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Die Erfindung betrifft ein Diagnoseverfahren im medizinischen
und veterinärmedizinischen Zusammenhang. Insbesondere betrifft
sie Verfahren zum Einschätzen von Knochen- und anderen
Bindegewebsmetabolismen durch Nachweis freier, durch Kollagenabbau
entstandener Verbnetzungen in biologischen Flüssigkeitsproben,
wie Urin.
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Die Assoziation von Kollagen als Hauptstrukturmaterial in
einer Vielzahl von Geweben einschließlich Knochen, Knorpel,
Haut, Sehnen, Zahnschmelz und anderen ist gut bekannt. Es ist
auch bekannt, dass die Faserstruktur von Kollagen durch
Vernetzen stabilisiert wird. Die Anwesenheit des fluoreszierenden
Pyridiniumringsystems als nicht reduzierbare Vernetzung in
Kollagen wurde berichtet von Fujimoto, D., et al., J. Biochem,
(1978) 83 : 863-867. Die Fujimoto-Veröffentlichung zeigte die
Isolierung eines fluoreszterenden Peptids aus einem
Pronaseverdau von Rinderachillessehnenkollagen. Es wurde vermutet,
dass das isolierte hydrolysierte Pyridinolin (Pyd) drei
Hydroxylysinreste enthält und man fand heraus, dass vor der
Hydrolyse Peptidfragmente an den Pyridinolinteil gebunden wurden.
Weitere Arbeiten zur Charakterisierung wurden unter Verwendung
hydrolysierten Urins von Gunja-Smith et al. ausgeführt, Gunja-
Smith, Z., et al., Biochem. J., (1981) 197 : 759-762 und die
Anwesenheit des Pyridinolin im Urin wurde von Robins genutzt,
Robins, S. P., Biochem. J., (1982) 207 : 617-620, der aus
hydrolysiertem Urin erhaltenes Pyridinolin mit einem Carrier zum
Erzeugen von Antikörpern verband. Die Antikörper wurden dann
in einem Immunoassay eingesetzt, um die
Pyridinolinkonzentra
tion in hydrolysiertem Urin zu bestimmen. Das verfahren wurde
von Robins als nützlich dargestellt, zum Erstellen eines
Indexes des Abbaus bestimmter Formen erwachsenen Kollagens durch
Analyse physiologischer Flüssigkeiten.
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In allem Vorangegangenem wurden Hydrolysate eingesetzt, um
Gesamtpyridinolin zu erhalten, da viele der Vernetzungen
Peptidverlängerungen der Hydroxylysylreste zurückhielten, die für
ihre Entstehung verantwortlich sind. Daher war ein vorheriger
Hydrolyseschritt nötig, um eine homogene Präparation zu
erhalten, die den Pyridiuniumring enthält.
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1982 war es gesichert, dass es zwei Wege zur
Vernetzungsbildung gibt, abhängig davon, ob Lysyl- oder Hydroxylysylreste in
den Telopeptiden vorhanden waren, von welchen diese
Vernetzungen abgeleitet wurden (Robins, S. P., in,Collagen in Health
and Disease' (1982 Weiss, J. B., et al., eds., pp 160-178,
Churchill Livingstone, Edinburgh). Es wurde festgestellt, dass
dies zu einer Spezifität der Vernetzung führt, wobei in
weichen Geweben, wie Haut, reduzierbare Aldimin-Verbindungen aus
oxidierten Lysylresten gebildet werden, wohingegen in Knorpel
und Knochen diese Bindungen, anfangs aus Hydroxylysinaldehyden
gebildet, eine spontane Umlagerung zu stabileren
Oxoiminvernetzungen durchlaufen. Diese reagieren weiter, um 3-
Hydroxypyridiniumvernetzungen zu bilden. Das stabil
vernetzende Pyridinolin, welches analog zu Lysin eher als Hydroxylysin
in den Helixteil einbindet, wurde von Ogawa identifiziert und
quantifiziert, Ogawa, T., et al., Biochem. Biophys. Res.
Commune., (1982) 107 : 1251-1257; Eyre, D. R., et al., Anal.
Biochem. (1984) 137 : 380-388, und als Desoxypyridinolin (Dpd)
bezeichnet. Es wurde dann vermutet, dass das Material auf
Knochenkollagen beschränkt ist, auch wenn die Mengen zwischen den
Spezies variieren.
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Weitere Arbeiten von Robins, Robins, S. P., Biochem. J., (1983)
215 : 167-173 lieferten den Beweis für die Existenz
glykosy
lierten Pyridinolins in Knochen. Robins schlug eine Struktur
vor, die die Derivatisierung des Rings aus drei
Hydroxylysylresten zeigt sowie dass Alkalihydrolysate von Kollagen ein O-
Galactosylderivat lieferten, das an der
Seitenkettenhydroxygruppe substituiert ist. Da dieses Material sehr instabil
gegen milde Säurebehandlung war, konnte es nicht in Proben von
hydrolysierten Gebeben oder Körperflüssigkeit vorhanden sein.
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Fujimoto, D., et al., J. Biochem, (1983) 94 : 1133-1136,
chromatographierte unhydrolysierte Urinproben und zeigte, dass der
3-Hydroxypyridiniumringteil selbst in substanziellem
Verhältnis als "freie" Form vorlag, z. B. die drei von Hydroxylysin
abgeleiteten Reste, welche ihn bildeten, enthielten keine
weiteren Peptidverlängerungen. Bei der Aminosäureanalyse, wo aus
einem Säurehydrolysat von Kollagen isoliertes Pyridinolin
einen unsymmetrischen Peak ergab, ergab hingegen "freies"
Urinpyridinolin einen symmetrischen Peak. Die Autoren folgerten,
dass dies durch die Isomerisierung durch Epimerisierung des
Hydroxylysylteils des Pyridinolinsystems während der Hydrolyse
verursacht wird. Zusätzlich wurde von diesen Forschern eine
Beziehung der Gesamtpyridinolingehalte (nach Hydrolyse) zum
Alter als ein Verhältnis zu den Kreatingehalten bestimmt. Es
wurde gefunden, dass das Verhältnis im Urin von Kindern hoch
war, aber mit steigendem Alter abnimmt, bis das Wachsen
aufhört. Es wurde weiter gefunden, dass dieses Verhältnis bei
Erwachsenen relativ konstant war aber bei hohem Alter leicht
zunimmt. Die Autoren mutmaßen, dass dies mit dem bei hohem Alter
beobachteten Verlust an Knochenmasse zusammenhängt.
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Es wurden auch Versuche gemacht, die oben genannten
Peptidverlängerungen zu charakterisieren. Robins et al., Robins, S. P.,
Biochem. J., (1983) 215 : 175-182, schlugen vor, dass in
knorpelabgeleitetem Typ II Kollagen das Pyridinolin zwei
Cterminale Telopeptidketten mit einer Einzelkette des helikalen
Peptids verbindet. Von einer weiteren Pyridinolinvernetzung,
z. B. mit einem zu anderen Peptiden derivatisierten Ring, wurde
vermutet, dass diese zwei N-terminalen, nichthelicalen Peptide
mit einer dritten Kette im helicalen Teil des Moleküls
verbindet. Diese Untersuchungen wurden durch Isolierung der
fluoreszierenden Pyridinolinvernetzungen aus Geweben durch
spezifische Spaltung mit CNBr durchgeführt, weshalb die
Peptidsequenzen als Verlängerungen der Hydroxylysylreste, welche den Ring
bilden, erhalten bleiben. Die Vernetzung wurde in den
Kollagenfasern durch Bestimmung der Aminosäuresequenzen dieser
Verlängerungen lokalisiert.
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In einer Veröffentlichung, welche in der Herangehensweise
ähnlich ist wie jene von Robins (supra), Wu, J. J., et al.
Biochemistry (1984) 23 : 1850-1857, führten Wu et al. die CNBr-
Spaltung erwachsenen Knorpels durch und bestimmten die Sequenz
der Peptidverlängerungsdomänen der Hydroxylysinteinehmer im
Pyridiniumring. Ihre Folgerungen waren jenen von Robins
ähnlich.
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Robins et al., Robins, S. P., et al. Biochim. Biophys. Acta,
(1987) 914 : 233-239, nutzten den CNBr-Verdau von aus Knochen
stammendem Kollagen, um die Vernetzungen in der Typ I
Kollagenstruktur zu lokalisieren. Diese Autoren folgerten, dass die
Verhältnisse der von Lysin stammenden Vernetzung und jener
von Hydroxylysin stammenden in denselben Verhältnissen in
jeder der isolierten Peptidformen vorlagen. Sie folgerten auch,
dass dies zeigte, dass die beiden Vernetzungsanaloga die
gleichen Orte in der Kollagenfaser besetzten und dass die
scheinbar von einem Lysylteilnehmer stammende Form durch
unvollständige Hydroxylierung der entsprechenden Lysylreste in der Helix
aufzutreten scheint. Aminosäureanalysen zeigten, dass die
Vernetzungen an zwei Orten gelegen sein müssen, wobei beide, die
N- und die C-terminalen Telopeptidregionen beteiligt sind.
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Henkel et al., Henkel, W., et al., Eur.J. Biochem (1987) 165
427-436 bestimmten die Aminosäuresequenzen, die mit den
Vernetzungen im aus Aorta isolierten Typ I Kollagen verbunden
sind. Diese Sequenzen sind verschieden von jenen, welche für
Typ II Kollagen erhalten werden. Ähnliche Ergebnisse wurden
von Eyre et al. gefunden, Eyre, D. R., et al., FEBS (1987)
2 : 337-341, die zeigten, dass die Vernetzungen aus Typ IX und
Typ II Kollagenen unterschiedliche Peptide anzeigten, welche
an die Pyridinolinvernetzungen geknüpft sind.
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Die PCT Anmeldung WO89/04491 auf die Washington Research
Foundation schlägt einen Urinassay zum Messen der
Knochenresorption durch Detektion der spezifischen Vernetzungen im Urin,
welche durch ihre mit Kollagen assoziierten Peptidverlängerungen
gekennzeichnet sind, vor. Der Assay beruht auf der
Quantifizierung der Peptidkonzentrationen in einer Körperflüssigkeit,
wo die Peptidfragmente, welche eine Pyridiniumvernetzung
aufweisen, von der Knochenresortption abgeleitet sind. Zwei
spezifische Einheiten, welche Peptidverlängerungen haben, die als
mit Knochenkollagen assoziiert vermutet wurden, sind
beschrieben. Diese wurden aus Urin von Patienten erhalten, die unter
der Paget Krankheit leiden, eine Krankheit, die hohe
Geschwindigkeiten des Knochenauf- und -abbaus mit sich bringt.
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Macek, et al., Macek, J., et al., Z. Rheumatol. (1987), 46
237-240, schlugen einen Assay für Osteoarthrose vor, der auf
den, mit den Vernetzungen des Kollagenverfalls
zusammenhängenden Peptiden beruht. Bei diesem Ansatz wurde die Urinprobe
nach Größe für Peptide eines Molekulargewichts von über 10 kd
aufgetrennt, wobei die Peptide dann durch HPLC unter
Verwendung eines Fluoreszenzdetektors aufgetrennt wurden, um jene
Fraktionen zu bestimmen, die die Fluoreszenz aufgrund des
Pyridiniumringes enthalten. Die von Patienten mit Osteoarthrose
erhaltenen Spektren wurden mit jenen von gesunden Patienten
verglichen und es war leicht aufzuzeigen, dass die Vielzahl
der Fluoreszenzpeaks, die mit dem Krankheitsumstand
zusammenhängen im gesunden Gegenstück abwesend waren. Weiterhin ergab
Urin desselben kranken Patienten zwei Wochen nach der
Gesamtendoprostese der kranken Hüfte, wobei die Produkte der
Oste
oarthrose abnahmen, ein Spektrum von Fluoreszenzpeaks, welches
zu jenem von Normalen ähnlicher war. Weiterhin war das
Osterarthrosespektrum leicht zu unterscheiden von jenem, dass von
Patienten mit Osteoarthrose erhalten wurde. Die größere
Ähnlichkeit des Osteoarthrosespektrums zu jener des Spektrums von
normalen Kontrollen wurde von den Autoren der höheren
Aktivität von Proteasen bei Osteoarthrose zugeordnet. Von dieser
wurde vermutet, dass sie Kollagenstrukturen in kleinere, in
ihrem System nicht nachweisbare Fragmente verdaut.
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Untersuchungen der erhöhten Gehalt an Gesamt-3-
Hydroxypyridiniumringvernetzungen in hydrolysiertem Urin von
Patienten mit Osteoarthrose wurden auch als Methode zur
Diagnose dieser Krankheit von Black et al., Black, D., et al.,
Annals of Rheumatic Diseases (1989) 48 : 641-644 vorgeschlagen.
Die Niveaus von, "hydrolysierter" Vernetzung bei Patienten mit
Osteoarthrose (ausgedrückt als Verhältnis dieser Verbindung zu
Kreatin) waren um einen Faktor von 5 verglichen mit den
Kontrollen erhöht. Bei dieser Methode waren von Hydroxylysin
abgeleitete Vernetzungen von jenen, von Lysin abgeleiteten
unterscheidbar; nur die von Hydroxylysin abgeleiteten
Vernetzungen waren messbar erhöht. In einer weitergehenden Untersuchung
unter Verwendung hydrolysierter Urine zeigten Seibel et al.,
Seibel et al., J. Rheumatol. (1989) 16 : 964-970 signifikante
Erhöhungen bei der Ausscheidung von knochenspezifischen
Vernetzungen in Bezug auf Kontrollen in sowohl rheumatischer als
auch Osteoarthrose, aber die markantesten Erhöhungen an von
Hydroxylysin abgeleitetem Pyridinium waren in Patienten mit
Osteoarthrose.
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Während diese, auf die Anwesenheit von aus Kollagen stammenden
Vernetzungen bezogenen Maße als Indices des Abbaus
spezifischer Kollagentypen verwendet wurden, einschließlich jener von
Knochen wurden umgekehrt Anstrengungen unternommen, Marker für
die Knochenbildung zu identifizieren. Delmas et al., Delmas,
P. D., et al., J. Bone Mineral Res. (1986) 1 : 333-337,
verwen
deten den Gehalt an GLA-Protein im Serum als Marker für die
Knochenbildung in der Osteoporose nach den Wechseljahren
(Lancet (1984) 1091-1093).
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Es gibt viele Situationen bei Menschen und Tieren, die durch
hohe Gehalt an Knochenresorption und durch eine unnormale
Balance zwischen Knochenbildung und Knochenresorption
gekennzeichnet sind. Unter den am besten bekannten von diesen sind
Osteoporose und die Paget Krankheit. Hingegen treten
Abnormalitäten im Knochenmetabolismus bei einer Vielzahl anderer
Zustände, einschließlich dem Voranschreiten von gutartigen und
bösartigen Tumoren von Knochen und metastatischen Krebsarten,
die auf Knochenzellen übertragen wurden, von beispielsweise
anfänglichen Prostata- oder Brusttumoren auf. Andere Zustände
umfassen Osteoporose, Knochenerweichungskrankheiten, Rachitis,
unnormales Wachstum bei Kindern, Nierenosteodystrophie und
medikamentöse Osteopenie. Unregemäßigkeiten im
Knochenmetabolismus sind oft auch Nebeneffekte von Schilddrüsenbehandlungen
und Schilddrüsenbedingungen an sich, so wie Primäre
Hypothyreose und Thyrotoxikose sowie die Cushing-Krankheit. Es wäre
nützlich, eine Diagnostik zu haben, die leicht der Zustand
eines Subjekts als eine Unregelmäßigkeit des Knochenmetabolismus
erkennt, sogar ohne ein genaues Syndrom unter der möglichen
Auswahl, wie solche, die hier aufgelistet sind, zu definieren.
Zusätzliche Tests auf dem Gebiet der bekannten
Knochenkrankheiten können, wenn sie erst einmal etabliert ist, dass dies
die Teilmenge von Problemen, aus denen die Diagnose
hervorgeht, durchgeführt werden.
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Die vorliegende Erfindung umfasst Antikörper,
Antikörperfragmente und Kits zum Gebrauch in eben solch einem Screeningtest,
der im allgemeinen für Knochenmetabolismusabnormalitäten ist.
WO/89/12824 beschreibt Methoden zum Überwachen des
Kollagenabbaus, welche eine Bestimmung von nicht hydrolysierten
biologischen Flüssigkeitsproben, beispielsweise einer Urinprobe,
auf
weisen, zur Bestimmung der Menge an Pyridiniumspecies, welche
daran Aminosäuren oder Zucker gebunden haben.
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Die vorliegende Erfindung betrifft diagnostische Antikörper
und Kits zum Gebrauch in einem direkten, wenn gewünscht nicht
invasiven Test zum Identifizieren von Subjekten, die
Bedingungen aufweisen, welche durch Abnormalitäten in der
Knochenbildung und Knochenresorption und dem Gleichgewicht zwischen
diesen gekennzeichnet sind. Der Test basiert auf der
Quantifizierung aus Kollagenabbau stammender nativer, peptidfreier,
unglykosylierter Pyridinolin- oder
Desoxypyridinolinvernetzungen, die in biologischen Flüssigkeiten wie Serum oder Urin
vorliegen. Der Test ist spezifisch ausgerichtet auf jede
einzelne oder beide Formen der Vernetzung, welche in solchen
Flüssigkeiten in unglykosylierten Formen auftreten, unabhängig
von zusätzlicher Aminosäuresequenz, die mit kondensierten
Lysyl- oder Hydroxylysylresten assoziiert ist, welche von
Kollagen abgeleitete Vernetzungen bilden.
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Dieser Test kann durch Abschätzung des Gehalts dieser
Abbauprodukte im Vergleich zu Indikatoren der Knochenbildung
feinabgestimmt werden. Zusätzliche Information, je nach Zustand
des Subjekts, kann erhalten werden, wenn gefunden wird, dass
der Unterschied zwischen dem Niveau der Knochenresorption, wie
durch die Gegenwart nativer freier Vernetzungen in der
biologischen Flüssigkeit gekennzeichnet, und dem Niveau der
Knochenbildung, wie durch den Indikatorgehalt gekennzeichnet,
derselbe oder verschieden von jenem normaler Subjekte ist. Im
allgemeinen sind jene, welche an Störungen leiden, die die
Skelettstruktur abbauen, gekennzeichnet durch größere
Unterschiede zwischen Resorptions- und Aufbaugeschwindigkeiten,
wobei die Resorption überwiegt.
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Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine
Zusammensetzung zur Verfügung, welche einen Antikörper oder ein
immun
reaktives Fragment davon umfasst, welches spezifisch mit der
nativen Form von peptidfreien Desoxypyridinolin, peptidfreien
unglykosyliertem Pyridinolin oder beiden immunreaktiv ist.
Es wurde hierbei vom Erfinder gefunden, dass Antikörper, die
an die hydrolysierten freien Vernetzungen binden, die aus
Geweben oder biologischen Flüssigkeiten durch Behandlung mit
Säuren erhalten werden, nicht kreuzreaktiv sind mit nativen
freien Vernetzungen - weder solche, welche eine
Lysylseitenkette aufweisen noch solche, welche eine
Hydroxylysylseitenkette aufweisen. Hingegen können die Antikörper, die
spezifisch für diese freien Vernetzungen sind, hergestellt werden.
Diese Antikörper müssen nicht kreuzreaktiv mit den
hydrolysierten Formen sein; für Zwecke des direkten Abschätzens
biologischer Proben macht dies nichts aus, da die hydrolysierten
Formen nicht vorliegen. Diese Antikörper können, wenn
gewünscht zur Unterscheidung zwischen den Lysyl- und
Hydroxylysylseitenketten umfassenden nativen freien Vernetzungsformen
hergestellt werden. Aufgrund vorheriger Erfahrung mit
polyklonalen Antikörpern gegen hydrolysiertes Pyridinolin ist es
wahrscheinlich, dass die Antikörper die freien Formen von den
nativen peptidenthaltenden Formen unterscheiden.
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Die erfindungsgemäßen Antikörper können in einem Verfahren zum
Identifizieren einer Teilmenge arthritischer Krankheiten durch
Bestimmung des Abbaus anderer Bindegewebe, einschließlich
Sehnen eingesetzt werden, wobei das Verfahren die Bestimmung des
Verhältnisses von Hydroxylysylseitenkettenvernetzungen zu
Lysylseitenkettenvernetzungen (Pyd/Dpd) in einer biologischen
Flüssigkeit des Subjekts und den Vergleich dieses
Verhältnisses zu jenem in normalen Kontrollen umfasst, wobei ein Anstieg
dieses Verhältnisses in dem Subjekt gegenüber normalen
Kontrollen einen Sehnenabbau in diesem Subjekt anzeigt.
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Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Kit zur
Bestimmung der Menge der nativen Form von peptidfreiem
Desoxypyridi
nolin, peptidfreiem, nicht glykosyliertem Pyridinolin oder
beiden in einer Körperflüssigkeitsprobe, zum Gebrauch beim
Screening auf die Anwesenheit einer
Knochenmetabolismusabnormalität, die charakteristisch ist für Osteoarthritis, Paget
Krankheit oder bösartigen Tumor oder metastatischen Krebs in
Knochen, wobei dieser Kit folgendes umfasst: eine
Zusammenstellung, welche einen Antikörper oder ein immunreaktives
Fragment davon, der/das spezifisch immunreaktiv mit der
nativen Form von peptidfreiem Desoxypyridinolin, peptidfreiem,
nicht glykosyliertem Pyridinolin oder beiden ist zumindest
ein weiteres Reagenz und Anleitungen zur Durchführung dieses
Assays.
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Der Kit kann ein Set von Behältern, von denen zumindest einer
die Antikörperzusammensetzung enthält, welche spezifisch mit
nativem, freiem Pyd oder Dpd immunoraktiv ist, und mindestens
einer ein zusätzliches Reagenz zur Durchführung des
Immunoassays zum Markieren gemäß der Anleitungen zur Durchführung des
Assays enthält. Vorzugsweise ist die biologische Flüssigkeit
ein Serum oder Urin. Die freien Vernetzungen können dann als
gesamte native, freie Vernetzungen bestimmt werden. Hingegen
können die freien Vernetzungen individuell als
Lysylseitenkettenvernetzungen (Dpd) oder als
Hydroxylysylseitenkettenvernetzungen bestimmt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
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Fig. 1 zeigt ein Chromatographiemuster von Pyridinolin, aus
einem sauren Hydrolysat, ein Muster von Pyridinolin
überlagernd, das ohne Hydrolyse aus Urin erhalten wurde. Die Figur
vergleicht weiterhin das Elutionsmuster, wie es über
Fluoreszenz bestimmt wurde mit dem aus Hydrolysat gewonnenen
Elutionsmuster, wie sie durch Reaktion mit Anti-
Pyridinolinantikörpern bestimmt wurde.
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Die Erfindung ergibt eine Verbesserung gegenüber gegenwärtig
verfügbaren Methoden zur Diagnose von Knochenstörungen oder
Krankheiten, die durch Unregelmäßigkeiten im
Kollagenmetabolismus gekennzeichnet sind. Sie nutzt Änderungen in den
Gehalten an aus Kollagen stammenden Pyridinvernetzungen in
biologischer Flüssigkeit als Index für diese Unregelmäßigkeiten.
Methoden nach Stand der Technik enthielten die Hydrolyse einer
Probe, typischerweise Urin, um Analyte in Form von
hydrolysierten Vernetzungen, frei von Seitenketten bereitzustellen,
die dann in einem Immunoassay unter Verwendung von bezüglich
der hydrolysierten Vernetzungen erzeugten Antikörpern
quantifiziert werden können. Während dieses Verfahren brauchbare
Information liefert, verhindert die vorher erforderliche
Hydrolyse, dass der Assay ein einfacher, klinischer Assay wird, der
direkt mit einer unbehandelten biologischen Probe ausgeführt
wird.
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Es wurde nun von den Erfindern gefunden, dass bezüglich der
hydrolysierten Formen der Pyridiniumvernetzung erzeugte
Antikörper nicht kreuzreagieren, weder mit den freien
Vernetzungen, die in Urin oder anderen biologischen Flüssigkeiten
vorliegen noch mit diesen, mit Peptiden konjugierten Vernetzungen
vor der Hydrolyse. Daher können die nach Stand der Technik
erhältlichen Antikörper nicht direkt mit unbehandelten
biologischen Proben verwendet werden.
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Die vorliegende Erfindung überwindet diesen Nachteil, indem
sie Reagenzien verfügbar macht, die man direkt mit der
biologischen Probe reagieren lassen kann, um die Vernetzungen zu
bestimmen, die in freier Form als jenes Diastereomer
vorliegen, das vor das Hydrolyse vorlag. Wie in den folgenden
Beispielen gezeigt, ergibt die direkte Messung dieser freien und
unhydrolysierten Vernetzungen Daten, die mit jenen
vergleichbar sind, die mit dem derzeit erhältlichen, komplizierteren
Assay erhältlich sind.
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Einige Hintergrundinformationen werden bezüglich der
enthaltenen Vernetzungsstrukturen nützlich sein.
Natur der Vernetzungen
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Die Abkürzungen Dpd und Pyd werden hierbei verwendet, um die
bekannten Formen der isolierten Vernetzung selbst zu
bezeichnen. Pyd oder Pyridinolin bezieht sich auf gebildete
Vernetzungen, wobei das Ring-N von einer ε-Aminogruppe eines
Hydroxylysylrestes stammt; Dpd oder Desoxypyridinolin bezieht sich
auf gebildete Vernetzungen, wobei das Ring-N von einer
Aminogruppe eines Lysylrestes stammt. (Verschiedene Methoden
zur Bezeichnung dieser Variationen wurden verwendet; zum
Beispiel HP wurde verwendet, um die "Hydroxylysyl-Form zu
bezeichnen und LP wurde verwendet, um die"Lysyl"-Form zu
bezeichnen.)
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Insbesondere wurde von Dpd vermutet, dass es Verbindungen der
Formel
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darstellt und von Pyd wurde vermutet, dass es Verbindungen der
Formel
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darstellt.
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Es ist ersichtlich, dass beide Vernetzungsformen 1,4,5
trisubstituierte 3-Hydroxypyridiniumreste sind. Pyd hat eine
freie Hydroxygruppe an der Seitenkette, welche glykosyliert
werden kann und es ist bekannt, dass es in einigen Geweben
glykosyliert werden kann. Die Glykosylierung ist empfindlich
gegen Säure und auch gegen Base, aber zu einem geringeren
Grad. Von Pyd wurde gezeigt, dass es als Gal-Pyd auftritt. Der
Erfinder hat hierbei ebenso die Anwesenheit von Glc.Gal-Pyd
im Urin gezeigt (siehe PCT-Anmeldung WO 89/00715). Diese
Formen von freiem Pyd umfassen Acetale, die jeweils mit den
Seitenkettenhydroxygruppen verbunden sind.
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Es ist ersichtlich, dass Dpd drei chirale Zentren enthält -
jene der drei chiralen α-Amino-Positionen in den Seitenketten.
Pyd enthält vier solcher Zentren, da es ein zusätzliches
chirales Zentrum an der Seitenkettenhydroxygruppe gibt.
Vermutlich sind die drei α-Aminogruppen in den unhydrolysierten
Proben, seien sie weiterhin zu Peptiden derivatisiert oder nicht,
abgeleitet aus nativ auftretenden L-Enantiomeren und die OH-
Gruppe ist in einer Konfiguration, die ebenfalls durch das
biologische System festgelegt ist.
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Wie in dem obigen Hintergrundsabschnitt dargelegt, liegt ein
beträchtlicher Anteil der Vernetzungen im Urin (etwa 40% in
Erwachsenen) in der Form von "freien Vernetzungen" vor - z. B.
gibt es keine Peptidketten, die an das Pyd, glykosyliertes Pyd
oder die Dpd-Strukturen, die oben gezeigt sind, konjugiert
ist, sogar bevor die Hydrolyse der Probe durchgeführt wurde.
Daher sind mit "freien Vernetzungen Verbindungen der oben
gezeigten Formel gemeint.
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Es sei angemerkt, dass bezüglich Pyd und Dpd die Chiralität
der chiralen Zentren nicht spezifiziert ist. Daher bezieht
sich "frei" auf diese Vernetzungen, seien sie den obigen
Hydrolysebedingungen ausgesetzt worden oder nicht. Die
vorliegende Arbeit zeigt, dass diese "freien Vernetzungen sich in der
Chiralität unterscheiden, wenn sie in ihrer "nativen Form
erhalten werden, verglichen mit ihrer "hydrolysierten" Form. Wie
hier verwendet, bezieht sich "native freie Vernetzungen auf
Dpd oder Pyd oder deren glykosylierte Formen, da sie in freier
Form in der biologischen Probe vorliegen; "hydrolysierte
freie Vernetzungen bezieht sich auf diese Strukturen, da sie
als Hydrolysate vorliegen. Selbstverständlich werden, da die
glykosydische Bindung empfindlich gegen die
Hydrolysebedingungen ist, "hydrolysierte freie Vernetzungen keine Zucker
enthalten.
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Da native freie Vernetzungen das Produkt des biologischen
Systems sind, wird angenommen, dass die biologisch bevorzugte
Chiralität an allen drei oder vier chiralen Zentren auftritt.
Vermutlich sind die drei chiralen Zentren vertreten durch die
α-Aminogruppen der Seitenketten in der L-Konfiguration, wie in
der natürlich auftretenden Aminosäure und die Chiralität des
Kohlenstoffs, welcher das Seitenkettenhydroxyl in Pyd trägt,
ist ebenso Vertreter einer einzigen Konfiguration. Dies wird
durch die in Fig. 1 gezeigten Ergebnisse bestätigt, in
welcher die gepunktete Linie das Ergebnis einer Ionentausch-
Chromatographie auf sulfonierten Polystyrolkugeln (7 u)
darstellt, equilibriert mit Natriumcitrat und durchgeführt mit
dem vorher isolierten Pyd in seiner nativen freien Form. Wie
in Fig. 1 zu sehen, eluiert das direkt aus Urin isolierte Pyd
bei einem einzigen Peak. Dies stimmt mit dem Vorliegen nur
eines einzigen Diastereomers überein.
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Hingegen eluiert das hydrolysierte freie Pyd nach Hydrolyse
als eine Mischung, wie durch die durchgezogene Linie in Fig.
1 gezeigt. Dies ist konsistent mit der Racematbildung an den
chiralen Zentren, um eine Mischung von Diastereomeren zu
erhalten, welche nicht mehr identisches chromatographisches
Verhalten zeigen. Ahnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn
natives freies Dpd mit hydrolysiertem freien Dpd verglichen wird.
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Die "nativen freien" Vernetzungen unterscheiden sich daher von
den hydrolysierten freien Formen der Vernetzungen. Es scheint,
dass bei konventioneller Säurehydrolyse die Racematbildung
auftritt, welche die Konfiguration von einigen der Moleküle
ändert. Die Verstärkung der Ausbeute von gesamt "nativen
freien" Vernetzungen in der biologischen Probe kann hingegen auch
durch proteolytische Behandlung des gesamten nativen Dpd und
Pyd erhalten werden, um die native freie Vernetzungsform
freizusetzen. Weiterhin sind die Vernetzungen an sich über die
Spezies hinweg identisch und andere Spezies außer Menschen
könnten verwendet werden, um native freie Vernetzungsstandards
zum Gebrauch in dem Assaysystem oder zum Gebrauch als
Immunogene herzustellen. Insbesondere enthält Schweineurin hohe
Mengen an nativen freien Vernetzungen. Jede Quelle für die
biologisch wichtigen Diastereomere kann verwendet werden.
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Es wurde hier vom Erfinder gezeigt, dass die Antikörper, die
gegen freies Pyd erzeugt wurden, das als Ergebnis der
Hydrolyse erzeugt wurde - wobei zum Beispiel das Immunogen durch
Behandlung der biologischen Flüssigkeiten oder des biologischen
Gewebes in konzentrierter Säure erhalten wird - so dass
Peptidbindungen zerstört werden und Pyd von Dpd getrennt wird,
keine oder kaum Kreuzreaktivität mit den nativen freien Formen
von sowohl Dpd als auch Pyd zeigen. Gegen das aus dem
Hydrolysat gebildete Pyd erzeugte Antikörper kreuzreagieren weiterhin
nur schwach mit dem so gebildeten Dpd. Antikörper, die gegen
Pyd aus einem Säurehydrolysat von Knochen oder Sehnen erzeugt
wurden, kreuzreagieren mit den Vernetzungen im Urin nach
Säurehydrolyse.
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Ein typisches Set von Ergebnissen ist in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse eines ELISA-Assays unter
Verwendung von Antiserum, welches durch Immunisierung mit dem
Pyd-Hydrolysat, welches aus Knochen isoliert wurde, erhalten
wurde. Das ELISA verwendet diese Hydrolysate als Antigen und
die Ergebnisse sind angegeben als Ausdruck der Fähigkeit der
Vernetzungskandidaten, die Bindung des Hydolysatantigens an
das Antiserum zu behindern. Unter Verwendung dieses Kriteriums
waren Antikörper, die durch Immunisierung von Kaninchen gegen
Pyd, welches aus einem Säurehydrolysat von Sehnen oder Knochen
isoliert wurde, erhalten worden, nur 5% kreuzreaktiv mit Pyd
in seiner nativen freien Form aus Urin (U-Pyd), auch wenn
vollständig kreuzreaktiv mit Pyd nach Hydrolyse in Säure der
gereinigten freien Vernetzung, welche aus Urin isoliert wurde.
Diese Antikörper waren weiterhin 20% kreuzreaktiv mit Dpd,
welches aus dem Knochenhydrolysat isoliert wurde und wobei
weniger als 1% kreuzreaktiv mit Dpd in seiner nativen freien
Form aus Urin (U-Dpd) war; etwa 70% der Reaktivität mit diesen
Antikörpern wurde nach Säurehydrolyse der nativen Form
erhalten (Tabelle 1).
Tabelle 1
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Dies wird weiterhin in Tabelle 1 gezeigt, welche, wie oben
angegeben, das Ergebnis einer Ionentausch-Chromatographie auf
natriumcitratequilibrierten sulfonierten Polystyrolkugeln
(7 u) darstellt. Die Elutionsmuster für das freie Pyd und das
Säurehydrolysat aus Urin wurden durch Fluoreszenz bestimmt.
Von Antikörpern, die gegen das Säurehydrolysat erzeugt wurden,
wurde gezeigt, dass diese signifikant nur mit dem Hydrolysat
reagieren. Die Diskrepanz in der Reaktivität der beiden
Hydrolysathauptpeaks lässt sich zu der unterschiedlichen
Immunogenität dieser Fraktionen zuordnen.
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Herstellung der Antikörper für native freie Vernetzungen
Antikörper werden für die native freie Vernetzung hergestellt,
entweder als Gesamtfraktion, oder vorzugsweise für jede
Verbindung dieser Fraktion. Eine allgemeine Trennung der
Pyridiniumverbindung in ihren freien Formen von den Fragmenten,
welche Protein enthalten, kann beispielsweise erreicht werden
durch die Methode von Fujimoto, D., J. Biochem. (1983) 94:
1133-1136 (supra). In dieser Präparation werden ein
Urinkonzentrat auf eine Sephadex G-10-Säule aufgetragen und die
gesamten Pyridinium enthaltenden Fraktionen eluiert. Das Eluat
wird dann auf eine Säule aus Phosphozellulose aufgetragen, die
mit Natriumcitrat equilibriert ist und mit Salz eluiert.
Dieses eher einfache Verfahren führt zu den freien Vernetzungen
als einem einzigen Peak. Da die Probe nicht Hydrolyse-
Bedingungen unterzogen wird, enthält dieser Peak nicht nur die
Dpd- und Pyd-Formen, sondern auch glykosyliertes Pyd
einschließlich Gal-Pyd und Glc.Gal-Pyd, wie oben beschrieben.
Weitere Trennung dieser nativen freien Vernetzungsfraktion
wird dann bequem nach Standardverfahren durchgeführt,
beispielsweise unter Verwendung von Ionenaustausch auf
sulfonierten Polystyrolkugeln, wie oben beschrieben oder unter
Verwendung von HPLC. Typische Protokolle für diese Trennung werden
beispielsweise gefunden in: Black, D., et al., Anal Biochem
(1988) 169 : 197-203; Seibel, M. J., et al., J Rheumatol (1989)
16 : 964-970.
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Die Antikörper-Herstellung geschieht gemäß herkömmlichen
Techniken einschließlich Injektion einer Mischung oder der
individuellen Komponenten, welche mit einem Carrier konjugiert sind,
in geeignete Säugetier-Subjekte sowie Kaninchen oder Mäuse
gemäß immunologischen Protokollen, die allgemein im Stand der
Technik bekannt sind.
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Die Materialien werden mit Carriern konjugiert wie BSA oder
Tetanus-Toxoid unter Verwendung von Standard-Konjugierungs-
Verfahren, um die Immunogenität zu erhöhen. Die Sera werden
titriert, um die Antikörperbildung bezüglich des Immunogens zu
bestimmen. Wenn gewünscht, können Milzzell- oder periphere
Blutlymphozyten entnommen werden und immortalisiert werden, um
Zellkulturen herzustellen, die zu einer kontinuierlichen
Herstellung von monoklonalen Antikörpern, welche mit der
gewünschten Komponente immunreaktiv sind, fähig sind. Diese
Präparationen haben erhöhte Spezifität bezüglich der
individuellen Verbindungen.
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Daher können polyklonale Antisera erhalten werden, welche
spezifisch immunreaktiv sind mit der nativen freien Form der
Vernetzungen, welche in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere
im Urin auftritt. Mit spezifischer Immunoreaktivität ist
gemeint, dass das Serum in der Lage ist, Komplexe mit den
nativen freien Vernetzungsformen in der Flüssigkeit zu bilden, mit
genügend höherer Affinität im Vergleich zu anderen Materialien
in der Flüssigkeit, um die Bestimmung der nativen freien
Formen in einem Immuno-Assay zu erlauben. Ein Teil des
polyklonalen Antiserums, welches entweder bezüglich der Mischung der
nativen freien Formen oder bezüglich der individuellen
Verbindungen hergestellt wurde, kann mit den nativen Formen
kreuzreagieren, welche Peptidketten angehängt haben; die Assays
können entweder durch Herstellung von monoklonalen Antikörpern,
welche nicht der Art kreuzreagieren, standardisiert werden
oder durch Standardisierung zur Berücksichtigung dieser
Kreuzreaktivität.
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Die Verfügbarkeit von Routmetechniken zum Erhalten
monoklonaler Antikörper-Präparationen erlaubt reproduzierbare
Reproduktion von Antikörpern der gewünschten Spezifität. Durch
Verwendung eines Screening-Verfahrens, welches als Kriterium die
Fähigkeit des immortalisierten Zellüberstands verwendet, mit
beispielsweise nativem freien Pyd kreuzzureagieren, aber weder
mit nativem freien Dpd noch mit Formen der Vernetzungen, die
weiter an Peptide konjugiert sind, reagieren zu können, kann
eine verlässliche Quelle von Antikörpern erhalten werden,
welche nur mit nativem freien Pyd reagiert. Dahingegen kann es
vorteilhaft sein, beim Abschätzen biologischer Proben
Cocktails von Antikörpern mit diesen einzigartigen Spezifitäten
einzusetzen, so dass alle nativen freien Formen bestimmt
werden.
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Immortalisierte Zelllinien, welche Antikörper der gewünschten
Spezifität abgeben, können in vitro kultiviert werden, zur
Herstellung praxisgerechter Mengen der gewünschten
monoklonalen Antikörper unter Verwendung von bekannten
Säugetierzelltechniken nach Stand der Technik. Solche Kulturtechniken sind
bereits auf kommerzieller Ebene erhältlich. Ferner können
immortalisierte Zelllinien in Mäuse injiziert werden und eine
etwas rohere Präparation der monoklonalen Antikörper als die
Aszitesflüssigkeit (ascites fluid) isoliert werden. Die
Antikörper-Präparation kann ebenso affinitätsgereinigt werden,
wenn gewünscht, unter Verwendung des Iimmunogens als ein
Affinitätsligand.
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Es sollte angemerkt werden, dass, während es
selbstverständlich ist, dass Antikörper, die bezüglich der hydrolysierten
freien Formen von aus Kollagen stammenden Vernetzungen
hergestellt wurden, nicht mit den nativen freien Formen reagieren
konnten, es nicht von Bedeutung ist, ob das Gegenteil wahr
ist, da die hydrolysierten Formen nicht in den
unhydrolysierten biologischen Proben vorliegen. Daher sind Screening-
Verfahren zum Sicherstellen der Abwesenheit von diesen
Kreuzreaktivitäten unnötig.
Durchführung der Immuno-Assays
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Dementsprechend ist es unter Verwendung eines Immuno-Assays
mit wie oben beschrieben hergestellten Antikörpern möglich,
eine biologische Flüssigkeitsprobe zu untersuchen, ohne
vorherige Fraktionierung oder Hydrolyse. Die Spezifität für die
ge
wünschte Form von nativem freien Pyd oder Dpd oder beiden wird
durch die Antikörper-Präparation geliefert.
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Die Immuno-Assays selbst werden durchgeführt unter Verwendung
der Vielzahl von Standard-Assay-Protokollen, die allgemein
nach Stand der Technik bekannt sind. Wie allgemein verstanden,
wird der Assay so gestaltet, dass er auf der Wechselwirkung
zwischen dem spezifischen Antikörper und dem gewünschten
Analyt zur Spezifität und zur Verwendung zum Detektieren des von
dem Analyt und dem Antikörper selbst gebildeten Komplexes
beruht. Die Komplexbildung kann zwischen dem Antikörper selbst
und einem immunologisch reaktiven Fragment davon sein, sowie
ein Fab, Fab' oder F(ab')&sub2;-Fragment. Der Antikörper oder das
immunologisch reaktive Fragment davon können mit einem festen
Träger komplexiert werden und als Fangantikörper für den
Analyt eingesetzt werden. Dieses Protokoll kann in direkter Weise
durchgeführt werden, wobei die Bildung des Analyt-
/Antikörperkomplexes durch eine fluoreszierende, radioaktive
oder enzymatische Markierung detektiert wird, oder er kann auf
kompetitive Weise durchgeführt werden, wobei ein markierter
Standard mit dem Analyt um den Antikörper konkurriert. Die
Ausführung kann ebenso als Agglutinations-Assay gestaltet
werden oder der Komplex kann durch Zugabe eines geeigneten
Fällungsreagenzes zu der Reaktionsmischung gefällt werden. Die
spezifische Gestaltung des Immuno-Assay-Protokolls steht einer
Vielzahl von Wahlmöglichkeiten offen, und die Anzahl von
klinischen Assay-Vorrichtungen und -protokollen, welche nach
Stand der Technik erhältlich sind, ist ein Vielfaches.
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Die Antikörper zum Durchführen eines Immuno-Assays unter
Verwendung von Standard-Detektionsprotokollen - zum Beispiel,
beispielsweise Radioisotop-Markierung, Fluoreszenz-Markierung
oder ELISA, entweder in direkter oder kompetitiver Form können
vorteilhaft als Kits bereitgestellt werden, welche die
notwendigen Komponenten und Anleitungen für den Assay umfassen.
Da Antikörper spezifisch gegen die Formen der nativen freien
Vernetzungen erzeugt werden können, welche die
verschiedenartigen Formen davon umfassen, können die Verhältnisse dieser
Verbindungen bestimmt werden ebenso wie ihre individuellen
Gehalte und ihre Gesamtmenge.
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Daher kann der Assay so gestaltet werden, dass er Antikörper
oder immunologisch reaktive Fragmente davon umfasst, was zur
Bestimmung der gesamten freien nativen Vernetzungen führen
wird, oder zur Bestimmung von nativem freien Pyd, Dpd, Gal-Pyd
oder Glc.Gal-Pyd oder jeder gewünschten Kombination davon. Da
die Gehalte der Pyd- und Dpd-Vernetzungen in verschiedenen
Geweben bestimmt werden können, kann die Veränderung der
relativen Mengen verwendet werden als Index für den Abbau des
speziellen fraglichen Gewebes. Zum Beispiel bleibt für die
meisten Erwachsenen das Verhältnis Pyd/Dpd über die Erwachsenen-
Periode hinweg konstant. Da Knochen ein Pyd/Dpd-Verhältnis von
4 : 1 hat und die Hauptquelle von freigesetztem Dpd zu sein
scheint, kann eine Erhöhung des Verhältnisses von Dpd zu Pyd
ein Hinweis auf Knochenabbau sein. (Obwohl auch die Aorta Dpd
enthält, ist ihre Umsatzrate gering.) Die Abschätzung der
Gehalte von Dpd in biologischen Flüssigkeiten ergibt ebenfalls
ein Ergebnis, welches relativ knochenspezifisch ist. Hingegen
scheint es, dass in vielen Fällen, wo eine Knochenstörung
vermutet wird, der Gesamtgehalt freier Vernetzung (Dpd + Pyd)
auch als Maß verwendet werden kann, wenn zusätzliche
Informationen vorliegen. Wenn die Symptome nicht eine Sehnenkrankheit
vorschlagen sowie Osteoarthrose, wird der Hauptteil
überschüssiger Vernetzung in freier Form in biologischen
Flüssigkeiten tatsächlich aufgrund der Resorption von Knochen
vorliegen.
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Da andere Bindegewebe sowie Sehnen zum Großteil nur Pyd und
nicht Dpd enthalten, kann eine Erhöhung des Pyd/Dpd-
Verhältnisses Krankheiten anzeigen, welche mit einem solchen
Schaden verbunden sind.
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Während Immuno-Assays unter Verwendung der Antikörper nach
dieser Erfindung vorteilhaft sind, können die nativen freien
Pyd und Dpd-Vernetzungen ebenso auf einer Vielzahl von Wegen
bestimmt werden. Da die Pyridinolin-Verbindung fluoreszierend
ist, kann die direkte Chromatographie der Probe einer
biologischen Flüssigkeit wie im Stand der Technik beschrieben, zur
Trennung von Dpd von Pyd und von den glykosylierten Formen von
Pyd führen und die Intensität der Fluoreszenz der erhaltenen
Peaks liefert einen Index für die Quantifizierung.
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In den Verfahren, welche die Antikörper nach der Erfindung
nutzen, können daher die nativen freien Vernetzungen entweder
als Gruppe bestimmt werden oder individuell durch Bestimmung
der Intensität der Fluoreszenz von dem chromatographierten
Material.
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Wie in der PCT-Anmeldung WO 89/04491 dargelegt, auf die oben
Bezug genommen wurde, kann die Menge der Vernetzungen auch
unter Verwendung spezifischer Elektroden von passendem
Redoxpotential für das Ringsystem bestimmt werden.
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Zusätzlich zum Gebrauch der nativen freien Vernetzung als
Indikator für Knochenresorption wird das knochenmetabolische
Gleichgewicht vorteilhaft durch Kombination dieser Bestimmung
mit der Bestimmung eines Markers für Knochenbildung in
derselben oder einer anderen biologischen Flüssigkeit desselben
Individuums bestimmt. Beispielsweise umfassen solche Marker
Prokollagen Typ II, Knochenosteokalzin (auch bekannt als Knochen
GLA-Protein oder BGP); Proknochen-GLA-Protein, Matrix-GLA-
Protein (MGP), knochenspezifische Proteine wie
knochenspezifisches Sialoprotein, Phosphoproteine, alkaline Phosphatase,
Osteonektin oder andere Nicht-Kollagen-Knochenproteine.
Methoden zur Bestimmung dieser Marker sind nach Stand der Technik
wohlbekannt. Geeignete Methoden zur Bestimmung dieser Marker
können beispielsweise gefunden werden in Delmas, P. D. et al.,
J. Bone Min Res (1986) 1 : 333-337 (supra) für GLA.
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Die oben genannten Assays, welche einen Index zur Bestimmung
des metabolischen Zustands von Geweben liefern, welche von
Kollagen stammende Vernetzungen erzeugen, wenn ein Abbau
auftritt, sind in einer Vielzahl von Zusammenhängen verwendbar.
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Erstens sind sie ein Verfahren zum Abschätzen eines abnormalen
Zustandes eines Subjekts durch Anzeigen beispielsweise einer
überschüssigen Knochenresorption. Dies kann beispielsweise die
Anwesenheit eines osteoporotischen Zustandes anzeigen oder das
unglückliche metastatische Voranschreiten eines bösartigen
Tumors. Andere durch überschüssige Knochenresorption
gekennzeichnete Zustände umfassen Paget Krankheit und
Hyperparathyreose. Da der Zustand des Subjekts fortlaufend überwacht
werden kann, kann die Anwendung dieser Assays ebenso zum
Überwachen des Fortschritts der verabreichten Therapie verwandt
werden, um diese oder andere Zustände zu behandeln. Die Assays
können auch eingesetzt werden als Maß für die Toxizität, wie
sie bei Verabreichung von toxischen Substanzen oft zu
Gewebeabbau führt.
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Die Assays können daher in jeder Situation angewandt werden,
in dem der metabolische Zustand von Kollagenvernetzungen
enthaltenden Geweben als Index verwendet werden kann, für den
Zustand, die Behandlung oder für den Effekt von direkt dem
Subjekt verabreichten Substanzen oder denen das Subjekt in der
Umwelt ausgesetzt ist.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne ihren
Schutzumfang zu begrenzen.
Beispiel 1
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Assay für native freie Vernetzungen in Urin
A. Isolierung von U-Pyd und U-Dpd: Urinproben werden von
Patienten mit Paget Krankheit oder Hyperparathyreose gesammelt
(welche erhöhte Gehalte freier Vernetzungen enthalten) und von
wachsenden Kindern (in welchen etwa zehnfach höhere
Konzentrationen von Vernetzungen im Vergleich zu normalen Erwachsenen
vorliegen). Nach zehnfacher Konzentration durch Rotations-
Verdampfung werden Ausschnitte des Urins (20 Liter)
ausschnittweise der Trennchromatographie auf Zellulose CF1
unterzogen unter Verwendung von Butanol: Essigsäure: Wasser (4 : 1 : 1
v/v/v) als mobile Phase. Die von der stationären Phase mit
Wasser eluierte Pyridiniumvernetzung enthaltende Fraktion
wurde auf einer Sephadex-G-10 Säule (3,2 · 150 cm) mit 0,2 M
Essigsäure chromatographiert. Gesammelte, die Vernetzungen
enthaltende Fraktionen wurden dann auf eine Na+-Konzentration von
67 mM gebracht und auf eine Dowex (1,7 · 35 cm) 50X - X8
Ionentauscherharzsäule gebracht, die mit 67 mM
Natriumcitratpuffer pH 2,75 equilibriert wurde. Nach Erhöhung der
Säulentemperatur auf 60ºC wurde die Elution mit 67 mM Natriumcitrat bei
einem linearen pH-Gradient von 2,75 bis 5,50 über 500 ml
durchgeführt. Der Säulenausfluss wurde durch Fluoreszenz
überwacht (ex 325 nm/ emm 400 nm) und die gesammelten Fraktionen
welche U-Pyd (364-377 ml) und U-Dpd (397-416 ml) enthielten,
wurden durch Gelfiltration auf Sephadex G10 entsalzt und bis
zur Trockenheit eingedampft. Die Ausbeute von 20 Litern Urin
war 2,5 umol U-Pyd und 0,6 umol U-Dpd.
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B: Ergebnisse: Das in Absatz A dargelegte Isolierungsverfahren
dieser Probe wurde auf Urinproben von verschiedenen Patienten
angewandt und die Mengen von U-Pyd und U-Dpd wurden unter
Verwendung von Fluoreszenzmessungen bezüglich Kreatin wie nach
Stand der Technik bekannt (supra) quantifiziert. Die für
normale Individuen und bei sieben Patienten mit Knochenstörungen
und arthritischen Krankheiten erhaltenen Werte werden in
Tabelle 2 gezeigt. Die Werte sind als Mittel ± SEM angegeben
(n = 6 in jeder Gruppe).
Tabelle 2
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Diese Werte zeigen dramatisch erhöhte Gehalte der freien
Vernetzungen in Patienten, von welchen bekannt war, dass sie an
Krankheiten leiden, die durch überschüssigen Abbau von
Bindegewebe gekennzeichnet sind.
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Tabelle 3 zeigt die Verhältnisse von U-Pyd und U-Dpd als
Prozent der Gesamtvernetzung, welche nach Hydrolyse in den
verschiedenen Patientengruppen gemessen wurde.
Tabelle 3
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*berechnet als: (U-Pyd/Gesamt Pyd) · 100 und U-Dpd/Gesamt Dpd)
x 100. Für alle zusammengefassten Gruppen (n = 36) war der
Korrelationskoeffizient zwischen U-Pyd und Gesamt-Pyd 0,929
(p< 0,0001) und zwischen U-Dpd und Gesamt-Dpd 0,952 (p< 0,0001).
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Da wie in Tabelle 3 gezeigt, der Prozentsatz von U-Pyd und U-
Dpd relativ unverändert in Patienten mit abnormalem Zustand
verglichen mit Kontrollen ist, spiegeln die Konzentrationen
der freien Vernetzungen im Urin dieselbe Erhöhung im
Kollagenabbau bei Krankheiten wieder, verglichen mit den Kontrollen,
wie es die nach der Hydrolyse von Urin gemessenen
Gesamtvernetzungen tun.
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U-Pyd und U-Dpd liefern daher brauchbare Indizes für den
Kollagenabbau, um Diagnose und Überwachung von Krankheiten,
welche Abnormalitäten des Bindegewebe-Metabolismus umfassen, zu
ermöglichen.
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C: Immuno-Assay: Native freie Vernetzungen dieses Beispiels,
welche durch das in Absatz A beschriebene Verfahren isoliert
wurden, werden zur Antigenherstellung eingesetzt. U-Pyd und U-
Dpd werden weiter gereinigt durch Ionentauschchromatograhpie
mit 67 mM-Natriumcitrat Puffer pH 4,25 unter Verwendung einer
Hochauflösungsharzsäule von einem Aminosäureanalysator
(Locarte Co. Ltd. London, UK).
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Zur Immunisierung werden die isolierten Vernetzungen kovalent
an Rinderserumalbumin gebunden unter Verwendung von
Karbodiimidreagentien und nach Stand der Technik wohl bekannten
Verfahren.
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Sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper werden
gegen die Vernetzungsverbindungen im Urin erzeugt. Zur
Herstellung monoklonaler Antikörper werden Balb/C-Mäuse mit
Vernetzungs-BSA-Konjugaten aus Urin immunisiert, und
Hybridomazelllinien werden nach Standardtechniken präpariert, nach Fusion
der Zellen aus Milz oder Lymphknoten mit Ag8 Myelomazellen.
Polyklonale Antikörper werden in Kaninchen erzeugt. Ein
Screening von sowohl Antiseren als auch Hybridomazellmedien wird
mit ELISA durchgeführt unter Verwendung von Mikrotiterplatten,
welche mit dem geeigneten Vernetzungsgelatinkonjugat aus Urin
beschichtet sind, welches wie von Robins beschrieben,
hergestellt wurde, Robins, Biochem J (1982) 271 : 617-620.
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Assays für jede der Vernetzungsverbindungen, welche in freier
Form im Urin vorkommen, werden durch einen Inhibitions-ELISA
wie folgt durchgeführt:
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Urinproben (5 oder 20 ul) oder Lösungen, welche 0,2 bis 20
pmol von gereinigtem Urin-Vernetzungs-Vergleichsstandard
enthalten, werden auf 110 ul mit phosphatgepufferter
physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, welche 0,05% Tween-20 Detergens
(PBS-T) enthält, und zu 110 ul des primären Antikörpers,
immunoreaktiven Fragments oder Antiserums, was 1 : 5000-1 : 20000 in
PBS-T verdünnt wurde, zugesetzt. Jede Probe wird dreifach
prä
pariert, in mit rundem Boden versehenen, 96 Loch
Mikrotiterplatten, welche dann über Nacht bei Raumtemperatur
inkubiert werden.
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Portionen (200 ul) der Proben werden in Mikrotiterplatten mit
flachem Boden überführt, welche zuvor mit Gelatinkonjugat,
welches die geeignete Urinvernetzungskomponente enthält,
beschichtet wurde. Nach 30 Minuten wird die Platte mit PBS-T
(3x) gewaschen und die gebundenen Antikörper mit
Standardtechniken, mit einem biotinmarkierten Antikörper detektiert,
welcher gegen die Spezies des ersten Antikörpers hergestellt
wurde, zusammen mit Streptavidinperoxidase und einem
Peroxidasesubstrat-Detektionssystem. Die Farbentwicklung wird bei 492 nm
unter Verwendung eines automatisierten
Mikrotiterplattenlesegeräts gemessen. Proben, welche den Analyt enthalten,
vermindern die Bindung des primären Antikörpers an die Platte und
haben so eine verminderte Farbkonzentration. Die Menge freier
Vernetzungen in der Probe wird bzgl. der Kurven von Standards,
welche auf jeder Platte unter Verwendung von Log-Log-Plots
berechnet werden, quantifiziert.
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Der obige Assay kann umgestaltet werden, um direkt ausgeführt
zu werden, durch Beschichtung der Probe, von welcher vermutet
wird, dass sie Antigen enthält, in der Microtiterplatte mit
flachem Boden und direkter Zugabe des markierten primären
Antikörpers in die Löcher. Nach Waschen wird die Menge von
markiertem Antikörper, der in der Testlösung verbleibt, bestimmt.
Eine Verminderung der Gehalte zeigt die Anwesenheit von
Antigen an.
Beispiel 2:
Quellen von nativer freier Vernetzung.
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Um eine Quelle für native freie Vernetzungen zu bestimmen,
welche als Standard in den Assays verwendbar ist, wurde der
Urin von einer Anzahl von Spezies großer Tiere analysiert. In
Rinderurin ist das Pyd-Dpd-Verhältnis 12 ± 2 mit lediglich
etwa 15% als freie Vernetzung; die Werte bei Schafen sind
ähnlich außer, dass etwa 20-25% freie Vernetzung ist. Bei
Schweineurin ist das Verhältnis Pyd/Dpd etwa 5 ± 1 und das
Verhältnis von freier Vernetzung bezüglich Gesamtvernetzung ist
42±5%. Konzentrationen von freien Vernetzungen sind etwa 380
nM für Pyd und 70 nM für Dpd.
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Kinderurin scheint eine bessere Ausbeute an Dpd zu ergeben als
der Urin von Erwachsenen. Etwas bevorzugter Verlust von Dpd
aus Schweineurin tritt auf, wenn CF1-Zelluluose beim
Reinigungsverfahren verwendet wird, und Gesamtausbeute von Pyd 40-
50% für Pyd ist, aber nur 20% für U-Dpd. Wenn Kinderurin als
Ausgangsmaterial verwendet wird, ist die Ausbeute für beide
Vernetzungen etwa 55%.
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Dementsprechend sind sowohl Kinder- als auch Schweineurin,
geeignete Quellen für Standards für freie Vernetzungen.
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Wie oben dargelegt, konnte die Ausbeute an Vernetzung in der
Diastereomerenform, die charakteristisch für native freie
Vernetzung ist, durch Freisetzung der Gesamtvernetzungen in
diesen Quellen durch enzymatische Hydrolyseverfahren verbessert
werden, sowie die Verwendung von Exopeptidasen und
Glykosidasen.
Beispiel 3:
Pyd-Dpd in humanen Geweben
-
Analysen einer Bandbreite verschiedener Gewebe zeigten, dass
der Vernetzungsgehalt von Schädelknochen etwas höher ist als
von Trabekularknochen mit einem Pyd-Dpd-Verhältnis von etwa
4,2. Obwohl Dpd nicht in Sehnen detektiert wurde, lag diese
Vernetzung in der Aorta und ihren Verbindungen vor. Diese
Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
Tabelle 4
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Sowohl Pyd als auch Dpd sind völlig abwesend bei den
Kollagenen normaler Haut, noch liegen sie in unreifen oder neu
synthetisierten Kollagen vor.
Beispiel 4
Bestimmung von freien Vernetzungen in Osteoporose-Patienten-
Urin
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Vierundsechzig Frauen nach den Wechseljahren mit Rückgrat-
Frakturen (Typ Grad I-Osteoporose) im Alter zwischen 53 und 74
Jahren (Mittel ± Standardabweichung 64 ± 5 Jahre) wurden
untersucht. Alle Frauen hatten eine Steißknochenmineraldichte
unter dem Bruchgrenzwert von 0,98 g/cm², wie durch Dualphoton-
Absorptionsmessung gemessen wurde und Rückgratsaufnahmen,
welche drei oder mehr Frakturen ersten Grades oder eine oder
mehrere Frakturen zweiten Grades zeigten. Kein anderer sekundärer
Grund für die Osteoporose wurde identifiziert.
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Als Kontrollgruppe wurden 67 Frauen nach den Wechseljahren mit
einem mittleren Alter (±Standardabweichung) von 65 6 Jahren
(Bandbreite von 50 bis 79 Jahre) untersucht. Alle Frauen
hatten normale Rückgrat-Röntgen-Aufnahmen und
Steißknochenmineraldichten innerhalb des für das Alter normalen Bereichs, wie
durch Dualphoton-Absorptionsmessung gemessen wurde. Keine
hatte irgendeine Krankheit oder nahm Medikamente, welche dafür
bekannt sind, den Knochenmetabolismus zu beeinflussen.
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Für Messungen des Hydroxyprolins wurden die Probanden vor der
Untersuchung für drei Tage auf eine gelatinfreie Diät gesetzt,
Urinproben wurden gesammelt und Portionen wurden bei -70ºC
gelagert, bis sie analysiert wurden. Die Vernetzungen wurden
gemessen, wie im wesentlichen vorher beschrieben wurde (Black,
D., et al., Anal Biochem (1988) 169 : 197-203; Seibel, M. J., et
al., J Rheumatol (1989) 16 : 964-970). Zur Bestimmung von U-Pyd
und U-Dpd in unyhdrolysiertem Urin wurden Portionen von 0,5 ml
direkt durch Partitionschromatographie auf CF1-Cellulose
verarbeitet, welche die freie Form von den peptidderivatisierten
Formen vor dem HPLC-Schritt trennt; HPLC wurde wie für die
hydrolysierten Proben durchgeführt. Hydroxyprolin in sauren
Hydrolysaten von Urin wurde mit HPLC gemessen (Dawson, C., et
al., Clin Chem (1988) 34 : 1572-1574).
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Messungen von nativen freien Pyridiniumvernetzungen und
Gesamthydroxyprolin in Urin für die Kontroll- und
Osteoporosegruppen werden in Tabelle 5 gezeigt. Die Ergebnisse zeigten,
dass die Ausscheidung knochenspezifischer Vernetzung, U-Dpd,
wesentlich höher in der osteoporotischen Gruppe verglichen mit
der Kontrolle war.
Tabelle 5
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Gezeigt ist die Statistische Signifikanz (Student's test) der
Differenz verglichen mit der entsprechenden Kontrollgruppe:
*p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001
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Unterschiede waren weniger markant für U-Pyd; die Werte für
die glykolysierten Derivate U-Pyd.Gal.Glc waren nicht
statistisch verschieden. Die lineare Regressionsanalyse zeigte, dass
es hochsignifikante Beziehungen zwischen als Kreatinverhältnis
ausgedrückten Werten und der gesamten 24 h-Ausscheidung für
sowohl U-Pyd (r = 0,80) als auch U-Dpd (r = 0,82) gab. Diese
Beobachtung ist konsistent mit dem Befund, dass es keine
wesentlichen Tagesvariationen in der Vernetzungsausscheidung für
gesunde männliche oder weibliche Probanden gab (A. M. McLaren und
S. P. Robins unveröffentlichte Ergebnisse).
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Es gab wesentliche Korrelationen von U-Dpd mit Hydroxyprolin,
welche in der osteoporotischen Gruppe (r = 0,53; p< 0,001)
markanter waren als in den Kontrollen (r = 0,21; N. S.). Die
Beziehung zwischen U-Pyd und Hydroxyprolin war ähnlich mit
Korrelationskoeffizienten für die osteoporotische und die
Kontrollgruppe von jeweils r = 0,45 (p< 0,001) und r = 0, 34 (p< 0,01).
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Bei den Proben, wo sowohl freie als auch Gesamtvernetzungen
gemessen wurden, gab es hochsignifikante Korrelationen
zwischen diesen Werten. Für Desoxypyridinolin waren die
Korrelationskoeffizienten für die osteoporotische Gruppe (n = 25) und
die Kontrollgruppe (n = 24) jeweils 0,90 und 0,84, die
entsprechenden Korrelationen für Pyridinolin waren
r = 0,96 und r = 0,85.