JP2000502182A

JP2000502182A - ドナー臓器由来分析物に基づく異種移植後のドナー臓器損傷の確認または検出方法

Info

Publication number: JP2000502182A
Application number: JP09521902A
Authority: JP
Inventors: ドイル，ジョン・マーティン; キルティ，コーマック・ジェラード
Original assignee: バイオトリン・インテレクチュアル・プロパティーズ・リミテッド
Priority date: 1995-12-08
Filing date: 1995-12-08
Publication date: 2000-02-22
Also published as: DE69525661D1; BR9510669A; PL328156A1; AU710668B2; ATE213835T1; DE69525661T2; CZ9801553A3; AU4122996A; CZ288968B6; PL180437B1; CA2239882C; EP0871881B1; EP0871881A1; ES2172601T3; WO1997022003A1; HUT78056A; CA2239882A1

Abstract

(57)【要約】異種移植後のドナー臓器損傷を示す生体液中のドナー臓器由来分析物の存在を確認しまたは検出し、それによってレシピエントにおける異種移植臓器損傷の識別を可能にする方法であって、（ａ）ドナー臓器由来分析物に特異的である；または（ｂ）該ドナー臓器由来分析物と交差反応できる抗体によって該分析物を捕捉し、そして該ドナー臓器由来分析物を直接的にまたは間接的に決定することを含む上記方法。この方法は、宿主由来とドナー由来の分析物とを区別し、それによって、このようなドナー由来分析物が同定されるやいなや適宜に矯正療法を行うことができるように、異種移植状態およびおそらくは拒絶反応の指標を得ることを可能にする。該方法は、in vivo および ex vivo 異種移植にあてはまる。

Description

【発明の詳細な説明】ドナー臓器由来分析物に基づく異種移植後のドナー臓器損傷の確認または検出方法技術分野本発明は、異種移植後のドナー臓器損傷を示す生体液中のドナー臓器由来分析物の存在を確認するまたは検出する方法に関する。背景技術現在、同種移植のためのドナー臓器（例えば、肝、腎および心臓）が世界的に不足しているが、この問題は、正常位移植手術の前に動物臓器を用いることによって一時的ではあるが克服できることが述べられ且つ実証されてきた。Chari,R. S.ら（The New England Journal of Medicine(1994);33巻,4号,234-237頁）は、 ex vivo ブタ肝灌流後の正常位肝移植で肝不全を治療した。一人の患者は１０日間安定にされた後、好結果の正常位肝移植を受けた。しかしながら、臓器の種間移植（異種移植）での従来の試みは、新たに移植された臓器がレシピエントに植込まれて何時間かの内に宿主免疫系によって圧倒され且つ拒絶される超急性拒絶反応として知られる現象のために成功していなかった。分子遺伝学の分野における最近の進歩は、トランスジェニック動物（主としてブタ）の開発を可能にしており、これらの臓器は、異なった種（すなわち、ヒト／非ヒト霊長類）に移入された場合に免疫原性がより少ないように遺伝子操作されている（Transplant New s(1995);5巻,9号）。この報告では、補体成分（例えば、Ｃｂ３複合体）の宿主活性化を妨げ、したがって、超急性拒絶反応を最小限にするように作用するトランスジェニック臓器中でのヒト「崩壊促進因子」遺伝子の発現によって免疫寛容が得られることが仮定されている。しかしながら、種内臓器移植（同種移植）の場合と同様、異種移植片拒絶は、なお移植医が取り組むべき問題であり、そして更に、異なった種からの組織が移植片レシピエント内に存在するという明らかな事実によって複雑になる。慣用的な肝機能試験は、ドナーとレシピエント（例えば、ブタとヒト）との臓器由来分析物を区別することができない。例えば、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）／アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）測定は、ブタとヒトとの酵素を区別しないので、移植後の酵素源を決定するいずれの試みも役立たせない。同様の状況は、腎臓異種移植分析の場合にあてはまると考えられる。実際に、現在のところ、腎臓の完全さについて一般的に許容されるタンパク質マーカーは存在していない。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、主として、等電点によって規定されるアルファ（αＧＳＴ）、ミュー（μＧＳＴ）、パイ（πＧＳＴ）およびシータクラス（θＧＳＴ）イソ型から成るタンパク質の多重遺伝子族を含み、そして主としてグルタチオンに対する結合によるある範囲の生体内異物の解毒化に関与している（Beckett,G.J.およびHayes,J.D.，Advances in Clinical Che mistry(1993);30,281-380）。ヒトの場合、αＧＳＴの比較的高い肝中レベルおよび短い血漿半減期（約１時間）と共に、均一な肝中分布は、この酵素が、移植後の肝状態および薬物誘導肝損傷を示すものとしてアミノトランスフェラーゼよりも感受性であることを意味する。ＥＰ−Ａ0640145号は、肝移植レシピエントにおける拒絶反応の初期診断の助けとなる且つ血漿または血清トランスアミナーゼが不存在であるかまたはそれが何等かの変化をする前の患者からの血漿または血清αＧＳＴの増加を測定することを含む方法を開示している。パイグルタチオンＳ−トランスフェラーゼは、肝内の胆管上皮細胞の細胞質中にあり、そしてホモ二量体の形でのみ存在すると考えられる。この不均一な肝臓内ＧＳＴ分布は、いろいろなイソ酵素がいろいろの肝部分で独特の in vivo 機能を有することを示唆し、したがって、血漿または胆汁ＧＳＴレベルの測定は、個々の肝状態の監視を容易にするであろうと結論することができる。同様の独特の分布は腎臓組織に関しても存在し、その場合、αＧＳＴはネフロンの近位細管部分にあり且つπＧＳＴは遠位細管部分に限られている（Champbell,J.A.H.ら， Cancer（フィラデルフィア）(1991);67,1608-1613）。最近の報告では、ヒト尿中のα／πＧＳＴの同時検出を用いて、シクロスポリンＡ腎毒性と移植片拒絶反応とを、それぞれの組織傷害の部位特異的性状によってそれぞれ区別しうることが述べられた（Sundberg,A.G.M.ら，Nephron,(1994):67,308-316）。したがって、移植臓器損傷を検出する手段として、または実際に、宿主および／または移植臓器の損傷を区別するために、宿主と移植片とに由来する分析物を識別する方法が必要とされている。発明の開示本発明は、異種移植後のドナー臓器損傷を示す生体液中のドナー臓器由来分析物の存在を確認しまたは検出し、それによって前記レシピエントにおける異種移植臓器損傷の識別を可能にする方法であって、（ａ）ドナー臓器由来分析物に特異的である；または（ｂ）該ドナー臓器由来分析物と交差反応できる抗体によって該分析物を捕捉し、そしてそのドナー臓器由来分析物を直接的にまたは間接的に決定することを含む上記方法を提供する。したがって、本発明による方法は、宿主由来とドナー由来の分析物とを区別し、それによって、以下で更に詳細に示されるように、このようなドナー由来分析物がレシピエントの生体液中で同定されるやいなや適宜に矯正療法を行うことができるように、異種移植状態およびおそらくは拒絶反応の指標を得ることを可能にする。本明細書中の生体液とは、例えば、胆汁、血漿、血清および尿などの体液、更には、組織支持培地および灌流液を意味する。本明細書中の生体液は、一般的に基質とも称される。本明細書中のドナー臓器由来とは、臓器自体および組織並びにそれらの構成部分であるまたはそれらに由来する細胞を意味する。同様に、本明細書中のドナー材料とは、臓器自体および組織並びにそれらの構成部分であるまたはそれらに由来する細胞を意味する。したがって、例として、ドナー材料は、肝臓、葉などの肝臓の一部分または肝細胞でありうる。典型的に、肝細胞の場合、肝細胞カートリッジが用いられるであろう。概して、レシピエントは、ヒトまたは非ヒト霊長類であろう。したがって、ドナー材料は、好ましくは、生理学的におよび生化学的にヒトと類似している非ヒト霊長類またはブタ(lobe)などの動物に由来するであろう。ドナー動物は、トランスジェニック動物でありうる。異種移植は、in vivo または ex vivo でありうる。異種移植される臓器は、適当に、心臓、腎臓または肝臓である。好ましくは、ドナー臓器由来分析物は、タンパク質、更に具体的には、酵素である。好ましくは、ドナー臓器由来分析物は、ドナー特異的であろう。対応するレシピエント分析物が存在する場合、好ましくは、そのレシピエント分析物は、該ドナー臓器由来分析物との僅かな相同性を有する。しかしながら、そのドナー臓器由来分析物は、対応するレシピエント分析物と高度の相同性（例えば、８０％より大の相同性）を有することがありうるし、そしてなお以下で記載のように本発明によって検出可能である。好ましい酵素は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、更に具体的には、α ＧＳＴである。更に、好ましくは、捕捉されたドナー臓器由来分析物の決定は、免疫検定形式によって行われる。適当な免疫検定形式には、酵素免疫検定が含まれる。したがって、ヒト生体液中のブタαＧＳＴの場合、ブタαＧＳＴを、固相に対して直接的にまたは間接的に結合したＩｇＧ［抗ブタαＧＳＴ］によって、また或いは、交差反応性を示すＩｇＧ［抗ヒトαＧＳＴ］によって捕捉することができる。本発明者は、ブタαＧＳＴに極めて特異的であるウサギ多クローン性ＩｇＧ［抗ブタαＧＳＴ］を生じさせた。高濃度のヒトαＧＳＴの存在下のような、抗体がヒトαＧＳＴとの僅かな（約５〜１０％）交差反応性をも示す場合、そのヒト αＧＳＴは別個に測定されうるし、そして以下で記載のように、ブタαＧＳＴの量を正しく計算することができる。本発明者は、以下の実施例３で記載のように、ブタαＧＳＴとほぼ１００％の交差反応性を有する単クローン性抗ヒトαＧＳＴを同定した。酵素免疫検定は、以下の実施例１および２でそれぞれ記載のように、サンドイッチ形式または半競合的酵素免疫検定でありうる。本発明のもう一つの態様において、ドナー材料の異種移植前の生存能力について試験する。したがって、本発明はまた、上述の定義の方法を用いることにより、ドナー材料を灌流する生体液中のドナー臓器由来分析物を測定することによってドナー材料の生存能力を試験することを可能にする。本発明のこの態様において、本発明による方法に加えて、既知のいずれの方法によっても分析物を検出することができる。例えば、臓器由来分析物が酵素である場合、その酵素の基質の使用に基づく酵素検定を用いて、該臓器由来分析物を検出することができる。本発明はまた、本明細書中上記の本発明による方法を実施するための１種類またはそれ以上の成分を含有する試験キットまたはパックを提供する。図面の簡単な説明添付図面において、図１は、実施例１のサンドイッチ酵素免疫検定の略図である；図２は、実施例１のブタαＧＳＴについてのサンドイッチ免疫測定酵素免疫検定によるαＧＳＴ濃度（μｇ／Ｌ）に対する４５０／６３０ｎｍでの吸光度のプロットである；図３は、実施例２の半競合的酵素免疫検定の略図である；図４は、実施例２のブタαＧＳＴについての競合的免疫測定酵素免疫検定によるαＧＳＴ濃度（μｇ／Ｌ）に対する４５０／６３０ｎｍでの吸光度のプロットである；図５は、ヒトおよびブタαＧＳＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である；図６は、ＩｇＧ［抗ヒトαＧＳＴ］およびヤギＩｇＧ［抗ウサギＩｇＧ］−ＨＲＰ結合体を用いるヒトおよびブタαＧＳＴのイムノブロット分析である；図７は、ＩｇＧ［抗ブタαＧＳＴ］およびヤギＩｇＧ［抗ウサギＩｇＧ］−ＨＲＰ結合体を用いるヒトおよびブタαＧＳＴのイムノブロット分析である；そして図８は、ＩｇＧ［抗ヒトαＧＳＴ］およびヤギＩｇＧ［抗マウスＩｇＧ］−ＨＲＰ結合体を用いるヒトおよびブタαＧＳＴのイムノブロット分析である。発明の実施態様本発明を次の実施例によって更に詳しく説明する。製造例ＡブタαＧＳＴの精製アルファＧＳＴを、アフィニティークロマトグラフィーおよびクロマトフォーカシング（ｐＨ９．５〜６．０）によってブタ肝臓から精製した。精製手順の正確な詳細は次の通りである。ａ．ブタ肝臓３０ｇを、均一化緩衝液中において肝臓１部対緩衝液３部の比率で、Waring（Waring は商標である）ブレンダーを用いて２分間均一化した。均一化緩衝液は、次の組成を有した。１０ｍＭトリス−ＨＣl ２５０ｍＭスクロース５ｍＭＥＤＴＡｐＨ７．８２μｇ／ｍｌロイペプチン２μｇ／ｍｌペプスタチンｂ．肝ホモジネートを１００００ｇで６０分間遠心分離した。ｃ．次に、その上澄みを、１０ｍＭトリスｐＨ９．１中で予め平衡されたグルタチオン（ＧＳＨ）−セファロースアフィニティーカラム上に充填した。平衡緩衝液を再度加えて、非結合タンパク質を溶離した。最後に、５ｍＭＧＳＨ含有５０ｍＭトリスｐＨ９．１を用いて、結合ＧＳＴをアフィニティーカラムから溶離した。ｄ．次に、溶離した材料を２５ｍＭエタノールアミンｐＨ９．５に対して透析し、そしてクロマトフォーカシングカラム（Pharmacia によって供給されたＰＢＥ94）に入れた。溶離緩衝液は、製造者の支持にしたがって調製された Polyb uffer 96（Po1ybuffer 96 は商標である）であった。製造例Ｂ抗体生産および精製：精製ブタαＧＳＴを、下記に与えられた日程にしたがってニュージーランドホワイトウサギに皮下（s.c.）注射し、そして血清の抗αＧＳＴ反応性について評価した。ＩｇＧ［抗ブタαＧＳＴ］力価が、半定量的ドットブロット分析によって測定したところ充分になったら、その被験動物から全採血し、そして血清を集めた。全ＩｇＧをウサギ血清からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、そして微量滴定プレートコーティング（半競合的ＥＩＡ−実施例２）およびビオチニル化（サンドイッチＥＩＡ−実施例１）両方に用いた。腹水としての単クローン性ＩｇＧ［抗ヒトαＧＳＴ］は、ナイメーヘン、オランダの大学病院から入手され且つ使用前に更に精製されなかった。免疫感作計画（概略）：１日目：ウサギの耳からプレ血清５ｍｌの試験採血を行った後、ブタαＧＳＴ抗原０．５ｍｌ（１００μｇ）を等容量のフロイント完全アジュバントと混合した。その抗原およびアジュバントを均一化して、確実に充分なエマルジョンとした。次に、この混合物を、予め毛を剃り落とされたウサギの背面上の多数の部位に皮下注射した。２８日目：ウサギの耳から血清５ｍｌの試験採血を行った後、抗原０．５ｍｌ（１００μｇ）を等容量のフロイント完全アジュバントと混合した。その抗原およびアジュバントを均一化して、確実に充分なエマルジョンとした。次に、この混合物を、ウサギの背面上の多数の部位に皮下注射した。４２日目：血液１０ｍｌの試験採血をウサギの耳から行った。５６日目：２回目のブースター投与をウサギに対して２８日目について記載のように与えた。７０日目：血液１０ｍｌの試験採血をウサギの耳から行った。力価が充分に高くなった時点でウサギを屠殺し、そして可能な限り多量の血液を集めた。製造例Ｃイムノブロット法下記の実施例で用いるための多クローン性および単クローン性ＩｇＧ全部を、ヒトおよびブタαＧＳＴ両方に対する反応性および交差反応性についてそれぞれ次のイムノブロット組合わせによって検査した。（ａ）ウサギＩｇＧ［抗ヒトαＧＳＴ］を用いて、固定されたヒトおよびブタ αＧＳＴを含有するニトロセルロース膜をプローブした。（ｂ）ウサギＩｇＧ［抗ブタαＧＳＴ］を用いて、固定されたヒトおよびブタ αＧＳＴを含有するニトロセルロース膜をプローブした。（ｃ）ネズミＩｇＧ［抗ヒトαＧＳＴ］を用いて、固定されたヒトおよびブタ αＧＳＴを含有するニトロセルロース膜をプローブした。イムノブロット検出に用いられた方法は、次の通りであった。１．ヒトおよびブタαＧＳＴ両方（０．５μｇ／トラック）を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動させ且つ分子量マーカーを包含させた。２．電気泳動後、そのポリアクリルアミドゲルを切取り、そして半分をタンパク質について染色し、その残りをニトロセルロース上への電気泳動転移に用いた。３．電気泳動転移後、そのニトロセルロース膜を、０．０５％（ｗ／ｖ）トゥイーン２０含有リン酸緩衝溶液（ＰＢＳＴ）すなわち遮断用緩衝液中５％（ｗ／ｖ）Marvel（Marvel は商標である）で１時間遮断した。４．次に、次の溶液を調製した。（ｉ）ＰＢＳＴ中１％（ｗ／ｖ）Marvel 中のウサギＩｇＧ［抗ヒトαＧＳＴ］（ii）ＰＢＳＴ中１％（ｗ／ｖ）Marvel 中のウサギＩｇＧ［抗ブタαＧＳＴ］（iii）ＰＢＳＴ中１％（ｗ／ｖ）Marvel 中のネズミＩｇＧ［抗ヒトαＧＳＴ］そしてこれらを膜に対して加え、いったん遮断緩衝液をデカントした。抗体溶液とのインキュベートを１時間続けた。５．次に、ニトロセルロース膜をＰＢＳＴ中で洗浄した（各５分間２回）。６．次に、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ結合体を製造し（ＰＢＳＴ中１％（ｗ／ｖ）Marvel 中で１／１０００）、そして上の４（ｉ）および（ii）に対して加えた。抗ネズミＩｇＧ−ＨＲＰ結合体も製造し（１／１０００）、そして上の４（iii）に対して加えた。免疫検出に用いられた抗種（ウサギ／マウス）結合体は、Bio-Rad Laboratories Limited から入手された。７．抗種結合体との１時間のインキュベーション後、試薬を捨て、そして上の５の場合と同様に膜を洗浄した。８．次に、ジアミノベンジジン基質を製造し、そして膜に対して加えた。正の反応は、ニトロセルロース膜上の褐色沈降によって示された。製造例ＤブタαＧＳＴ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体合成： αＧＳＴ−ＨＲＰ結合体を、チオエーテル結合法を用いて合成した。反応性マレイミド基を、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン１−カルボキシレート）を用いてαＧＳＴ分子上に導入し、そしてマスキングされたスルフィドリル基をＨＲＰに対して結合した（Duncan,R.J.S.ら（1983）；Anal.Biochem.132,68-73）。反応性スルフィドリル基を生じるデマスキング工程後、マレイミドで活性化されたαＧＳＴおよびＨＲＰ−ＳＨを一緒に混合し且つ４．５時間反応させた。共有チオエーテル結合によって形成されて得られたαＧＳＴ−ＨＲＰ結合体を５０％（ｖ／ｖ）グリセロールに対して加え、そして実施例２の半競合的ＥＩＡで用いるために−２０℃で貯蔵した。製造例ＥＩｇＧ［抗ブタαＧＳＴ］のビオチニル化ビオチニル化されたＩｇＧ［抗ブタαＧＳＴ］は、精製αＧＳＴでのウサギの免疫感作（製造例Ｂで記載のように）によって予め生成された精製多クローン性ＩｇＧ［抗ブタαＧＳＴ］をアルカリ性条件下でＮ−ヒドロキシスクシンイミド −ビオチン（ＮＨＳ−ビオチン）に対してカップリングさせることによって製造された。次に、未反応ＮＨＳ−ビオチンを広範囲にわたる透析によって除去し、そしてビオチニル化ＩｇＧを分別し且つ必要とされるまで−２０℃で凍結貯蔵した。実施例１サンドイッチ酵素免疫検定用いられた手順は、図１で図示されている。ａ． Nunc Maxisorp（Nunc Maxisorp は商標である）微量滴定プレートを、ヤギＦ（ａｂ）₂フラグメント［抗マウスＩｇＧ］によって固定されたネズミ単クローン性ＩｇＧ［抗ヒトαＧＳＴ］（製造例Ｂで論及された）で被覆した。この抗体コーティング法は、Ｍａｂ結合部位を位置付けるのに役立ち、そして更に、付着、すなわち、捕捉抗体の誘導変性を最小限にすることによって検定感度を向上させる。微量滴定プレートを、タンパク質／スクロース溶液で遮断した。ｂ．死亡直後に得られた、製造例Ａで記載のように肝臓から精製され且つ２〜８℃または−２０℃で貯蔵されたブタαＧＳＴを検定標準物質として用いた。ｃ．ビオチニル化ＩｇＧ［抗ブタαＧＳＴ］結合体を用いて、捕捉された／固定されたαＧＳＴの検出を促進した。ｄ．次に、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体を用い、テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ）の使用を伴って、完全な抗原サンドイッチ複合体を検出した。ｅ．酵素反応をＩＮＨ₂ＳＯ₄の添加によって停止させ、そして吸光度を４５０ｎｍにおいて基準波長として６３０ｎｍを用いて測定した。色の純度はαＧＳＴ濃度に比例するので、濃度（μｇ／Ｌ）に対するＡ_450/630nmのプロットを作成した後、未知試料の濃度を決定することができる（図２を参照されたい）。全検定時間は３．５時間未満であった。実施例２半競合的酵素免疫検定用いられた手順は、図３で図示されている。ａ．多クローン性ＩｇＧの直接コーティングは、おそらくは微量滴定プレートに対する結合時のＩｇＧ変性のためにαＧＳＴ捕捉を促進しないことが判ったので、この場合、Nunc Maxisorp プレートを、プロテインＡによって固定された多クローン性ＩｇＧ［抗ブタαＧＳＴ］で被覆した。ｂ．この場合、ＨＲＰで標識されたαＧＳＴを結合体として用い、そしてマイクロウェルに対して、続いて未標識の標準物質／試料に対して加えた。この方法で、ＨＲＰ標識および未標識αＧＳＴ間に競合型反応を生じさせた。ｃ．通常は６０分間の適当なインキュベーション時間後、微量滴定プレートを洗浄し、そしてＴＭＢ基質を加えた。ｄ．酵素反応を１ＮＨ₂ＳＯ₄の添加によって停止させ、そして吸光度を４５０ｎｍにおいて基準波長として６３０ｎｍを用いて測定した。色の強度はブタ αＧＳＴ濃度に反比例するので、濃度（μｇ／Ｌ）に対してＡ_450/630nmをプロットした後、未知試料の定量を行う（図４を参照されたい）。実施例３免疫検定試薬の純度の評価イムノブロット法は、製造例Ｃで記載の手順にしたがって行われた。結果を図５〜８で示す。図５〜８のトラックの略語一覧：トラック１：分子量マーカー。トラック２：ヒトαＧＳＴ（０．５μｇ）。トラック３：ブタαＧＳＴ（０．５μｇ）。図５は、ウサギへの免疫感作前のヒトおよびブタαＧＳＴ両方の純度（それぞれに単一バンドで示される）を示し、低下した検定特異性の原因となりうる何等かの他のヒトまたはブタ由来タンパク質が存在しないことを確証する。抗体反応性についてのイムノブロット分析は、ＩｇＧ［抗ヒトαＧＳＴ］がヒトαＧＳＴに極めて特異的であり、しかも、弱いブタαＧＳＴシグナル強度に相対して強いヒトαＧＳＴシグナル強度によって示されるように、ブタαＧＳＴとの交差反応性をほとんど示さない（図６）ことを示している。Biotrin International Limi ted，マウント・メリオン，ダブリン州，アイルランドによって HEPKIT という名称で市販されたヒトαＧＳＴ（αＧＳＴ）ｈ特異的酵素免疫検定においてブタ αＧＳＴ（αＧＳＴ）ｐ反応性の欠如によって支持された知見。結果を表１で示すが、これは、Biotrin HEPKIT でのαＧＳＴｐ反応性の評価を示す。ａＧＳＴｐを HEPKIT で検定する場合、交差反応性が存在しないことは明らかである。ＰＣ=正対照。この事実の意味は、それが、ヒトαＧＳＴ定量に関する酵素免疫検定はヒトα ＧＳＴの検出に特異的であるということを意味しているので極めて重要である。したがって、ブタαＧＳＴもまた測定され得る試料中にヒトαＧＳＴが存在する場合、交差混入することなくブタ抗原から特異的に検出することができる。ヒト αＧＳＴ酵素免疫検定でのこの交差反応性の欠如、および強いブタαＧＳＴシグナル強度に相対して弱いヒトαＧＳＴシグナル強度によって示されるように、ＩｇＧ［抗ブタαＧＳＴ］とヒトαＧＳＴとの間に約５〜１０％の交差反応性が示されるという知見（図７）は、HEPKIT 酵素免疫検定でのヒトαＧＳＴおよびブタαＧＳＴに関する酵素免疫検定でのブタαＧＳＴの同時定量を用いて、ブタα ＧＳＴ免疫検定における任意のヒトαＧＳＴ寄与分を補正できることを意味する。例えば、試料が、次の読み、検定 αＧＳＴ（μｇ／Ｌ）ブタＥＩＡ（ブタαＧＳＴ）１００００ Hepkit ＥＩＡ（ヒトαＧＳＴ）１０００を与える場合、ブタＥＩＡでのヒトαＧＳＴの交差反応性を約７％と仮定すると、ヒトαＧＳＴは、ブタαＧＳＴ読みに対して１０００／１００Ｘ７＝７０μｇ／Ｌを与えることを意味する。したがって、１００００−７０＝９９３０μｇ／ＬのブタαＧＳＴが存在する。更に、上述のように、ネズミＩｇＧ［抗ヒトαＧＳＴ］とブタαＧＳＴとの間の広範囲にわたる交差反応性は、それぞれのバンド／シグナルの比較しうる強度によって示されるように、図８で明らかに示される。この現象は、ブタαＧＳＴに関する実施例１のサンドイッチ免疫検定においてこの抗体を「捕捉」またはプレートコーティング抗体として用いることによって利用される。実施例４検定特異性実施例１および２の検定は、主として、非ブタ生体液中のブタαＧＳＴを検出するのに用いられるので、その検定感度および特異性は、次のマトリックス中(m atrices)に存在するブタαＧＳＴを用いて評価されることが不可欠である。 − ヒト尿 − ヒト血清 − ヒト血漿 − ヒト胆汁 − 組織支持培地この分析を行うために、ブタαＧＳＴを上の全部のマトリックス中に「スパイクさせ（spiked）」た後、実施例１および２の免疫検定で検定した。定量的αＧＳＴ検出に加えて、検定直線性（平行度）もまた検定感度と同様に評価された。更に、検定特異性がブタαＧＳＴの検出だけを促進すること、および免疫検定においていずれのヒトαＧＳＴもほとんど妨害を引き起こさないということもまた必要である。この目的のために、ヒトαＧＳＴの潜在的交差反応性は、ブタαＧＳＴ含有試料を種々の量のヒトαＧＳＴと混合して潜在的交差反応性を評価することによって調べられた。両方のイソ酵素の間にこのような有意の配列相同性が存在するとすれば、これは取るに足らない問題ではなく、ヒトαＧＳＴとの潜在的交差反応性に関する抗血清［抗ブタαＧＳＴ］の広範囲にわたる分析によってしか克服できない。サンドイッチおよび半競合的酵素免疫検定によって測定される種々の試料マトリックス中のブタαＧＳＴの定量の結果を表２で示す。略語一覧：１． Sand：サンドイッチ酵素免疫検定。２． comp：半競合的酵素免疫検定。３．競合的検定範囲（０〜１０００μｇ／Ｌ）のために１／５に希釈された後、サンドイッチ検定（範囲０〜４０μｇ／Ｌ）のために１／１００まで希釈された試料。４．ＭＥＭおよびＴＣ-100：組織支持培地。表２から、ブタαＧＳＴの定量的回収は、試験された全部のマトリックス中で達成できることが明らかである。明らかに、αＧＳＴは、異種移植肝および腎臓状態を助長するように、それぞれヒト血漿および尿の両方で検出可能であることが不可欠であり、これがまさにその場合である。しかしながら、血漿マトリックスが、おそらくは異常な読みを引き起こす固定されたプロテインＡとのＩｇＧ相互作用のために、半競合的免疫検定形式と不適合であるらしいことは注目に値する。これは別として、他の液は全て、両方の検定形式と適合しうる考えられる。これらの系は、概して、慣用的な支持培地中で維持されるので、特に興味深いのは、移植前異種移植片評価または単離ブタ肝細胞生存能力分析の可能性を助長すべき組織支持培地（カートリッジ中に存在する）中のブタαＧＳＴを検出する能力である。更に、この基質／試料適合性は、ex vivo ドナー臓器の維持に用いられた培地中のαＧＳＴの検出を大いに促進するはずであり、それによってドナー臓器（例えば、肝）は体外で培地と接触して維持される。実施例５ブタαＧＳＴサンドイッチ酵素免疫検定におけるヒトαＧＳＴ妨害の評価実施例１のブタαＧＳＴサンドイッチ酵素免疫検定におけるヒトαＧＳＴ妨害の評価を行った。増加した吸光度値によって測定したところ、２５μｇ／Ｌ未満のマイクロウェル濃度（希釈試料中１／５希釈での１２５μｇ／Ｌ試料濃度に等しい）では、明らかな検定妨害はなかった。結果を表３で示す。略語一覧： αＧＳＴｐ − ブタαＧＳＴ αＧＳＴｈ − ヒトαＧＳＴ表３で示された結果は、ブタαＧＳＴの検出に対する免疫検定の特異性を示している。このデータから、ヒトαＧＳＴは、ヒト血清および尿αＧＳＴそれぞれの標準の上限の１５倍および６倍の値である１２５μｇ／Ｌ（２５μｇ／Ｌｘ５）と同程度に高い試料濃度でも酵素免疫検定を妨げないことが明らかである。ヒトαＧＳＴのより高いレベル（＞２５０μｇ／Ｌ；５０μｇ／Ｌｘ５）では、若干の妨害が起こることが明らかであり、ヒトαＧＳＴとＩｇＧ［抗ブタαＧＳＴ］との間には約５〜１０％の交差反応性が存在することが計算された。しかしながら、ヒトおよびブタ両方のαＧＳＴに関する定量的免疫検定でのαＧＳＴレベルの同時測定は、存在するヒトαＧＳＴの正確な量を計算することを可能にし、したがって、ヒト生体液中のブタαＧＳＴ定量の際に考慮される。本発明による免疫検定が、ブタまたはブタ臓器に関係した in vitro または i n vivo 毒物学研究に関する場合と同様、ブタ由来生体液中のブタＧＳＴの検出に用いることもできるということは更に注目されるべきである。ブタおよびヒト生理学／生化学は極めて類似しているので、したがって、ブタはしばしば、ヒトにおける薬物毒性を予測する動物モデルとして用いられることが知られていることから、この知見は有意義である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年１月２８日（１９９８．１．２８）【補正内容】同様の独特の分布は腎臓組織に関しても存在し、その場合、αＧＳＴはネフロンの近位細管部分にあり且つπＧＳＴは遠位細管部分に限られている（Champbell, J.A.H.ら，Cancer（フィラデルフィア）(1991);67,1608-1613）。最近の報告では、ヒト尿中のα／πＧＳＴの同時検出を用いて、シクロスポリンＡ腎毒性と移植片拒絶反応とを、それぞれの組織傷害の部位特異的性状によってそれぞれ区別しうることが述べられた（Sundberg,A.G.M.ら，Nephron,(1994):67,308-316）。したがって、移植臓器損傷を検出する手段として、または実際に、宿主および／または移植臓器の損傷を区別するために、宿主と移植片とに由来する分析物を識別する方法が必要とされている。発明の開示本発明は、異種移植後のドナー臓器損傷を示す実質的に非ドナーの生体液中のドナー臓器由来分析物の存在を、対応するレシピエント分析物の存在下または不存在下において確認しまたは検出し、それによって前記レシピエントにおける異種移植臓器損傷の識別を可能にする方法であって、（ａ）ドナー臓器由来分析物に特異的である；または（ｂ）該ドナー臓器由来分析物と交差反応できる抗体によって該ドナー分析物を捕捉しまたは検出し、そしてそのドナー臓器由来分析物を直接的にまたは間接的に決定することを含む上記方法を提供する。したがって、本発明による方法は、宿主由来とドナー由来の分析物とを区別し、それによって、以下で更に詳細に示されるように、このようなドナー由来分析物がレシピエントの生体液中で同定されるやいなや適宜に矯正療法を行うことができるように、異種移植状態およびおそらくは拒絶反応の指標を得ることを可能にする。本明細書中の生体液により、例えば、胆汁、血漿、血清および尿などの体液、更には、組織支持培地および灌流液を意味する。本明細書中の生体液は、一般的に基質とも称される。本明細書中のドナー臓器由来により、臓器自体および組織並びにそれらの構成部分であるまたはそれらに由来する細胞を意味する。同様に、本明細書中のドナー材料により、臓器自体および組織並びにそれらの構成部分であるまたはそれらに由来する細胞を意味する。したがって、例として、ドナー材料は、肝臓、葉などの肝臓の一部分または肝細胞でありうる。典型的に、肝細胞の場合、肝細胞カートリッジが用いられるであろう。概して、レシピエントは、ヒトまたは非ヒト霊長類であろう。したがって、ドナー材料は、好ましくは、生理学的におよび生化学的にヒトと類似している非ヒト霊長類またはブタなどの動物に由来するであろう。ドナー動物は、トランスジェニック動物でありうる。異種移植は、in vivo または ex vivo でありうる。異種移植される臓器は、適当に、心臓、腎臓または肝臓である。好ましくは、ドナー臓器由来分析物は、タンパク質、更に具体的には、酵素である。本発明のもう一つの態様において、ドナー材料の異種移植前の生存能力について試験する。したがって、本発明はまた、以下に定義の方法を用いることにより、ドナー材料を灌流する生体液中のドナー臓器由来分析物を測定することによってドナー材料の生存能力を試験することを可能にする。本発明のこの態様において、本発明による方法に加えて、既知のいずれの方法によっても分析物を検出することができる。例えば、臓器由来分析物が酵素である場合、その酵素の基質の使用に基づく酵素検定を用いて、該臓器由来分析物を検出することができる。本発明はまた、本明細書中上記の本発明による方法を実施する場合に用いるための試験キットまたはパックを提供する。図面の簡単な説明添付図面において、図１は、実施例１のサンドイッチ酵素免疫検定の略図である；図２は、実施例１のブタαＧＳＴについてのサンドイッチ免疫測定酵素免疫検定によるαＧＳＴ濃度（μｇ／Ｌ）に対する４５０／６３０ｎｍでの吸光度のプロットである；図３は、実施例２の半競合的酵素免疫検定の略図である；図４は、実施例２のブタαＧＳＴについての半競合的免疫測定酵素免疫検定によるαＧＳＴ濃度（μｇ／Ｌ）に対する４５０／６３０ｎｍでの吸光度のプロットである；請求の範囲１．異種移植後のドナー臓器損傷を示す実質的に非ドナーの生体液中のドナー臓器由来分析物の存在を、対応するレシピエント分析物の存在下または不存在下において確認しまたは検出し、それによってレシピエントにおける異種移植臓器損傷の識別を可能にする方法であって、（ａ）ドナー臓器由来分析物に特異的である；または（ｂ）該ドナー臓器由来分析物と交差反応できる抗体によって該ドナー分析物を捕捉しまたは検出し、そして該ドナー臓器由来分析物を直接的にまたは間接的に決定することを含む上記方法。２．レシピエントがヒトである請求項１に記載の方法。３．レシピエントが非ヒト霊長類である請求項１に記載の方法。４．ドナー臓器がブタに由来する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。５．臓器が腎臓である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。６．臓器が肝臓である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。７．ドナー臓器由来分析物がタンパク質である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。８．ドナー臓器由来分析物が酵素である請求項７に記載の方法。９．酵素がグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である請求項８に記載の方法。１０．酵素がαＧＳＴである請求項９に記載の方法。１１．請求項４に依る場合、抗体が多クローン性抗ブタαＧＳＴである請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。１２．請求項２に依る場合、抗体が、ブタαＧＳＴとほぼ１００％交差反応性を示す抗ヒトαＧＳＴである請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。１３．存在する任意のヒトαＧＳＴを、別の検定システムにおいて特異的抗ヒトαＧＳＴを用いて検出する請求項１１に記載の方法。１４．ドナー材料の異種移植前の生存能力について試験する請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。１５．請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を実施する場合に用いるための試験キットまたはパック。

Claims

【特許請求の範囲】１．異種移植後のドナー臓器損傷を示す生体液中のドナー臓器由来分析物の存在を確認しまたは検出し、それによってレシピエントにおける異種移植臓器損傷の識別を可能にする方法であって、（ａ）ドナー臓器由来分析物に特異的である；または（ｂ）該ドナー臓器由来分析物と交差反応できる抗体によって該分析物を捕捉し、そして該ドナー臓器由来分析物を直接的にまたは間接的に決定することを含む上記方法。２．レシピエントがヒトである請求項１に記載の方法。３．レシピエントが非ヒト霊長類である請求項１に記載の方法。４．ドナー臓器がブタに由来する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。５．臓器が腎臓である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。６．臓器が肝臓である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。７．ドナー臓器由来分析物がタンパク質である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。８．ドナー臓器由来分析物が酵素である請求項７に記載の方法。９．酵素がグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である請求項８に記載の方法。１０．酵素がαＧＳＴである請求項９に記載の方法。１１．請求項４に依る場合、抗体が抗ブタαＧＳＴである請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。１２．請求項２に依る場合、抗体が、ブタαＧＳＴとほぼ１００％交差反応性を示す抗ヒトαＧＳＴである請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。１３．ドナー材料の異種移植前の生存能力について試験する請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。１４．請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を実施するための１種類またはそれ以上のに成分を含有する試験キットまたはパック。