DE69332655T2

DE69332655T2 - Verfahren und testsatz für pyridinium-crosslink-assay

Info

Publication number: DE69332655T2
Application number: DE69332655T
Authority: DE
Inventors: J. Cerelli; Y. Daniloff; Jeffrey Evans; Pingren He; Julia Ju; T. Kung; F. Zuk
Original assignee: Metra Biosystems Inc
Current assignee: Metra Biosystems Inc
Priority date: 1992-07-31
Filing date: 1993-07-30
Publication date: 2003-11-27
Anticipated expiration: 2013-07-31
Also published as: CA2140921C; AU4795593A; WO1994003814A3; CA2140921A1; JP3626182B2; WO1994003814A2; ES2191015T3; ATE231618T1; JPH07509780A; AU684047B2; EP0653067B1; EP0653067A1; JP2005010174A; DE69332655D1

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Menge an nativen, freien Pyridinium-Vernetzungen in menschlichen Urinproben, ein Antikörper-Reagens sowie einen Kit zur Verwendung in diesem Verfahren.

2. Literaturangaben

Black, D., et al., Anal. Biochem. 169: 197-203 (1988).
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Wong, S. S., Chemistry of Protein Conjuqation and Cross-Linking, CRC Press, Boca Raton, Florida (1991).

3. Technischer Hintergrund der Erfindung

Beim Menschen ist eine Vielzahl von Erkrankungen bekannt, die durch einen hohen Grad an Knochenresorption sowie durch ein abnormales Gleichgewicht zwischen Knochenbildung und Knochenresorption gekennzeichnet sind. Zu den verbreitetsten Erkrankungen dieser Art zählen die Osteoporose, das Paget-Syndrom sowie Erkrankungen, die mit dem Fortschreiten von gutartigen und bösartigen Knochentumoren und metastatischen Krebsgeschwulsten in Verbindung stehen, welche z. B. von Prostata- oder Brust- Primärtumoren auf Knochenzellen übertragen wurden. Andere, mit Veränderungen im Kollagen-Metabolismus in Verbindung stehende Erkrankungen schließen Osteomalacie-Erkrankungen, Rachitis, abnormales Wachstum bei Kindern, renale Osteodystrophie sowie die medikamenteninduzierte Osteopenie ein. Unregelmäßigkeiten des Knochenmetabolismus sind oftmals Nebenwirkungen von Schilddrüsenbehandlungen sowie Schilddrüsenerkrankungen an sich, wie z. B. der primären Schilddrüsenunterfunktion, der Thyrotoxicose sowie des Cushing-Syndroms.
Es ist erkannt worden, dass Funktionsstörungen bei der Knochenresorption oder andere Erkrankungen, die durch ein abnormales Gleichgewicht zwischen Knochenbildung und Knochenresorption gekennzeichnet sind, anhand des veränderten Niveaus von Pyridinium-(Quer)Vernetzungen im Urin festgestellt werden können (Robins, 1982b; Macek; Black). Diese Vernetzungen, welche aus einer Anzahl von kollagenhaltigen Geweben stammen, nehmen die Form von Verbindungen an, die einen zentralen 3-Hydroxypyridinium-Ring enthalten, bei welchem der Stickstoff im Ring von der &epsi;-Aminogruppe des Lysins oder des Hydroxylysins abgeleitet ist (Fujimoto, 1978; Robins, 1982a; Gunja-Smith; Ogawa; Eyre).
Die Pyridinium-Vernetzungsverbindungen, die im Urin gefunden werden, können in vier allgemeine Klassen eingeteilt werden: (1) Freie, native Vernetzungen mit einem Molekulargewicht von etwa 400 Dalton (Fujimoto), (2) glycosilierte Vernetzungen und Vernetzungspeptidformen mit einem Molekulargewicht von etwa 550 bis 1000 Dalton (Robins, 1983), (3) Vernetzungspeptidformen mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 3500 Dalton (Robins, 1983), 1987; Henkel; Eyre) und (4) Vernetzungspeptidformen mit einem Molekulargewicht von mehr als 3500 Dalton. Bei normalen Erwachsenen machen diese Formen etwa 38% (1), 40% (2), 15% (3) sowie 7% (4) der gesamten im Urin enthaltenen Vernetzungen aus (Daniloff). Beim Urin eines normalen Erwachsenen sind etwa 80% der freien Vernetzungen (die obige Gruppe 1) Pyridinolin (Pyd), dessen Ring-Stickstoff von Hydroxylysin abgeleitet ist, und etwa 20% sind Desoxypyridinolin (Dpd), dessen Ring-Stickstoff von Lysin abgeleitet ist. Dieses Pyd/Dpd-Verhältnis trifft in etwa auf die anderen drei Klassen der im Urin vorliegenden Vernetzungen zu. Die Vernetzungen mit höherem Molekulargewicht können mittels Säurehydrolyse in die freien Vernetzungen umgewandelt werden (Fujimoto, 1978).
Es wurden Verfahren zur Messung der Pyridinium-Vernetzungen im Urin vorgeschlagen. Eines dieser Verfahren involviert die Messung des gesamten hydrolysierten Pyd, das heißt Pyd, welches mittels umfassender Hydrolyse der im Urin enthaltenen Vernetzungen hergestellt wurde, indem der Peak des mittels HPLC abgetrennten hydrolysierten Pyd quantifiziert wird (Fujimoto, 1983). Die Beziehung zwischen dem gesamten hydrolysierten Pyd und dem Alter wurde von diesen Forschern in Form des Verhältnisses von gesamtem hydrolysiertem Pyd/Kreatinin bestimmt, wobei die Kreatininmenge zur Normierung des Vernetzungsspiegels auf die Urinkonzentration und die Skelettmasse verwendet wird. Es wurde gefunden, dass dieses Verhältnis beim Urin von Kindern hoch ist, während des Erwachsenenalters relativ konstant ist und bei hohem Alter geringfügig ansteigt. Die Autoren spekulieren, dass dieser Effekt mit dem im hohen Alter beobachteten Verlust an Knochenmasse einhergehen kann.
Es ist vorgeschlagen worden, das erhöhte Niveau der gesamten Vernetzungen im hydrolysierten Urin von Patienten mit rheumatischer Arthritis als Verfahren zur Diagnose dieser Erkrankung zu untersuchen (Black, 1989). Das Niveau der gesamten hydrolysierten Vernetzungen bei Patienten mit rheumatischer Arthritis (ausgedrückt als Verhältnis der gesamten, mittels HPLC gemessenen Vernetzungen zum Kreatinin) war im Vergleich mit Kontrollgruppen um den Faktor 5 erhöht. Indessen zeigte lediglich das gesamte hydrolysierte Pyd und nicht das gesamte hydrolysierte Dpd einen messbaren Anstieg.
Im Rahmen einer aufwendigeren Untersuchung unter Verwendung von hydrolysiertem Urin zeigten Seibel et al. sowohl bei rheumatischer Arthritis als auch bei Osteoarthritis signifikante Erhöhungen bei der Ausscheidung von Pyd- und Dpd-Vernetzungen im Vergleich zu Kontrollgruppen auf. Die bemerkenswerteste Erhöhung der Pyd-Vernetzungen trat bei Patienten mit rheumatischer Arthritis auf (Seibel et al.),
Untersuchungsverfahren wie die soeben erwähnten, welche die Quantifizierung von Vernetzungen aus hydrolysierten Proben oder von Vernetzungs-Unterfraktionen aus nicht-hydrolysierten Proben mittels HPLC involvieren, sind bei ihrer Durchführung relativ Zeit- und kostenaufwendig und können für ein umfangreiches Screening oder eine Therapieüberwachung bei Störungen des Knochenmetabolismus nicht praktiziert werden.
Es sind zur Messung der im Urin enthaltenen Vernetzungen auch Immunoassays vorgeschlagen worden. Das US-Patent Nr. 4,973,666 beschreibt ein Assay zur Messung der Knochenresorption mittels Bestimmung spezifischer Pyridinium-Vernetzungen im Urin, welche durch spezifische Peptidverlängerungen gekennzeichnet sind und mit dem Knochenkollagen in Zusammenhang stehen.
Es werden zwei spezifische Einheiten mit Peptidverlängerungen beschrieben, von denen angenommen wird, dass sie mit dem Knochenkollagen in Zusammenhang stehen. Diese werden aus dem Urin von Patienten, die am Paget-Syndrom leiden, erhalten, einer Krankheit, die dafür bekannt ist, dass sie hohe Knochenbildungs- und -zerstörungsgeschwindigkeiten involviert. Das Assay beruht auf der immunospezifischen Bindung von Vernetzungsverbindungen, welche das spezifische Peptidfragment oder die -verlängerung enthalten, an einen gegen das Vernetzungspeptid hergestellten Antikörper. Es ist nicht klar, ob und wie die Konzentration des untersuchten Vernetzungspeptids mit der Gesamtmenge an Vernetzungen im Urin in Zusammenhang steht.
Von Robins ist ein Verfahren zur Messung von Pyridinolin im Urin unter Verwendung eines gegen hydrolysiertes Pyd spezifischen Antikörpers beschrieben worden (Robins et al., 1986).
Dieses Verfahren weist die Einschränkung auf, dass sich der Antikörper als gegenüber Pyd in seiner hydrolysierten Form spezifisch erwies, was es erforderlich macht, dass die zu untersuchende Urinprobe zuerst unter hydrolytischen Bedingungen behandelt werden muss. Die hydrolytische Behandlung erhöht den Zeit- und Kostenaufwand des Assays und schließt Messungen anderer nativer Pyridinium-Vernetzungen aus.
Es ist bekannt, dass der Gehalt an Pyridinium-Vernetzungen kollagenhaltiger Gewebe im Hinblick auf seine Menge und seine Zusammensetzung in Abhängigkeit vom Gewebetyp variiert. Pyd- Vernetzungen werden im Knorpel, Knochen, Bandscheiben, Bändern und in der Aorta gefunden. Dpd-Vernetzungen, welche allgemein weniger verbreitet sind als Pyd-Vernetzungen, werden im Knochen, Dentin, Bändern und in der Aorta gefunden. Der Anteil an Dpd an Pyridinium-Vernetzungen im Gewebe scheint beim Knochen am Höchsten zu sein, welcher ein Pyd : Dpd-Verhältnis von etwa 3 : 1 bis 4 : 1 aufweist. Andererseits enthalten Pyridinium- Vernetzungen im Knorpel vorwiegend Pyd.
Ein Untersuchungsverfahren zur Beurteilung des Knochenmetabolismus, welches auf den im Urin enthaltenen Pyridinium-Vernetzungen beruht, sollte idealerweise (a) eine nicht-hydrolysierte Urinprobe verwenden, um die Notwendigkeit einer Säurehydrolyse der Probe zu vermeiden, und (b) ein Antikörper-Reagens zum Nachweis der nativen, freien Pyridiniumspezies verwenden, um dem Zeit- und Kostenaufwand der Analyse im Vergleich zu herkömmlichen, auf HPLC basierenden Tests zu reduzieren.
WO 89/04491 beschreibt ein Assay zur Beurteilung der Knochenresorption, das auf einer Messung von Kollagenpeptiden, welche Pyridinium-Vernetzungen enthalten, beruht.
WO 89/12824 beschreibt den Nachweis von Pyridinium-Vernetzungen im Urin, welche an ursprüngliche Aminosäuren oder Zucker gebunden sind.
WO 91/10141 beschreibt Verfahren zur Diagnose von Störungen des Knochenmetabolismus oder des Bindegewebsmetabolismus, welche den Schritt der Bestimmung des Niveaus der nativen, peptidfreien Pyd- oder Dpd-Vernetzungen in einer biologischen Flüssigkeit einer Testperson sowie des Vergleichs dieses Niveaus mit dem Niveau bei einer gesunden Testperson umfasst. Dieser Bestimmungsschritt wird vorzugsweise mittels eines spezifisch mit den nativen, peptidfreien Vernetzungen immunoreaktiven Antikörpers oder Antikörperfragments durchgeführt. Indessen wird in WO 91/10141 ausgesagt, dass die von Robins et al. (1982a, 1986) beschriebenen, gegen H-Pyd herangezogenen Antikörper nicht in signifikanter Weise mit dem nativen, peptidfreien Pyd und Dpd kreuzreaktiv sind.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Antikörper zur Verfügung, hergestellt durch Immunisieren eines Tiers mit hydrolysiertem Pyridinolin oder hydrolysiertem Desoxypyridinolin, welche an einen Träger gebunden sein können, wobei der Antikörper durch:
das immunospezifische Binden an Pyridinium-Vernetzungen, ausgewählt aus nativem, freiem Pyridinolin und/oder nativem, freiem Desoxypyridinolin, und
ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber der (den) ausgewählten nativen, freien Pyridinium-Vernetzung(en) und den Harn-Pyridiniumpeptiden mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 Dalton von größer als 3 : 1 gekennzeichnet ist.
Gemäß einer Ausführungsform ist der Antikörper auf natives, freies Pyridinolin spezifisch und weist ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber nativem, freiem Pyridinolin und nativem, freiem Desoxypyridinolin von größer als 5 : 1 auf. Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist der Antikörper auf natives, freies Desoxypyridinolin spezifisch und weist ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber nativem, freiem Desoxypyridinolin und nativem, freiem Pyridinolin von größer als 25 : 1 auf. Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist der Antikörper sowohl auf natives, freies Pyridinolin als auch auf natives, freies Desoxypyridinolin spezifisch. Dieser Antikörper weist vorzugsweise ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber nativem, freiem Pyridinolin und nativem, freiem Desoxypyridinolin zwischen 2 : 1 und 1 : 2 auf.
Allgemeiner ausgedrückt kann das Reaktivitätsverhältnis gegenüber nativem, freiem Pyridinolin und nativem, freiem Desoxypyridinolin von größer als 5 : 1 bis kleiner als 1 : 25 unter Einschluss aller Zwischenverhältnisse betragen.
Vorzugsweise ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper. In weiteren Ausführungsformen ist der Antikörper ein polyklonaler Antikörper, welcher zur immunospezifischen Reaktion mit Pyridinium-Vernetzungen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus nativem, freiem Pyridinolin und nativem, freiem Desoxypyridinolin fähig ist. Der polyklonale Antikörper weist ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber den ausgewählten Pyridinium-Vernetzungen und Harn-Pyridiniumpeptiden mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 Dalton von größer als 3 : 1, vorzugsweise größer als 5 : 1 auf.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit zur Verwendung bei der Untersuchung der Abnahme des Knochenkollagenspiegels bei einer Testperson zur Verfügung, umfassend:
einen erfindungsgemäßen Antikörper und
Nachweismittel zum Nachweisen der Menge des Immunokomplexes, welcher durch die Reaktion des Antikörpers mit solchen freien Pyridinium-Vernetzungen gebildet wird.
Vorzugsweise schließt das Nachweismittel ein Reporter-Enzym ein, das wirksam ist, ein colorimetrisches Signal zu erzeugen, obwohl auch andere Formate verwendet werden können. Gemäß einer allgemeinen Ausführungsform schließt der Kit einen Festphasenträger mit einem oberflächengebundenen Bindungsreagens ein, bei welchem es sich um ein Antikörper-Reagens wie oben beschrieben oder um native, freie Pyridinium-Vernetzungen handeln kann. Gemäß einer weiteren allgemeinen Ausführungsform wird im Kit eine EMIT-Konfiguration verwendet.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur. Untersuchung der Abnahme des Knochenkollagenspiegels bei einer Testperson zur Verfügung, umfassend:
das Reagieren einer nicht-hydrolysierten menschlichen Urinprobe mit einem erfindungsgemäßen Antikörper;
wobei durch das Reagieren ein Immunkomplex zwischen dem Antikörper und (einer) solchen in der Probe vorliegenden ausgewählten Pyridinium-Vernetzung(en) gebildet wird; und
aus der Menge des gebildeten Immunkomplexes der Spiegel der ausgewählten Pyridinium-Vernetzung(en) in der Probe bestimmt wird, wobei ein bestimmter Spiegel, welcher über dem für eine normale Testperson charakteristischen Spiegel liegt, das Vorliegen einer erhöhten Geschwindigkeit der Abnahme des Knochenkollagenspiegels in der Testperson anzeigt.
Die Urinprobe kann durch ein Nitrocellulosefilter oder ein anderes geeignetes Trennmedium laufen gelassen werden, um Komponenten der Probe (z. B. Proteine) zu entfernen, welche die Untersuchung stören können.
Bei einer bevorzugten Untersuchung wird die filtrierte Urinprobe mit einem Bindungsreagens umgesetzt, das wirksam ist, einen Antigen/Antikörper-Komplex mit dem Analyten unter Bedingungen zu bilden, die wirksam sind, den Antikörper an den festen Träger proportional zur Menge des Analyten in der Probe zu binden. Bevorzugte Filtermembranen umfassen Nitrocellulose, Immobilon®-CD und Immobilon®-PSQ.
Erfindungsgemäße monoklonale Antikörper können mit einem Verfahren hergestellt werden, welches die Bildung einer Hybridomzelle, bestehend aus dem Fusionsprodukt von (a) Milzzellen aus einem mit einem an ein Trägerprotein gebundenen hydrolysierten freien Pyridinolin oder hydrolysierten freien Desoxypyridinolin immunisierten Tier mit (b) einem immortalisierenden Fusionspartner, und die Auswahl von Hybridomzellen, welche mit den ausgewählten nativen, freien Pyridiniumvernetzungen immunoreaktiv sind, umfasst.
Diese und weitere Aufgaben bzw. Gegenstände sowie Merkmale der vorliegenden Erfindung treten bei einem Studium der nachfolgenden detaillierten Beschreibung der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen deutlicher zutage, in welchen:
Fig. 1A-1C Schritte bei der Durchführung einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Untersuchung illustrieren;
Fig. 2 eine lineare Regression von nativen, freien Pyridinolin- Konzentrationen, gemessen unter Verwendung eines erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper-Reagens (y-Achse), aufgetragen gegen die gesamte (hydrolysierte), mittels HPLC gemessene Pyridinolin-Konzentration in 44 Urinproben zeigt;
Fig. 3 native, freie Pyridinolinspiegel normaler Patienten im Vergleich zu Patienten mit metastatischem Krebs zeigt, gemessen unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens;
Fig. 4 native, freie Pyridinolinspiegel bei Patienten mit der Diagnose einer schwere Osteoporose und Hüftfraktur (Gruppe 1), Osteoporose in Abwesenheit einer Hüftfraktur (Gruppe 2) sowie bei Patienten einer altersentsprechenden Kontrollgruppe zeigt, gemessen unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens;
Fig. 5 native, freie Desoxypyridinolinspiegel bei normalen Patienten (Gruppe 1), Patienten mit metabolischen Knochenerkrankungen (Gruppe 2) sowie Onkologie-Patienten (Gruppe 3) zeigt, gemessen unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens;
Fig. 6 native, freie Desoxypyridinolinspiegel in Osteoporose- Patienten vor und nach einer einjährigen Östrogenbehandlung zeigt, gemessen unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens;
Fig. 7A-7B Schritte bei der Durchführung einer anderen Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Untersuchung zeigt;
Fig. 8 die Rest-Enzymaktivität von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PHD) als Funktion der Anzahl von Pyridinolin- oder Desoxypyridinolinmolekülen zeigt, welche über das Kopplungsreagens EDC an das Enzym gekoppelt sind;
Fig. 9A und 9B graphische Darstellungen der Rest-Enzymaktivität von mit Pyd markiertem G6PHD in Anwesenheit steigender Konzentrationen eines Pyd spezifischen monoklonalen Antikörpers. (9A) und eines Pyd spezifischen polyklonalen Antikörpers (9B) zeigen;
Fig. 10 eine unter Verwendung der in den Fig. 7A-7C gezeigten Assay-Konfiguration erhaltene Kalibrierungskurve zeigt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

I. Definitionen

Die hier im Folgenden verwendeten Begriffe weisen die nachfolgenden Definitionen auf:
"Pyd" oder "Pyridinolin" oder "freies Pyridinolin " bezeichnet die im Folgenden bei I wiedergegebene Verbindung, bei welcher der Stickstoff im Ring von der &epsi;-Aminogruppe eines Hydroxylsyl- Restes abgeleitet ist, und
"Dpd" oder "Desoxypyridinolin" oder "freies Desoxypyridinolin" bezeichnet die im Folgenden bei II wiedergegebene Verbindung, bei welcher der Stickstoff im Ring von der &epsi;-Aminogruppe eines Lysyl-Restes abgeleitet ist.
"Freie Vernetzungen" bezeichnet die Verbindung I oder II oder ein Gemisch davon.
"Glycosiliertes Pyridinolin" oder "Glyco-Pyd" bezeichnet die glycosilierten Formen der Verbindung I, wobei die Glycosylgruppen kovalent an die aliphatische Hydroxylgruppe von Pyd gebunden sind. Zwei Glyco-Pyd-Vernetzungen, welche identifiziert wurden, sind. Gal-Pyd und Glc-Gal-Pyd, welche die im Folgenden bei III und IV wiedergegebenen Acetale enthalten.
"Pyd-Peptide" oder "Pyridinolin-Peptide" bezeichnet Peptid-derivatisierte Formen der Verbindung I, bei welchen eine oder mehrere der drei Aminosäuregruppen in der Verbindung über eine Peptid-Verbindung mit zusätzlichen Aminosäuregruppen verbunden sind. Ähnlichermaßen bezeichnet "Dpd-Peptide" oder "Desoxypyridinolin-Peptide" Peptid-derivatisierte Formen der Verbindung II, in welchen eine oder mehrere der drei Aminosäuregruppen in der Verbindung über eine Peptidverknüpfung mit zusätzlichen Aminosäureresten verknüpft sind.
"Pyridinium-Peptide" bezeichnet ein Gemisch aus Pyd-Peptiden und Dpd-Peptiden.
"Pyd-Peptide mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 Dalton" oder "Pyd-Peptide (MW > 1000)" bezeichnet Pyd-Peptide, welche von einer Dialysemembran zurückgehalten werden, die einen Molekulargewichts-Cut-Off-Wert von 1000 aufweist.
"Pyd-Vernetzungen" bezeichnen die Pyridinium-Vernetzungen im Urin, welche die Verbindung 1 entweder in freier oder derivatisierter Form enthalten. Pyd-Vernetzungen umfassen Pyd, Glyco- Pyd und Pyd-Peptide. Ähnlichermaßen bezeichnet "Dpd-Vernetzungen" die Pyridinium-Vernetzungen im Urin, welche die Verbindung II entweder in freier oder derivatisierter Form enthalten. "Dpd-Vernetzungen" umfassen Dpd und Dpd-Peptide.
"Pyridinium-Vernetzungen" bezeichnen Pyridinium-Vernetzungen, welche die Verbindungen I und/oder II in freier und/oder derivatisierter Form enthalten.
"Gesamtes H-Pyd" bezeichnet die Gesamtmenge an hydrolysiertem Pyd, hergestellt mittels Hydrolyse von Pyd-Vernetzungen zu Pyd. Ähnlichermaßen bezeichnet "gesamtes H-Dpd" die Gesamtmenge an hydrolysiertem Dpd, hergestellt mittels Hydrolyse von Dpd-Vernetzungen zu Dpd.
"Hydrolysiertes Pyd" oder "H-Pyd" bezeichnet Pyd, hergestellt mittels 16-stündiger Hydrolyse von Pyd-Vernetzungen in 6 N HCl bei 110ºC. Ähnlichermaßen bezeichnet "hydrolysiertes Dpd" oder "H-Dpd" Dpd, hergestellt mittels 16-stündiger Hydrolyse von Dpd-Vernetzungen in 6 N 801 bei 110ºC.
"Natives Pyd" oder "N-Pyd" bezeichnet Pyd, welches aus Urin erhalten wurde, der keinen Hydrolysebedingungen unterworfen war. Ähnlichermaßen bezeichnet "natives Dpd" oder "N-Dpd" freies Dpd, welches aus Urin erhalten wurde, der keinen Hydrolysebedingungen unterworfen war.
Ein monoklonaler Antikörper (oder Antikörper-Reagens), welcher "zur immunospezifischen Reaktion mit Pyridinium-Vernetzungen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus nativem, freiem Pyridinolin und nativem, freiem Desoxypyridinolin in der Lage ist", bezeichnet einen monoklonalen Antikörper, welcher gegenüber nativem, freiem Pyridinolin, nativem, freiem Desoxypyridinolin oder beiden im Gegensatz zu anderen Antigen-Materialien, welche in Urinproben vorliegen können, immunospezifisch ist. Das Verhältnis der Reaktivität (Affinität) des monoklonalen Antikörpers gegenüber dem nativen, freien Pyridinolin und dem nativen, freien Desoxypyridinolin kann im Bereich von etwa 5 : 1 oder größer bis etwa 1 : 25 oder weniger, unter Einschluss aller Zwischenverbindungen, liegen.
Die Bedeutung des Begriffs "Reaktivitätsverhältnis gegenüber den ausgewählten Pyridinium-Vernetzungen und den Harn-Pyridiniumpeptiden mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 Dalton von größer als 3 : 1" hängt von der relativen Spezifität des Antikörpers auf natives, freies Pyridinolin im Vergleich zu nativem, freiem Desoxypyridinolin ab. Wenn der Antikörper ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber nativem, freiem Pyridinolin und nativem, freiem Desoxypyridinolin von größer als 2 : 1 aufweist, bezeichnet der angegebene Begriff das Reaktivitätsverhältnis gegenüber N-Pyd und Pyd-Peptiden (MW > 1000). Wenn der Antikörper ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber nativem, freiem Pyridinolin und nativem, freiem Desoxypyridinolin von weniger als 1 : 2 aufweist, bezeichnet der angegebene Begriff das Reaktivitätsverhältnis gegenüber N-Dpd und Dpd-Peptiden (MW > 1000). Bei einem monoklonalen Antikörper mit einem Reaktivitätsverhältnis gegenüber nativem, freiem Pyridinolin und nativem, freiem Desoxypyridinolin, welches zwischen 2 : 1 und 1 : 2 liegt oder zu diesen Werten gleich ist, bedeutet der angegebene Begriff, dass das Reaktivitätsverhältnis gegenüber N-Pyd und Pyd-Peptiden (MW > 1000) und auch das Reaktivitätsverhältnis gegenüber N-Dpd und Dpd-Peptiden (MW > 1000) beide größer als 3 : 1 sind.

II. Herstellung des Antikörper-Reagens

Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern ("Antikörper-Reagens"), welche auf native, freie Pyridinium-Vernetzungen (entweder N-Pyd, N-Dpd oder beide) spezifisch sind, was anhand eines Reaktivitätsverhältnisses gegenüber den nativen, freien Pyridinium-Vernetzungen und den Harn-Pyridiniumpeptiden mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 Dalton von größer als 3 : 1, vorzugsweise größer als 5 : 1, ersichtlich ist.
Wenn der Antikörper zum Binden an natives, freies Pyridinolin bestimmt ist, weist der Antikörper vorzugsweise ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber nativem, freiem Pyridinolin und nativem, freiem Desoxypyridinolin von größer als 5 : 1, vorzugsweise größer als 20 : 1 und weiter bevorzugt größer als 100 : 1 auf.
Wenn der Antikörper zum Binden an natives, freies Desoxypyridinolin bestimmt ist, weist der Antikörper vorzugsweise ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber nativem, freiem Desoxypyridinolin und nativem, freiem Pyridinolin von größer als 5 : 1, vorzugsweise größer als 25 : 1 und weiter bevorzugt größer als 100 : 1 auf.
Wenn der Antikörper zur Bindung sowohl an natives, freies Pyridinolin als auch natives, freies Desoxypyridinolin bestimmt ist, weist der Antikörper vorzugsweise ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber nativem, freiem Pyridinolin und nativem, freiem Desoxypyridinolin zwischen 2 : 1 und 1 : 2 auf.
Das erfindungsgemäße Antikörper-Reagens weist vorzugsweise eine spezifische Bindungsaffinitäts-Konstante für eine ausgewählte Pyridinium-Spezies (N-Pyd oder N-Dpd) von größer als 5 · 10&sup7;/molar auf.

A. Immunogen

Das zur Herstellung des Antikörper-Reagens verwendete Immunogen ist an ein Trägermolekül, typischerweise ein Trägerprotein wie z. B. Keyhole Limpet-Hämocyanin (KLH), konjugiertes H-Dpd oder H-Pyd.
Hydrolysiertes Pyd oder Dpd kann mittels Säurehydrolyse von Pyridinium-Vernetzungen im Knochenkollagen oder Urin hergestellt werden, gereinigt wie z. B. bei Black et al., 1988, beschrieben.
Die Kopplung von H-Pyd oder H-Dpd an ein Trägerprotein erfolgt mittels standardmäßigen Kopplungsverfahren, typischerweise unter Verwendung eines bifunktionellen Kopplungsmittels, welches an einem Kopplungsende eine Amidverknüpfung mit einer der freien Carboxylgruppen von H-Pyd oder H-Dpd bildet, und am anderen Kopplungsende eine Amid- oder Ester- oder Disulfid-Verknüpfung mit dem Trägerprotein, was standardmäßigen Verfahren entspricht.
Alternativ kann bei einer bevorzugten Ausführungsform das H-Pyd oder H-Dpd direkt an ein Protein gekoppelt werden, z. B. in Anwesenheit eines wasserlöslichen, Carboxyl-aktivierenden Mittels wie z. B. EDC (1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid), was ebenfalls gemäß wohlbekannten Verfahren erfolgt. Dieser letztgenannte Ansatz wird in Beispiel 3 illustriert, worin die Kopplung von H-Dpd an Keyhole Limpet-Hämocyanin (KLH) mittels EDC-Aktivierung beschrieben wird. Allgemeine Kopplungsreaktionen zur Derivatisierung eines Trägerproteins mit einem Peptid- Antigen werden von Harlow (1988), S. 77-87, sowie von Wong (1991) beschrieben.

B. Monoklonales Antikörper-Reagens

Zur Herstellung eines monoklonalen Antikörper-Reagens wird das oben beschriebene Immunogen zur Immunisierung eines Tiers wie z. B. einer Maus verwendet, von welchem Antigen-spezifische Lymphocyten zur Immortalisierung erhalten werden können. Ein Tier, welches sich als geeignet herausgestellt hat, ist die "Autoimmun"-MRL/MpJ-lpr-Maus, erhältlich von Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).
Wenn ein Antikörper gewünscht wird, welcher gegenüber N-Pyd spezifisch ist, wird üblicherweise ein H-Pyd-Immunogen verwendet. Ähnlichermaßen wird, wenn ein Antikörper gewünscht wird, welcher gegenüber N-Dpd spezifisch ist, üblicherweise ein H-Dpd-Immunogen verwendet. Ein Antikörper, der sowohl Pyd als auch Dpd erkennt, kann unter Verwendung eines H-Pyd-Immunogens oder eines H-Dpd-Immunogens erhalten werden.

B1. Monoklonaler Antikörper gegen N-Pyd

Zur Herstellung eines monoklonalen Antikörper-Reagens, welches gegenüber N-Pyd spezifisch ist, können Mäuse unter Anwendung einer Reihe von Injektionen von H-Pyd-KLH-Immunogen immunisiert werden, wie in Beispiel 4 skizziert wird. Etwa 8 Wochen nach der anfänglichen Immunisierung werden Milzzellen geerntet und mit einer P3X63Ag8.653-Myelom-Zelllinie verschmolzen. Eine Selektion von Produkten einer erfolgreichen Verschmelzung kann in HAT in einem konditionierten S-DMEM-Medium gemäß veröffentlichten Verfahren durchgeführt werden (siehe hauptsächlich Harlow, S. 196-212). Erfolgreiche Verschmelzungsprodukte werden anschließend hinsichtlich ihrer Immunoreaktivität mit N-Pyd gescreent, wobei ein kompetitives Immunoassay-Format ähnlich dem in Beispiel 8 beschriebenen verwendet wird. Zelllinien, welche eine hohe Bindungsaffinität gegenüber N-Pyd aufweisen, werden mittels limitierender Verdünnung subkloniert und weiterhin auf Produktion von Antikörpern mit hoher Bindungsaffinität gegenüber N-Pyd gescreent. Eine subklonierte Zelllinie, welche mit dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde und eine hohe Antikörper-Affinität gegenüber N-Pyd ergab, wird hier als Mab- XXV-3G6-3B11-1A10 bezeichnet. Proben dieser Zelllinie wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852 hinterlegt; ihnen wurde die ATCC- Nr. HB11089 zugeteilt.
Zur Herstellung des Antikörper-Reagens wird die Hybridom-Zelllinie in einem geeigneten Medium wachsen gelassen (Harlow, S. 247-270), wie z. B. in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), supplementiert wie im nachfolgenden Abschnitt "Materialien und Verfahren" beschrieben. Monoklonale Antikörper ("Mabs") werden aus diesem Medium geerntet und können gemäß publizierter Verfahren aufkonzentriert und gelagert werden (Harlow, S. 271-318).
Wie oben angemerkt wurde, besteht eine wichtige Eigenschaft der vorliegenden Erfindung in der Spezifität des Antikörper-Reagens gegenüber N-Dpd und N-Pyd gegenüber Harn-Pyridinium-Vernetzungen mit höherem Molekulargewicht. Die relative Spezifität des Antikörper-Reagens gegenüber N-Pyd, N-Dpd und anderen Harn-Pyridinium-Vernetzungen kann mittels eines kompetitiven Bindungsassays für N-Pyd bestimmt werden, wie in Beispiel 10 ausführlich beschrieben wird.
Kurz gefasst werden verschiedene gereinigte Vernetzungsproben, welche N-Pyd und N-Dpd sowie ein Aminosäurengemisch, welches die 20 üblichen Aminosäuren in äquimolaren Mengen (jeweils 150 uM) enthält, umfassen, mit einer limitierenden Menge des Antikörper-Reagens über einem Festphasenträger mit, gebundenem N-Pyd unter Bedingungen umgesetzt, bei welchen die Pyridinium- Vernetzungen in der Probe mit dem trägergebundenen N-Pyd um eine Bindung an den Antikörper konkurrieren. Das Ausmaß der Bindung des Antikörpers an den Festphasenträger stellt ein Maß der relativen Reaktivitäten der Vernetzungen in der Probe mit dem Antikörper-Reagens dar.
In Übereinstimmung mit dem in Beispiel 10 skizzierten Verfahren wurde das Ausmaß der Bindung von N-Pyd, N-Dpd, Pyd-Peptiden (MW > 1000) und eines Aminosäurengemischs (jeweils 150 um der 20 üblichen Aminosäuren) an monoklonale Antikörper der Zelllinie Pyd-XXV-3G6-3B11-1A10 untersucht. Die scheinbare Pyd-Konzentration jeder Probe wurde unter Verwendung der unter Verwendung von gereinigtem N-Pyd erstellten Eichkurven ermittelt. Die prozentuale Reaktivität jeder Probe wurde als Verhältnis der scheinbaren Konzentration (gemessen unter Verwendung der oben erwähnten N-Pyd-Eichkurve) zur gesamten Pyd-Vernetzungs-Konzentration in der Probe, bestimmt mittels HPLC-Messung des gesamten H-Pyd (multipliziert mit 100), oder der gesamten Dpd- Vernetzungs-Konzentration, bestimmt mittels HPLC-Messung des gesamten H-Dpd (multipliziert mit 100) im Falle der N-Dpd- Probe, errechnet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 wiedergegeben, in welcher die Reaktivität mit N-Pyd als 100% definiert wurde.

Tabelle 1

Kreuzreaktivität des monoklonalen N-Pyd-Antikörpers

N-Pyd 100%
N-Dpd 16%
Pyd-Peptid (> 1000) < 1%
Aminosäurengemisch (150 uM) < 1%
Es ist ersichtlich, dass das monoklonale Antikörper-Reagens sehr selektiv gegenüber N-Pyd im Vergleich zu N-Dpd ist, und ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber nativem, freiem Pyridinolin und nativem, freiem Desoxypyridinolin, welches größer als 3 : 1, im vorliegenden Falle größer als 5 : 1 ist, zeigt. Das Reagens ist ebenso selektiv gegenüber N-Pyd im Vergleich zu den untersuchten Pyridinium-Peptidformen (quantitativ bestimmt hinsichtlich des Pyd-Gehaltes) und weist ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber Pyridinolin-Peptiden mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 Dalton von größer als 100 : 1 auf. Darüber hinaus zeigt das Reagens eine minimale Kreuzreaktivität (< 1%) mit dem untersuchten Aminosäurengemisch.
Noch allgemeiner ausgedrückt weist das Mab-Reagens, welches gegenüber N-Pyd spezifisch ist, eine Reaktivität gegenüber nativem, freiem Pyridinolin (N-Pyd) und Pyd-Peptiden (MW > 1000) von größer als 5 : 1, vorzugsweise größer als 10 : 1, weiter bevorzugt größer als 25 : 1 und im vorliegenden Fall größer als 100 : 1 auf, wie mit dem oben beschriebenen Assay gemessen wurde.

B.2 Monoklonaler Antikörper gegen N-Dpd

Zur Herstellung eines monoklonalen Antikörper-Reagens, welches gegenüber N-Dpd spezifisch ist, kann das obengenannte Verfahren zum Erhalt von N-Pyd-Mabs verwendet werden, mit der Abwandlung, dass als Immunogen H-Dpd-KLH verwendet wird und das Screening auf Immunoreaktivität mit einem Assay für N-Dpd durchgeführt wird. Eine subklonierte Zelllinie, welche mit diesem Verfahren erhalten wurde und eine hohe Antikörper-Affinität gegen N-Dpd ergab, wird hier als Mab-Dpd-II-7B6-1F4-1H11 bezeichnet (siehe Beispiel 5).
Das Antikörper-Reagens wird mit denselben allgemeinen Verfahren, welche oben im Hinblick auf N-Pyd-Mabs beschrieben wurde, aus der Hybridom-Zelllinie hergestellt und gelagert.
Die relative Spezifität des Antikörper-Reagens gegenüber N-Dpd, N-Pyd und anderen Harn-Pyridiniumvernetzungen kann mit dem oben beschriebenen Ansatz bestimmt werden (Kapitel B.1), wobei indessen ein Festphasenträger mit daran gebundenem N-Dpd verwendet wird.
In Übereinstimmung mit dem in Beispiel 10 skizzierten Verfahren wurde das Ausmaß der Bindung von N-Dpd, N-Pyd, Dpd-Peptiden (MW > 1000) und einem Aminosäurengemisch (jeweils 150 uM der üblichen 20 Aminosäuren) an monoklonale Antikörper aus der Zelllinie Mab-Dpd-II-7B6-1F4-1H11 untersucht. Die scheinbare Dpd- Konzentration der jeweiligen Probe wurde unter Verwendung von Kalibrierungskurven bestimmt, welche unter Verwendung von gereinigtem N-Dpd erstellt wurden. Der Prozentsatz der Reaktivität jeder Probe wurde als Verhältnis der scheinbaren N-Dpd-Konzentration (gemessen unter Verwendung der obengenannten N-Dpd- Kalibrierungskurve) zur gesamten Dpd-Vernetzungskonzentration in der Probe, bestimmt mittels HPLC-Messung des gesamten H-Dpd (multipliziert mit 100), oder zur gesamten Pyd-Vernetzungskonzentration, bestimmt mittels HPLC-Messung des gesamten H-Pyd (multipliziert mit 100) im Falle der N-Pyd-Probe, errechnet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 wiedergegeben, wobei die Reaktivität mit N-Dpd als 100% definiert wurde.

Tabelle 2

Kreuzreaktivität des monoklonalen N-Dpd-Antikörpers

N-Dpd 100%
N-Pyd < 1%
Dpd-Peptide (> 1000) 13%
Aminosäurengemisch (150 uM) < 1%
Es ist ersichtlich, dass das monoklonale Antikörper-Reagens eine hohe Selektivität gegenüber N-Dpd relativ zum N-Pyd und weist ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber nativem, freiem Desoxypyridinolin und dem nativen, freien Pyridinolin von größer als 100 : 1 aufweist. Weiterhin ist das Reagens gegenüber N-Dpd im Verhältnis zu den untersuchten Pyridinium-Peptidformen (als Dpd-Gehalt quantifiziert) selektiv und zeigt ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber Desoxypyridinolin-Peptiden mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 Dalton von größer als 3 : 1, vorzugsweise größer als 5 : 1. Darüber hinaus weist das Reagens eine minimale Kreuzreaktivität (< 1%) mit dem untersuchten Aminosäurengemisch auf.
Allgemeiner ausgedrückt hat das Mab-Reagens, welches gegenüber N-Dpd spezifisch ist, eine Reaktivität gegenüber nativem Desoxypyridinolin (N-Dpd) und Dpd-Peptiden (MW > 1000) von größer als 5 : 1, vorzugsweise größer als 10 : 1, weiter bevorzugt größer als 25 : 1 und im vorliegenden Fall größer als 100 : 1, gemessen mit dem obengenannten Assay.

B.3 Monoklonale Antikörper, welche N-Pyd und N-Dpd mit vergleichbaren Affinitäten binden

Zur Herstellung eines monoklonalen Antikörper-Reagens, welches N-Pyd und N-Dpd mit vergleichbarer Affinität bindet, können die oben beschriebenen Verfahren zum Erhalt von N-Pyd-Mabs und N-Dpd-Mabs verwendet werden. Das Immunogen kann Pyd-KLH oder Dpd-KLH sein, und das Screening auf Immunoreaktivität wird mit getrennten Assays für N-Pyd und N-Dpd durchgeführt. Eine subklonierte Zelllinie, welche mit dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, wobei H-Dpd-KLH als Immunogen verwendet wurde, und welche eine hohe Antikörper-Affinität sowohl gegenüber N-Dpd als auch N-Pyd ergab, wird hier als Mab-Pyd/Dpd-V- 6H2-2H4-1E4 bezeichnet (siehe Beispiel 6).
Das Antikörper-Reagens wird nach denselben allgemeinen Verfahren, welche oben im Zusammenhang mit N-Pyd-Mabs beschrieben wurden, aus der Hybridom-Zelllinie hergestellt und gelagert.
Die relative Spezifität des Antikörper-Reagens gegenüber N-Dpd, N-Pyd und anderen Harn-Pyridiniumvernetzungen kann mit dem oben beschriebenen Verfahren bestimmt werden (Kapitel B.1 und B.2). Im vorliegenden Falle wurde bei den unter Verwendung der Pyd/Dpd-V-6H2-2H4-1E4-Zelllinie hergestellten Antikörpern der Prozentsatz der Reaktivität einer jeden Probe als Verhältnis der scheinbaren N-Dpd-Konzentration (gemessen unter Verwendung der oben beschriebenen N-Dpd-Kalibrierungskurve) zur gesamten Dpd-Vernetzungskonzentration in der Probe, bestimmt mittels HPLC-Messung des gesamten H-Dpd (multipliziert mit 100), oder zur gesamten Pyd-Vernetzungskonzentration, gemessen mittels HPLC-Messung des gesamten H-Pyd im Falle der N-Pyd-Probe, berechnet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 wiedergegeben, wobei die Reaktivität mit N-Dpd als 100% definiert wurde.

Tabelle 3

Kreuzreaktivität des monoklonalen Pyd/Dpd-Antikörpers

N-Dpd 100%
N-Pyd 102%
Dpd-Peptide (> 1000) 1%
Pyd-Peptide (> 1000) 11%
Aminosäurengemisch (150 uM) 5%
Wie zu sehen ist, erkennt das monoklonale Antikörper-Reagens N-Dpd und N-Pyd mit vergleichbaren Affinitäten, wobei das Kreuzreaktivitäts-Verhältnis nahe bei 1 : 1 liegt. Weiterhin ist das Reagens gegenüber N-Dpd im Vergleich zu den untersuchten Pyridinium-Peptidformen (sowohl Pyd- als auch Dpd-Peptiden) selektiv und weist ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber Pyridinium-Peptiden mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 Dalton von größer als 3 : 1 und im vorliegenden Falle größer als 9 : 1 auf. Zusätzlich zeigt das Reagens minimale Kreuzreaktivität (5%) mit dem untersuchten Aminosäurengemisch.
Allgemeiner ausgedrückt weist das Pyd/Dpd-spezifische Mab- Reagens eine Reaktivität gegenüber nativem, freiem Pyridinolin (N-Pyd) und nativem, freiem Desoxypyridinolin (N-Dpd) zwischen 2 : 1 und 1 : 2 auf.

B.4 Affinitätschromatographie

Das erfindungsgemäße Antikörper-Reagens kann gemäß standardmäßigen Affinitätschromatographieverfahren auch in einer Affinitätschromatographie-Matrix verwendet werden, um von Kollagen- Geweben abgeleitete native, freie Pyridinium-Vernetzungen zu binden und zu sammeln, indem z. B. vereinte Urinproben durch eine derartige Matrix geleitet werden. Zur Isolation von N-Pyd wird in der Matrix ein Antikörper-Reagens, welches auf N-Pyd spezifisch ist, verwendet. Alternativ wird zur gemeinsamen Isolierung von N-Pyd und N-Dpd ein Antikörper eingesetzt, welcher an beide Substrate mit vergleichbaren Affinitäten bindet. Die erhaltenen nativen, freien Verknüpfungen können mit den in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Verfahren weiter gereinigt werden, falls dies erforderlich ist.

C. Polyklonale Antikörper

Die Herstellung polyklonaler Antikörper erfolgt nach herkömmlichen Verfahren, einschließlich der Injektion des Immunogens in geeignete Säugetiere wie z. B. Kaninchen oder Mäuse in Übereinstimmung mit immunologischen Protokollen, welche allgemein auf dem vorliegenden technischen Gebiet bekannt sind, siehe z. B. Harlow, S. 93-115. Typischerweise wird Kaninchen das Immunogen in einem Adjuvans subkutan injiziert und alle 2-3 Wochen werden Verstärkungsimmunisierungen mittels subkutaner oder intramuskulärer Injektionen verabreicht; bei Mäusen kann gemäß einem ähnlichen Zeitplan intraperitoneal injiziert werden. In Intervallen von z. B. 1-2 Wochen nach jeder Immunisierungsinjektion wird Blut gesammelt. Die Antiseren können zur Bestimmung der Antikörperbildung bezüglich N-Pyd oder N-Dpd gemäß standardmäßigen Immunopräzipitierungsverfahren (Harlow, S. 423-470) titriert werden. In Beispiel 19 werden detaillierte Angaben hinsichtlich eines Verfahrens zur Herstellung polyklonaler Antikörper bei Ratten gemacht.
Die Bindungsaffinitäts-Konstante polyklonaler Antiseren kann mittels bekannter Verfahren bestimmt werden (z. B. mittels einer Scatchard-Analyse unter Verwendung einer Immunopräzipitierung oder eines ELISA-Assays); sie stellt einen gemittelten Wert der Bindungsaffinitäts-Konstante der Antikörper in den Antiseren, welche gegenüber den selektierten Pyridinium-Spezies spezifisch sind, dar. Die vom Kaninchen Nr. VI-8 erhaltenen polyklonalen Antikörper weisen eine Bindungskonstante für N-Pyd von etwa 1 · 10&sup8; auf, bestimmt mittels Scatchard-Analyse.
Die relative Bindungs-Spezifität des Antikörper-Reagens gegenüber ausgewählten Pyridinium-Spezies und anderen Pyridinium- Verknüpfungen kann mit einem kompetitiven Bindungsassay bestimmt werden, wie dies z. B. im obigen Kapitel B beschrieben wird und in Beispiel 10 genauer ausgeführt wird. Die Tabelle 3.5 gibt die relativen Bindungsspezifitäten des vom Kaninchen Nr. VI-8 erhaltenen Anti-Pyd-Antiserums wieder, wobei die Reaktivität gegenüber N-Pyd als 100% definiert wurde.

Tabelle 3.5

Kreuzreaktivität des polyklonalen N-Pyd-Antikörpers

N-pyd 100%
N-Dpd < 10%
Pyd-Peptide (MW > 1000) < 5%
Aminosäurengemisch ~12%
Wie ersichtlich ist, weist das Antikörper-Reagens, welches gegenüber N-Pyd spezifisch ist, weniger als 10% Kreuzreaktivität mit N-Dpd, weniger als 5% Kreuzreaktivität mit Pyd-Peptiden (MW > 1000) sowie eine mäßige Kreuzreaktivität (-12%) mit dem Aminosäurengemisch auf. Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung weist das polyklonale Antikörper-Reagens eine Reaktivität gegenüber ausgewählten, nativen, freien Pyridinium-Spezies (N-Pyd, N-Dpd oder beiden) und Harn-Pyridiniumpeptiden mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 Dalton von größer als 3 : 1, vorzugsweise größer als 5 : 1 auf, gemessen mit dem oben beschriebenen kompetitiven Antigen-Assay.

III. Immunoassay-Kit

Gemäß einem weiteren Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit zur Verwendung bei der Untersuchung der Abnahme des Knochenkollagenspiegels bei einer menschlichen Testperson. Der Kit umfasst (a) einen erfindungsgemäßen Antikörper, wie er im obigen Kapitel II beschrieben wurde, und (b) Nachweismittel zum Nachweisen der Menge des Immunokomplexes, welcher durch die Reaktion des Antikörper-Reagens mit der (dem) freien Pyridinium-Vernetzung(en) gebildet wird. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Nachweismittel wirksam, um ein colorimetrisches Signal zu produzieren, das heißt, ein Signal, welches spektrophotometrisch gemessen werden kann.
Gemäß einer allgemeinen Ausführungsform schließt der Kit einen Festphasenträger mit oberflächengebundenen Bindungsmolekülen ein, welche wirksam sind, einer Reportergruppe im Detektionsreagens proportional zur Menge der nativen, freien Pyridinium- Vernetzungen in der Probe, welche mit dem Antikörper-Reagens immunoreaktiv sind, zu binden.
Zum Zwecke der Illustration wird eine spezifische Ausführungsform eines solchen Kits zur Messung von N-Pyd in einer Probe in den Fig. 1A-1C unter 10 wiedergegeben. Ein Festphasenträger 12 in diesem Kit weist eine Oberfläche auf, an welche das Bindungsreagens adsorbiert oder chemisch gebunden werden kann. Es ist eine Vielzahl von Glas- oder Polymerharzträgern mit chemisch derivatisierbaren Gruppen bzw. zur Proteinadsorption wirksamen Oberflächen erhältlich. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt der Kit 96 Assay-Vertiefungen in einer Mikrotiterplatte zur Verfügung, in welchen die Oberflächen der Vertiefungen die Festphasenträger-Oberflächen des Kits bilden.
Das Bindungsreagens im Kit 10 ist N-Pyd, was in den Figuren z. B. unter 16 als Pyd(N) angegeben ist. Das Bindungsreagens wird an die feste Phase gebunden, im vorliegenden Fall an jede der Vertiefungen der Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, indem zunächst ein Ovalbumin-Biotin-Komplex an die Oberflächen der Vertiefungen gebunden wird, wie z. B. Komplex 18 in Fig. 1A, und anschließend ein N-Pyd-Streptavidin-Komplex wie z. B. Komplex 20 an das adsorbierte Biotin gebunden wird. Alternativ kann die Adsorption eines Ovalbumin-Biotin-Komplexes vermieden werden und das N-Pyd-Streptavidin kann direkt an den festen Träger gebunden werden. Verfahren zur Bildung einer mit N-Pyd beschichteten Mikrotiterplatte werden in den Beispielen 8 und 9 detailliert beschrieben.
Das Antikörper-Reagens im Kit wird in den Fig. 1B und 10 mit 22 bezeichnet und umfasst das im obigen Kapitel beschriebene monoklonale Reagens. Wie in Fig. 1B wiedergegeben ist, treten die Pyridinium-Vernetzungen in der Probe, wie z. B. die mit 26 bezeichnete N-Pyd-Vernetzung, mit dem oberflächengebundenen N-Pyd hinsichtlich der Bindung an das Antikörper-Reagens in Konkurrenz. Der durch die Reaktion des Antikörper-Reagens mit den Vernetzungen in der Probe gebildete Immunokomplex wird in dieser Figur mit 28 bezeichnet.
In diesem Kit ist das Detektionsreagens ein Reporter-markierter zweiter Antikörper, welcher in Fig. 1C mit 24 bezeichnet wird, welcher wirksam ist, an das Antikörper-Reagens zu binden, welches seinerseits an das an den festen Träger gebundene N-Pyd gebunden ist. Reporter-markierte Antikörper wie z. B. Enzym-markierte Antikörper sind kommerziell erhältlich oder können für eine Vielzahl von Reporter-Gruppen leicht konstruiert werden (Harlow, S. 319-358). Ein bevorzugtes Enzym in einem Enzym-markierten Antikörper ist alkalische Phosphatase, welche mit einem p-Nitrophenylphosphat-Substrat unter Bildung eines gefärbten Produktes reagieren kann, welches einen starken Absorptionspeak bei 405 nm aufweist.
Der Reporter-markierte zweite Antikörper ist typischerweise ein Anti-IgG-Antikörper wie z. B. ein Anti-Maus-TgG-Antikörper, wenn das monoklonale Antikörper-Reagens des Kits durch eine Immunisierung von Mäusen erhalten wird. In diesem Falle ist das Antikörper-Reagens (welches wie oben gegenüber N-Pyd immunoreaktiv ist) "Reporter-markierbar", da das Antikörper-Reagens mittels Reaktion mit dem Reporter-markierten zweiten Antikörper markiert werden kann. Andere Beispiele von Reporter-markierbaren Antikörper-Reagenzien schließen einen Biotin- oder Streptavidin-markierten Antikörper ein, welcher mit einem Reporter-markierten Streptavidin- oder Biotin-markierten Partner für Detektionszwecke markiert werden kann.
In einer alternativen Ausführungsform kann das Detektionsreagens das Anti-Pyd-Antikörper-Reagens selbst sein, markiert mit einem Reporter wie z. B. einem Enzym.
Das Nachweismittel im Kit kann auch notwendige Substrate oder dergleichen einschließen, welche zur Detektion des Reporters benötigt werden.
In einer alternativen Ausführungsform eines Kits mit einem Festphasenträger ist das Bindungsreagens (Bindungsmolekül), welches an den Träger gebunden ist, das in Kapitel II beschriebene Antikörper-Reagens. Das Antikörper-Reagens kann an den festen Träger mit einer Vielzahl von bekannten Verfahren gebunden werden, einschließlich chemischer Derivatisierung oder hochaffiner. Bindung des Antikörpers an z. B. trägergebundenes Protein A oder Anti-IgG-Antikörper gemäß Standardverfahren. In dieser Ausführungsform kann der Kit zusätzlich ein Pyridinolin- Reagens enthalten, welches wirksam ist, mit N-Pyd in der Probe hinsichtlich der Bindung an das Antikörper-Reagens auf dem Träger in Konkurrenz zu treten. Zum Zwecke der Detektion kann das Pyridinolin-Reagens eine Reporter-Markierung enthalten, welche covalent an das Pyridinolin gebunden ist (d. h., das Reagens kann ein Reporter-markiertes Pyridinolin sein). Alternativ kann das Pyridinolin-Reagens Reporter-markierbar sein, indem das Pyridinolin-Reagens Pyd enthalten kann, welches an ein Agens wie z. B. Biotin oder Streptavidin zur Erkennung durch ein entsprechendes Reporter-markiertes Streptavidin- oder Biotinmolekül konjugiert ist.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform wird im Kit eine EMIT-Konfiguration (Enzym-multipliziertes Immunoassayverfahren, Fig. 7A-7C) eingesetzt. Bei diesem Ansatz tritt der Analyt in der Probe mit einem Analyten-markierten Enzym hinsichtlich der Bindung an einen Analyten-spezifischen Antikörper in Konkurrenz, und zwar unter Bedingungen, bei denen die Bindung des Antikörpers an das markierte Enzym zu einer Verringerung der katalytischen Aktivität des Enzyms führt. Somit ist die beobachtete katalytische Aktivität des Enzyms proportional zum Analytenspiegel in der Probe, wobei höhere Analytenspiegel zu einer höheren Enzymaktivität führen.
Im Hinblick auf die Fig. 7A-7C schließt der Kit ein Pyridinium-markiertes Enzym 32 ein, welches aus einem Enzym 34 und einer oder mehreren Pyridinium-Markierung(en) 36 (d. h. freiem Pyridinolin oder freiem Desoxypyridinolin) gebildet ist. In dieser in den Figuren abgebildeten Ausführungsform ist die Pyridinium-Markierung 36 freies Pyridinolin.
Das Enzym 34 ist zur Katalyse der Bildung eines detektierbaren Produktes in der Lage, welches vorzugsweise spektrophotometrisch gemessen werden kann. Beispielsweise ist ein Enzym, welches zur Verwendung in diesem Kit geeignet ist, Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase (G6PHD) aus leuconostoc mesenteroides.
Weiterhin enthalten ist ein Pyridinium-spezifischer Antikörper 38, welcher zur immunospezifischen Reaktion mit der Pyridinium- Vernetzung 36 und mit der Analyten-Pyridinium-Spezies 40 in der Lage ist. In der in den Fig. 7A-7C gezeigten Ausführungsform sind die Markierung 36 und die Analyten-Pyridinium-Spezies freies Pyridinolin.
Eine Kopplung zwischen dem Enzym 34 und der Markierung 36 kann mittels direkter oder indirekter Verknüpfung unter Verwendung einer Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Kopplungsreagenzien erfolgen (z. B. Wong, 1991). In einer bevorzugten Ausführungsform führt z. B. die Reaktion des Enzyms 34 mit der Pyridinium-Markierung 36 (d. h. Pyridinolin) in Anwesenheit eines Carbodiimid-Reagens zur direkten Kopplung einer Carboxylat- oder Aminogruppe in der Markierung 36 mit einer Amino- oder Carboxylatgruppe im Enzym 34. Die Reaktionsbedingungen zur Bildung einer solchen direkten Verknüpfung sind in Beispiel 15 angegeben. Alternativ kann die Markierung 36, das Enzym 34 oder beide mit einem Kopplungsreagens umgesetzt werden, welches wirksam ist, um eine Brückengruppe einer ausgewählten Länge zwischen der Markierung und dem Enzym zu bilden (d. h. über eine indirekte Kopplung). In den in Beispiel 16 beschriebenen Verfahren wird Pyridinolin mit dem Kopplungsagens Sulfo-SMCC (im Folgenden als SMCC bezeichnet) umgesetzt, um ein Maleimid-haltiges Pyridinolin-Produkt zu bilden. Dieses Addukt kann anschließend mit Amino- oder Sulfhydrylgruppen an der Oberfläche des Enzyms 34 unter Bildung des markierten Enzyms 32 umgesetzt werden. Wie in Beispiel 16 illustriert wird, kann das Enzym z. B. mit N-Succinylimidyl-S-acetylthioacetat (SATA) derivatisiert werden, um zusätzliche Sulfhydrylgruppen einzuführen, welche mit dem Pyrdinolin-Addukt reaktiv sind. Ein ähnlicher Ansatz unter Verwendung des Kopplungsreagens SPDP wird in Beispiel 18 beschrieben.
Gewünschte Eigenschaften des markierten Enzyms 32 umfassen (1), dass das markierte Enzym im Vergleich zur Aktivität des nicht- markierten Enzyms ein wesentliches Ausmaß an katalytischer Aktivität behält (d. h. größer als etwa 5%), und (2) dass die Bindung eines Pyridinium-spezifischen Antikörpers an die Pyridinium-Markierung 36 zu einer nachweisbaren Abnahme der Aktivität des gebundenen Enzyms 32 führt. Dementsprechend können Reaktionen zur Herstellung eines markierten Enzyms in Anwesenheit eines Liganden für den Wirkort des Enzyms (z. B. einem Substrat oder einem Substratanalogon) durchgeführt werden, um den Aktivitätsverlust aufgrund einer Markierung von Wirkort-Gruppen im Enzym zu minimieren. Darüber hinaus kann der Typ bzw. können die Typen der Enzym-Oberflächengruppen, welche mit der Markierung 36 markiert werden sollen, durch eine geeignete Auswahl des Kopplungsreagens und der Reaktionsbedingungen ausgewählt werden, wie im Stand der Technik bekannt ist (Wong, 1991).
Bei der Herstellung eines markierten Enzyms, welches zur Verwendung im Kit geeignet ist, sollten verschiedene Kandidaten für markierte Enzyme unter Verwendung verschiedener Kopplungsreagenzien und eines Bereichs von Pyridinium-Markierung. Enzymverhältnissen hergestellt werden. Obwohl hohe Verhältnisse von Pyridinium-Markierung. Enzym die Wahrscheinlichkeit einer Markierung eines Restes in der Nähe des Wirkorts erhöhen (so dass die Bindung eines Antikörpers an dieser Stelle die katalytische Aktivität verringert), können solche hohen Verhältnisse auch zu einem größeren Verlust an katalytischer Aktivität führen, wie aus Fig. 8 ersichtlich ist. Das optimale Verhältnis von Pyridinium-Markierung. Enzym wird im Hinblick auf die Enzymaktivität typischerweise auf der Grundlage der im Folgenden diskutierten zusätzlichen Erwägungen festgelegt.
Der Antikörper 38 kann ein polyklonaler Antikörper oder monoklonaler Antikörper sein, hergestellt nach den im obigen Kapitel II diskutierten allgemeinen Verfahren. Typischerweise wird die Spezifität des Antikörpers im Hinblick auf natives, freies Pyridinolin, Desoxypyridinolin und Pyridinium-Peptidformen mit höheren Molekulargewicht bestimmt, wie dies in Kapitel II diskutiert und in Beispiel 10 illustriert wird.
Wie oben erwähnt wurde, führt das Binden des Antikörpers an das markierte Enzym 32 zu einem nachweisbaren Rückgang der Enzymaktivität. Vorzugsweise ein Überschuss des Antikörpers 38 kann die katalytische Aktivität des markierten Enzyms 32 um mindestens 10%, weiter bevorzugt um mindestens 20 bis 30% verringern. Die Fähigkeit einer Antikörper-Zusammensetzung zur Verringerung der katalytischen Aktivität kann nach dem in den Fig. 9A und 9B illustrierten Ansatz bestimmt werden. Fig. 9A zeigt die Aktivität von Pyd markiertem G6PDH (~8 Moleküle H-Pyd pro Molekül G6PDH) als Funktion steigender Konzentrationen eines Pyd-spezifischen monoklonalen Antikörpers (V-6H&sub2;), welcher wie in Kapitel II. B.1 diskutiert hergestellt wurde. Wie ersichtlich ist, sank die Enzymaktivität von 100% in Gegenwart einer 100-fachen Verdünnung des Antikörpers auf etwa 60% in Gegenwart einer 10- fachen Verdünnung des Antikörpers (das heißt ein Rückgang von 40%). Im Hinblick auf Fig. 9B, welche Daten für einen Pyd-spezifischen polyklonalen Antikörper (VI-8-19) zeigt, führte die Erhöhung der Konzentration des Antikörpers von einer 400-fachen Verdünnung auf eine 10-fache Verdünnung zu einem Aktivitätsrückgang von etwa 80%.
Weiterhin kann der Kit 30 Nachweisreagenzien zur Messung der katalytischen Aktivität des Enzyms 32 in Gegenwart des Antikörpers 38 und des Analyten 40 enthalten. In dem in Fig. 7 illustrierten Kit, in welchem das Enzym 32 G6PDH ist, umfassen die Nachweisreagenzien Glucose-6-Phosphat sowie die oxidierte Form von Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD&spplus;) zur Herstellung der reduzierten Form von Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid (NADH), welches bei 340 nm stark absorbiert. In einer bevorzugten Ausführungsform, in welcher der Kit eine Mikrotiterplatte mit vielen Vertiefungen bereitstellt, wird die katalytische Aktivität des Enzyms 32 unter Verwendung einer Mikroplatten-Lesevorrichtung gemessen, welche zur Messung der Absorption als Funktion der Zeit in der Lage ist.
Die Verwendung eines exemplarischen, auf EMIT basierenden Assay-Kit wird in Beispiel 18 detailliert beschrieben. Kurzgefasst wird ein 50 ul-Aliquot eines Pyridinolin-Standards oder einer verdünnten Urinprobe zu jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte zugegeben, gefolgt von 100 ul eines in geeigneter Weise verdünnten Antikörpers. Nach Inkubierung der Platte bei Raumtemperatur während eines geeigneten Zeitraums (z. B. 2 Minuten) werden 100 ul verdünntes, EDC-gekoppeltes Pyridinolin- G6PDH-Konjugat (8 Pyd/G6PDH-Molekül) zu jeder Vertiefung zugegeben, gefolgt von einer Inkubierung bei Raumtemperatur (für z. B. 5 Minuten). Im Anschluss an die letzte Inkubierungsperiode werden 60 ul einer Substratlösung, welche Glucose-6-Phosphat und NAD&spplus; enthalten, zu jeder Vertiefung hinzugegeben und die G6PDH-Aktivität wird bei 340 nm unter Verwendung einer Mikroplatten-Ablesevorrichtung gemessen. Die bei verschiedenen Pyd- Standards gemessenen, Aktivitäten werden zur Erstellung einer Pyd-Kalibrierungskurve verwendet (siehe z. B. Fig. 10), welche zur Bestimmung der Pyd-Spiegel in der Urinprobe verwendet werden kann. Es ist klar, dass die Reihenfolge, in welcher die Probe, das Antikörper-Reagens und das Enzym zusammengegeben werden, von der in Beispiel 18 zur Anwendung kommenden Reihenfolge abweichen kann.
Obwohl die obigen Kits im Hinblick auf N-Pyd-Assays illustriert werden, ist es verständlich, dass ähnliche Formate verwendet werden können, wenn der Kit zur Messung von N-Dpd unter Verwendung eines N-Dpd-spezifischen Antikörper-Reagens bestimmt ist, oder zur Messung der Summe von N-Pyd und N-Dpd unter Verwendung eines Antikörper-Reagens, welches N-Pyd und N-Dpd mit vergleichbaren Affinitäten bindet.
Darüber hinaus ist es verständlich, dass der erfindungsgemäße Kit an einer Anzahl von anderen homogenen oder heterogenen Assay-Formaten angepasst werden kann, einschließlich Formaten, die auf Radiotracern, gekoppelten Enzymen, Fluoreszenz und Chemilumineszenz basieren.

IV. Immunoassay-Verfahren

Das erfindungsgemäße Immunoassay-Verfahren stellt ein Verfahren zur Untersuchung der Abnahme der Knochenkollagenaktivität bei einer Testperson zur Verfügung. Dieses Verfahren involviert die Reaktion einer Urinprobe der Testperson mit dem im obigen Kapitel II beschriebenen Antikörper-Reagens unter Bildung eines Immunokomplexes zwischen dem Antikörper und dem nativen, freien Pyridinolin in der Probe sowie einer Messung der Menge des gebildeten Immunokomplexes.
Wie in Kapitel V weiter diskutiert wird, wird die Urinprobe vorzugsweise (z. B. mittels Filtration) mit einem Nitrocellulosefilter oder einer Nitrocellulosemembran in Kontakt gebracht, bevor die Probe mit dem Antikörper-Reagens umgesetzt wird, um das Ausmaß an Substanzen in der Probe, welche die Messung von N-Pyd stören können, zu reduzieren.
Wie im obigen Kapitel III ausgeführt wurde, kann die Umsetzung der Urinprobe mit dem Antikörper-Reagens in einem Festphasenformat unter Verwendung einer Vielzahl von Konfigurationen oder in einem homogenen Assay-Format durchgeführt werden. Zum Zwecke der Illustration wird das Immunoassayverfahren im Folgenden im Hinblick auf ein Assay-Format beschrieben, welches einen Festphasenträger involviert, wie dies in den Fig. 1A-1C wiedergegeben ist.
Bei einer beispielhaften Ausführungsform des Verfahrens wird ein bekanntes Volumen von typischerweise 10-100 ul der Urinprobe zu dem mit N-Pyd beschichteten festen Träger wie z. B. den Vertiefungen in einer Mikrotiterplatte zugegeben, gefolgt von einer Zugabe eines bekannten Volumens von typischerweise 50-200 ul des Antikörper-Reagens von einer bekannten Verdünnung. Das Gemisch auf der Oberfläche des festen Trägers wird anschließend inkubiert, vorzugsweise unter Bedingungen, welche zur Erreichung eines Gleichgewichtes zwischen dem Antikörper, den in der Probe enthaltenen Pyridinium-Vernetzungen und dem oberflächengebundenen Pyd wirksam sind. Bei dem in Beispiel 8 ausführlich beschriebenen Verfahren erfolgt die Inkubierung über Nacht bei 2-8ºC.
Im Anschluss an die Inkubierung wird der feste Träger mehrfach gewaschen, um Antikörper zu entfernen, welche nicht spezifisch an den Träger gebunden sind, und anschließend mit einem Reporter-markierten Anti-IgG-Antikörper oder dergleichen inkubiert, welche wirksam sind, um spezifisch an den Träger gebundenen Antikörper zu binden. Herkömmlicherweise ist im Falle von monoklonalen Antikörpern, welche aus Mäusen gewonnen sind, der Reporter-markierte Antikörper ein an alkalische Phosphatase konjugiertes Ziege-anti-Maus-IgG. Nach kurzer Inkubationszeit wird der Träger wieder gewaschen, um nicht spezifisch gebundenes Material zu entfernen, und die Menge des an den Träger gebundenen Enzyms wird durch Zugabe des Enzymsubstrats und spektrophotometrische Bestimmung des umgewandelten Substrats bestimmt.
Bei einem typischen Assay zur Messung von N-Pyd werden N-Pyd- Standards, welche steigende Konzentrationen von N-Pyd enthalten, jeweils zweifach zu einigen der Vertiefungen zugegeben, um eine N-Pyd-Konzentrations-Kalibrierungskurve zu erstellen. Anschließend werden bis zu 40 Proben jeweils zweifach zu den verbleibenden Vertiefungen hinzugegeben und die Vertiefungen werden anschließend wie oben beschrieben untersucht. Die Kalibrierungskurve wird zur Bestimmung der Konzentration von N-Pyd im Urin verwendet. Die gemessenen Konzentrationen werden vorzugsweise als Verhältnis von N-Pyd/Kreatinin ausgedrückt, um die Proben hinsichtlich Schwankungen der Urinkonzentration und der Körpermasse zu normieren. Die Konzentrationen von Kreatinin im Urin können mittels standardmäßigen Verfahren bestimmt werden, wie z. B. Verfahren, die auf einer Reaktion mit alkalischem Picrat basieren (Cook, 1975).
Die Assays zur Messung von N-Dpd im Urin werden wie oben durchgeführt, wobei jedoch eine N-Dpd-Kalibrierungskurve zur Bestimmung der Konzentration von N-Dpd in der Probe verwendet wird. Wenn mit dem Untersuchungsverfahren die Summe von N-Pyd und N-Dpd mittels eines Antikörper-Reagens, welches N-Pyd und N-Dpd mit vergleichbaren Affinitäten bindet, gemessen wird, ist einzusehen, dass eine entweder auf N-Pyd oder N-Dpd basierende Kalibrierungskurve für das Verfahren genügt, sobald die relativen Affinitäten des Antikörper-Reagens für N-Pyd und N-Dpd bestimmt worden sind.
Das Pyd kann natives Pyd (N-Pyd) oder hydrolysiertes Pyd (H-Pyd) sein. Gleichermaßen kann das Dpd natives Dpd (N-Dpd) oder hydrolysiertes Dpd (H-Dpd) sein. Zum Erhalt von N-Dpd oder N-Pyd kann eine grobe Abtrennung von N-Dpd oder N-Pyd von anderen Pyridinium-Verbindungen im Urin mittels Fraktionierung des Urins erreicht werden, wie in Beispiel 2 beschrieben. Kurzgesagt wird ein Urin-Konzentrat auf eine Sephadex® G-10-Säule aufgegeben und die gesamten Pyridinium-haltigen Fraktionen werden eluiert. Das Eluat wird anschließend auf eine Säule mit Phosphocellulose, welche mit Natriumcitrat äquilibriert ist, aufgegeben und mit Salz eluiert, wodurch die freien Vernetzungen in einem einzelnen Peak erhalten werden. Wenn die Probe keinen hydrolytischen Bedingungen unterzogen wird, enthält dieser Peak nicht nur N-Dpd- und N-Pyd-Formen ("freie Vernetzungen"), sondern auch Glyco-Pyd einschließlich Gal-Pyd und Glc- Gal-Pyd, wie oben beschrieben wurde. Eine weitere Reinigung wird anschließend einfach mit standardmäßigen Verfahren durchgeführt wie z. B. unter Anwendung eines Ionenaustauschs auf sulfonierten Polystyrolkügelchen oder mittels HPLC. Typische Protokolle für diese Trennung werden z. B. bei Black et al., 1988, Seibel et al., 1989 gefunden und in Beispiel 2 detailliert beschrieben.
Beispiel 8 illustriert ein typisches Verfahren zur erfindungsgemäßen Untersuchung von Pyridinium-Spiegeln im Urin unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, welcher gegenüber N-Pyd spezifisch ist und aus den im Kapitel II. B.1 beschriebenen Pyd- XXV-3G6-3B11-1A10-Zellen hergestellt wurde. Die Untersuchung wurde in zwei Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt, wobei in jeder Platte 12 Vertiefungen für jeweils 2 Proben von 6 N-Pyd-Standards und in jeder Platte 44 Vertiefungen für jeweils 2 Proben von 22 Urinproben von Frauen im Post-Menopause-Alter verwendet wurden. Eine Kalibrierungskurve für N-Pyd, welche aus den 6 N-Pyd-Standards erstellt wurde, wurde zur Berechnung der Konzentration (in nm) der Pyridinium-Vernetzungen in der Probe, welche mit dem Assay-Antikörper immunoreaktiv waren, für jede unbekannte Probe verwendet. Die Daten aus der obigen Tabelle 1 zeigen an, dass die gemessene Pyridinium-Konzentration nahezu vollständig auf das N-Pyd in der Probe zurückzuführen ist, wobei nur ein kleiner Beitrag von N-Dpd herrührt.
Die gemessenen Pyridinium-Vernetzungskonzentrationen der 44 Proben wurden gegen die gesamten, mittels HPLC gemessenen H-Pyd-Konzentrationen aufgetragen, was die in der Fig. 2 wiedergegebene Punktwolke ergab. Die am besten angepasste Regressionslinie in dieser Figur wird durch die Gleichung y = -10,407 + 0,40310x wiedergegeben. Somit steht die in dem Assay gemessene Pyridinium-Vernetzungskonzentration mit der Konzentration des gesamten hydrolysierten Pyridinolins in der Probe in einer linearen Beziehung, deren Steigung zwischen 0,3 und 0,5 liegt; bei dem vorliegenden spezifischen Datensatz beträgt die Steigung 0,403. Die lineare Beziehung zwischen der gemessenen Pyridinium-Vernetzungskonzentration und dem gesamten H-Pyd sowie die hohe Korrelation zwischen diesen beiden Werten (r = 0,982) erlaubt eine genaue Bestimmung der Werte des Gesamt-Pyd im Assay aus der Messung der Pyridinium-Vernetzungsspiegel.
Es ist ersichtlich, wie die mit dem Assay gemessenen N-Pyd- Spiegel verwendet werden können, um einen Index zur Bestimmung des metabolischen Status von Geweben, welche bei ihrer Zerstörung von Kollagen abgeleitete Vernetzungen erzeugen, bereitzustellen. Wie oben diskutiert wurde, ist eine Vielzahl von Abnormalien oder pathologischen Zuständen des Knochenmetabolismus durch eine Änderung sowohl von N-Pyd als auch des Gesamt-Pyd in menschlichen Urinproben gekennzeichnet. Darüber hinaus stellen die Änderungen beim N-Pyd auch ein gutes Maß für Änderungen beim N-Dpd dar. Letzterer Punkt wird anhand der in der nachfolgenden Tabelle 4 wiedergegebenen Daten erläutert, welche N-Pyd- und N-Dpd-Spiegel wiedergeben, welche mittels HPLC aus gereinigten N-Pyd- und N-Dpd-Vernetzungen in einer Vielzahl von Urinproben gemessen wurden. Tabelle 4
Diese Ergebnisse zeigen dramatisch erhöhte Spiegel von freien Vernetzungen bei Patienten, bei welchen bekannt ist, dass sie an durch exzessiven Bindgewebsabbau gekennzeichneten Erkrankungen leiden.
Die Tabelle 5 gibt die Anteile von N-Pyd und N-Dpd als Prozentsatz der entsprechenden gesamten, nach einer Hydrolyse gemessenen Vernetzungen bei verschiedenen Patientengruppen wieder. Tabelle 5
Da, wie in der Tabelle 5 wiedergegeben ist, der Prozentsatz von N-Pyd (als Prozentsatz des gesamten Pyd) und N-Dpd (als Prozentsatz des gesamten Dpd) bei Patienten mit Abnormalitäten im Vergleich zur Kontrollgruppe relativ unverändert ist, reflektieren die im Urin gemessenen N-Pyd-Spiegel dieselbe Erhöhung im Falle eines Kollagenabbaus wie die gesamten H-Pyd-Spiegel, welche nach einer Hydrolyse des Urins gemessen werden gleichermaßen reflektieren die im Urin gemessenen N-Dpd-Spiegel dieselbe Erhöhung im Falle eines Kollagenabbaus wie die gesamten H-Pyd-Spiegel.

V. Urinprobenvorfiltration

Gemäß bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens wird eine Urinprobe durch eine Membran filtriert, welche wirksam ist, um eine Substanz bzw. Substanzen zu entfernen, welche auf unspezifische Weise an Antikörper binden, wobei der N-Dpd- bzw. N-Pyd-Analyt durch die Membran durchgelassen wird. Die filtrierte Urinprobe wird mit einem Bindungsreagens (Bindungsmolekül) umgesetzt, welches wirksam ist, um einen Antigen/Antikörper-Komplex mit dem Analyten zu bilden, und zwar unter Bedingungen, die wirksam sind, um den Antikörper an den festen Träger proportional zur Menge des Analyten in der Probe zu binden.
Dieses Verfahren basiert auf der Erkenntnis, dass eine Substanz bzw. Substanzen, welche in Urinproben in veränderlichen Mengen vorliegen, die Empfindlichkeit, Präzision und Genauigkeit von Immunoassays stören kann bzw. können. Diese störenden Substanzen variieren von Person zu Person und können auch bei verschiedenen Proben, welche von derselben Person erhalten wurden, schwanken.
Die störende Substanz bzw. Substanzen kann bzw. können erfindungsgemäß mittels Inkontaktbringens einer Urinprobe mit einem Trennmedium (z. B. einer Filtermembran) entfernt werden, welche gekennzeichnet ist durch (i) eine zur Verringerung der Menge der störenden Substanz bzw. Substanzen in der Probe unter einen gewählten Schwellenwert ausreichende Bindungskapazität und (ii) eine geringe Affinität für den N-Dpd- oder N-Pyd-Analyten, das heißt, dass die Analytenkonzentration nach der Behandlung der Probe im Wesentlichen dieselbe ist wie vor der Behandlung der Probe. Andere wünschenswerte Eigenschaften des Trennmediums umfassen eine schnelle Betreibbarkeit und ein geringes Retentionsvolumen.
Materialien, welche als Trennmedium verwendet werden können, schließen auf Nitrocellulose basierende Materialien, hydrophobe/stark Protein-bindende Materialien sowie aufgeladene hydrophile Materialien ein. Die Konfiguration des Mediums kann eine Vielzahl von Formen annehmen, einschließlich z. B. eines Streifens, eines Kügelchens, einer Kartusche, einer Filterscheibe oder einer Rotationsfiltrationsvorrichtung. Die Wirksamkeit des Trennmediums bei der Entfernung der störenden Substanz kann mit weiter unten beschriebenen Verfahren bewertet werden.
Bei einer in den Beispielen 13-14 illustrierten bevorzugten Ausführungsform ist das Trennmedium als eine Rotationsfiltrationsvorrichtung konfiguriert, welche einen schnellen Probendurchsatz erlaubt. Alternativ kann das Trennmedium für eine festgelegte Zeit in die Probe eingebracht werden, um die störende Substanz bzw. die störenden Substanzen zu binden und dadurch aus der Probe zu entfernen. Studien, welche für die Zwecke der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, legen nahe, dass dann, wenn das Trennmedium die Form einer Membran annimmt, eine geringe Porengröße (z. B. weniger als 0,45 um und vorzugsweise weniger als 0,1 um) die Bindungskapazität der Membran für die störende Substanz erhöhen kann.
Allgemein ist es nützlich, Kandidaten für Trennmaterialien, welche entweder auf einer geringen Affinität für den N-Dpd- oder N-Pyd-Analyten oder eine hohe Affinität für die störende Substanz bzw. störenden Substanzen beruhen, einem anfänglichen Screening zu unterwerfen.
Die Bindung des Analyten an ein bestimmtes Abtrennungsmedium kann unter Verwendung einer oder mehrerer Standardlösungen, welche bekannte Mengen des Analyten enthalten, beurteilt werden. Es werden vorzugsweise keine Urinlösungen verwendet, um die Wirkungen der störenden Substanz bzw. störenden Substanzen zu vermeiden. Die Standardlösungen werden mit dem Abtrennungsmedium in Kontakt gebracht (z. B. durch dieses filtriert) und der Analyt wird untersucht, um zu bestimmen, ob der Analyt an das Abtrennungsmedium gebunden wurde. Bei einem anderen Ansatz wird der Analytengehalt einer Urinprobe, welche die störende Substanz bzw. störenden Substanzen enthält, unter Verwendung eines Analyseverfahrens (z. B. HPLC) gemessen, welches nicht durch die störende Substanz beeinträchtigt wird. Die Abwesenheit einer Änderung des gemessenen Analytenspiegels im Anschluss an den Kontakt der Probe mit dem Abtrennungsmedium zeigt an, dass eine weitere Charakterisierung des Mediums gewährleistet ist.
Die Bindung der störenden Substanz bzw. störenden Substanzen an ein bestimmtes Abtrennungsmedium kann mit einer Anzahl von Methoden bewertet werden. So kann beispielsweise das Immunoassay, welches zur Messung des Analyten verwendet wird, so modifiziert werden, dass ein Assay zur Verfügung steht, welches die Anwesenheit der störenden Substanz unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit des Analyten anzeigt. Wie in Beispiel 12 illustriert wird, kann die störende Substanz unter Verwendung eines Assays detektiert werden, welches das Ausmaß der Bindung eines Reporter-markierten Anti-Antikörpers an den festen Träger einer Mikrotiterplatte in Abwesenheit eines analytenspezifischen Antikörpers misst. Sodann kann eine Urinprobe, welche solches nicht-spezifisches Binden des Anti-Antikörpers an den festen Träger bewirkt, verwendet werden, um die Wirksamkeit eines möglichen Abtrennungsmediums zur Reduzierung oder Eliminierung eines solchen, durch die Probe bewirkten nicht-spezifischen Bindens zu beurteilen.
Sobald ein vielversprechendes Abtrennungsmaterial identifiziert wurde, können die Zusammensetzung und die Bindungskapazität dieses Materials im Hinblick auf die Anforderungen des Immunoassays für den Analyten optimiert werden.
Typischerweise wird der Analyt in einem kompetitiven Format untersucht, wobei die Urinprobe mit einem analytenspezifischen Antikörper-Reagens in Anwesenheit eines Reporter-markierten Analyten-Konkurrenten umgesetzt wird; die Menge des Immunokomplexes, welcher zwischen dem Antikörper-Reagens und dem Analyten-Konkurrenten gebildet wird, steht in reziproker Beziehung zur Menge des in der Urinprobe anwesenden Analyten. Üblicherweise ist entweder das analytenspezifische Antikörper-Reagens oder der Reporter-markierte Analyten-Konkurrent auf einem festen Träger als ein oberflächengebundenes Bindungsmolekül immobilisiert.
Alternativ kann ein Sandwich-Assay-Format verwendet werden, wobei zuerst ein Antikörper zur Bindung des Analyten auf einem festen Träger immobilisiert wird und ein zweiter Antikörper, welcher markiert ist oder mit einem Reporter markiert werden kann (z. B. mit einem Enzym-markierten Anti-Antikörper) verwendet wird, um den Analyten, welcher an das erste Antikörper-Reagens gebunden ist, zu detektieren.
Die Wirkungen der störenden Substanz bei einem repräsentativen Immunoassay werden anhand der in der Tabelle 6 wiedergegebenen Daten illustriert. Diese Daten wurden unter Verwendung des in der Fig. 1 illustrierten Immunoassays mit N-Pyd als Analyt erhalten. Wie in Beispiel 11 detailliert beschrieben wird, wurden Aliquote von sechs Urinproben jeweils vor und nach dem Kontakt mit einem Nitrocellulosefilter untersucht und der scheinbare Analytenspiegel in jeder Probe wurde über einen Vergleich mit aus einem Satz von N-Pyd-Standardlösungen erhaltenen Daten ermittelt. Tabelle 6
Wie der Tabelle 6 entnommen werden kann, stieg die gemessene Konzentration von N-Pyd um etwa 7-45 Prozent nach der Entfernung der störenden Substanz durch eine Nitrocelluse-Filterscheibe, was eine starke Variabilität des Störungsausmaßes unter den einzelnen Proben anzeigt. Darüber hinaus war eine hohe Korrelation der Analytenkonzentrationen, welche mit filtrierten Proben erhalten wurden, mit den N-Pyd-Konzentrationen in der Probe, gemessen mittels HPLC, gegeben, was anzeigt, dass die Variabilität der Probe aufgrund der störenden Substanz durch den Kontakt mit dem Abtrennungsmedium größtenteils eliminiert wird.
In der in Beispiel 12 beschriebenen Untersuchung wird gezeigt, dass die störende Substanz die Bindung des Enzym-markierten Anti-Antikörpers an den festen Träger in Abwesenheit von zugegebenem Anti-Analyten-Antikörper vermittelt. Es wurden 44 Urinproben unter Verwendung des in Beispiel 8 beschriebenen Assay-Formats für N-Pyd in Abwesenheit von Anti-Analyten-Antikörper untersucht. Von diesen 44 untersuchten Proben ergaben 8 Proben Dichtewerte von größer als 0,02 Absorptionseinheiten, was die Anwesenheit einer Substanz bzw. von Substanzen anzeigt, welche eine direkte, nicht-Pyd-spezifische Bindung des Enzymmarkierten Antikörpers an den festen Träger vermittelt bzw. vermitteln. Diese nicht-analytenspezifische Bindung von Antikörper an den festen Träger wird ebenfalls bei anderen Reporter-markierten Anti-Antikörpern beobachtet, wie z. B. bei Kaninchen-anti-Maus-Antikörpern.
Tabelle 7 gibt Messwerte der optischen Dichte wieder, welche mit den 8 problematischen Urinproben aus Beispiel 12 jeweils vor und nach dem Durchtritt der Proben durch eine Nitrocellulosemembran in einer Rotationsfiltrationsvorrichtung (Beispiel 13) erhalten wurden. Diese Tabelle zeigt, dass die untersuchten Urinproben ohne Vorfiltration optische Dichtewerte im Bereich von 0,36 bis 0,101 Absorptionseinheiten ergaben. Falls die Urinproben jedoch durch eine Nitrocellulosemembran rotationsfiltriert wurden, waren die optischen Dichtewerte auf weniger als 0,02 Absorptionseinheiten im Falle aller Proben verringert. Somit ist die Nitrocellulosemembran zur Entfernung der störenden Substanz wirksam, so dass eine nicht-spezifische Bindung von Anti-Antikörper an den festen Träger wesentlich verringert ist. Tabelle 7
Die Tabellen 8 und 9 illustrieren vergleichbare Wirksamkeiten von drei Abtrennungsmedien, welche sich als nützlich zur Entfernung der störenden Substanz bzw. der störenden Substanzen aus Urinproben herausgestellt haben (Beispiel 14). Tabelle 8 gibt die optischen Dichtewerte (OD) wieder, welche mit 16 Urinproben vor und nach der Filtration erhalten wurden. Es ist ersichtlich, dass die optischen Dichtewerte der Proben vor der Filtration im Bereich von 0,0 bis 0,905 Absorptionseinheiten (zweite Spalte) lagen. Eine Rotationsfiltration der Proben durch Immobilon®-CD (CD) - und Immobilon®-PSQ (PSQ) -Filter reduzierte indessen die optischen Dichtewerte der Proben auf Null, ähnlich den mit Nitrocellulose (NC) erhaltenen Ergebnissen (siehe Spalten 3-5). Tabelle 8 Tabelle 9
Tabelle 9 zeigt, dass die im Anschluss an die Filtration der Probe durch Nitrocellulose (NC) -, Immobilon®-CD (CD) - und Immobilon®-PSQ (PSQ)-Membranen gemessenen N-Pyd-Spiegel untereinander hervorragend übereinstimmten. Somit sind alle drei Medien zur Entfernung der störenden Substanz geeignet.

VI. Anwendungen

Wie oben angemerkt wurde, variiert der Pyridinium- Vernetzungsgehalt aus Kollagen enthaltenden Geweben mit dem Gewebetyp. Pyd-Vernetzungen werden im Knorpel, im Knochen, Bandscheiben, Bändern und in der Aorta gefunden. Dpd- Vernetzungen sind im Allgemeinen weniger verbreitet als Pyd- Vernetzungen und werden im Knochen, Dentin, in Bändern und in der Aorta gefunden. Der Anteil von Dpd an den Pyridinium- Vernetzungen im Gewebe scheint beim Knochen am höchsten zu sein, welcher ein Pyd : Dpd-Verhältnis von zwischen 3 : 1 und 4 : 1 aufweist.
Krankheitszustände, welche durch erhöhte Dpd-Spiegel (und Pyd- Spiegel) im Urin gekennzeichnet sind und somit von erhöhten Knochenabbaugeschwindigkeiten begleitet werden, umfassen beispielsweise Osteoporose, Paget-Syndrom, Nebenschilddrüsenunterfunktion und Osteoarthritis. Andere Krankheitszustände, welche erhöhte Pyd- und Dpd-Spiegel involvieren, umfassen verschiedene Formen von metastatischem Krebs, welche den Knochenmetabolismus verändern oder im Knochengewebe angesiedelt sind.
Die vorliegende Erfindung beruht teilweise auf der Erkenntnis, dass erhöhte Spiegel von N-Pyd und N-Dpd im Urin verlässliche Indikatoren einer erhöhten Kollagenabbauaktivität beim Menschen sind. Die Messung eines erhöhten N-Pyd-Spiegels oder erhöhter N-Pyd- und N-Dpd-Spiegel dient als ein allgemeiner Indikator eines erhöhten Kollagenabbaus. Die Messung von N-Dpd im Urin über einen Dpd-spezifischen Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung dient als ein relativ spezifischer Marker für einen erhöhten Knochenabbau.
Die vorliegende Erfindung ist weiterhin zur Überwachung antiresorptiver Therapien geeignet, welche mit einer Beherrschung der obengenannten Krankheitszustände in Verbindung stehen.
Darüber hinaus ist die vorliegende Erfindung, wenn ein Assay für N-Pyd in Verbindung mit einem Assay für N-Dpd verwendet wird, auch zur Unterscheidung von Krankheitszuständen nützlich, welche den Abbau von Kollagen enthaltenden Geweben involvieren, bei welchen der Anteil von Dpd-Vernetzungen wesentlich geringer (relativ zu den Pyd-Vernetzungen) ist, als der im Knochen gefundene Anteil. So ist beispielsweise im Falle der rheumatischen Arthritis, welche den Abbau von Bindegeweben zu involvieren scheint, welche relativ wenige Dpd-Vernetzungen enthalten, das Verhältnis von N-Pyd zu N-Dpd im Urin im Vergleich zu dem bei alleinigem erhöhtem Knochenabau beobachteten Verhältnis erhöht.
Fig. 3 illustriert die Verwendung eines Pyd spezifischen Antikörper-Reagens in der in den Fig. 1A-2C wiedergegebenen Assay-Konfiguration zur Detektion erhöhter N-Pyd-Spiegel in Urinproben von Patienten mit metastatischem Krebs. Die auf der linken Seite der Figur wiedergegebene Punktekolonne entspricht N-Pyd-Spiegeln (ausgedrückt als Pyd/Kreatinin-Verhältnisse), welche in einer Gruppe von gesunden Testpersonen gemessen wurden. Die Punktekolonne auf der rechten Seite der Figur entspricht N-Pyd-Spiegeln, die bei Patienten mit der Diagnose eines metastatischen Krebses gemessen wurden. Diese Daten zeigen Patienten mit erhöhten N-Pyd-Spiegeln an, was die Wahrscheinlichkeit einer Knochenbeteiligung bei ihren onkologischen Krankheitszuständen anzeigt.
Fig. 4 illustriert die Verwendung eines Pyd spezifischen monoklonalen Antikörper-Reagens zur Detektion erhöhter N-Pyd- Spiegel in Urinproben von Osteoporose-Patienten. Die Punktekolonne auf der rechten Seite der Figur (Gruppe 3) sind N-Pyd-Spiegel (ausgedrückt als Pyd/Kreatinin-Verhältnisse), welche bei einer Gruppe von 27 Kontrollpersonen (Alter 70-90 Jahre) gemessen wurden. Die mittlere Punktekolonne sind N-Pyd- Spiegel, die bei 20 Patienten (Alter 71-99 Jahre) mit bekannter oder vermuteter Osteoporose (Gruppe 2) gemessen wurden. Die Punktekolonne auf der linken Seite (Gruppe 1) sind N-Pyd- Spiegel, die bei 30 Patienten mit Oberschenkelhalsfraktur, verbunden mit schwerer Osteoporose, gemessen wurden. Diese Daten zeigen erhöhte N-Pyd-Spiegel im Urin beider Osteoporose- Patientengruppen (2 und 3) im Vergleich mit der altersentsprechenden Kontrollgruppe (Gruppe 1) an.
Die Verwendung eines Dpd-spezifischen monoklonalen Antikörpers in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung zur Detektion erhöhter Dpd-Spiegel im Urin ist in der Fig. 5 illustriert. In dieser Untersuchung wurde die in den Fig. 1A-1C gezeigte Assay-Konfiguration verwendet, welche zur Detektion von N-Dpd angepasst wurde. Die Punkte in der linken Spalte der Figur sind gemessene Dpd-Spiegel (ausgedrückt als Dpd/Kreatinin- Verhältnisse) bei einer Gruppe gesunder Patienten. Die Punkte in der mittleren Spalte der Figur sind gemessene Dpd-Spiegel von einer Patientenpopulation, welche Patienten mit diagnostizierten Knochenmetabolismusstörungen umfasst. Die Punkte der rechten Spalte in der Figur sind gemessene Dpd- Spiegel einer Gruppe von Onkologiepatienten. Diese Untersuchung identifiziert solche Patienten, die erhöhte Dpd-Spiegel zeigen, d. h. Patienten, deren onkologische Krankheitszustände wahrscheinlich eine Knochenbeteiligung umfassen.
Fig. 6 illustriert die Verwendung eines Dpd-spezifischen monoklonalen Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung zur Überwachung der Östrogentherapie bei Frauen, die sich in Osteoporosebehandlung befinden. Bei dieser Untersuchung wurden die Dpd-Spiegel vor der Therapie (einfarbige Balken in der Figur) und nach einem Jahr Östrogentherapie (schattierte Balken) gemessen. Bei sieben Patientinnen wurde im Verlauf der Therapie ein merklicher Abfall der Dpd-Spiegel beobachtet, was anzeigt, dass die Therapie die gewünschte Reduktion der Knochenresorption bewirkt. Die Ergebnisse von zwei weiteren Fällen, bei denen die Dpd-Spiegel im Verlauf der Therapie anstiegen, können anzeigen, dass eine alternative Behandlung in Erwägung gezogen werden sollte.
Anhand der vorausgehenden Ausführungen ist es ersichtlich, wie die Aufgaben der vorliegenden Erfindung gelöst wurden. Das Assay für native, freie Vernetzungen kann mit einer nicht- hydrolysierten Urinprobe betrieben werden, wodurch die Notwendigkeit eines vorangehenden Säurehydrolyseschrittes vermieden wird. Die Untersuchung verwendet ein Antikörper- Reagens und kann daher an eine Anzahl von im Stand der Technik bekannten einfachen und schnellen Assayformate angepasst werden. Darüber hinaus kann die vorliegende Erfindung, da sie eine Beurteilung des nativen, freien Pyd-Spiegels, Dpd-Spiegels oder beider in einer Urinprobe ermöglicht, zur Detektion und Überwachung einer Vielzahl von kollagenbezogenen Krankheitszuständen verwendet werden.
Die nachfolgenden Beispiele illustrieren erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Antikörper-Reagenzien und erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren. Diese Beispiele sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung illustrieren, aber keinesfalls einschränken.

BEISPIELE

Materialien und Verfahren

Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH, aus leuconostoc mesenteroides; å(280 nm, 1%) = 1,15 ml/mg·cm; Suspension in Ammoniumsulfat), Glucose-6-Phosphat (G6P) und Nikotinamid- Adenin-Dinucleotid (NAD) wurden von Boehringer Mannheim erworben. 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB), Cysteinhydrochlorid, N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA), Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC), 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimid-HCl (EDC) und N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) wurden von Pierce (Rockford, IL) erworben. p-Nitrophenylphosphat-Tabletten (jeweils 20 mg), N-Ethylmaleimid (NEM) sowie Diethanolamin wurden von Sigma erworben. Dialyseschläuche wurden von Spectrum Laboratories erworben. Mikrotiterplatten (96 Vertiefungen) wurden von Nung und von Costar Corp. erworben. Die Absorptionswerte von Lösungen in den Miktrotiterplatten wurden unter Verwendung einer V-max-Mikroplatten-Ablesevorrichtung von Molecular Devices Corp. (Menlo Park, CA) bestimmt. Die langsame, tropfenweise Zugabe von Reagenzien wurde unter Verwendung einer peristaltischen Mikroperplex-Pumpe vom Typ 2132 von LKB durchgeführt.

A. Reagenzien für monoklonale Antikörper

Weibliche Autoimmun-Mäuse vom Typ MRL/MpJ-lpr wurden vom Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, erworben.
Nicht-sekretierende Mäuse-Myelomzellen vom Typ P3X63Ag8.653 sowie Maus-Monocyten-Makrophagen-Zelllinien vom Typ P388D1(IL-1) und J774A.1 wurden von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, erworben.
Die Adjuvantien Ribi und Ribi(CWS) wurden von RIBI Immunochem Research, Inc., Hamilton, Montana, erworben. 50%-iges PEG 1500 (Polyethylenglycol 1500, 50% (w : v), in Wasser) wurde von Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana, erworben. HAT und HT wurden von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, erworben.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), NCTC-109 und Gentamicin wurden von Gibco, Grand Island, New York, erworben. Fötales Rinderklonserum wurde von Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah, erworben. Oxalessigsäure und Insulin stammten von Sigma Chemical Company. S-DMEM wurde wie folgt formuliert, wobei die Prozentsätze die endgültigen Volumenprozentsätze im fertigen Medium angeben: DMEM (80%), NCTC-109 (10%), fötales Rinderklonserum (10%), Oxalessigsäure (1 mM), L-Glutamin (2 mM), Gentamicin (50 ug/ml) und Insulin (10 ug/ml).
Zur Herstellung konditionierter Medien wurden Maus-Monocyten- Zelllinien vom Typ P388D1 (IL-1) bzw. dagegen austauschbar Zelllinien vom Typ J774A.1 in S-DMEM-Medium wachsen gelassen, wobei zweimal wöchentlich eine 1 : 4-Aufteilung erfolgte. Nach jeweils 3 Tagen wurden die überstehenden Lösungen der Zellkulturen durch ein 0,2 Micron-Filter filtriert und anschließend mit 4 mM L-Glutamin supplementiert. Die resultierenden konzentrierten, konditionierten Medien wurden als 20%-iger Zusatz zu S-DMEM zum Heranziehen von Hybridomzellen verwendet.
Falls nichts anderes angegeben ist, ist PBS als ein Puffer definiert, welcher 0,01 M Phosphat und 150 mM NaCl bei einem pH-Wert von 7 enthält.

Beispiel 1

HPLC-Messung der Vernetzungen

Die HPLC-Analyse auf Pyd und Dpd wurde im Wesentlichen ausgeführt wie bei Black et al. (1988) beschrieben. Kurzgesagt wurden Urinproben mit Butanol und Eisessig unter Herstellung eines 4 : 1 : 1-Gemischs (Butanol : Essigsäure : Probe, v : v : v) eingestellt und auf CF1-Cellulose-Kartuschen (Whatman) aufgegeben und anschließend mit 4 : 1 : 1 Butanol : Essigsäure : Wasser gewaschen. Es wurden nur freie Vernetzungen (und Glyco-Pyd) zurückgehalten. Die freien Vernetzungen wurden von der CF1- Cellulose mit Wasser eluiert. Das eluierte Material wurde auf einer C18-Umkehrphasensäule (Rainin, C18-80-200-C3) unter Verwendung eines Wasser/Acetonitril-Gradienten (3-17% in 10 Minuten) bei einer Zufuhrgeschwindigkeit von 1 ml/Minute unter Überwachung der Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 295 nm und einer Emissionswellenlänge von 395 nm analysiert.
Die gesamten Vernetzungen im Urin wurden mittels 16-stündiger Hydrolyse einer Urinprobe in (6 N) Hcl bei 110ºC, gefolgt von CF1-Vorbehandlung und der oben beschriebenen HPLC-Analyse, gemessen. Die HPLC-Trennung ergab hydrolysierte Pyd- und Dpd- Fraktionen, aus welchen das Gesamt-H-Pyd und das Gesamt-H-Dpd quantitativ ermittelt wurden.

Beispiel 2

Reinigung der Vernetzungsverbindungen

Menschlicher Urin wurde durch ein 3000 D Molecular Cut-Off- Filter (Filtron Co.) unter Anwendung eines Hinterdrucks von 40 psi filtriert. Das Filtrat wurde anschließend lyophilisiert und mit 0,2 M Essigsäure auf 1/20 seines ursprünglichen Volumens rekonstituiert.
Der konzentrierte Urin wurde anschließend auf eine Sephadex® G-10-Säule von 2,6 · 95 cm aufgegeben, welche mit 0,2 M Essigsäure äquilibriert worden war. Das aus der Säule eluierte Material wurde auf freies Pyd und Dpd wie oben beschrieben analysiert. Die freie Vernetzungen enthaltenden Fraktionen wurden vereint, auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt und auf eine Kationenaustauschersäule mit den Dimensionen 1 · 18 cm (Lacarte Co., UK) aufgegeben, welche mit 0,1 M Natriumcitrat bei einem pH-Wert von 4,2 äquilibriert worden war.
Glyco-Pyd, N-Pyd und N-Dpd wurden danach von der Säule mit 0,1 M Natriumcitrat bei einem pH-Wert von 4,2 zusammen eluiert. Die gesammelten Fraktionen wurden auf die Anwesenheit von Vernetzungen mittels HPLC-Analyse wie oben beschrieben analysiert. Fraktionen, welche spezifische Vernetzungen enthielten (Glyco- Pyd, Pyd und Dpd) wurden vereint und auf eine Umkehrphasen-C18- Säule mit den Dimensionen 2,5 · 10 cm (Waters) aufgegeben, welche danach mit einem 2-20%-igen Gradienten von Acetonitril, enthaltend 0,1% HFBA, entwickelt wurde. Die getrennten Fraktionen (N-Pyd und N-Dpd) wurden getrennt gesammelt und mittels Lyophilisierung aufkonzentriert. Die trockenen Rückstände wurden mit 0,2 M Essigsäure rekonstituiert und bei 4ºC gelagert. Die Reinheit der endgültigen Materialien wurde mittels gravimetrischer Analyse und Elementaranalyse gemessen.
Vernetzungspeptide im Urin wurden mittels erschöpfender Dialyse von menschlichem Urin unter Verwendung von 1000 D Molekulargewichts-Cut-Off-Dialysemembranen (Spectra/Por®) hergestellt. Die Gesamtgehalte der Peptidfraktionen an Pyd-Vernetzungen und Dpd- Vernetzungen wurden mittels 16-stündiger Hydrolyse der Peptidproben mit 6 N HCl bei 110ºC, gefolgt von einer HPLC-Analyse des Gesamt-H-Pyd und des Gesamt-H-Dpd bestimmt.
Präparative Mengen an H-Pyd und H-Dpd wurden aus hydrolysierten, pulverisierten Knochen von Rindern oder Schafen erhalten, wie von Black et al. (1988) beschrieben.

Beispiel 3

Herstellung der Immunogene

Das nachfolgende Verfahren illustriert, wie Immunogene zum Erhalt von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegen natives, freies Pyridinolin, natives, freies Desoxypyridinolin oder beide hergestellt werden können. Die im Folgenden unter A und B beschriebenen Verfahren werden in Bezug auf H-Pyd-Immunogene beschrieben; H-Dpd-Immunogene werden unter Anwendung desselben Ansatzes mit H-Dpd anstelle von H-Pyd hergestellt.

A. H-Pyd-BSA-Immunogen

Zu einer 3,1 ml-Lösung, bestehend aus 9 mg Rinderserumalbumin (BSA) und 3,8 mg H-Pyd in 0,1 M MES, pH-Wert = 5,0, wurden 0,88 ml einer wässrigen Lösung, enthaltend 88 mg EDC, zugegeben. Das Gemisch wurde vier Stunden lang bei Raumtemperatur umgesetzt und anschließend erschöpfend gegen phosphatgepufferte Salzlösung, pH-Wert = 7,0 (PBS), dialysiert. UV- und Fluoreszenzmessungen zeigten 5,8 Mol Pyridinolin, substituiert pro Mol Albumin an.

B. H-Pyd-KLH-Immunogen

Zu einer Lösung aus getrocknetem H-Pyd (6 mg) in Wasser, eingestellt auf einen pH-Wert von 5 ± 0,5 (200 ul), wurden 2 ml einer 10 mg/ml-Lösung von Keyhole Limpet-Hämocyanin (KLH) in PBS zugegeben. Zu der Mischung wurden 30 mg festes 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid (EDC, Pierce) zugegeben und 10 Minuten später nochmals 30 mg EDC, worauf 4 h lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen wurde. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend erschöpfend gegen PBS dialysiert, worauf das Pyd-KLH-Immunogen gesammelt und gelagert wurde.

Beispiel 4

Herstellung von monoklonalen Anti-Pyd-Antikörpern

A. Immunisierungsprotokoll

Weibliche, 5 Wochen alte Autoimmun-Mäuse vom Typ MLR/MpJ-lpr wurden unter Anwendung des nachstehenden Protokolls immunisiert: Tabelle 10 Immunisierungsprotokoll für Pyd-Mäuse
¹ Das Adjuvans und das Antigen wurden in Hank's Salzlösung (Hank's balanced salt solution) suspendiert.
² Intraperitoneal
³ Intravenös
Am Tage der Fusion wurde die immunisierte Maus mit CO&sub2;-Gas getötet, die Milz wurde aus der Maus herausgeschnitten und in eine Kulturschale gelegt, welche 5 ml serumfreies DMEM-Medium enthielt, welches auf 37ºC vorgewärmt war. Im Anschluss an die Entfernung des mit der Milz verbundenen Fettgewebes wurde die Milz mit 5 ml serumfreiem DMEM-Medium gewaschen. Die Milz wurde anschließend in kleine Stücke geschnitten, welche in einen Zellhomogenisator, der 7 ml serumfreies DMEM-Medium enthielt, vorgelegt wurden, und die Zellen wurden unter Bildung einer Zellsuspension homogenisiert.

B. Fusionsprotokoll

Die nachfolgenden Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die Milzzellensuspension (~2 · 10&sup8; Zellen in serumfreiem DMEM- Medium) und Log-Phasen-Myelomzellen vom Typ P3X63Ag8.653 (~7 · 10&sup7; Zellen in serumfreiem DMEM-Medium) wurden unabhängig voneinander bei 400 · g 10 Min. lang zentrifugiert. Die resultierenden Zell-Pellets wurden zusammen in serumfreiem DMEM-Medium (10 ml) in einem 50 ml-Zentrifugenglas suspendiert und anschließend bei 400 · g 10 Min. lang zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde vollständig entfernt und das Zentrifugenglas wurde zum Ablösen des Zellpellets geklopft.
Zur Zellfusion wurde eine Lösung von 50%-igem PEG 1500 (4 ml) tropfenweise innerhalb von 90 Sekunden zum Zentrifugenglas unter vorsichtigem Mischen mit einer Pipette zugegeben. Sodann wurde innerhalb 1 Min. serumfreies DMEM (4 ml) tropfenweise zugegeben. Anschließend wurde S-DMEM (40 ml) innerhalb von 2 Min. unter vorsichtigem Mischen zugegeben, wonach das Gemisch noch 2,5 Min. lang mit einer Pipette gemischt wurde. Das resultierende Gemisch wurde 10 Min. lang bei 400 · g zentrifugiert. Nach sorgfältiger Entfernung der überstehenden Flüssigkeit wurden die Zellen in 320 ml HAT in 20%-igem, mit P388D1 konditioniertem S-DMEM-Medium suspendiert. Die Zellsuspension wurde in 16 Gewebskulturplatten mit 96 Vertiefungen bei 200 ul/Vertiefung plattiert, und die Platten wurden anschließend bei 37ºC in einer 7% CO&sub2; enthaltenden Atmosphäre inkubiert. Die Zellgemische wurden am Tag 3 und Tag 7 ernährt, indem 100 ul/Vertiefung altes Medium entfernt und 150 ul/Vertiefung HAT-Medium (Tag 3) oder HT-Medium (Tag 7) zugegeben wurden. Die Vertiefungen waren nach 7 bis 10 Tagen nach der Fusion bereit zum Screening.

C. Screening der Hybridomzellen auf Produktion von monoklonalen Anti-N-Pyd-Antikörpern

Erfolgreiche Fusionsprodukte wurden unter Verwendung des in Beispiel 8 beschriebenen N-Pyd-Immunoassayformats auf Immunoreaktivität gescreent. Zelllinien, welche hochaffine Bindung an N-Pyd zeigten, wurden mittels limitierender Verdünnung subkloniert und erneut auf Produktion von Antikörpern mit einer hohen Bindungsaffinität an N-Pyd gescreent. Eine der subklonierten Zelllinien, welche eine hohe Antikörper-Affinität gegenüber N-Pyd ergab, wird hier als Mab-Pyd-XXV-3G6-3B11-1A10 bezeichnet. Die Spezifität der mit dieser Zelllinie produzierten Antikörper ist in der obenstehenden Tabelle 1 wiedergegeben.

Beispiel 5

Herstellung von monoklonalen Anti-Dpd-Antikörpern

Monoklonale Anti-Dpd-Antikörper wurden mit dem oben bei Beispiel 4 beschriebenen Verfahren hergestellt, wobei wie in Beispiel 3 hergestelltes Dpd-KLH-Immunogen verwendet wurde. Das Immunisierungsverfahren der Mäuse war dasselbe wie in Beispiel 4, mit der Ausnahme, dass Ribi (CWS) anstelle von Ribi als Adjuvans verwendet wurde und dass 75 ug Immunogen pro Maus anstelle von 100 ug beim vierten Immunisierungsschritt (18 Tage von der Fusion) verwendet wurden.
Erfolgreiche Fusionsprodukte wurden unter Verwendung des in Beispiel 9 beschriebenen N-Dpd-Immunoassayformats auf Immunoreaktivität gescreent. Zelllinien, welche eine hochaffine Bindung an N-Dpd zeigten, wurden mittels limitierender Verdünnung subkloniert und erneut auf Produktion von Antikörpern mit hoher Bindungsaffinität gegenüber N-Dpd gescreent. Eine der subklonierten Zelllinien, welche eine hohe Antikörperaffinität an N-Dpd ergab, wird hier als Mab-Dpd-II-7B6-1F4-1H11 bezeichnet. Die Spezifität der von dieser Zelllinie produzierten Antikörper ist in der obenstehenden Tabelle 2 wiedergegeben.

Beispiel 6

Herstellung von monoklonalen Antikörpern, welche sowohl auf N-Pyd als auch auf N-Dpd spezifisch sind

Monoklonale Antikörper, welche sowohl auf N-Pyd als auch auf N-Dpd spezifisch sind, wurden mit dem Verfahren gemäß Beispiel 5 hergestellt, wobei H-Dpd-KLH (Beispiel 3) als Immunogen verwendet wurde. Erfolgreiche Fusionsprodukte wurden unter Verwendung des in Beispiel 9 beschriebenen N-Dpd- Immunoassayformats auf Immunoreaktivität gescreent. Zelllinien, welche eine hohe Bindungsaffinität gegenüber N-Dpd zeigten, wurden mittels limitierender Verdünnung subkloniert und erneut auf Produktion von Antikörpern mit hoher Bindungsaffinität gegenüber sowohl N-Pyd als auch N-Dpd gescreent. Eine der subklonierten Zelllinien, welche hohe Bindungsaffinität gegenüber sowohl N-Pyd als auch N-Dpd ergab, wird hier als Mab- Pyd/Dpd-V-6H2-2H4-1E4 bezeichnet. Die Spezifität der von dieser Zelllinie produzierten Antikörper ist in der obigen Tabelle 3 wiedergegeben.

Beispiel 7

Herstellung von H-Pyd-Streptavidin und H-Dpd-Streptavidin

Die Konjugation von H-Pyd an Streptavidin wurde mittels Kopplung eines thiolierten Streptavidins an H-Pyd mittels des Kopplungsreagens SMCC bewerkstelligt. Thioliertes Streptavidin wurde mittels Umsetzung mit N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP, Pierce) wie folgt hergestellt. Zu 0,75 ml einer Lösung von 5 mg Streptavidin in PBS wurden 21 ul Dimethylformamid zugegeben, welches 260 ug SPDP enthielt. Das Gemisch wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen und anschließend gegen PBS dialysiert. Das SPDP-markierte Streptavidin wurde mittels Zugabe von Dithiothreitol bis zu einer Endkonzentration von 10 mM reduziert. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde das thiolierte Streptavidin über eine G-25-Säule gereinigt.
Zur Bildung von H-Pyd-Streptavidin wurde eine Lösung, welche 180 ug Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC, Pierce) in Dimethylformamid (4 ul) enthielt, zu einer Lösung zugegeben, welche 0,5 mg thioliertes Streptavidin und 50 ug H-Pyd in 100 ul PBS enthielt. Das Gemisch wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur reagieren lassen und anschließend gegen PBS dialysiert. Eine spektrophotometrische Analyse des resultierenden Pyd-Streptavidins zeigte, dass zwischen 1 und 2 Äquivalente Pyridinolin pro Äquivalent Streptavidin gebunden waren.
H-Dpd-Streptavidin wurde nach demselben Verfahren hergestellt, mit der Ausnahme, dass H-Dpd anstelle von H-Pyd verwendet wurde.

Beispiel 8

Immunoassay unter Verwendung eines monoklonalen Anti-Pyd-Antikörper-Reagens

A. Mit H-Pyd beschichtete Mikrotiterplatten

Biotin-markiertes Ovalbumin und H-Pyd-Streptavidin (Beispiel 7) wurden zur Beschichtung der Mikroplatte verwendet.
Die Biotinylierung von Ovalbumin wurde mittels Zugabe von 10 mg Biotin-x-2, 4-dinitrophenyl-x-1-lysin-succinimidylester (Molecular Probes) in 400 ul Dimethylformamid zu 10 ml einer Lösung von PBS, welche 150 mg Ovalbumin enthielt, durchgeführt. Das Gemisch wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur umgesetzt, gefolgt von Chromatographie auf einer G25-Säule. Eine spektrophotometrische Analyse zeigte, dass zwei Mol Biotin pro Mol Ovalbumin substituiert waren.
Die Vertiefungen in einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen wurden wie folgt mit N-Pyd beschichtet. Zu jeder Vertiefung wurden 150 ul einer Biotin/Ovalbumin-Lösung von 3,8 ug/ml in PBS zugegeben, nachfolgend wurde über Nacht bei 2-8ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit PBS gewaschen und mittels Zugabe von 20 ul Ovalbumin von 1 mg/ml und einer Inkubierung über Nacht bei Raumtemperatur blockiert. Die Vertiefungen wurden anschließend zweimal mit PBS gewaschen. 150 ul einer Lösung, die 100 ug/ml H-Pyd-Streptavidin in PBS enthielt, wurde zu jeder Vertiefung der mit Biotin/Ovalbumin beschichteten Mikroplatte hinzugegeben. Nach einer einstündigen Inkubierung bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen zweimal mit PBS gewaschen. Der verbleibende Ligand wurde von den Vertiefungen entfernt, indem über Nacht in einem Konvektionsofen bei 37ºC getrocknet wurde.

B. Assayprotokoll

N-Pyd-Standardlösungen und Urinproben wurden jeweils zweifach getestet. Die Standardlösungen bestanden aus 0 nM, 25 nM, 75 nM, 250 nM, 750 nM und 3000 nM N-Pyd in einem Assay-Puffer (0,05% NaN&sub3;, 0,05% Tween 20 und 0,1% BSA in PBS). Die Urinproben wurden vor der Untersuchung mittels Zentrifugierens durch eine Nitrocellulosemembran filtriert (Rotationsfiltration).
Unter Verwendung der oben hergestellten Mikrotiterplatten wurden 20 ul/Vertiefung der Standardlösungen jeweils zweifach zu 12 der 96 Vertiefungen in den beschichteten Platten zugegeben und jeweils 20 ul/Vertiefung der 44 Urinproben wurden jeweils zweifach zu den Vertiefungen von zwei Mikrotiterplatten zugegeben.
Es wurden 100 ul/Vertiefung Mab-3G6-3B11-1A10 (Verdünnung 1 : 100000) in Assaypuffer (0,05% NaN&sub3;, 0,05% Tween 20 und 0,1% BSA in PBS) zugegeben. Die Standards bzw. Proben und die Mab- Gemische wurden bei 4ºC über Nacht inkubiert. 100 ul/Vertiefung von Ziege-anti-Maus-IgG + M(H+L)-alkalische Phosphatase-Konjugat (Pierce, Nr. 31330, Verdünnung 1 : 1000 in Assaypuffer) wurden zur Platte hinzugegeben und bei Raumtemperatur eine Stunde lang inkubiert.
Zu jeder Vertiefung wurden 100 ul Enzym/Substrat-Lösung (2 mg/ml) p-Nitrophenylphosphat (Sigma) in 1,0 M Diethanolamin, pH-Wert = 9,8, enthaltend 1 mM MgCl&sub2;) zugegeben. Im Anschluss an eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur wurden 50 ul 3,0 N NaOH zu jeder Vertiefung zugegeben, um die enzymatische Reaktion abzustoppen. Die optische Dichte bei 405 nm wurde anschließend mit einer Vmax-Ablesevorrichtung (Molecular Devices Corp.) gemessen.
Die optischen Dichtewerte (405 nm) von jeweils zwei Proben wurden gemittelt und die gemittelten Werte der N-Pyd-Standards wurden zur Erstellung einer Kalibrierungskurve von OD-Werten gegen die N-Pyd-Konzentration verwendet. Aus dieser Kurve wurde die freie N-Pyd-Vernetzungskonzentration jeder Urinprobe bestimmt. Die Kreatinin-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines Assays, welches alkalisches Picrat involvierte (Cook, 1975), gemessen.
Dieselben Urinproben wurden hinsichtlich des gesamten Pyd mit dem in Beispiel 2 beschriebenen HPLC-Verfahren quantifiziert. Kurzgesagt wurden die Urinproben 16 Stunden lang in HCl (6 N) bei 110ºC hydrolysiert, gefolgt von einer CF1-Vorbehandlung und HPLC-Analyse des Gesamt-H-Pyd.
Fig. 2 gibt eine Punktwolke von Pyridinium-Vernetzungsmesswerten (in nM), gemessen mit dem Immunoassayverfahren (y-Achse) wieder, aufgetragen gegen das mittels HPLC gemessene Gesamt- H-Pyd. Die Gerade in diesem Plot stellt die am besten angepasste lineare Regression dar, welche die Immunoassay-Werte als eine Funktion mit den mittels HPLC gemessenen Gesamt-Pyd- Werten korreliert.

Beispiel 9

Immunoassay unter Verwendung eines monoklonalen Anti-Dpd-Antikörper-Reagens

A. Mit H-Dpd beschichtete Mikrotiterplatten

Zu jeder Vertiefung einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen wurden 100 ul einer Lösung zugegeben, welche H-Dpd-Streptavidin (0,5 ug/ml in PBS) enthielt. Nach einer Inkubation über Nacht bei 4ºC wurden die Vertiefungen entleert und anschließend mittels Inkubation mit Ovalbumin (1 mg/ml in PBS; 150 ul/Vertiefung) innerhalb einer Zeit von 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4ºC blockiert. Nach der Inkubation wurden die Platten 3-mal mit PBS gewaschen.

B. Assay-Protokoll

N-Dpd-Standardlösungen und Urinproben wurden jeweils zweifach getestet. Die Standardlösungen bestanden aus 0 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM und 500 nM N-Dpd in Assaypuffer (0,05% NaN&sub3;, 0,05% Tween 20 und 0,1% BSA in PBS). Die Urinproben wurden vor der Untersuchung mittels Zentrifugierens durch eine Nitrocellulosemembran (Rotationsfiltration) filtriert.
Im Anschluss an die Zugabe von Probe (10 ul/Vertiefung) wurden 100 ul/Vertiefung des monoklonalen Antikörpers vom Typ 7B6-1F4- 1H11 (eine 1 : 1600-Verdünnung von überstehender Flüssigkeit der Gewebekultur in Assaypuffer, -10 ng/ml Antikörper) zugegeben, und die Assayplatte wurde über Nacht bei 4ºC inkubiert. Nachdem die Platte 3-mal mit 300 ul/Vertiefung Waschpuffer gewaschen worden war, wurden 100 ul/Vertiefung Ziege-anti-Maus- IgG+M(H+L)-alkalische Phosphatase-Konjugat (Pierce, Nr. 31330) (Verdünnung in Assaypuffer 1 : 1000) zugegeben und die Platte wurde bei Raumtemperatur 1 h lang inkubiert. Die Vertiefungen wurden anschließend 3-mal mit Waschpuffer gewaschen.
Das gebundene Enzym wurde wie im vorstehenden Beispiel untersucht. Die Konzentration an N-Dpd-Vernetzungen in jeder unbekannten Urinprobe wurden mittels Quantifizierung anhand der Kalibrierungskurve ermittelt.

Beispiel 10

Bindungsselektivität von monoklonalen Antikörper-Reagenzien

N-Pyd, N-Dpd und Pyridinium-Peptide (MW > 1000) wurden aus Urinproben wie oben beschrieben isoliert. Aliquote der Pyridinium-Präparate wurden hydrolysiert, um die Vernetzungen in den Fraktionen zu H-Pyd und H-Dpd zu hydrolysieren. Die Konzentrationen von Pyd in den N-Pyd- und H-Pyd-Präparaten, von Dpd in den N-Dpd- und H-Dpd-Präparaten und von Dpd in den Pyridiniumpeptid-Präparaten wurden mittels HPLC wie in Beispiel 1 bestimmt. Zusätzlich wurde eine Aminosäurenlösung, welche ein äquimolares Gemisch der 20 üblichen Aminosäuren mit jeweils 150 uM in PBS enthielt, hergestellt.
Aliquote (50 ul) der nativen Vernetzungs-Präparate und des Aminosäurengemischs wurden jeweils zweifach zu den mit Pyd oder Dpd beschichteten Mikrotitervertiefungen, die wie oben beschrieben hergestellt worden waren, zugegeben, und jede Vertiefung wurde in geeigneter Weise auf Pyridinolin oder Desoxypyridinolin gemäß Beispiel 8 oder 9 untersucht. Die optischen Dichtewerte (405 nm) der jeweils zweifachen Proben wurden gemittelt, und aus diesen Werten wurde die scheinbare N-Pyd- oder N-Dpd-Konzentration jeder Probe unter Verwendung einer mit gereinigtem N-Pyd oder N-Dpd erstellten Eichkurve bestimmt. Der Prozentsatz der Reaktivität jeder Probe wurde als Verhältnis der scheinbaren Konzentration (unter Verwendung einer Kalibrierungskurve; siehe Beispiele 8 und 9) zur gesamten Pyd-Vernetzungskonzentration in der Probe, bestimmt mittels HPLC-Analyse des Gesamt-H-Pyd (multipliziert mit 100) oder des Gesamt-H-Dpd im Falle der gesamten Dpd-Vernetzungskonzentration, errechnet. Die mit Antikörpern verschiedener Spezifitäten erhaltenen Resultate sind in den obigen Tabellen 1, 2 oder 3 wiedergegeben.

Beispiel 11

Filtration mit einer Nitrocellulose-Spritze

Sechs Urinproben mit den Bezeichnungen 2181, 2176, 2159, 2167, 2161 und 2172 wurden untersucht. Ein. Aliquot (400 ul) jeder Probe wurde mit einer Spritze durch ein Nitrocellulosefilter mit 25 ml Durchmesser und einer Porengröße von 0,44 um (Millipore, Millex-HA, Bedford, MA) filtriert und das Filtrat wurde in einem Röhrchen gesammelt. Aliquote (10 ul) von filtriertem und unfiltriertem Probenmaterial sowie von N-Pyd-Standards wurden jeweils zweifach zu den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen zugegeben, welche wie in Beispiel 8 hergestellt worden war, und die Konzentration von N-Pyd in jeder Probe wurde wie allgemein in Beispiel 8 beschrieben bestimmt, wobei ein N-Pyd-selektiver polyklonaler Antikörper und ein mit alkalischer Phosphatase markierter Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper verwendet wurde. Die Resultate sind in der Tabelle 6 wiedergegeben.

Beispiel 12

Beurteilung der von den Urinproben vermittelten nicht-spezifischen Bindung

Urinproben wurden mit dem nachfolgenden Verfahren auf die Anwesenheit von störenden Materialien untersucht. Aliquote (10 ul) an Puffer, N-Pyd-Standards und jeweils 44 Urinproben wurden jeweils zweifach in den Vertiefungen von zwei Miktrotiterplatten mit 96 Vertiefungen vorgelegt. Das in Beispiel 8 beschriebene Untersuchungsverfahren wurde durchgeführt, mit der Ausnahme, dass der Anti-N-Pyd-Antikörper durch Assaypuffer oder durch verdünnte überstehende Flüssigkeit der Zellkultur ersetzt wurde. Die Vertiefungen, zu welchen lediglich Puffer, verdünnte Gewebekultur oder N-Pyd-Standard hinzugegeben worden war, ergaben optische Dichtewerte von weniger als 0,010. Von den 44 untersuchten Urinproben ergaben 8 Proben Werte von mehr als 0,02 Absorptionseinheiten (Tabelle 7).

Beispiel 13

Entfernung von störender Substanz mittels Rotationsfiltration

Die 8 Urinproben aus Beispiel 12, welche optische Dichtewerte von mehr als 0,02 ergaben, wurden dem folgenden Rotationsfiltrationsschritt unterworfen. Ein Aliquot (200 ul) jeder Probe wurde in einer Nitrocellulose-Filtereinheit, welche in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen suspendiert war, vorgelegt, die Filtereinheit und das Mikrozentrifugenröhrchen werden zusammen als "Filteranordnung" bezeichnet. Die Filtereinheit (hergestellt von Lida Manufacturing Corp., Kenosha, WI) umfasste ein zylindrisches Gehäuse aus Polypropylen (40 mm Länge · 10 mm Außendurchmesser) und enthielt an ihrem unteren Ende eine Doppelschicht aus Nitrocellulosemembranen (0,1 um Porengröße) sowie einen Träger aus nicht-gewebtem Polyethylen. Der effektive Filtrationsquerschnitt der Nitrocellulosemembranen betrug 0,2 cm². Die Proben enthaltenden Filteranordnungen wurden anschließend bei 1500 · g 2 Minuten lang zentrifugiert, um die Proben vollständig durch die Filter hindurchzuleiten. Die Proben wurden anschließend wie in Beispiel 8 beschrieben verarbeitet, wobei indessen Assaypuffer anstelle des Anti-Pyd-Antikörpers verwendet wurde. Die gemessenen optischen Dichten aller acht filtrierten Proben betrugen weniger als 0,02 (Tabelle 7).

Beispiel 14

Vergleich der Rotationsfilter

Aliquote (200 ul) von 16 Urinproben wurden in Rotationsfilteranordnungen zentrifugierte, welche eines der folgenden Membranmaterialien enthielt: Nitrocellulose (Lida Manuf. Corp., Kenosha, WI), Immobilon®-CD (Millipore Corp., Bedford, MA, Katalog-Nr. ICDM-00000) und Immobilon®-PSQ (Millipore, Katalog-Nr. ISEQ-00000). Die Nitrocellulose-enthaltende Filteranordnung wurde wie in Beispiel 13 beschrieben konfiguriert. Die Immobilon enthaltenden Filteranordnungen wurden ähnlich konfiguriert wie die Anordnungen, welche Nitrocellulose enthielten, mit der Ausnahme, dass die Immobilon-Membranen nicht zweischichtig, sondern einschichtig waren und eine Porengröße von 0,1 um aufwiesen.
Aliquote (10 ul) von filtrierten und unfiltrierten Urinproben wurden jeweils zweifach zu den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen zugegeben, welche wie in Beispiel 8 beschrieben hergestellt worden war. Das in Beispiel 8 beschriebene Untersuchungsverfahren wurde durchgeführt, mit der Ausnahme, dass der Anti-N-Pyd-Antikörper durch Assaypuffer ersetzt wurde. Die optischen Dichtewerte, welche von den Urinproben hervorgerufen wurden, sind in der Tabelle 8 wiedergegeben (alle Werte wurden durch Subtraktion der Absorption des reinen Puffers korrigiert). Die in denselben Proben unter Verwendung einer mit N-Pyd-Standards erstellten Kalibrierungskurve gemessenen N-Pyd-Konzentrationen sind in der Tabelle 9 wiedergegeben.

Beispiel 15

Herstellung eines Pyridinolin-G6PDH-Konjugats unter Verwendung eines Carbodiimids

Aus einem Ammoniumsulfat-Präzipitat ausgefälltes G6PDH (MW = 110000) (Boehringer Mannheim) wurde mittels 5-minütiger Zentrifugation bei 12000 Upm gesammelt. Zu jedem einer Anzahl von Aliquots des Pellets wurde eine Lösung aus hydrolysiertem Pyd oder Dpd (15, 23 oder 37 mM Vorratslösungen) in 0,1 M Phosphat, enthaltend 150 mM NaCl (PBS), pH-Wert = 7,5, bei einem Molverhältnis (Pyd bzw. Dpd zu G6PDH) von 80 : 1, 130 : 1 oder 200 : 1 zugegeben, und das resultierende Gemisch wurde gemischt. Die Schlusskonzentration von G6PDH im Gemisch betrug 20 mg/ml.
Im Anschluss an die Zugabe einer ausgewählten Menge an trockenem EDC zur Lösung (das Molverhältnis von EDC zu G6PDH betrug 170 : 1, 290 : 1 oder 460 : 1) wurde das resultierende Gemisch bei 4ºC über Nacht reagieren gelassen. Das resultierende, mit Pyd markierte G6PDH eines jeden Reaktionsgemisches wurde über eine Sephadex®G-25-Säule unter Verwendung von 0,01 M PBS, pH-Wert = 7,0, als Elutionspuffer oder mittels Dialyse gegen 0,01 M PBS, pH-Wert = 7,0, gereinigt. Das Verhältnis von Pyd zu G6PDH in jedem Konjugat wurde auf der Grundlage der Absorptionswerte bei 280 nm berechnet (G6PDH, &epsi;(280 nm, 1%) = 1,15 ml/mg·cm) sowie bei 326 nm (Pyd, &epsi;(326 nm) = 5420 ml/mmol·cm, pH-Wert 7; oder Dpd &epsi;(326 nm) = 4933 ml/mmol·cm, pH-Wert = 7) berechnet. Das Konjugat wurde bei -20ºC in 50%-igem Glycerin aufbewahrt. G6PDH, Pyd und EDC ergaben in den Verhältnissen 1 : 130 : 290 G6PDH, welches mit etwa 8,8 Pyd-Molekülen pro Mol G6PDH markiert war.

Beispiel 16

Herstellung eines Pyridinolin-G6PDH-Konjugats unter Verwendung von Sulfo-SMCC und SATA

Thioliertes GSPDH wurde wie folgt hergestellt. Eine Lösung, welche G6PDH (2 mg/ml) und 5 Moläquivalente NAD&spplus; enthielt, wurde in 0,1 M PBS, pH-Wert = 7,5, hergestellt. Zu dieser Lösung wurden 25 Moläquivalente SATA, gelöst in (10,5 ul) wässrigem Dimethylsulfoxid zugegeben. Nach einer Umsetzungsdauer von 45 Minuten bei Raumtemperatur wurden 30 Moläquivalente NH&sub2;OH·HCl zugegeben, und das resultierende Gemisch wurde 30 Minuten lang reagieren gelassen, um die Thiol-Schutzgruppen der Enzym-gebundenen SATA-Moleküle zu entfernen. Das resultierende thiolierte G6PDH wurde von verbleibendem NH&sub2;OH·HCl und nicht- gebundenem SATA mittels Zentrifugierens bei 900 Upm durch eine Gelfiltrationssäule vom Typ PD-10 (Pharmacia) gereinigt.
Ein Pyd-SMCC-Derivat vom Verhältnis 1 : 1 wurde wie folgt hergestellt. Zu einer heftig gerührten Lösung von hydrolysiertem Pyd (29 mM) in 0,1 M PBS, pH-Wert = 7,5, wurde langsam eine Lösung, welche 1,5 Moläquivalente Sulfo-SMCC in 200 ul eines 1 : 1-Gemischs von MeOH in 0,1 M PBS, pH-Wert = 7,5, enthielt, zugegeben. Die resultierende klare, tief bernsteinfarbene Lösung wurde weitere 3 h lang gerührt. Im Anschluss an eine zweitägige Lagerung der Reaktionslösung bei -20ºC wurde die Lösung durch eine Säule aus BioGel P-2 (Biorad) unter Verwendung von 10 mM PBS, pH-Wert = 7,5, als Eluent durchgeleitet. Mittels UV-Überwachung bei 326 nm wurden drei Pyd-haltige Peaks beobachtet: Pyd : SMCC (1 : 2); Pyd : SMCC (1 : 1) sowie freies (nicht-derivatisiertes) Pyd. Die Fraktionen, welche das 1 : 1 Pyd : SMCC-Derivat enthielten, wurden vereint und die Konzentration wurde auf der Basis der Absorption des Pyd-Pyridiniumrings bei 326 nm bestimmt.
Pyd-markiertes G6PDH wurde mittels Zugabe von 1,3 ml einer thiolierten 6GPDH-Lösung (0,8 mg/ml, hergestellt wie oben beschrieben) zu 63 ul einer 1,7 mM-Lösung des 1 : 1 Pyd : SMCC-Derivats (12 Moläquivalente Pyd : SMCC-Derivat pro Äquivalent G6PDH) hergestellt. Der pH-Wert des resultierenden Gemischs wurde falls erforderlich auf 7,5 eingestellt und das Gemisch wurde 1 h lang bei Raumtemperatur unter einer Argon-Atmosphäre verschlossen reagieren gelassen.
Alle verbleibenden Thiol-Gruppen wurden mittels 1-stündiger Umsetzung mit einer methanolischen Maleimid-Lösung (1 M Vorratslösung, endgültige Konzentration, 50 mM) mit Endgruppen versehen. Im Anschluss an diesen Abdeckungsschritt ("capping step") wurde das resultierende Gemisch über Nacht im Dunkeln bei 4ºC in 12-14000 NW Cut-Off-Dialyseschläuchen in 10 mM PBS bei einem pH-Wert von 7 dialysiert. Nach der Dialyse wurde das endgültige Volumen gemessen und das Verhältnis G6PDH : Pyd wurde auf der Grundlage der Absorptionen bei 280 und 326 nm berechnet.

Beispiel 17

Herstellung eines Pyridinolin-G6PDH-Konjugats unter Verwendung von Sulfo-SMCC und SPDP

Die nachfolgenden Puffer wurden hergestellt und entgast: 0,05 M Natriumphosphat, pH-Wert 7,5, welcher 115 uM NAD&spplus; enthielt (pH 7,5-Puffer); 0,10 M Natriumphosphat, pH-Wert = 6,0, welcher 115 uM NAD&spplus; enthielt (pH 6-Puffer).
Zu einer heftig gerührten Lösung von G6PDH (2 mg/ml, 0,5 ml) im pH 7,5-Puffer wurden 14 oder 47 ul einer 19 mM-Lösung von SPDP (30 oder 100 Moläquivalente) in wasserfreiem Ethanol innerhalb von 1-2 h unter Verwendung einer peristaltischen. Pumpe zugegeben. Nach Vervollständigung der Zugabe wurde die resultierende Lösung erschöpfend unter Verwendung eines 6-8000 oder 12-14000 MW Cut-Off-Schlauchs gegen den pH 6-Puffer bei 4ºC dialysiert. Im Anschluss an diese Dialyse wurde das SPDP-markierte Enzym gesammelt und mit Dithiotreitol (5-10 mM innerhalb von 30 Minuten) umgesetzt, um die 2-Thiopyridin-Gruppen zu entfernen und dadurch ein thioliertes Enzym herzustellen. Die Anzahl der SPDP-Moleküle, welche an das Enzym gebunden waren, wurde mittels Messung der Menge an Pyridin-2-thion (A&sub3;&sub4;&sub4;) gemessen, welches bei der Umsetzung mit Dithiothreitol freigesetzt wurde. Das resultierende thiolierte Enzym wurde unter Verwendung einer Entsalzungssäule vom Typ PD-10 mit pH 6-Puffer gereinigt, und der genaue Thiol-Gehalt des Enzyms (5 bzw. 10 Thiolgruppen pro Molekül G6PDH, erhalten mit 30 bzw. 100 Moläquivalenten SPDP) wurde unter Verwendung von Ellman's Reagans bestimmt.
Zur Herstellung des Pyd-markierten Enzyms wurde eine Lösung des thiolierten Enzyms (0,8 mg/ml) in pH 6-Puffer; 1 Moläquivalent) zu einer Lösung (70 oder 160 ul) von Pyd-SMCC (Beispiel 16) in pH 6-Puffer (20 bzw. 40 Äquivalente) zugegeben und das resultierende Gemisch wurde 3 h lang bei 4ºC unter Argon-Atmosphäre im Dunkeln reagieren gelassen. Im Anschluss an die Umsetzung wurde eine Lösung von N-Ethylmaleimid (1 M) in Methanol zugegeben (endgültige Maleimid-Konzentration, 50 mM), und das Gemisch wurde 1 h lang reagieren gelassen. Das Gemisch wurde anschließend erschöpfend in 12-14000 MW Cut-Off-Dialyseschläuchen gegen 10 mM PBS, pH-Wert = 7, bei 4ºC im Dunkeln dialysiert. Das Verhältnis von G6PDH : Pyd (1 : 2 bzw. 1 : 6) wurde mittels Messung der Absorption bei 280 und 326 nm berechnet.

Beispiel 18

EMIT-Assay

A. Messung der katalytischen Aktivität von G6PDH

Bei den nachfolgenden Untersuchungen wurden die G6PDH-Konzentrationen (nicht-markierte sowie verschiedene mit Pyridinium markierte Formen) soweit erforderlich verdünnt, um eine Enzymkonzentration von 5 ug/ml in 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert = 7,5, vor der Zugabe zu den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zu erhalten. In jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurden 100 ul Tris-Puffer und 50 ul des aufeinanderfolgend verdünnten Enzyms (5 ug/ml oder weniger) zugegeben. Als Kontrolle wurde eine Reihe von Vertiefungen ohne Enzym hergestellt. Zu jeder Vertiefung wurden 20 ul einer Substratlösung (250 mM D-Glucose-6-phosphat und 50 mM NAD&spplus; in 50 mM Tris, pH- Wert = 7,5) zugegeben, und die Änderung der Absorption bei 340 nm wurde als Funktion der Zeit unter Verwendung einer V-max-Mikroplatten-Ablesevorrichtung (Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA) aufgezeichnet. Die Enzymaktivitäten wurden typischerweise in mOD/Minute-Einheiten aufgezeichnet.

B. Wirkung des Antikörpers auf die katalytische Aktivität des Pyridinium-Enzym-Konjugats

Zu den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurden 100 ul eines 50 mM Tris-Puffers, pH-Wert = 7,5, und 50 ul eines Pyridinium-spezifischen Antikörpers, welcher im Verlauf der Platte nacheinander verdünnt wurde, zugegeben. Zu jeder Vertiefung wurden anschließend 100 ul des Pyridinium-markierten Enzyms zugegeben, um eine zur Erzeugung von etwa 200-300 mOD/min Enzymaktivität in Abwesenheit des Antikörpers wirksame Enzymkonzentration zu erreichen. Nachdem die Platte für eine ausgewählte Zeit (5-20 Minuten) bei Raumtemperatur inkubieren gelassen wurde, wurden 50 ul Substratlösung (siehe oben) zugegeben, was Endkonzentrationen von 50 mM G6P und 10 mM NAD&spplus; ergab. Die Änderung der Absorption als Funktion der Zeit wurde anschließend bei 340 nm gemessen, und der Prozentsatz der "Down Modulation" (Abnahme der katalytischen Aktivität) in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen des Antikörpers wurde bezogen auf die Aktivität, welche in Abwesenheit des Antikörpers beobachtet wurde (als 100%-Aktivität definiert) bestimmt.

C. EMIT-Assay

Zur Messung der Spiegel von nativem, freiem Pyridinolin in Urin wurde ein 50 ul Aliquot eines Pyridinolin-Standards (0 bis 3000 nM Pyd in 50 mM Tris, pH-Wert = 7,5) oder eine Urinprobe (1 : 5 in Tris verdünnt, pH-Wert = 7,5) zu jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte zugegeben, gefolgt von 100 ul eines in geeigneter Weise verdünnten Antikörpers im selben Tris-Puffer (wie im obenstehenden Kapitel B bestimmt). Nachdem die Platte eine ausgewählte Zeit lang (2, 10 oder 30 Minuten) bei Raumtemperatur inkubiert worden war, wurden 100 ul eines verdünnten EDC- gekoppelten Pyridinolin-G6PDH-Konjugats (welches zur Erzeugung einer Aktivität von 200-300 mOD/min in Abwesenheit des Antikörpers wirksam war) zu jeder Vertiefung zugegeben, gefolgt von einer 5-, 10-, 15- oder 30-minütigen Inkubierung bei Raumtemperatur). Im Anschluss an die letzte Inkubierungsperiode wurden 60 ul einer Substratlösung (siehe oben) zu jeder Vertiefung zugegeben, und die G6PDH-Aktivität wurde bei 340 nm wie oben beschrieben gemessen. Die mit den verschiedenen Pyd-Standards gemessenen Aktivitäten wurden zur Erstellung einer Pyd-Kalibrierungskurve verwendet (siehe z. B. Fig. 10). Diese Kalibrierungskurve wurde anschließend zur Bestimmung der Pyd-Spiegel in der Urinprobe unter Verwendung der Softmax 2.22-Software, welche mit der Vmax-Mikroplattenablesevorrichtung (Molecular Devices Corp.) mitgeliefert wurde, verwendet.

Beispiel 19

Herstellung eines Anti-Pyridinolin-Antiserums

Weiße-Neuseeländer-Kaninchen (insgesamt 59 Stück) wurden zur Immunisierung gemäß dem in der untenstehenden Tabelle 11 angegebenen Immunisierungsprotokoll in acht Gruppen eingeteilt. Die Immunisierungsdosis betrug 200 ug H-Pyd-BSA (Beispiel 3A), low-hapten H-Pyd-BSA-Immunogen (hergestellt wie in Beispiel 3A für H-Pyd-BSA beschrieben, jedoch mit einer niedrigeren Pyd : BSA-Stöchiometrie), oder H-Pyd-KLH (Beispiel 3B) in 1,0 ml PBS, gemischt mit 1,0 ml Ribi-Adjuvans (Ribi ImmunoChemical Research, Inc.). Die anfängliche Immunisierung wurde mittels subkutaner Injektion an verschiedenen Stellen bewerkstelligt, und die darauffolgenden Wiederholungsimmunisierungen wurden intramuskulär in dreiwöchentlichen Intervallen verabreicht. Das Antiserum wurde 10 Tage nach jeder Immunisierung gesammelt. Tabelle 11
Nach seiner Sammlung wurde jedes Antiserum hinsichtlich seiner Pyd-Bindungsaffinität und Verwendung in Beispiel 8 beschriebenen Assay-Formats untersucht. Kurzgesagt würde die Bindung von Anti-Pyd-Antikörpern aus dem Serum an auf einem festen Träger immobilisiertes Pyd unter Verwendung eines mit alkalischer Phosphatase markierten Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper-Reagens detektiert.
Die immunisierten Tiere wurden behalten, falls ihre Antiseren die nachfolgenden Kriterien erfüllten, welche im folgenden Absatz genauer definiert sind: AA < 20%, Pyd-Peptid < 10%, Titer > 5000 sowie einen Signalabstand zwischen 0 und 25 nM Pyd von > 10% des gesamten modulierten Signals.
Profile der am stärksten reaktiven Antiseren werden in der nachfolgenden Tabelle 12 wiedergegeben, welche unter Verwendung des in Beispiel 8 beschriebenen Assay-Formats gemessen wurden. Die erste Spalte gibt das Immunisierungsprogramm an, aus welchem das Kaninchen-Antiserum stammte. Die zweite Spalte gibt die Blutchargen an, welche zur Analyse vereinigt wurden. Die mit "Titer" bezeichnete Spalte gibt die Verdünnung eines jeden Antiserums an, welche notwendig ist, um einen optischen Dichtewert von 1,2 bis 1,6 mit einer Pyd-negativen Probe (kein Pyd anwesend) im Immunoassay zu erhalten. Die mit "AA" bezeichnete Spalte gibt die Kreuzreaktivität eines jeden Antiserums mit dem in Beispiel 10 beschriebenen Aminosäurengemisch wieder. Die mit "Pyd-pep. > 1000 MW" bezeichnete Spalte gibt die Kreuzreaktivität eines jeden Antiserums mit Pyd-Peptiden (> 1000 MW) wieder. Die letzte Spalte gibt den Signalabstand bei 0 und 25 nM Pyd- Proben als Bruchteil des gesamten modulierten Signals wieder. Tabelle 12
¹K = · 1000.
Es ist ersichtlich, dass die Kaninchen III-3, V-4 und VI-8 eine signifikante Modulierung des Signals zwischen 0 und 25 nM N-Pyd zeigten. Das Serum mit der höchsten Aktivität (VI-8) wurde zur Verwendung im hier beschriebenen N-Pyd-Assay ausgewählt.

Beispiel 20

Immunoassay unter Verwendung eines polyklonalen Antikörper-Reagens

Das nachfolgende Immunoassay wurde unter Verwendung des polyklonalen Kaninchen-Antikörpers VI-8, welcher in den obigen Tabellen 10 und 12 charakterisiert wird, und der in Beispiel 8A beschriebenen, mit N-Pyd beschichteten Mikrotiterplatte durchgeführt.
N-Pyd-Standardlösungen und Urinproben wurden jeweils zweifach untersucht. Die Urinproben wurden vor der Untersuchung durch eine Nitrocellulosemembran mittels Zentrifugation filtriert (Rotationsfiltration).
Im Anschluss an die Zugabe der Probe oder des Standards (25 ul/Vertiefung) wurden 125 ul/Vertiefung des 20000-fach in Assaypuffer verdünnten VI-8-Antiserums zugegeben, und die Assayplätte wurde über Nacht bei 4ºC inkubiert. Nachdem die Platte 3-mal mit 300 ul/Vertiefung Waschpuffer gewaschen worden war, wurden 150 ul/Vertiefung Ziege-anti-Kaninchen-IgG-alkalische Phosphatase-Konjugat (1 : 1000 Verdünnung in Assaypuffer) zugegeben, und die Platte wurde 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden anschließend 3-mal mit Waschpuffer gewaschen.
Zu jeder Vertiefung wurden 150 ul Enzym-Substratlösung (2 mg/ml p-Nitrophenylphosphat (Sigma) in 1,0 M Diethanolamin, pH-Wert = 9,8, enthaltend 1 mM MgCl&sub2;) zugegeben. Im Anschluss an eine 1-stündige Inkubation bei Raumtemperatur wurden 50 ml 3,0 N NaOH zu jeder Vertiefung zugegeben, um die enzymatische Reaktion abzustoppen. Die optische Dichte bei 405 nm wurde anschließend unter Verwendung einer Vmax-Ablesevorrichtung (Molecular Devices Corp.) gemessen.
Die optischen Dichtewerte (405 nm) von jeweils 2 Proben wurden gemittelt und die Mittelwerte der N-Pyd-Standards wurden zur Erstellung einer Kalibrierungskurve der OD-Werte gegen die N-Pyd-Konzentration verwendet. Aus dieser Kurve wurde in jeder Probe die Konzentration der freien N-Pyd-Vernetzungen bestimmt.

Claims

1. Antikörper, erhältlich durch Immunisieren eines Tieres mit hydrolysiertem Pyridinolin oder hydrolysiertem Desoxypyridinolin, welche an einen Träger gebunden sein können, wobei der Antikörper durch

das immunspezifische Binden an Pyridinium-Vernetzungen, ausgewählt aus nativem, freiem Pyridinolin und/oder nativem, freiem Desoxypyridinolin, und

ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber der (den) ausgewählten nativen, freien Pyridinium-Vernetzung(en) und den Harn-Pyridiniumpeptiden mit einem Molekulargewicht von mehr als 1.000 Dalton von größer als 3 : 1

gekennzeichnet ist.

2. Antikörper nach Anspruch 1, welcher ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber nativem, freiem Pyridinolin und nativem, freiem Desoxypyridinolin von größer als 5 : 1 aufweist.

3. Antikörper nach Anspruch 2, erhalten aus einer Zelllinie, welche durch die. ATCC Nr. HB11089 identifiziert ist.

4. Antikörper nach Anspruch 1, welcher ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber nativem, freiem Desoxypyridinolin und nativem, freiem Pyridinolin von größer als 25 : 1 aufweist.

5. Antikörper nach Anspruch 1, welcher ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber nativem, freiem Pyridinolin und nativem, freiem Desoxypyridinolin zwischen 2 : 1 und 1 : 2 aufweist.

6. Antikörper einem vorhergehendem Anspruch, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

7. Antikörper nach einem der Ansprüche 1, 2, 4 oder 5, wobei der Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist.

8. Diagnostischer Kit zur Verwendung bei der Untersuchung der Abnahme des Knochenkollagenspiegels in einem menschlichen Lebewesen, umfassend einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und ein Nachweismittel zum Nachweisen der Menge des Immunkomplexes, welcher durch die Reaktion des Antikörpers mit solchen freien Pyridinium- Vernetzungen gebildet wird.

9. Kit nach Anspruch 8, welcher weiter einen Festphasenträger mit oberflächengebundenen freien vernetzten Pyridiniummolekülen einschließt, die wirksam sind, mit solchen freien Pyridinium-Vernetzungen, die in der Probe vorliegen, zur Bindung an den Antikörper zu konkurrieren, und wobei der Antikörper ein Reporter-markierter oder Reporter- markierbarer Antikörper ist.

10. Kit nach Anspruch 8, welcher weiter einen Festphasenträger, an welchen der Antikörper gebunden ist, und eine Reporter-markierte oder Reporter- markierbare freie Pyridinium-Vernetzung einschließt, welche wirksam ist, mit solchen freien Pyridinium-Vernetzungen, die in der Probe vorliegen, zur Bindung an den Antikörper auf dem Träger zu konkurrieren.

11. Kit nach Anspruch 8, wobei das Nachweismittel ein Reporterenzym einschließt, das wirksam ist, ein kolorimetrisches Signal proportional zu der Menge eines solchen gebildeten Immunkomplexes zu erzeugen.

12. Kit nach Anspruch 8, wobei das Nachweismittel ein Enzym einschließt, welches mit der ausgewählten Pyridinium-Vernetzung markiert ist, wobei das markierte Enzym wirksam ist, mit solchen freien Pyridinium- Vernetzungen, die in der Probe vorliegen, zur Bindung an den Antikörper zu konkurriren, wobei das Binden des Antikörpers an das markierte Enzym eine Abnahme in der katalytischen Aktivität des markierten Enzymes bewirkt.

13. Kit nach einem der Ansprüche 8 bis 12, welcher weiter eine Filtermembran, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Nitrozellulose, Immobilon®-CD, und Immobilon®-PSQ, für die Probenfiltration einschließt.

14. Verfahren zur Untersuchung der Abnahme des Knochenkollagenspiegels in einem menschlichen Patienten, umfassend

das Reagieren einer nicht hydrolysierten, menschlichen Urinprobe mit einem Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 7,

wobei durch das Reagieren ein Immunkomplex zwischen dem Antikörper und solchen ausgewählten Pyridinium-Vernetzungen, die in der Probe vorliegen, gebildet wird, und

aus der Menge des gebildeten Immunkomplexes der Spiegel der ausgewählten Pyridinium-Vernetzungen in der Probe bestimmt wird, wobei ein bestimmter Spiegel, welcher über dem für einen normalen Patienten Charakteristischen ist, die Anwesenheit einer erhöhten Geschwindigkeit der Abnahme des Knochenkollagenspiegels in dem Patienten anzeigt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Antikörper ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber nativem, freiem Pyridinolin und nativem freiem Desoxypyridinolin von größer als 5 : 1 aufweist.

16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der gemessene Spiegel von nativem, freiem Pyridinolin auf die Konzentration des gesamten hydrolysierten Pyridinolins in der Probe über eine lineare Beziehung mit einer Steigung von 0,3-0,5 bezogen wird.

17. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Antikörper ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber freiem, nativem Desoxypyridinolin und nativem, freiem Pyridinolin von größer als 25 : 1 aufweist.

18. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Antikörper ein Reaktivitätsverhältnis gegenüber nativem, freiem Pyridinolin und nativen freiem Desoxypyridinolin von zwischen 2 : 1 und 1 : 2 aufweist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei das Reagieren zum Konkurrieren mit solchen ausgewählten Pyridinium-Vernetzungen in einer Probe das Kontaktieren der Urinprobe mit einem Festphasenträger mit oberflächengebundenem, peptidfreiem Pyridinolin oder Desoxypyridinolin einschließt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei das Reagieren das Kontaktieren der Urinprobe mit einem Festphasenträger mit einem oberflächengebundenen Antikörper gemäß Anspruch 1 einschließt.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 20, wobei vordem Reagieren die Probe durch eine Filtermembran, ausgewählt, aus der Gruppe bestehend aus Nitrozellulose, Immobilon®-CD und Immobilon®-PSQ, filtriert wird, wobei die Membran wirksam ist, eine Substanz zu entfernen, die unspezifisch an Antikörper bindet, aber im wesentlichen allen nativen freien Pyridinium-Vernetzungen gestattet mit der Probe durchzuströmen.

22. Verfahren zum Herstellen von Antikörpern gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Verfahren

das Immunisieren eines Tieres mit einer Pyridinium-Vernetzung, ausgewählt aus hydrolysiertem Pyridinolin und hydrolysiertem Desoxypyridinolin,

das Erhalten der Antikörper aus dem Tier, und

das Auswählen der Antikörper, welche eine Bindungsaffinität von größer als 5 · 10&sup7;/molar für natives, nicht-glycosyliertes, peptidfreies Pyridinolin oder natives, peptidfreies Desoxypyridinolin aufweisen;

umfaßt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die ausgewählte Pyridinolin- Vernetzung natives, nicht-glycosyliertes, peptidfreies Pyridinolin ist:

24. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die ausgewählte Pyridinium- Vernetzung natives, peptidfreies Desoxypyridinolin ist.

25. Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Tier ein Kaninchen oder eine Maus ist.