ES2214722T3 - Metodo de ensayo de peptidos de colageno. - Google Patents

Abstract

Un método para determinar el nivel de fragmentos de colágeno del tipo I en una muestra fluida in vitro que comprende poner en contacto una muestra de fluido con un anticuerpo que es inmunoespecífico para un epítopo contenido en una de las secuencias de péptido siguientes: (1) Ala-Hyp-Gly-Asp-Arg-Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ala (2) Gly-Asn-Ser-Gly-Glu-Hyp-Gly-Ala-Hyp en condiciones eficaces para formar un complejo entre dicho anticuerpo y fragmentos de polipéptido que contienen dicho epítopo en la muestra, determinar el nivel de complejo formado, y del nivel determinado de complejo, determinar el nivel de fragmentos de polipéptido que contienen el epítopo en la muestra.

Description

Método de ensayo de péptidos de colágeno.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para evaluar ciertos fragmentos de colágeno en fluidos biológicos. En una realización, la invención se refiere a un método para evaluar el nivel de degradación de colágeno en sujetos mamíferos, particularmente en seres humanos y para la diagnosis y el control de afecciones médicas asociadas con el metabolismo de colágeno anormal.

Referencias

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Antecedentes de la invención

Hay numerosos estados de enfermedad en seres humanos que se caracterizan por un nivel alto de resorción ósea y/o un equilibrio anormal entre la formación de hueso y la resorción ósea. Entre los más comunes de estos están la osteoporosis, osteoartritis, artritis reumatoide y afecciones relacionadas con el progreso de tumores benignos y malignos del hueso y cánceres metastásicos que se han trasladado a osteocitos desde otras partes del cuerpo, por ejemplo, de tumores iniciales de próstata o pecho.

Otras afecciones asociadas con cambios del metabolismo de colágeno incluyen enfermedades osteomalácicas, raquitismo, crecimiento anormal en niños, osteodistrofia renal y osteopenia inducida por fármacos. Además, las anormalidades en el metabolismo de huesos son a menudo efectos secundarios del tratamiento de tiroides y afecciones de tiroides en sí, tales como hiperparatiroidismo primario y tirotoxicosis así como la enfermedad de Cushing.

La matriz orgánica del hueso consiste en aproximadamente 90% de colágeno del tipo I, que contiene dos cadenas \alpha1 y una \alpha2 enrolladas alrededor una de la otra para formar una triple hélice. El dominio helicoidal de cada cadena es precedido por un N-telopéptido corto y es seguido de un C-telopéptido corto. Se han descrito rutas biosintéticas que conducen a la formación y maduración de colágeno del tipo I (por ejemplo, Alberts et al., 1989; Eyre, 1987). Las cadenas de colágeno al principio son sintetizadas como cadenas de procolágeno que se asocian para formar complejos helicoidales triples y triméricos. Seguido de la secreción en el espacio extracelular, las moléculas triméricas son hendidas para liberar los propéptidos de los extremos N- y C- para formar moléculas de colágeno (también conocidos como tropocolágenos). Las moléculas de colágeno se asocian para formar fibrillas en forma de barritas en las que las moléculas se empaquetan en paralelo, en grupos de series. La formación de varias reticulaciones intra- e inter-moleculares dentro de y entre las moléculas de colágeno adyacentes imparte una estabilidad aumentada.

En mamíferos, la formación y el mantenimiento de tejidos de colágeno de hueso se entiende como que es un procedimiento dinámico mediado por las células que forman hueso (osteoblastos) y las células que degradan hueso (osteoclastos). Un desequilibrio entre las velocidades de formación de hueso y la degradación de hueso y particularmente la elevación en la degradación de hueso, puede causar serias afecciones patológicas deletéreas para la salud.

Durante varias décadas pasadas, se han propuesto varios métodos para diagnosticar o controlar las anormalidades de la degradación del colágeno de hueso. Por ejemplo, la hidroxiprolina, un constituyente principal de polipéptidos de colágeno, fue propuesto hace muchos años como posible marcador en la orina.

Hay, sin embargo, varias desventajas con el uso de la medida de hidroxiprolina como marcador, que incluyen la necesidad de una etapa muy larga de hidrólisis ácida, una carencia de especificidad para el colágeno del tipo I (del hueso) y el metabolismo sustancial de hidroxiprolina libre en el hígado. En resumen, la hidroxiprolina ha sido rechazada como marcador clínico para las afecciones de resorción ósea.

Se han propuesto la hidroxilisina y cierta forma glucosilada de la misma, pero se ha limitado el uso de estos marcadores debido a la carencia de un método de ensayo adecuado y conveniente para uso clínico general, así como por la necesidad de una etapa de pretratamiento de la hidrólisis ácida, tal como para la hidroxiprolina.

También se han investigado ciertos fragmentos terminales de colágeno para posibles aplicaciones diagnósticas. Antes de la presente invención de los solicitantes, generalmente se creía en la técnica que los péptidos que provienen de las regiones helicoidales de colágeno no podían usarse como indicadores de resorción ósea debido a la degradación sustancial causada por proteasas endógenas en el espacio extracelular, la circulación de sangre y la orina. En consecuencia, los expertos en la técnica se han ocupado en la medición de fragmentos de las regiones de telopéptido de colágeno que contienen especies de reticulación tales como reticulaciones de piridinolina, que por lo visto protegen regiones de cadena de colágeno asociadas de la degradación proteolítica (por ejemplo, Risteli, 1992 y el documento US 5538853). Los métodos para medir tales fragmentos de telopéptido se han descrito, por ejemplo, en los documentos WO 89/04491 (Eyre), WO 95/08115 (Qvist) y WO 94/14844 (Baylink). También se han descrito métodos para medir reticulaciones de telopéptido por sí mismos, sin cadenas de colágeno unidas (véanse los documentos de Robins, WO 91/10141; Cerelli et al., WO 94/03814; y Kung et al., WO 94/14072).

Los fragmentos de telopéptido, como se ha relatado, son útiles en conexión con afecciones de resorción ósea. Sin embargo, la especie de péptido de procolágeno, como se ha relatado, es útil para medir la formación de hueso (por ejemplo, Taylor, 1994), un procedimiento que es irrelevante para la mayor parte de enfermedades relacionadas con la resorción ósea. El documento EP 0401370 describe un inmunoensayo enzimático para determinar los restos de triple hélice central de colágeno humano del Tipo-IV para diagnosticar trastornos de hígado.

En consecuencia, queda una necesidad de desarrollar nuevos marcadores que sean útiles para diagnosticar y controlar afecciones de resorción ósea anormales. Idealmente, tal marcador debería ser mensurable en fluidos biológicos tales como la orina y el suero, convenientemente por inmunoensayo. El marcador debería ser útil para diagnosticar la presencia de trastornos de resorción ósea que se caracterizan por niveles de degradación de hueso por encima de lo normal. Además, el marcador debería ser útil para detectar cambios del estado de la degradación de hueso en el sujeto con el tiempo, particularmente en respuesta al tratamiento terapéutico.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento por los solicitantes de un método de inmunoensayo para medir fragmentos de péptido que contienen ciertas regiones del dominio helicoidal de cadenas \alpha1(I) de colágeno del tipo I en un fluido corporal, que es particularmente útil para determinar o controlar el nivel de degradación de colágeno de hueso en un sujeto mamífero.

La presente invención incluye, en un aspecto, un método para determinar el nivel de fragmentos de colágeno del tipo I en una muestra fluida. En el método, se ponen en contacto la muestra fluida con un anticuerpo que es inmunoespecífico para un epítopo contenido en una de las secuencias de péptido siguientes:

(1) Ala-Hyp-Gly-Asp-Arg-Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ala (SEQ ID NO:1) o

(2) Gly-Asn-Ser-Gly-Glu-Hyp-Gly-Ala-Hyp (SEQ ID NO:2)

en condiciones eficaces para formar un complejo entre el anticuerpo y los fragmentos de polipéptido que contienen dicho epítopo en la muestra. El nivel de complejo formado se determina y, a partir de éste, se determina el nivel de fragmentos de polipéptido que contienen el epítopo. El anticuerpo usado en el método puede ser policlonal o monoclonal y preferiblemente es monoclonal. La muestra que se ensaya es preferiblemente orina o sangre, aunque también sean contempladas otras muestras fluidas.

En una realización preferida, el método de la invención puede usarse para evaluar el nivel de degradación de colágeno de hueso en un sujeto mamífero, particularmente en seres humanos. Por lo tanto, la invención incluye un método para determinar el nivel de degradación de colágeno de hueso en un sujeto mamífero. En el método, se pone en contacto una muestra de fluido corporal del sujeto con un anticuerpo que es inmunoespecífico para un epítopo contenido en una de las secuencias de polipéptido nombradas anteriormente, en condiciones eficaces para formar un complejo entre el anticuerpo y los fragmentos de polipéptido que contienen el epítopo en la muestra. A partir del nivel de complejo formado, se determina el nivel de fragmentos de polipéptido que contienen el epítopo en la muestra. Un nivel de fragmento medido que sea elevado en relación con el nivel normal es una indicación de que el sujeto tiene un trastorno de resorción ósea.

El método es útil en la detección de la presencia de trastornos óseos caracterizados por un nivel elevado de resorción de colágeno de hueso. En un grupo de realizaciones, el método puede usarse para detectar la presencia de un trastorno óseo seleccionado de uno o más del grupo que consiste en osteoporosis, osteoartritis, hiperparatiroidismo, artritis reumatoide, enfermedad de Paget o una afección de cáncer de hueso metastásico.

En otra realización general, el método puede usarse para controlar la resorción ósea con el tiempo, particularmente en respuesta a un tratamiento terapéutico.

En otro aspecto, la invención incluye un anticuerpo que es inmunorreactivo con uno de los péptidos antígenos definidos anteriormente.

La invención también incluye un kit para medir el nivel de fragmentos de colágeno del tipo I en una muestra fluida. El kit incluye un anticuerpo del tipo descrito anteriormente y preferiblemente también incluye un estándar inmunogénico que contiene el péptido para el cual el anticuerpo es inmunoespecífico. Típicamente, el kit incluye instrucciones y otros reactivos necesarios para llevar a cabo de forma acertada el ensayo.

Preferiblemente, el medio de detección usado en el método o kit incluye una enzima de marcaje que es eficaz para producir una señal colorimétrica, aunque puedan usarse otros formatos.

En una realización general, el kit incluye un soporte en fase sólida al cual están unidos los anticuerpos para la captura de los fragmentos de colágeno que se detectan en la muestra. En una segunda realización, un péptido o un polipéptido que contiene el epítopo que se detecta se une directamente o indirectamente a un soporte en fase sólida, para competir con los fragmentos de colágeno que se detectan en la muestra.

Un método para producir anticuerpos monoclonales que son útiles en el método y el kit anteriores incluye formar un hibridoma compuesto del producto de fusión de (a) células de bazo de un animal inmunizado con péptido seleccionado que contiene epítopo como se definió anteriormente, preferiblemente unido a una sustancia vehículo y (b) un modelo de fusión de inmortalización y seleccionar hibridomas que sean inmunoespecíficos con el epítopo seleccionado.

Los anticuerpos policlonales que son útiles en el método y el kit anteriores se producen inmunizando un animal con un inmunógeno como se describe en este documento, recogiendo un antisuero que se produce como consecuencia de la inmunización, y seleccionando para los anticuerpos que tienen un promedio de afinidad de unión de al menos 10^{7}/molar para un epítopo como se describe en este documento.

Un inmunógeno para uso en la preparación de un reactivo de anticuerpo como se describió anteriormente consiste esencialmente en una de las secuencias de péptido nombradas anteriormente, o una secuencia más corta del mismo, unido a un vehículo adecuado. Un vehículo preferido es hemocianina de Megathura crenulata.

En un método para evaluar el efecto de una sustancia seleccionada, tal como un fármaco, sobre el nivel de expresión o secreción del colágeno del tipo I y/o sus fragmentos por una preparación celular o tisular, una célula o un tejido seleccionado se expone a la sustancia, después de que se pone en contacto con sobrenadante de fluido de cultivo o extracto de célula o tejido con un anticuerpo específico para un epítopo como se describió anteriormente, en condiciones eficaces para formar un complejo entre el anticuerpo y cualesquiera fragmentos de polipéptido que contienen el epítopo en la muestra. A partir de la cantidad de complejo formado, se determina el nivel de polipéptidos que contienen el epítopo, tal que un aumento del nivel medido en relación con el nivel observado en ausencia de la exposición a la sustancia indica que la sustancia aumenta la producción de tales polipéptidos y una disminución indica que la sustancia reduce la producción de tales polipéptidos. El método es útil, por ejemplo, para identificar y/o caracterizar sustancias que reducen actividades de osteoclastia (resorptiva) en células y tejidos que contienen
colágeno.

El inmunoensayo descrito anteriormente puede usarse en un método para evaluar el efecto de una sustancia seleccionada, tal como un fármaco, sobre niveles de helicopéptido en un fluido corporal de un modelo de animal tal como ratas, ratones, gatos, perros, monos, etc. El método es útil, por ejemplo, para identificar y/o caracterizar sustancias y terapias que reducen el nivel de resorción ósea.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra una separación cromatográfica inicial de fracciones que contienen hidroxiprolina (Hyp) de orina de pacientes con enfermedad de Paget;

La figura 2 muestra una separación de cromatográfica de afinidad de fracciones de Hyp reunidas de la separación cromatográfica precedente;

La figura 3 muestra los resultados de una separación HPLC final de fracciones Hyp reunidas con un pl de \sim 6,2, indicando el aislamiento de helicopéptido (I) de colágeno (Ejemplo 2);

La figura 4 muestra una curva estándar para un inmunoensayo de la presente invención; y

La figura 5 muestra niveles urinarios de un helicopéptido de colágeno del tipo I como se mide en sujetos normales, osteoporóticos, con enfermedad de Paget y posmenopáusicos usando un inmunoensayo conforme a la presente invención.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

Los términos y las expresiones a continuación tienen los significados siguientes a no ser que se indique de otra manera.

La expresión "muestra de sangre" pretende abarcar sangre en cualquier forma adecuada para análisis, tales como suero o plasma preparados por métodos estándar.

La expresión "fluido biológico" como se usa en este documento abarca cualquier fluido biológico que comúnmente se ensaya en muestras clínicas, incluyendo fluidos del cuerpo tales como sangre, orina, saliva y sudor, así como extracciones y sobrenadantes de células y/o tejidos.

El término "polipéptido" significa un polímero de al menos dos residuos de aminoácido contiguos y que contienen al menos un enlace peptídico.

El término "péptido" significa un polipéptido de 50 residuos de aminoácido contiguos o menos.

El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales y policlonales, así como sus fragmentos. Cuando se usa en el contexto de un método de medición o determinación de fragmentos de colágeno, el término "anticuerpo" generalmente pretende abarcar a cualquier modelo de unión específico de analito, producido de cualquier forma.

El término "epítopo" se refiere a la secuencia de aminoácido mínima en un polipéptido que se reconoce por, y así determina la inmunoespecificidad de, un anticuerpo que une tal epítopo en un polipéptido. En el contexto de la presente invención, un epítopo puede ser tan corto como tres residuos de aminoácidos contiguos y más típicamente incluye cuatro o más residuos contiguos. La longitud real del epítopo para la que un anticuerpo es específico puede ser determinada empíricamente realizando estudios de unión con péptidos que contienen varios epítopos candidatos limitados por residuos no epitópicos.

El término "mamífero" pretende tener su significado estándar, incluyendo, por ejemplo, ratones, conejos, ovejas, perros, gatos, caballos y seres humanos.

II. Preparación de anticuerpos A. Inmunógeno

El inmunógeno usado para producir los anticuerpos de la invención incluye preferiblemente una secuencia de péptido correspondiente a SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 como se definió anteriormente, o una secuencia más corta seleccionada de éste, que puede unirse covalentemente a un vehículo adecuado. Típicamente el inmunógeno contendrá un epítopo que comprende al menos tres residuos contiguos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2. Tales péptidos pueden prepararse mediante métodos químicos convencionales o recombinantes, u obtenerse a partir de fuentes naturales, por métodos conocidos en la técnica o descritos en este documento.

Los fragmentos que contenían las secuencias nombradas anteriormente fueron aisladas y secuenciadas por los solicitantes a partir de orina humana, como se describe en el Ejemplo 1. La secuencia de aminoácidos del primer péptido, designado como SEQ ID NO:1, corresponde a los residuos 620-633 de la cadena \alpha1(I) de colágeno y se refiere en este documento como "helicopéptido II" o "helicopéptido/\alpha1(I)^{620\sim 633}". La secuencia de aminoácidos del segundo péptido, SEQ ID NO:2, corresponde a los residuos 253-261 de la cadena \alpha1(I) de colágeno y se refiere en este documento como "helicopéptido I" o "helicopéptido/\alpha1(I)^{253\sim 261}". Se prepararon péptidos sintéticos que tenían estas secuencias como se describe en el Ejemplo 2.

Además de contener el epítopo de interés, un péptido que contiene epítopo para uso como inmunógeno puede incluir residuos adicionales o restos unidos que sirven para unir el péptido al vehículo. En un enfoque preferido, un residuo de cisteina se incorpora en el péptido en su extremo N o C para facilitar la unión covalente al vehículo, como se ilustra en el Ejemplo 2.

El vehículo para el inmunógeno puede ser cualquier proteína, tal como albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de Megathura crenulata (KLH), que tienen baja inmunogenicidad por sí mismas y que, cuando se unen a un péptido de interés, facilitan una respuesta inmunológica frente al péptido.

De forma alternativa, pueden unirse uno o varios de los péptidos seleccionados de interés a una estructura molecular, tal como una poliamina, que es adecuada para presentar el péptido al sistema inmunológico de un animal. Se conocen una variedad de moléculas de vehículo adecuadas en la técnica.

La unión del inmunógeno de péptido a la molécula de vehículo se realiza mediante métodos de unión estándares, típicamente usando un agente de acoplamiento bifuncional cuyos grupos reactivos sean reactivos frente a grupos funcionales en el vehículo y el péptido, respectivamente. Por ejemplo, para acoplar un péptido que contiene cisteina a los grupos amino de KLH, puede usarse SPDP (3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo, o sulfo-SMCC (4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de sulfo-N-succinimidilo) (Wong, 1991). Este reactivo contiene un grupo éster activado que puede reaccionar con los grupos amino de KLH para formar acoplamientos de amida, y un disulfuro activado que puede reaccionar con un grupo tiol de la cisteina del inmunógeno de péptido para formar un nuevo disulfuro. Un método ilustrativo para unir una proteína de vehículo a antígenos de péptido se proporciona en el Ejemplo 3A.

De forma alternativa, el inmunógeno de péptido puede unirse directamente a un vehículo, por ejemplo, en presencia de un agente activador de carboxilo soluble en agua tal como EDC (1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida), también de acuerdo con métodos estándar. Se proporcionan generalmente reacciones de acoplamiento para derivatizar una proteína vehículo con un antígeno de péptido en Harlow, et al. (1988), pp. 77-87 y en Wong (1991).

B. Anticuerpos monoclonales

Para preparar un reactivo de anticuerpo monoclonal conforme a la invención, se usa un inmunógeno como se describió anteriormente para inmunizar un animal, tal como un ratón, del que pueden obtenerse linfocitos específicos de antígeno para la inmortalización. Un número de líneas de ratón adecuadas han sido desarrolladas para este propósito, incluyendo la bien conocida de ratones Balb/c así como líneas de ratón que han aumentado las respuestas inmunes, tal como las del ratón "autoinmune" MRL/MpJ-lpr disponible del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, Maine).

El animal seleccionado típicamente se inmuniza usando una serie de inyecciones de inmunógeno conforme a protocolos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede llevarse a cabo cada inmunización intraperitonealmente con alícuotas de inmunógeno (por ejemplo, 100 \mug) en un adyuvante adecuado (por ejemplo, Ribi (CWS), disponible de RIBI Immunochem Research, Inc., Hamilton, Montana). Un protocolo de inmunización ejemplar es descrito en el Ejemplo 4.

Las células de bazo por lo general son cultivadas aproximadamente 8 semanas después de la inmunización inicial y fusionadas con una línea celular inmortal tal como la línea celular de mieloma P3X63Ag8.653. La selección para productos de fusión acertados puede ser realizada en HAT en medio S-DMEM modificado, de acuerdo con métodos publicados (véase, de forma general, Harlow, et al., pp. 196-212, 1988). Un medio útil suplementado es DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco, disponible de Gibco, Nueva York), suplementado de acuerdo con la formulación: DMEM (80%), NCTC-109 (10%), suero bovino FetalClone (10%), ácido oxaloacético (1 mM), L-glutamina (2 mM), gentamicina (50 \mug/mL) e insulina (10 \mug/mL).

El DMEM modificado y suplementado ("S-DMEM modificado") puede prepararse por el crecimiento de línea celular de monocito de ratón IL-l-secretante P388D1, o de manera intercambiable, la línea celular J774A.1, en S-DMEM, con una división 1:4 dos veces por semana. Cada 3 días, se filtraron los sobrenadantes del cultivo de tejido por un filtro de 0,2 micras y luego se suplementaban con L-glutamina de 4 mM. El resultado concentrado, S-DMEM modificada puede ser usada después como un suplemento para la S-DMEM no modificada (por ejemplo, S-DMEM no modificada se suplementa con medio condicionado P388D1 al 20% (v:v), o con medio condicionado J774A1 al 10%) para aumentar las células de hibridoma. Las células de bazo que sirven como alimentadores también pueden ser añadidas a la S-DMEM para suplementar el crecimiento de células hibridoma.

Los productos de fusión exitosos se seleccionan después para la inmuno-reactividad con el inmunógeno, típicamente usando un formato de inmunoensayo competitivo. Las líneas celulares que muestran alta afinidad de unión al inmunógeno son sub-clonadas por dilución restrictiva y además son seleccionadas para la producción de anticuerpos con alta afinidad de unión para el epítopo de interés.

Para producir el reactivo del anticuerpo, la línea celular de hibridoma es cultivada en un medio adecuado (Harlow, et al., pp. 247-270, 1988), tal como el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado como se describe en los Ejemplos. Los anticuerpos monoclonales ("Mabs") se cultivan a partir del medio y pueden concentrarse y almacenarse de acuerdo con métodos publicados (Harlow, et al. pp. 271-318, 1988).

Los experimentos de detección llevados a cabo en apoyo a la invención (Ejemplo 4) dieron como resultado la identificación de un alto porcentaje de productos de fusión acertados para los inmunógenos KLH (3) y (4), en el que el inmunógeno (3) contiene la secuencia del helicopéptido I de arriba y el inmunógeno (4) contiene la secuencia del helicopéptido II. Después de la identificación de los clones de hibridoma productores de anticuerpo, fue empleado un ELISA indirecto competitivo para seleccionar clones que exhibían tanto alta sensibilidad como especificidad a inmunógeno. Basado en este procedimiento de selección, el clon 10B1, que produce anticuerpos monoclonales específicos para SEQ ID NO:1, se seleccionó para una posterior ilustración de la invención.

C. Anticuerpos policlonales

La preparación de anticuerpos policlonales se realiza por técnicas convencionales, incluyendo la inyección de un inmunógeno en sujetos mamíferos adecuados, tales como conejos, ratones, ratas, u ovejas de acuerdo con protocolos inmunológicos conocidos de forma general en la técnica, por ejemplo, Harlow, et al., pp. 93-115 (1988).

Típicamente a los conejos se les inyecta subcutáneamente inmunógeno en un adyuvante, se dan inmunizaciones de refuerzo cada 2-3 semanas por inyección subcutánea o intramuscular; los ratones pueden ser inyectados intraperitonealmente de acuerdo con un programa similar. La sangre se recoge en intervalos, por ejemplo de 1-2 semanas después de cada inyección de inmunización. El antisuero puede ser titulado para determinar la formación de anticuerpo en lo que concierne al inmunógeno de péptido, de acuerdo con el estándar ELISA o métodos de inmunoprecipitación
(Harlow, et al., pp. 423-470, 1988). El ejemplo 5 describe un procedimiento usado para producir anticuerpos policlonales frente a helicopéptido I.

D. Afinidad de unión

La afinidad de unión de los anticuerpos para el inmunógeno de péptido, tanto si los anticuerpos son monoclonales como policlonales, puede ser determinada por métodos conocidos, (por ejemplo, por el análisis de Scatchard usando una inmunoprecipitación o un ensayo ELISA (por ejemplo, Campbell, 1991; Segel, 1976).

En el caso de anticuerpos policlonales, la afinidad medida representa por lo general un promedio de constante de afinidad de unión para una mezcla de los anticuerpos presentes en el antisuero que es inmunoespecífica para el inmunógeno seleccionado. Por lo tanto, los anticuerpos policlonales pueden purificarse además por cromatografía de afinidad usando el antígeno unido, según la metodología conocida en la técnica, para enriquecer los anticuerpos con alta especificidad y afinidad para el inmunógeno.

Como se describió anteriormente, el anticuerpo de la invención generalmente se selecciona para ser inmunoespecífico para un epítopo contenido en el helicopéptido I o II anterior. Preferiblemente, el anticuerpo se caracteriza por una o varias de las propiedades siguientes, incluyendo cualquiera de sus permutaciones posibles.

Preferiblemente, el anticuerpo tiene una constante de afinidad de unión para el inmunógeno de aproximadamente 1 x 10^{7}/molar o mayor, preferiblemente aproximadamente 1 x 10^{8}/molar o mayor y más preferiblemente al menos 1 x 10^{9}/molar. Por ejemplo, la constante de afinidad del anticuerpo monoclonal 10B1 para el helicopéptido I es de aproximadamente 1 x 10^{8}/M (Ejemplo 4C).

Preferiblemente, el anticuerpo de la invención no reacciona de forma cruzada considerablemente con el colágeno intacto (triple helicoidal), particularmente del colágeno Tipos I hasta V. La reactividad cruzada relativa del anticuerpo para cualquiera de esta especie de colágeno puede ser determinada por métodos estándares tal como se describió anteriormente, usando colágenos preparados por métodos conocidos (por ejemplo, Miller & Rhodes, 1982) o de fuentes comerciales (por ejemplo, Sigma Chem. Co. o Heyl GmbH & Co., Berlín, Alemania). Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 10B1 se une fuertemente al helicopéptido I en la forma unicatenaria, pero no reacciona cruzadamente con el colágeno intacto de cualquiera de los Tipos I a V. Al parecer, la región del epítopo de péptido se une a una conformación particular tridimensional que no es reconocida por el sitio de unión del anticuerpo.

En consecuencia, en una realización preferida, el anticuerpo de la invención es específico para un epítopo en helicopéptido I o helicopéptido II en la forma de monopéptido y no reacciona en un grado significativo con la secuencia del epítopo correspondiente el colágeno helicoidal triple intacto, (por ejemplo, el anticuerpo tiene una afinidad de unión para la secuencia del epítopo en el colágeno helicoidal triple que es al menos de 10 veces menos y más preferiblemente es al menos de 100 veces menos, que la constante de afinidad del anticuerpo para la forma de monopéptido de helicopéptido I o II, usando el protocolo del Ejemplo 8C).

El anticuerpo también puede ser seleccionado para tener una afinidad de unión para la secuencia correspondiente en la cadena \alpha1 del colágeno Tipo II que sea al menos 10 veces menor que la afinidad del anticuerpo para el correspondiente helicopéptido del Tipo I\alpha1 (I o II) nombrado anteriormente.

Más generalmente, el anticuerpo debería ser suficientemente específico para el helicopéptido seleccionado para evitar resultados falsos debido a la unión con otros componentes en la muestra. La especificidad adecuada para ensayar un tipo particular de muestra fluida puede ser establecida típicamente por estudios de recuperación de la respuesta como se ilustra en los Ejemplos 9 y 12.

III. Método del inmunoensayo

El método del inmunoensayo de la invención proporciona un modo de determinar el nivel de helicopéptido I o II en fluidos biológicos.

En una realización preferida, el método es útil para medir o controlar la degradación de colágeno de hueso en un sujeto mamífero, especialmente en seres humanos. El método incluye típicamente las etapas de (a) poner en contacto la muestra biológica fluida con un anticuerpo que es inmunoespecífico para el epítopo de péptido seleccionado como se describió anteriormente, (b) mediante dicho contacto, formar un inmunocomplejo entre el anticuerpo y los fragmentos de colágeno en la muestra que contiene el epítopo seleccionado, (c) medir la cantidad de inmunocomplejo formado y (d) mediante dicha medición, determinar el nivel de fragmentos de colágeno inmunológicamente reactivos en la muestra. El nivel determinado se compara con un nivel característico de sujetos normales, en el que un nivel por encima de lo normal es indicador de un nivel por encima de lo normal de resorción de colágeno de hueso y así indica que el sujeto tiene un trastorno de resorción ósea.

Cuando el fluido de la muestra ensayada es la orina, el nivel de fragmentos de colágeno medidos puede ser normalizado usando un nivel medido de creatinina o cualquiera de sus equivalentes, por métodos convencionales. La recogida de orina puede ser conforme a protocolos de recogida estándar, tal como el de las 24 horas, primera recogida al vacío y segunda al vacío. Preferiblemente, el mismo modo de recogida de la muestra se usa para todas las muestras para reducir la variación en los resultados.

La muestra de sangre puede ser convertida a suero o plasma por métodos conocidos y puede ser sometida a otros procesos previos de ser deseado. Por ejemplo, el suero puede ser pasado por un filtro de vuelta que tenga un corte de peso molecular definido (por ejemplo, \geq 20.000 MW) para eliminar las proteínas de un tamaño seleccionado de la muestra anterior para ensayar.

Pueden usarse métodos convencionales para cualquier otro tipo de muestra biológica fluida que sea ensayada.

La estabilidad de la muestra a menudo puede ser mejorada por la inclusión de uno o varios inhibidores de proteasa para reducir la degradación proteolítica del helicopéptido. Se conocen varios inhibidores de proteasa en la técnica, incluyendo el inhibidor disponible en el comercio "cocktails" (por ejemplo, de Sigma Chemical Co.), como se ilustra en los Ejemplos 1 y 12.

La reacción de muestra con el reactivo de anticuerpo puede llevarse a cabo usando cualquiera de una variedad de configuraciones de inmunoensayo conocidas en la técnica, incluyendo formatos de ensayo homogéneos y heterogéneos. Formatos de ensayo representativos son descritos en los Ejemplos 8-12.

El formato de detección puede ser por cualquier medio, incluyendo marcadores radiactivos (RIA), enzimas acopladas, técnicas de absorbancia, fluorescencia, quimiluminiscencia, o configuración EMIT (Gosling, 1990). Un marcaje preferido es el de la fosfatasa alcalina, que puede reaccionar con un sustrato de p-nitrofenilfosfato para producir un producto coloreado que tiene un pico fuerte de absorción a 405 nm. Un protocolo ejemplar para preparar un conjugado de fosfatasa alcalina de inmunógeno es descrito en el Ejemplo 3B. Será apreciado que pueden ser empleados otros modos de detección, tal como un segundo anticuerpo marcado con biotín en la combinación con un marcador de marcaje con estreptavidina. Una metodología representativa para preparar un conjugado de inmunógeno de helicopéptido-estreptavidina es proporcionada en el Ejemplo 3C.

En una realización ejemplar del método de ensayo, un volumen conocido, típicamente 10-50 \muL, de muestra se añaden a un soporte sólido revestido de inmunógeno, por ejemplo, los pocillos en una placa de microtitulación y la adición de la muestra es seguida de la adición de un volumen conocido, típicamente 50-200 \muL, de anticuerpo específico inmunógeno de una dilución conocida. La mezcla sobre la superficie del soporte sólido es incubada después, preferiblemente en condiciones eficaces para alcanzar el equilibrio entre la unión del anticuerpo a los fragmentos de colágeno de la muestra y el inmunógeno unido a la superficie (por ejemplo, de la noche a la mañana a 2-8ºC o a temperatura ambiente durante varias horas).

Después de la incubación, el soporte sólido se lava varias veces para eliminar el anticuerpo no unido específicamente al soporte y entonces se incuba con un anticuerpo anti-IgG marcado por la enzima eficaz para unir específicamente al anticuerpo unido al soporte. Por ejemplo, cuando el anticuerpo específico al inmunógeno es un anticuerpo policlonal de conejo, el anticuerpo marcado por la enzima puede ser IgG anticonejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina. Para un reactivo de anticuerpo monoclonal de ratón, el anticuerpo marcado por la enzima puede ser un IgG antiratón de cabra derivatizado con fosfatasa alcalina.

Después de un tiempo de incubación corto, el soporte se lava de nuevo para eliminar el material no unido específicamente y el nivel de enzima unida al soporte se determina por la adición de sustrato de enzima, con determinación espectrofotométrica de sustrato convertido.

Para la calibración del ensayo, se añaden estándares que contienen el intervalo de concentraciones del inmunógeno en duplicado a algunos pocillos, para generar una curva estándar. Hasta 40 muestras se añaden entonces en duplicado a los pocillos restantes y los pocillos se analizan después como se describió anteriormente.

Más generalmente, el formato de ensayo es preferiblemente un formato de inmunoensayo competitivo, "heterogéneo" en el que el marcador del marcaje para la detección del inmunocomplejo se une directamente al inmunógeno competidor o al anticuerpo específico del inmunógeno.

Por lo tanto, en una configuración preferida, los anticuerpos específicos del inmunógeno son inmovilizados sobre un soporte sólido y se añade inmunógeno marcado con enzima para competir con fragmentos de colágeno en la muestra, para unir a los anticuerpos inmovilizados. El marcador de enzima puede ser, por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante.

En una segunda configuración preferida, el inmunógeno es inmovilizado sobre el soporte sólido para competir con fragmentos de colágeno en la muestra para unir al anticuerpo marcado con enzima no inmovilizado.

Los experimentos llevados a cabo en apoyo de la invención demuestran el buen funcionamiento global tanto de los ensayos con orina como a base de suero (por ejemplo, los Ejemplos 9 y 12), basados en marcadores helicopéptidos descritos en este documento. Pueden ser adaptados ensayos para fluidos biológicos de otras fuentes fácilmente a partir de la metodología discutida en este documento.

IV. Utilidad

La presente invención proporciona un método para evaluar el nivel de actividad de resorción ósea en sujetos humanos que es útil en una variedad de aplicaciones. El método puede usarse en una realización de detección o para detectar (diagnosticar) no invasivamente la presencia de un trastorno de colágeno de hueso caracterizado por una resorción ósea por encima de lo normal. Trastornos óseos ejemplares para los cuales la presente invención puede ser útil incluyen osteoporosis, osteoartritis, artritis reumatoide y afecciones relacionadas al progreso de tumores benignos y malignos del hueso y cánceres metastásicos que han emigrado a osteocitos desde otras partes del cuerpo, por ejemplo, de la próstata o tumores iniciales de pecho. Otras afecciones incluyen enfermedades osteomalácicas, raquitismo, crecimiento anormal en niños, osteodistrofia renal y osteopenia inducida por fármacos. Además, las anormalidades en el metabolismo óseo son a menudo efectos secundarios del tratamiento de tiroides y afecciones de tiroides en sí, tales como hiperparatiroidismo primario y tirotoxicosis así como enfermedad de Cushing.

Los experimentos llevados a cabo en apoyo de la invención indican que los ensayos en suero y orina basados en marcadores helicopéptidos descritos en este documento pueden detectar niveles de resorción ósea elevados en varias poblaciones (Ejemplos 10 y 12).

El método también puede usarse para controlar el progreso de un trastorno de colágeno de hueso en curso con el tiempo, o controlar la respuesta de un sujeto al tratamiento terapéutico. Un número de terapias anti-resorción están ahora en desarrollo o están ya disponibles para las que la invención será útil. Esto se ilustra en el Ejemplo 11 para los fármacos anti-resorción conocidos, pamidronate y alendronate y en el Ejemplo 13 para el tratamiento con pamidronate después del cáncer de tiroides. Asi mismo, el método puede usarse en el contexto de afecciones de cáncer metastásico, para determinar si un cáncer primario se ha extendido al tejido óseo del sujeto y si un sujeto responde al tratamiento.

Será apreciado que el método también puede usarse con otros métodos diagnósticos, tales como técnicas radiográficas, de ultrasonido y ensayos dirigidos a otros indicadores del estado de la resorción ósea, para proporcionar un cuadro más completo del estado del sujeto.

El método y los anticuerpos de la invención son también útiles para evaluar el efecto de sustancias seleccionadas, tales como fármacos o drogas candidatos, sobre el nivel de expresión o secreción del colágeno del tipo I y/o sus fragmentos mediante una preparación tisular o celular. Por lo tanto, el método puede usarse con células óseas, tales como los osteoclastos y/o osteoblastos en cultivos tisulares o celulares, para el estudio de sustancias osteogénicas y otras similares. Las medidas de helicopéptido pueden ser llevadas a cabo sobre sobrenadantes o extractos de cultivos que están preparados conforme a métodos convencionales.

Un método para evaluar el efecto de una sustancia seleccionada, tal como un fármaco, sobre los niveles de helicopéptido en un fluido corporal de un modelo de animal tal como ratas, ratones, gatos, perros, monos, etc., usando un método de inmunoensayo tal como se describió anteriormente es útil para identificar y/o caracterizar sustancias y terapias que reducen el nivel de resorción ósea.

Además, el reactivo de anticuerpo de la invención también puede usarse en una matriz de cromatografía de afinidad, conforme a métodos de cromatografía de afinidad estándar, para unir y recoger péptidos y fragmentos de colágeno de fluidos biológicos, por ejemplo, pasando la sangre reunida o la orina por tal matriz.

De lo anterior, será apreciado cómo varios objetos y características de la invención son encontrados. La invención proporciona un método simple, no invasivo para medir ciertos fragmentos de colágeno en fluidos biológicos, que son indicadores útiles de los niveles de resorción ósea. El método también permite controlar los cambios de estado de la enfermedad durante o después de tratamientos terapéuticos.

Los ejemplos siguientes son usados para ilustrar la invención.

Ejemplos Materiales y métodos

Líneas celulares. El modelo de fusión no secretante de mieloma P3X63Ag8.653 de ratón (Nº de catálogo ATCC; CRL1580), la línea celular de macrófago de monocito de ratón P388D1 (IL-I) (Nº de catálogo ATCC; TIB63) y J774A. 1 (Nº de catálogo ATCC; TIB67) fueron comprados de la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD.

Medios. Los Medios de Águila Modificados de Dulbecco (DMEM) (Nº de catálogo; 320-1995AJ), NCTC-109 (Nº de catálogo; 320-1340AJ), la L-glutamina y la gentamicina fueron comprados en Gibco, Grand Island, Nueva York. El producto de suero bovino FetalClone fue obtenido de los Laboratorios HyClone, Inc., Logan, Utah. El ácido oxaloacético y la insulina fueron comprados de la empresa Sigma Química, San Louis, MO. La S-DMEM fue formulada para contener lo siguiente: 80% de DMEM suplementado con 10% de NCTC-109, 10% de producto de suero bovino de clon fetal, ácido oxaloacético 1 mM, L-glutamina 2 mM, 50 \mug/mL de gentamicina y 10 \mug/mL de insulina, donde los porcentajes indican porcentajes de volumen finales en el medio.

Medios acondicionados de macrófagos o células de bazo. Las líneas celulares de monocito de ratón P388D1 (IL1) y J774A. 1 fueron cultivadas en medio S-DMEM con una división 1:4 dos veces por semana. Los sobrenadantes del cultivo de tejido fueron filtrados por un filtro de 0,2 \mum y suplementados con L-glutamina 4 mM. Estos medios concentrados acondicionados fueron usados como suplemento del 20% de S-DMEM para aumentar las células de hibridoma. El medio acondicionado de Sigma J774A.1 (Nº de catálogo; M 8782) fue usado como suplemento del 10% de S-DMEM para la clonación de dilución restrictiva. Las células de bazo fueron añadidas a la S-DMEM para la clonación de dilución restrictiva.

Placas. Placas de 96, 48, 24 y 6 pocillos de cultivo de tejido planos profundizados y frascos de cultivo de tejido T 25, T 75, T 225 fueron obtenidos de Costar, Cambridge, MA. Las placas EIA fueron compradas de Costar (Nº. de catálogo; 3590) y Nunc (Nº. de catálogo; AS-72090).

Medios de congelación. El DMSO estéril (dimetil-sulfóxido) fue comprado de la American Type Culture
Collection (Rockville, MD) o de la Compañía Sigma Química. Los medios de congelación fueron formulados para contener 40 mL de S-DMEM, 5 mL de suero fetal bovino y 5 mL de DMSO.

Ratones. Ratones femeninos autoinmunes de 5 semanas MRL/MpJ-lpr fueron comprados del Laboratorio Jackson, Bar Harbor, Maine. Ratones Balb/c fueron comprados de Charles River Laboratories, Hollister, CA.

Tampones. Varios tampones usados en los protocolos a continuación fueron preparados como sigue:

PBS (solución salina tamponada de fosfato): fosfato de sodio 10 mM o 100 mM y NaCl 150 mM, pH = 7,0.

Tampón de lavado altamente detergente: 0,005% de NaN_{3} y 0,3% de Tween 20 en PBS de potasio 10 mM (potasio usado en lugar de sodio).

Tampón de lavado del ELISA: 0,005% de NaN_{3} y 0,05% de Tween 20 en PBS de potasio 10 mM (potasio usado en lugar de sodio).

Tampón de ensayo del ELISA tampón: 0,05% de NaN_{3}, 0,05% de Tween 20 y 0,1% de BSA (albúmina de suero bovino) en PBS 100 mM.

Tampón de sustrato del ELISA: 0,05% de NaN_{3}, dietanolamina 1 M y MgCl_{2} 1 mM.

Solución de bloqueo de PSA (albúmina de suero porcino): 1 mg/mL de albúmina de cerdo (Sigma Nº de catálogo; A4414) en PBS 10 mM.

Otros. La inmunoglobulina Isotyping Kit-IsoStrip® (Nº de catálogo; 1493 027) fue comprada de Boehringer
Mannhein. La IgG+A+M antiratón de conejo (Nº de catálogo; 61-6500) fue comprada de los Laboratorios Zymed, Inc., San Francisco, CA. Los péptidos sintéticos fueron obtenidos del Centro Beckman, Universidad de Stanford, Palo Alto, CA. El PNPP (p-nitrofenilfosfato) fue obtenido de la Compañía Sigma Química.

El adyuvante Ribi (Emulsión MPL+TDM) con suplemento de CWS fue comprado de RIBI Immunochem
Research, Inc., Hamilton, Montana. El kit de ensayo de proteína BCA (Nº de catálogo; 23225) fue comprado de Pierce,
Rockford, IL. El PEG 1500 (polietilenglicol 1500) fue comprado de Mannheim Boehringer, Indianapolis, EN. Los medios HAT y HT fueron obtenidos de la Compañía Sigma Química, San Louis, MO. El IFA (adyuvante incompleto de Freund, Nº de catálogo; 77146G) fue obtenido de Pierce.

Ejemplo 1 Aislamiento y caracterización de helicopéptidos naturales

La orina de un paciente con grave enfermedad de Paget (fosfatasa alcalina> \sim 1000 Ul) fue combinada con un cóctel de inhibidor de proteasa que consiste en fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF), N-etil-maleimida 100 mM, Tris 50 mM pH 11 en etanol del 25% (20 mL de cóctel por 2L de muestra) y almacenados a 4ºC hasta el análisis. La orina fue concentrada usando un filtro UM-2 de Amicon con un depósito y dispositivo de corte automático que permitió la concentración de hasta 2,5 litros. El concentrado fue entonces dializado a 2ºC usando membranas de diálisis Spectra/Por® con un límite de peso molecular de 3500 y luego se liofilizó. Las porciones entonces fueron disueltas en un cóctel de CaCl_{2} 1 M/TrisHCl 50 mM/azida de sodio 0,2%/inhibidor de proteasa 1% y se sometieron a cromatografía en el mismo tampón sobre Sephadex G-75. Las fracciones fueron controladas por OD_{230} y las alícuotas fueron hidrolizadas por tratamiento ácido y analizadas para hidroxiprolina (Hyp). El agua tritiada fue usada para marcar el final de la separación. Se muestran los resultados en la figura 1.

Las fracciones que contenían Hyp (fracciones 50-70) fueron recogidas, reunidas y dializadas para eliminar los constituyentes del tampón y se liofilizaron. Los péptidos en estas fracciones fueron además purificados por cromatografía de afinidad (medios PBE 94 de Pharmacia en columna de 0,9 x 10 cm equilibrada a pH 7,4 con imidazol-HCl 0,025 M) para la separación de acuerdo con el punto isoeléctrico. Un anfolito politampón de pH 7,5-4,0 (Politampón 74 de Pharmacia, gradiente de 110 mL con un caudal de 21 mL/h) fue usado para la cromatografía de afinidad, que fue eliminado después de los péptidos eluidos por el paso por una columna P-10 de Sephadex (113 cm).

Los péptidos eluidos se analizaron de acuerdo con el método de ensayo de la hidroxiprolina de Bergmann y Loxley (1963) usando alícuotas de hasta 100 microlitros. Aproximadamente el 39% de la hidroxiprolina aplicada eluyó inmediatamente en el volumen vacío, seguido de la elución de tres picos resueltos correspondiente a los puntos isoeléctricos (pl) de 4,8, 5,3 y 6,2, como se muestra en la figura 2.

La elución de fracciones con pl de \sim 6,2 (indicado por la flecha en la figura 2) fue resuelta por HPLC en una columna TP201 C18 de Vydac usando una unidad HPLC de Beckman, con una combinación de dos gradientes acuosos lineales de acetonitrilo, de acuerdo con el método de van der Rest (1982).

Los gradientes de acetonitrilo empleados fueron (i) ácido heptafluorobutírico (acetonitrilo del 4-32%, 90 minutos) e (ii) ácido trifluoroacético 0,009 M (acetonitrilo del 0-32%, 1 h) en un caudal de 1 mL/min (figura 3). Las muestras correspondientes a os picos fueron recogidas y la secuenciación del aminoácido fue realizada en un Secuenciador de Aminoácidos 470 de ABI usando el procedimiento de degradación de Edman. Varios picos no fueron secuenciados debido a los extremos N bloqueados. Dos secuencias de fragmento fueron determinadas satisfactoria-
mente:

(1) Ala-Hyp-Gly-Asp-Arg-Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ala (SEQ ID NO:1), y

(2) Gly-Asn-Ser-Gly-Glu-Hyp-Gly-Ala-Hyp (SEQ ID NO:2).

Los péptidos anteriores corresponden a los residuos 620-633 y 253-261, respectivamente, del dominio helicoidal de la cadena \alpha1 del colágeno humano Tipo I.

Ejemplo 2 Péptidos sintéticos

Los péptidos sintéticos (1) y (2), correspondientes a las secuencias nativas SEQ ID NO:1 y 2 (Ejemplo 1), respectivamente, fueron preparados por métodos de síntesis de péptido estándar para uso como estándares en ensayos y kits y para la conjugación de la fosfatasa alcalina. También para la preparación conjugada, los péptidos sintéticos (1) y (2) fueron modificados para incluir un residuo adicional de cisteina en sus extremos N como se muestra a
continuación:

(Ia) Cys-Ala-Hyp-Gly-Asp-Arg-Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ala (SEQ ID NO:3), y

(2a) Cys-Gly-Asn-Ser-Gly-Glu-Hyp-Gly-Ala-Hyp (SEQ ID NO:4).

La HPLC de fase inversa confirmó la pureza de los péptidos sintéticos resultantes cisteinilados (1a) y (2a). La espectrometría de masas confirmó las masas moleculares.

Ejemplo 3 Conjugados de helicopéptido A. Conjugado de KLH-Helicopéptido

Los inmunógenos para generar anticuerpos frente a los péptidos (1) y (2) fueron preparados uniendo los Cys-helicopéptidos del Ejemplo 2 a KLH modificado con maleimida usando sulfo-SMCC (4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de sulfo-N-succinimidilo) como sigue.

Hemocianina de Megathura crenulata (IMJECT, Pierce Chemical, 20 mg, 2,50 x 10^{-6} mmoles) fue reconstituida en 2,0 mL de agua, dando como resultado una solución de KLH de 10 mg/mL que contenía fosfato de sodio 83 mM, pH 7,2, con NaCl 0,9 M. A esta solución turbia azul coloidal fue añadido un exceso molar de 500 veces (asumiendo un peso molecular de 1 millón para KLH) de sulfo-SMCC (Pierce Chemical, 6,55 mg en 200 \muL de DMSO). La solución resultante entonces fue incubada a temperatura ambiente durante 1,5 a 2 h. La solución fue dializada durante 2 h a temperatura ambiente frente a 1,8 litros de fosfato de sodio 100 mM, pH 6,8, con cloruro de sodio 150 mM, con un cambio de tampón.

Un exceso molar de 1000 veces de cada uno de los péptidos cisteinilados (1a) y (2a) fue disuelto en 300 \muL de fosfato de sodio 100 mM, pH 6,8, NaCl 150 mM. A cada uno de los péptidos disueltos fue añadida la mitad de la solución que contenía KLH-SMCC dializada. Se permitió a la mezcla resultante reposar durante 2 h a temperatura ambiente. Los conjugados KLH resultantes fueron purificados mediante diálisis exhaustiva de la noche a la mañana a 4ºC en PBS, pH 7,1, con un cambio de tampón.

El análisis de aminoácidos de los conjugados, KLH-SMCC-N-Cys-helicopéptido (1) y KLH-SMCC-N-Cys-helicopéptido (2) (inmunógenos designados (3) y (4), respectivamente), indicó la presencia de una cantidad sustancial de hidroxiprolina en los conjugados y ninguna en el KLH solo, indicando una fuerte derivatización de KLH vehículo con cada uno de los péptidos inmunogénicos.

No fueron determinadas relaciones de conjugación exactas debido a la heterogeneidad del vehículo.

B. Conjugados de helicopéptido-fosfatasa alcalina

Para detectar los anticuerpos monoclonales, se prepararon conjugados de fosfato alcalino (conjugados (5) y (6), respectivamente) usando cada uno de los péptidos (1a) y (2a) y N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP) como agente de acoplamiento.

Un exceso molar de 10 veces SPDP (Pierce, solución madre 6 mg/mL en DMSO) fue añadido a 3 mg de fosfatasa alcalina (Scripps) para formar una solución resultante a una concentración de 10 mg/mL de proteína. Después de reposar durante 1 h a temperatura ambiente, se dializó la mezcla de reacción de la noche a la mañana a 4ºC frente a 1,5 litros de fosfato de sodio 100 mM, pH 6,0, con un cambio de tampón.

La solución de fosfatasa alcalina dializada y SPDP-derivatizada fue dividida entre dos recipientes de reacción cada uno conteniendo un exceso molar 20 veces del helicopéptido sintético (1a) o (2a). Después de reposar durante 4 h a temperatura ambiente, las reacciones fueron paradas por la adición de N-etilmaleimida a una concentración final de 75 mM (solución madre de 1 M en metanol) y se dejó reposar durante 1 h.

Los conjugados resultantes, fosfatasa alcalina-SPDP-péptido (5) y fosfatasa alcalina-SPDP-péptido (6), fueron purificados mediante diálisis exhaustiva de la noche a la mañana a 4ºC frente a 1,5 litros de PBS, pH 7,1, con un cambio de tampón.

Los conjugados de fosfatasa alcalina se analizaron para la actividad de fosfatasa alcalina por la observación de la absorbancia A_{405} después del tratamiento con fosfato de p-nitrofenilo en tampón sustrato de dietanolamina.

Para determinar las relaciones de conjugación correspondientes, se midió la cantidad presente de hidroxiprolina en los conjugados por el análisis de aminoácidos. Las relaciones de conjugación eran las mismas para ambos conjugados (seis péptidos por dímero de fosfatasa alcalina).

En un enfoque alternativo, pueden prepararse conjugados de fosfatasa alcalina como sigue: 12,5 mg de fosfatasa alcalina dializada frente a PBS 10 mM (pH 7) se mezclan con 3,2 mg de péptido (1a) o (2a) en 150 mL de PBS 100 mM (pH de 7 a 7,5). Después de que la concentración de fosfatasa alcalina se ajusta a 5 mg/mL con PBS100 mM, se añaden 2,3 mg de suberato de bis-(succinimidilo) (Pierce) en forma de polvo, seguido de agitación. Se permite a la reacción proceder durante 1,5 h a temperatura ambiente. La reacción se inactiva con glicina 1 M en PBS 100 mM y se dializa frente a 2 litros de PBS 10 mM con cinco cambios en tres días.

C. Conjugados helicopéptido-estreptavidina

Los conjugados de estreptavidina (por ejemplo, para determinar el título del anticuerpo) se prepararon como sigue. Un exceso molar de 10 veces de SPDP (Pierce, solución madre 6 mg/mL en DMSO) fue añadido a 3 mg de estreptavidina (Scripps) y se permitió a la solución resultante reposar durante 1 h a temperatura ambiente. La concentración de proteína de la mezcla de reacción resultante era 10 mg/mL. La mezcla de reacción se dializó de la noche a la mañana a 4ºC frente a 1,5 litros de fosfato de sodio 100 mM, pH 6,0, con un cambio de tampón.

La solución de estreptavidina dializada y SPDP-derivatizada fue dividida entre dos recipientes de reacción cada uno conteniendo un exceso molar de 20 veces de helicopéptido (1a) o (2a) que contenía cisteina. Después de reposar durante 4 h a temperatura ambiente, las reacciones fueron paradas por la adición de N-etilmaleimida a una concentración final de 75 mM (solución madre 1 M en metanol), seguido por la incubación durante 1 h.

Los conjugados resultantes, estreptavidina-SPDP-N-Cys-helicopéptido (1) y estreptavidina-SPDP-N-Cys-helicopéptido (2) (conjugados denominados (7) y (8), respectivamente), fueron purificados mediante diálisis exhaustiva de la noche a la mañana a 4ºC frente a 1,5 litros de PBS, pH 7,1, con un cambio de tampón. El análisis de aminoácidos indicó las relaciones de conjugación de aproximadamente 4 péptidos por tetrámero de estreptavidina para ambas preparaciones de conjugados.

Ejemplo 4 Anticuerpos monoclonales A. Inmunización

Fueron inmunizados ratones Balb/c y MRL/MpJ-Ipr con inmunógeno (3) y (4), respectivamente, usando el protocolo siguiente:

TABLA 1A Ratones Balb/c, Inmunógeno (3)

Inmunización	Días de fusión	Antígeno inyectado (\mug)	^{1}Adyuvante	Modo de inyección
1	81	100	Ribi (CWS)	ip^{2}
2	67	100	Ribi (CWS)	ip
3	39	100	Ribi (CWS)	ip
4	7	200	- -	iv^{3}, ip
5	3	200	- -	ip
^{1}El adyuvante y el antígeno son suspendidos en la solución de sal equilibrada de Hank (HBSS);
^{2}intraperitoneal; ^{3}intravenosa

Los mejores resultados de la titulación (inmunógeno 3): título indirecto \sim 37.912, título "sanwich" 50.930.

(Determinado como el recíproco de la dilución, que tiene un O.D. equivalente al 50% máximo de O.D. basado en el ELISA indirecto o "sanwich").

TABLA 1B Ratones MRL/MpJ-Ipr, Inmunógeno (4)

Inmunización	Días de Fusión	Antígeno inyectado (\mug)	^{1}Adyuvante	Modo de Inyección
1	81	100	Ribi (CWS)	ip^{2}
2	67	100	Ribi (CWS)	ip
3	39	100	Ribi (CWS)	ip
4	7	200	- -	ip, iv^{3}
^{1} El adyuvante y el antígeno son suspendidos en la solución de sal equilibrada de Hank (HBSS);
^{2} intraperitoneal; ^{3}intravenosa

Los mejores resultados de la titulación (inmunógeno 4): título indirecto 128.477, "sanwich", 54.314).

Fue recogida sangre de vena de cola y los títulos de suero fueron determinados alrededor de 10 días después de las terceras inmunizaciones usando una determinación de título "sanwich" y un "ELISA indirecto" como se describe a continuación. Los mejores títulos de ratones fueron reforzados intravenosamente con inmunógeno de péptido 200 \mug/mL en HBSS de 3 a 7 días antes de la fusión.

Los ratones inmunizados entonces fueron sacrificados por asfixia con CO_{2}. Cada ratón fue aclarado con alcohol del 70%, colocado sobre su lado derecho sobre la tabla de cortar y transferido a una capucha. El bazo fue transferido a una placa petri que contenía 5 mL de medio DMEM sin suero. El bazo fue lavado dos veces en medio DMEM sin suero y luego fue cortado en pequeños pedazos y homogeneizado en 7 mL DMEM libre de suero en un homogeneizador celular.

B. Protocolo de Fusión

Las fusiones para el inmunógeno (3) fueron llevadas a cabo con aproximadamente 33 x 10^{6} células de mieloma y 1 x 10^{8} células de bazo inmunes homogeneizadas; fueron llevadas a cabo fusiones para el inmunógeno (4) con aproximadamente 66 x 10^{6} células de mieloma y 2 x 10^{8} células de bazo inmunes homogeneizadas.

Para cada fusión, las células de mieloma y las células de bazo inmunes homogeneizadas fueron centrifugadas a 1000 revoluciones por minuto durante 10 minutos. La mezcla celular granulada entonces fue suspendida de nuevo en 10 mL de medio DMEM libre de suero (tubo de centrifugadora de 50 mL) y centrifugada a 1000 revoluciones por minuto durante 10 minutos. El sobrenadante fue eliminado completamente y la punta del tubo de la centrifugadora de 50 mL fue golpeada débilmente para desmoronar el pelet celular. Fueron añadidos 2 mL de fusógeno 1500 PEG del 50% al pelet celular gota a gota durante 90 segundos y mezclado con cuidado con una pipeta. Entonces, fueron añadidos 2 mL de DMEM sin suero gota a gota durante 1 minuto. 20 mL de S-DMEM fueron añadidos despacio durante 2 minutos y se permitió a la mezcla celular reposar durante otros 2,5 minutos con agitación lenta durante el procedimiento. La suspensión celular entonces fue centrifugada a 1000 revoluciones por minuto durante 10 minutos.

Después de eliminar el sobrenadante, las células fueron suspendidas de nuevo en 200 mL de HAT en medio de S-DMEM P388D1 o J77S-1 al 20% acondicionados. La suspensión celular fue pipeteada en diez placas de cultivo de 96 pocillos de tejido Costar. Las placas fueron incubadas en CO_{2} al 7% a 37ºC para aumentar las células de hibridoma. Las células fueron alimentadas el día 3 y el día 7 pipeteando hacia fuera 100 \muL/pocillo de los viejos medios, luego fueron suplementados con 150 \muL/pocillo de medio HAT (día 3) o HT (día 7). Las placas de fusión fueron típicamente preparadas para analizarlas 7-10 días después de la fusión.

En los experimentos de fusión para producir anticuerpos monoclonales, de 950 pocillos para cada uno de los inmunógenos (3) y (4) cultivados con células, todos los pocillos parecieron contener hibridomas viables.

C. Análisis de los hibridomas

Los productos de fusión exitosos fueron analizados después para la inmuno-reactividad usando el formato de ensayo inverso descrito en el Ejemplo 8C.

Fusiones para el inmunógeno (3): Basado en el ELISA indirecto, un total de 196 de 950 pocillos exhibieron resultados positivos buenos para la fusión (O.D.> 1,5) y 32 de 950 pocillos mostraron resultados altamente positivos (O.D.> 2,0).

Fusiones para el inmunógeno (4): Basado sobre el ELISA indirecto, un total de 911 de 950 pocillos exhibieron resultados muy altamente positivos para la fusión (O.D.> 3,0), mientras 15 de 950 pocillos mostraron resultados positivos buenos (O.D.> 2,0).

Siguiendo la determinación de clones de hibridoma productores de anticuerpo, fue utilizado un protocolo de ELISA indirecto competitivo para analizar a clones que exhibían tanto sensibilidad como especificidad a inmunógeno. El ELISA indirecto competitivo fue realizado frente a cada uno de los péptidos sintéticos (1) y (2) y frente a la orina de niños como una fuente de péptidos de colágeno nativo.

Cuatro clones aumentados frente al inmunógeno (3) exhibieron buena inmuno-reactividad tanto frente al péptido sintético (1) como frente a la orina de niños. Un clon, clon 10B1, demostró inmuno-reactividad superior frente al inmunógeno (3). Dos de los cuatro clones sobrevivieron la primera ronda de clonación de dilución restrictiva (clonación de célula individual), uno de los cuales era el clon 10B1. Basado en su sensibilidad y especificidad, el clon 10B1 fue además caracterizado.

La constante de afinidad del anticuerpo monoclonal 10B1 fue determinada siendo aproximadamente 1 x 10^{8}/M, usando el protocolo descrito en el Ejemplo 8C. El clon 10B1 (nombre completo 10B1-5A6-1C9) fue depositado el 12 de marzo de 1998 con la ATCC (American Type Culture Collection, 10801 Universidad Blvd, Manassas, VA, 20110-2209) como depósito de hibridoma HB-12480 en cumplimiento con el Tratado de Budapest.

Ejemplo 5 Anticuerpos policlonales

Conejos blancos de Nueva Zelanda fueron inmunizados con 200 \mug/conejo de conjugados de KLH-SMCC-helicopéptido de inmunógeno (3) o (4) del Ejemplo 3) con adyuvante Ribi (CWS) cada tres semanas. El antisuero fue recogido después de la tercera inmunización y 10 días después de cada inmunización subsecuente. Los títulos fueron analizados usando el procedimiento siguiente. A cada pocillo de una placa de microtitulación fueron añadidos 100 \muL de IgG de anticonejo de cabra a 3 \mug/mL (Zymed) en PBS 10 mM, seguido por incubación de una noche a 4ºC. Los pocillos entonces fueron lavados 3 veces con 300 \muL de tampón de lavado. Fueron añadidos 100 \muL/pocillo de suero policlonal de conejo correctamente diluido y fue incubado a temperatura ambiente durante una hora. Después del lavado de los pocillos tres veces con 300 \muL/pocillo de tampón de lavado, fueron añadidos estándares (50 \muL/pocillo) y orina (dilución 1:2 en tampón de ensayo), seguido por (50 \muL/pocillo) conjugados de fosfato alcalino (5) y (6) (Ejemplo 3B) en tampón de ensayo. Las mezclas fueron incubadas a temperatura ambiente durante 1 hora, lavadas 3 veces con 300 \muL/pocillo de tampón de lavado y fueron añadidos 150 \muL/pocillo de solución de sustrato PNPP de 2 mg/mL. Fueron tomadas lecturas de A_{405} después de la incubación a temperatura ambiente durante
1 hora.

Ejemplo 6 Preparación de microplacas revestidas con inmunógeno A. Biotín-PSA

La biotinilación de albúmina de suero porcino (PSA) fue llevada a cabo añadiendo 10 mg de succinimidil-éster de biotín-X-2,4-dinitrofenol-X-L-lisina (Molecular Probes, Eugene, OR) en 400 microlitros de dimetilformamida (DMF) a una solución de 15 mL de PBS que contenía 150 mg de albúmina. Se permitió a la mezcla reaccionar durante dos horas a temperatura ambiente, seguido de una cromatografía en una columna G-25.

B. Revestimiento con conjugado de inmunógeno-estreptavidina

Los conjugados (7) y (8) del Ejemplo 3C son opcionalmente purificados por filtración en gel usando S-300 HR de Sephacryl (1,6 x 98 cm), eluyendo con PBS 50 mM a pH 7,5 que contiene Tween 20 del 0,05% a 0,33 mL/min.

Cada uno de los pocillos en una placa ELISA de 96 pocillos fue revestido del conjugado (7) u (8) como sigue. A cada pocillo fueron añadidos 150 microlitros de solución de biotín-PSA a 3,8 \mug/mL en PBS, seguido por una incubación de una noche a 2-8ºC. Las microplacas fueron lavadas con PBS que contenía "TWEEN"-20 del 0,3% y fueron bloqueadas por la adición de 200 microlitros de albúmina a 1 mg/mL, seguido por una incubación de una noche a temperatura ambiente. Las microplacas entonces fueron lavadas dos veces con PBS que contenía "TWEEN"-20 del 0,05%.

A cada pocillo revestido con biotín-PSA fueron añadidos 150 microlitros de una solución que contenía el conjugado (7) u (8) en PBS a 100 ng/mL. Después de una incubación de una hora a temperatura ambiente, las placas fueron lavadas dos veces con PBS que contenía "TWEEN"-20 del 0,05%, seguido por la incubación con 200 \muL/pocillo de sacarosa del 10% en PBS 100 mM durante 2 horas, para mejorar la estabilidad del soporte. Después de la aspiración de los pocillos, el líquido residual fue entonces eliminado de la microplaca secando de la noche a la mañana en una estufa por convección a 37ºC.

Ejemplo 7 Conjugado de IgG anticuerpo-fosfatasa alcalina

Diez equivalentes de 3-(2-piridilditio)-propionato de N-succinimidilo (SPDP) (Pierce Chemical; 0,22 mg, 6,92 x 10^{-4} mmoles) a 4 mg/mL en etanol anhidro fueron añadidos inmediatamente gota a gota a fosfatasa alcalina (Biozyme; 9,7 mg, 6,92 x 10^{-5} mmoles) a 12,2 mg/mL en tampón de fosfato de sodio 0,05 M a pH 7,5 que contenía EDTA 1 mM y fue desoxigenado con gas argón. Entonces se permitió a la mezcla reposar a temperatura ambiente durante 2,5 h. El producto resultante de fosfatasa alcalina-piridilditiopropionato fue purificado con diálisis frente a tampón fosfato de sodio 0,1 M a pH 6 que contenía EDTA 1 mM y fue desoxigenado con gas argón.

La conversión al tiol correspondiente fue llevada a cabo exponiendo el producto fosfatasa alcalina-piridilditiopropionato a exceso de ditiotreitol (Molecular Probes; 2,3 mg, 0,02 mmoles) a 5 mM durante 30 minutos. Una alícuota fue medida por A_{280} y A_{344} y fue determinado que contenía 4,8 grupos tiol por enzima. El enzima-tiol fue purificado por filtración de gel en una columna G-25 de Sephadex.

Diez moles de 4-(N-maleimidometil ciclohexano-1-carboxilato) de sulfosuccinimidilo (Pierce Chemical; 0,087 mg, 2,00 x 10^{-4} mmoles) a 2 mg/mL en metanol anhidro fueron añadidos inmediatamente gota a gota al anticuerpo de IgG específico de péptido purificado de proteína A (2,00 x 10^{-5} mmoles) a 6,0 mg/mL en tampón fosfato de sodio 0,05 M a pH 7,5 que contenía EDTA 1 mM y fue desoxigenado con gas argón y esto se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2,25 h. La IgG-maleimida resultante fue purificada por diálisis frente a tampón fosfato de sodio 0,1 M a pH 6 que contenía EDTA 1 mM y fue desoxigenado con gas argón.

La IgG-maleimida entonces fue añadida directamente a 2,6 moles de fosfatasa alcalina-tiol, sellada bajo gas argón y se permitió reposar a 4ºC durante 24 h. Los grupos tiol residuales fueron entonces terminados con N-etil-maleimida 50 mM haciéndolos reaccionar durante más de 24 h a 4ºC.

El conjugado de IgG-fosfatasa alcalina resultante fue purificado entonces para eliminar la IgG residual no reaccionada, enzima y NEM por filtración de gel a través de S-300HR de Sephacryl (1,6 x 98 cm), eluyendo con PBS 50 mM a pH 7,5 que contenía Tween 20 del 0,05%. La fracciones que contenían IgG-enzima, en relación con el material no conjugado, primero fueron determinadas por absorbancia a A_{280} combinado con el análisis de alícuotas diluidos sobre placas de microtítulo.

Primero, la actividad de la enzima fue ensayada observando la absorbancia a A_{405} después del tratamiento con fosfato de p-nitrofenilo en tampón de sustrato de dietanolamina. Segundo, el conjugado fue identificado uniendo a una placa de microtítulo revestida con anticuerpo de antiratón de conejo (a 3 \mug/mL), lavando y detectando con fosfato de p-nitrofenilo en tampón de sustrato de dietanolamina.

Finalmente, el conjugado fue ensayado uniendo a una placa revestida de inmunógeno de péptido (PSA-biotín a 3,75 \mug/mL de la noche a la mañana a 4ºC, bloqueando la placa con una solución de 1 mg/mL de PSA, seguida del conjugado de estreptavidina-péptido (Ejemplo 3C) a 3,8, \mug/mL de la noche a la mañana a 4ºC y luego detectando cualquier IgG-enzima unida con 2 mg/mL de fosfato de p-nitrofenilo en dietanolamina. Las fracciones se reunieron basándose en estos resultados para obtener sólo fracciones que contenían el conjugado IgG-AP.

Ejemplo 8 Configuraciones de ensayo ilustrativas A. Formato directo "sanwich"

Las etapas siguientes se llevan a cabo para preparar varias configuraciones de ensayo:

(1) Las placas ELISA se revisten con 150 \muL/pocillo, 3,75 \mug/mL de biotín-PSA a 4ºC de la noche a la mañana.

(2) Las placas se humedecen con lavado de detergente superior de 250 \muL/pocillo durante 2 horas.

(3) Las placas se bloquean con 250 \muL/pocillo, 1 mg/mL de PSA a 4ºC de la noche a la mañana.

(4) Las placas se lavan dos veces con tampón de lavado.

(5) El conjugado marcado con estreptavidina (7) u (8) (aproximadamente 2 \mug/mL) se añade a las placas, 150 \muL/pocillo, a 4ºC de la noche a la mañana.

(6) Las placas se lavan tres veces con tampón de lavado.

(7) 100 \muL/pocillo de conjugado de anticuerpo-AP (dilución 1:1000, aprox. 84 ng/mL) en tampón de ensayo y se añaden 50 \muL/pocillo de estándares o muestras a la placa. La placa se incuba durante 1 hora o más.

(8) Las placas se lavan tres veces con 300 \muL/pocillo de tampón de lavado.

(9) 150 \muL/pocillo de PNPP de 2 mg/mL en tampón de sustrato se añaden a las placas y se incuba a temperatura ambiente durante 60 minutos o más. El desarrollo del color se para con NaOH 3 N. La absorbancia se mide a 405 nm.

B. Formato "sanwich" indirecto

El procedimiento en la parte A anterior se modifica como sigue. Las modificaciones siguientes son hechas en lugar de las etapas (7) y (8):

(7) 100 \muL/pocillo de anticuerpo específico de inmunógeno (de aprox. 10 a 50 ng/mL) en tampón de ensayo y con 50 \muL/pocillo de estándar de inmunógeno o muestra, se añaden a la placa. La placa se incuba durante 1 hora o más.

(8) Las placas se lavan tres veces con 300 \muL/pocillo de tampón de lavado.

(8.5) 150 \muL/pocillo de conjugado de IgG+A+M (H+L) antiratón de cabra de Pierce-fosfatasa alcalina (dilución 1:1.000 en tampón de ensayo) se añaden a la placa de ELISA y se incuba a temperatura ambiente durante una
hora.

C. Formato inverso

(1) Una placa ELISA de Costar o Nunc se reviste con 150 \muL/pocillo de 3 ó 4 \mug/mL de IgG+A+M (H+L) antiratón de conejo de Zymed en PBS 10 mM a temperatura ambiente durante 1-24 horas.

(2) La placa se incuba con 300 \muL/pocillo de detergente de lavado fuerte a temperatura ambiente durante 2 horas y luego se lava dos veces más.

(3) Se añaden anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-helicopéptido (I) o anti-helicopéptido (II)) de sobrenadantes de cultivo celular, suero de ratón, o como anticuerpos purificados, en tampón de ensayo (por ejemplo, 180 \muL/pocillo de anticuerpo 10B1 a 50 ng/mL) y se incuban a temperatura ambiente durante 16-24 horas.

(4) Las placas se lavan de una a tres veces con 300 \muL/pocillo de tampón de lavado, seguido de 250 \muL/pocillo de una solución de sacarosa del 10%, 1% de BSA y 0,05% de NaN_{3} en PBS 100 mM a temperatura ambiente durante al menos una hora.

(5) Después de lavar, la placa se incuba con 250 \muL/pocillo de sacarosa del 15% en PBS 100 mM durante 30 minutos a 1 hora. Después de quitar la solución de sacarosa, la placa se seca de la noche a la mañana a 37ºC en una incubadora y luego se almacena con un desecante.

(6) Se añaden 20 \muL de fluido biológico o estándar en cada uno de los pocillos.

(7) Se añaden 150 \muL de dilución apropiada del conjugado de fosfatasa alcalina-péptido en tampón que contiene K_{2}SO_{4} 0,5 M, MgCl_{2} 4 mM y ZnCl_{2} 0,4 mM. Se incuba durante 3 horas a temperatura ambiente (también aceptable: 1 hora a una noche, temperatura ambiente o 4ºC).

(8) Se lava tres veces con tampón de lavado.

(9) Se añaden 100-150 \muL/pocillo de PNPP a 2 mg/mL en tampón de sustrato a las placas y se incuba a temperatura ambiente durante 30-60 minutos, después que el desarrollo del color se para con NaOH 1 N. La absorbancia se mide a 405 nm, seguido por el ajuste de la curva de cuatro parámetros.

Ejemplo 9 Ensayo de péptido de orina

El procedimiento de formato inverso en el Ejemplo 8C fue usado para caracterizar el funcionamiento analítico de un ensayo ejemplar.

A una placa de microtítulo revestida con anticuerpo monoclonal de anti-helicopéptido (I) fueron añadidos 20 \muL de calibrador o muestra de orina (por duplicado), seguido por la adición de 150 \muL de conjugado de péptido-fosfatasa alcalina en K_{2}SO_{4} 0,5 M que contenía MgCI_{2} 4 mM y ZnCl_{2} 0,4 mM. La placa fue incubada durante tres horas a temperatura ambiente y luego lavada tres veces con tampón de lavado. La detección colorimétrica fue llevada a cabo por la adición de 150 \muL de solución de sustrato PNPP (2 mg/mL), seguida por la incubación durante una hora a temperatura ambiente. Un volumen de 100 \muL de solución de paro de NaOH 1N fue añadido entonces a cada uno de los pocillos. La absorbancia fue medida después a 405 nm.

Precisión. El ensayo ELISA exhibió un buen comportamiento analítico con un coeficiente de variación intraensayo (CV) del 4-7% y un coeficiente de variación interensayo (CV) del 5-7%.

Estos resultados se resumen en la Tabla 2 a continuación.

Linealidad. La linealidad media fue determinada como el promedio de 8 muestras medidas netas o diluídas 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16 con tampón de ensayo. La recuperación de linealidad de orina media fue de 104 + 8% sobre las diluciones, donde el % de la recuperación de linealidad = (valor observado/valor esperado) x 100.

Recuperación de la respuesta. La recuperación de la respuesta media fue determinada por las diferentes cantidades de recuperación de péptido sintético (I) (100 ng/mL, 300 ng/mL y 1000 ng/mL) en 9 muestras de orina. La recuperación de la respuesta media fue de 99 + 4%.

Una curva estándar para el ensayo de colágeno del tipo I de orina basado en la detección de helicopéptido (I) se muestra en la figura 4.

TABLA 2 Comportamiento analítico de ensayo

Muestra	Péptido de orina ng/mL*	CV* Intraensayo	Péptido de orina ng/mL**	Interensayo**
1	117	7%	127	7%
2	344	5%	356	7%
3	708	4%	729	5%
* n = 26-28 réplicas/experimento
** n = 2 réplicas/experimento, 10 experimentos, 2 días

Los resultados en la Tabla 2 ilustran el buen comportamiento total analítico de un ELISA indirecto representativo conteniendo anticuerpos monoclonales de anti-helicopéptido para detectar marcadores de helicopéptido de la presente invención.

Ejemplo 10 Detección de resorción ósea en varias poblaciones

Utilizando el ELISA descrito en el Ejemplo 9, fueron realizados ensayos sobre muestras de orina de las poblaciones siguientes: (i) 73 mujeres sanas premenopaúsicas, edades de 25-44; (ii) 20 hombres sanos, edades de 25-44, (iii) 30 pacientes con enfermedad de Paget y (iv) 47 mujeres osteoporóticas.

Basado en los resultados de ensayo, el nivel medio urinario de péptido/\alphal (I)^{620-633} (I) en poblaciones normales (i) e (ii) era 30,0 + 17,9 ng/nmol creatinina. El nivel medio de marcador (I) en pacientes con enfermedad de Paget era de 241,7, con 27 fuera de 30 de las muestras conteniendo > 60,0 ng/nmol de creatinina (frente a P normal < 0,0001). El nivel medio de marcador (I) en mujeres osteoporóticas (población (iv)) era de 40,4 \pm 33,5 ng/nmol de creatinina. Estos resultados están presentados gráficamente en la figura 5 y en la Tabla 3 a continuación.

TABLA 3 Comparaciones de población

Población	Péptido urinario
	(SEQ ID NO:1)
	Valor de P	Valor de t	Elevación
Normal vs. Post-MP	0,0585	0,71	42%
Normal vs. Osteoporóticos	0,041	0,76	45%
Normal vs. Paget	< 0,0001	12	703%
\begin{minipage}[t]{145mm}Valor de p: prueba de t de student inapareada; Valor de t: media de prueba / medio de población de referencia (se refiere a la población SD); elevación en %: [(media de prueba - media de población de referencia)-1] x 100% \end{minipage}

Ejemplo 11 Control de tratamiento terapéutico

El ensayo ELISA descrito en el Ejemplo 10 fue empleado para controlar cambios del estado de degradación de hueso en respuesta al tratamiento terapéutico con pamidronate y alendronate.

Terapia con pamidronate. El estudio fue llevado a cabo sobre un total de 24 sujetos. La duración del estudio fue de 26 semanas.

14 pacientes osteoporóticas femeninas fueron expuestas a un régimen de tratamiento continuo de 150 mg de pamidronate de disodio oral (ADP) administrado a diario durante un período de 26 semanas. 10 sujetos adicionales recibieron un régimen de mantenimiento semanal de 150 mg de pamidronate a diario durante un período de dosis de administración de 4 semanas, seguido de una dosis de mantenimiento semanal de pamidronate oral (150 mg tomados un día por semana), acompañado por una placebo de pamidronate correspondiente tomado 6 días por semana durante el curso de la 22 semana restante del estudio.

Las muestras de orina (muestras recogidas cada 24 horas) fueron recogidas antes del tratamiento para establecer una línea de fondo y a los 6 meses siguientes en el curso del tratamiento.

Terapia de alendronate. 11 pacientes femeninos que tenían baja masa ósea (no necesariamente osteoporéticas) fueron tratadas a diario con 10 mg de alendronate orales. Fueron recogidas segundas muestras de orina vacías de mañana para el análisis de la línea de fondo (antes del tratamiento), un mes (2 pacientes), 3 meses (6 pacientes) y 6 meses (3 pacientes) después de que el tratamiento fue comenzado.

Resultados. Los resultados se resumen a continuación en las Tablas 4-6. En 24 pacientes osteoporóticas tratadas con pamidronate (Tabla 5), la excreción de péptido urinario/\alphal(1)^{620\sim 633} disminuyó por una media del 69% y disminuyó en mayor medida que el 40% en 22 de los 24 pacientes. Asimismo en 11 pacientes osteoporóticas tratadas con alendronate (Tabla 6), la excreción de péptido urinario/\alphal(1)^{620\sim 633} disminuyó por una media del 80% y disminuyó en mayor medida que el 60% en 9 de 11 pacientes.

Estos resultados muestran que la medida de la excreción de péptido urinario/\alphal(1)^{620\sim 633} por ELISA proporciona (i) un buen marcador de resorción ósea y (ii) un indicador sensible para controlar la eficacia de varias terapias antirresortivas.

TABLA 4 Media, SD y %CV de 72 mujeres premenopáusicas sanas

Ensayo	Péptido de orina
Unidad	ng/mL Péptido/mM Cr.
Media	30,42
SD	18,08
CV, %	59%

TABLA 5 Respuesta media de 24 pacientes después de la terapia con pamidronate

Ensayo	Péptido de orina (I)
Gota media	69%
SD	24%

TABLA 6 Respuesta media de 11 pacientes después de la terapia con alendonate

Ensayo	Péptido de orina
Gota Media	80%
SD	28%

Ejemplo 12 Ensayos de suero

Para los dos protocolos siguientes, la estabilidad de las muestras de suero fue mejorada por la inclusión de un cóctel de inhibidor proteasa (Nº de catálogo de Sigma P8340) en una concentración del 2% (v:v).

A. Protocolo 1

A una placa de microtítulo revestida de anticuerpo monoclonal de anti-helicopéptido (I) (10B1) fueron añadidos 50 \muL (o 100 \muL) de estándar de calibración o muestra de suero, seguido por 100 \muL (o 50 \muL) de conjugado de péptido de colágeno-fosfatasa alcalina. La placa fue incubada a 4ºC durante 3 horas (o de la noche a la mañana) y lavada tres veces con tampón de lavado.

La detección colorimétrica fue llevada a cabo por la adición de 150 \muL de solución de sustrato PNPP (2 mg/mL), seguida por la incubación durante una hora a temperatura ambiente. Un volumen de 100 \muL de solución de paro de NaOH 1N fue añadida entonces a cada uno de los pocillos. La absorbancia entonces fue medida a 405 nm.

B. Protocolo 2

A una placa revestida de anticuerpo monoclonal 10B1 preparado como se describe en el Ejemplo 8C (etapas de 1 a 5) fueron añadidos 50 \muL/pocillo de anticuerpos de suero de conejo (no específicos) totales pH 2-tratados en tampón de ensayo DMSO del 2% (para reducir la unión no específica), seguido de 50 \muL de muestra de suero o estándar. El conjugado de péptido-fosfatasa alcalina (50 \muL) en K_{2}SO_{4} 0,5 M que contenía MgCl_{2} 4 mM y ZnCl_{2} 0,4 mM entonces fue añadido y la placa fue incubada a 4ºC durante 3 horas de la noche a la mañana.

Después de la incubación, la placa fue lavada tres veces con 300 \muL/pocillo de tampón de lavado. La detección colorimétrica fue llevada a cabo por la adición de 150 \muL de solución de sustrato PNPP (2 mg/mL), seguida por incubación durante una hora a temperatura ambiente. La solución de paro (100 \muL de NaOH 1N) fue añadida a cada uno de los pocillos y la absorbancia fue medida a 405 nm.

C. Resultados

Precisión. El ensayo ELISA a base de suero exhibió una alta precisión como se indica por los parámetros siguientes.

1. Coeficiente de variación intraensayo (CV) (n = 26-28 replicados): 2,8% (a 25 ng/mL); 7,74% (a 13,4 ng/mL); y 8,4% (a 8,14 ng/mL).

2. Coeficiente de variación interensayo (CV) (n = 2 replicados por experimento, 7 experimentos, 2 días): 8% (a 17,5 ng/mL); y 11% (a 76 ng/mL).

Linealidad. La linealidad media fue determinada como el promedio de 5 muestras de suero medido neto o diluído 1:2, 1:4 y 1:8 con tampón de ensayo. La recuperación de dilución de suero media era de 112 + 6% sobre las diluciones.

Recuperación de la respuesta. La recuperación de la respuesta media fue determinada por la recuperación de 15 muestras de suero con 10% en volumen de péptido sintético (I) a varias concentraciones (10 ng/mL, 30 ng/mL y 100 ng/mL). La recuperación de la respuesta media era de 93 \pm 3%.

Comportamiento clínico del ensayo de suero para detectar resorción ósea en varias poblaciones

Los ensayos descritos anteriormente fueron usados para determinar la cantidad de helicopéptido (I) en muestras de suero de varias poblaciones y para evaluar la eficacia del ensayo en la discriminación entre pacientes normales y con enfermedad.

Las muestras de suero fueron recogidas a partir de las poblaciones siguientes: (i) 24 mujeres sanas premenopaúsicas; (ii) 35 varones normales; (iii) 29 pacientes con enfermedad de Paget.

Basado en los resultados del ensayo, el nivel de suero medio de péptido/\alphal(I)^{620-633} en mujeres normales premenopaúsicas era de 17,8 \pm 4,6 ng/mL y 16,7 \pm 7,2 ng/mL para varones normales. También, el 62% (18/29) de los pacientes de Paget tenían niveles de péptido de suero que excedían del no0rmal medio en mujeres al menos 2 veces.

Estos resultados muestran que los helicopéptidos de la presente invención (i) son marcadores eficaces para determinar el estado en procesos de resorción de hueso, (ii) pueden usarse para detectar enfermedades óseas específicas y (iii) pueden ser empleado en una variedad de tipos de ensayo y configuraciones usando varias muestras biológicas fluidas tales como la orina y el suero.

Ejemplo 13 Tratamiento con pamidronate en cáncer de tiroides

A 42 pacientes con cáncer de tiroides con dosis represivas de tiroxina se les administraron 30 mg de pamidronate por infusión, o un placebo. El suero y las muestras de orina fueron recogidos para la línea de fondo (antes de la administración del fármaco) y 1, 2, 3 y 12 meses después del principio de la administración del fármaco y el nivel de helicopéptido fue determinado usando los protocolos de ensayo de los Ejemplos 9 y 12B. Un cambio mínimo significativo (MSC) fue definido como 2 veces la variabilidad a largo plazo intraindividual (basado en los niveles en la línea de fondo, 1, 2 y 3 meses en el placebo). Los resultados se muestran en la tabla 7:

TABLA 7

	Descenso Max. (%)	MSC (%) (=2 x %CV)	% de muestras que exceden MSC
péptido urinario	72 (n=21)	40 (n=21)	86 (18/21)
péptido de suero	17 (n=11)	34 (n=15)	27 (3/11)

TABLA 8

	Descenso Max. (%)	MSC (%) (=2 x %CV)	% de muestras que exceden MSC
péptido urinario	72 (n=21)	40 (n=21)	86 (18/21)
péptido de suero	17 (n=11)	34 (n=15)	27 (3/11)

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<110> Metra Biosystems, Inc.

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<120> Método de ensayo de Colágeno-Péptido

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<130> 5640-0020.41

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<140> no asignado

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<141> 1998-07-30

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<150> 60/054,369

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<151> 1997-07-31

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<160> 4

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> H. sapiens

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<220>

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<221> Péptido

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1)... (14)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> péptido aislado en orina humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (2)... (2)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> 4Hyp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (8)... (8)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> 4Hyp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (11)... (11)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> 4Hyp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Xaa Gly Asp Arg Gly Glu Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> H. sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> PÉPTIDO

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1)... (9)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> péptido aislado en orina humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (6)... (6)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> 4Hyp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (9)... (9)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> 4Hyp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Asn Ser Gly Glu Xaa Gly Ala Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> secuencia de péptido artificial correspondiente a SEQ ID NO: 1, a la que se ha añadido un residuo Cys al extremo N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3)... (3)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> 4Hyp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (9)... (9)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> 4Hyp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (12)... (12)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> 4Hyp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ala Xaa Gly Asp Arg Gly Glu Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> Péptido

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1)... (10)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> secuencia de péptido artificial correspondiente a SEQ ID NO: 2, a la que se ha añadido un residuo Cys al extremo N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (7)... (7)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> 4Hyp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (10)... (10)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> 4Hyp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 4

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\sa{Cys Gly Asn Ser Gly Glu Xaa Gly Ala Xaa}

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Claims (14)

1. Un método para determinar el nivel de fragmentos de colágeno del tipo I en una muestra fluida in vitro que comprende:

poner en contacto una muestra de fluido con un anticuerpo que es inmunoespecífico para un epítopo contenido en una de las secuencias de péptido siguientes:

(1) Ala-Hyp-Gly-Asp-Arg-Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ala (SEQ ID NO:1)

o

(2) Gly-Asn-Ser-Gly-Glu-Hyp-Gly-Ala-Hyp (SEQ ID NO:2)

en condiciones eficaces para formar un complejo entre dicho anticuerpo y fragmentos de polipéptido que contienen dicho epítopo en la muestra,

determinar el nivel de complejo formado, y

del nivel determinado de complejo, determinar el nivel de fragmentos de polipéptido que contienen el epítopo en la muestra.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal o monoclonal.

3. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que la muestra de fluido biológico es una muestra de orina, una muestra de sangre, un sobrenadante de cultivo celular o sobrenadante de cultivo de tejido.

4. El método de cualquier reivindicación precedente para uso en la medición del nivel de resorción de colágeno de hueso en un sujeto mamífero, en el que un nivel de fragmento determinado que es superior a un nivel de fragmento característico de sujetos normales es una indicación de que el sujeto tiene un trastorno de resorción
ósea.

5. El método de la reivindicación 4 para uso en el análisis de la presencia de una afección de resorción ósea seleccionada de osteoporosis, osteoartritis, hiperparatiroidismo, artritis reumatoide y una afección de cáncer de hueso metastásico.

6. El método de la reivindicación 4, para uso en el control del nivel de resorción de colágeno de hueso en un sujeto en respuesta a un tratamiento terapéutico.

7. Un anticuerpo que es inmunoespecífico para un epítopo contenido en una de las secuencias de péptido siguientes:

(1) Ala-Hyp-Gly-Asp-Arg-Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Ala (SEQ ID NO:1)

o

(2) Gly-Asn-Ser-Gly-Glu-Hyp-Gly-Ala-Hyp (SEQ ID NO:2)

8. El anticuerpo de la reivindicación 7, que es un anticuerpo monoclonal o policlonal.

9. El anticuerpo de la reivindicación 8, en el que el anticuerpo tiene una afinidad de unión para dicho epítopo de al menos 1 x 10^{7}/molar.

10. Un kit de prueba para medir el nivel de fragmentos de colágeno en kit en una muestra de fluido biológico, comprendiendo dicho kit un anticuerpo que es inmunoespecífico para uno de los epítopos definidos en la reivindicación 7 y un estándar inmunogénico que contiene el epítopo para el que el anticuerpo es inmunoespe-
cífico.

11. Un péptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2.

12. Un antígeno que comprende un péptido de la reivindicación 11 unido a un vehículo.

\newpage

13. Un antígeno de la reivindicación 12, en el que el vehículo es eficaz para facilitar una respuesta inmunológica frente al péptido.

14. Una línea celular inmortalizada que produce un anticuerpo conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9.