foretrukket tap av Dpd fra griseurin forekommer når CF-1 cellulose blir anvendt i rensingsprosedyren, og samlet utvinning av Pyd er 40-50% for Pyd, men bare 20% for U-Dpd. Ved å anvende urin fra barn som utgangsmateriale, er utvinningen av begge tverrbindingene ca. 55%.

Således er både urin fra barn og griseurin velegnede kilder for frie tverrbindingsstandarder.

Som beskrevet over, kan utbyttet av tverrbinding i diastere-omerisk form som er kjennetegnet ved nativ fri tverrbinding bli forbedret ved å frigjøre totale tverrbindinger i disse kildene ved enzymatiske hydrolysefremgangsmåter, slik som anvendelse av eksopeptidaser og glykosidaser.

Eksempel 3

Pyd/ Dpd i menneskelig vev

Analyser av et område med forskjellig vev har vist at tverrbidingsinnholdet i kortikalt ben er svakt høyere enn det i trabekulaert ben med et Pyd/Dpd forhold på ca. 4,2. Selv om Dpd ikke ble påvist i brusk, var denne tverrbindingen tilstede i aorta og i ligamenter. Disse resultatene er oppsummert i tabell 4.

Både Pyd og Dpd er fullstendige fraværende fra kollagen i normal hud, og de er heller ikke tilstede i immatur eller nylig syntetiserte kollagener.

Eksempel 4

Bestemmelse av frie tverrbindinger 1 osteoporose pasienturin 64 postmenopausale kvinner med vertebrale frakturer (type I osteoporose) med alder fra 53 til 74 år (gjennomsnittlig ± SD, 64 ± 5 år) ble studert. Alle kvinnene hadde lumbarspin benmineraltetthet under bruddterskelen på 0,98 g/cm<2>som målt ved dobbel-foton absorptiometri og sinalradiografer som viser tre eller flere grader 1 frakturer eller en eller flere grader 2 frakturer. Ingen annen sekundær årsak for osteoporose ble identifisert.

Som en kontrollgruppe ble 67 postmenopausale kvinner med gjennomsnittlig (± SD) alder på 65 ± 6 år (område 50 til 79 år) studert. Alle kvinnene hadde normale spinradiografer og hadde lumbarspin benmineraltettheter innenfor det normale området for alderen som målt ved dobbel-foton absorptiometri. Ingen hadde noen sykdommer eller inntok medikamenter som var kjent å påvirke benmetabolismen.

For målinger av hydroksyprolin, ble forsøkspersonene holdt på en gelatin-fri diett i tre dager forut for studiene. Urinprøver ble oppsamlet og prøver ble lagret ved -70 °C inntil de ble analysert. Totale tverrbindinger ble målt i det vesentlige som beskrevet tidligere (Black, D. , et al., Anal Biochem (1988) 169:197-203; Seibel, M.J., et al., J. Rheumatol (1989) 16:964-970). For bestemmelse av U-Pyd og U-Dpd i uhydrolysert urin, ble 0,5 ml porsjoner bearbeidet direkte ved partisjonskromatografi på CF1 cellulose (som separerer den frie formen fra peptid-derivatiserte former forut for HPLC-trinnet; HPLC ble gjennomført som for hydrolyserte prøver). Hydroksyprolin i sure hydrolysater i urin ble målt ved HPLC (Dawson, C, et al., Clin. Chem.

(1988) 34:1572-1574).

Målinger av native frie pyridintverrbindinger og total hydroksyprolin i urin for kontrollen og osteoporosegruppene er vist i tabell 5. Resultatene viste at utskillelse av ben-spesifikt tverrbinding, U-Dpd, var signifikant høyere i den osteoporotiske gruppen sammenlignet med kontrollene.

Forskjellene var mindre markerte for U-Pyd; verdiene for glykosylert derivat, U-Pyd.Gal.Gle, var ikke statistisk forskjellig. Lineær regressjonsanalyse viste at det var meget signifikante korrelasjoner mellom verdier uttrykt som kreatinforhold og som samlet 24t ekskresjon for både U-Pyd (r = 0,80) og U-Dpd (r = 0,82). Denne observasjonen er i overensstemmelse med funnet at det ikke var noen signifikante variasjner diurinalt i tverrbindingsekskresjon for friske mannlige eller kvinnelige frivillige (A.M. McLaren og S.P. Robins, upubliserte resultater).

Det var signifikante korrelasjoner av U-Dpd med hydroksyprolin som ikke var mer markert i den osteoporotiske gruppen (r = 0,53; p<0,001) enn i kontrollene (r = 0,21; N.S.). Forholdet mellom U-Pyd og hydroksyprolin var tilsvarende med korrelasjonskoeffisientene for osteoporotisk og kontrollgrup-per på r = 0,45 (p<0,001) og r = 0,34 (p<0,01).

Prøver der både frie og totale tverrbindinger ble målt, var det meget signifikante korrelasjoner mellom disse verdiene. For deoksypyridinolin var korrelasjonskoeffisientense for den osteoporotiske gruppen (n = 25) og kontrollgruppen (n = 24) henholdsvis 0,90 og 0,84; de tilsvarende korrelasjonene for pyridinolin var r=0,96 og r = 0,85.

Claims (12)

1. Fremgangsmåte for å overvåke eller diagnostisere tilstedeværelse av en forstyrrelse som er forbundet med en bindevevs metabolisme-abnormalitet,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter sammenligning av nivået av native frie tverrbindinger avledet fra kollagen i et ikke-hydrolysert biologisk fluid fra et menneskelig subjekt med nivået av nevnte tverrbindinger i normale subjekter slik at man kan diagnostisere et subjekt som har et forhøyet nivå av tverrbindinger som viser tilstedeværelse av forstyrrelsen, der tverrbindingene blir valgt fra nativ peptid-fri ikke-glykosylert pyridinolin (N-Pyd), nativ peptid-fri deoksypyridinolin (N-Dpd), eller summen av N-Pyd og N-Dpd.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at nevnte biologiske fluid er serum eller urin.

3. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 2,karakterisert vedat bestemmelsen av native frie tverrbindinger utnytter en immunoanalyse som omfatter trinnet med å bringe biologisk fluid eller en fraksjon derav i kontakt med en sammensetning som inneholder et antistoff eller immunologisk reaktivt fragment derav der sammensetningen er spesifikt immunoreaktiv med de valgte native frie tverrbindinger.

4. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3,karakterisert vedat de frie tverrbindingene blir bestemt som summen av N-Pyd og N-Dpd.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3,karakterisert vedat de frie tverrbindingene blir bestemt som N-Pyd.

6. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 3,karakterisert vedat de frie tverrbindingene blir bestemt som N-Dpd.

7. Sammensetning for bruk i fremgangsmåten ifølge krav 1-6,karakterisert vedat den inneholder et antistoff eller et immunologisk reaktivt fragment derav der sammensetningen er spesifikt immunoreaktiv med en eller flere native frie tverrbindinger valgt fra N-Pyd og N-Dpd.

8. Monoklonalt antistoff eller immunologisk reaktivt fragment derav for bruk i fremgangsmåten ifølge krav 1-6,karakterisert vedat det er spesifikt immunoreaktivt med en eller flere native frie tverrbindinger valgt fra N-Pyd og N-Dpd.

9. Udødelig cellelinje for bruk i fremgangsmåten ifølge krav 1-6,karakterisert vedat den sekreterer et antistoff som spesifikt er immunoreaktivt med en eller flere native frie tverrbindinger utvalgt fra N-Pyd og N-Dpd.

10. Sett for immunoanalysebestemmelse av mengden eller konsentrasjon av en eller flere native frie tverrbindinger i et ikke-hydrolysert biologisk fluid, der tverrbindingene blir valgt fra N-Pyd og N-Dpd, for bruk i fremgangsmåten ifølge krav 1-6,karakterisert vedat den omfatter et sett av beholdere der minst en av disse inneholder en sammen setning som inneholder et antistoff eller immunologisk reaktivt fragment derav, hvori sammensetningen er spesifikt immunoreaktiv med en eller flere av de valgte tverrbindinger, og minst en av disse beholderene inneholder et ytterligere reagens for å gjennomføre immunoanalysen sammen med instruk-sjoner for å gjennomføre nevnte analyse.

11. Sett for bruk i fremgangsmåten ifølge krav 1-6,karakterisert vedat det videre innbefatter et sett av beholdere der minst en av disse inneholder en sammensetning som inneholder et antistoff elller immunologisk reaktivt fragment derav, nevnte sammensetning er spesifikt immunoreaktiv med en eller flere bendanneslesindikatorer.

12. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter bestemmelse av forholdet N-Pyd/N-Dpd i et ikke-hydrolysert biologisk fluid til et menneskelig subjekt og sammenligne dette forhold med det i normale kontroller, der en økning i dette forhold i nevnte subjekt over normale kontroller indikerer bindevevsnedbrytning i nevnte subjekt.