CZ288968B6

CZ288968B6 - Způsob určování nebo zjią»ování poąkození dárcovského orgánu po xenotransplantaci pomocí analýzy látek pocházejících z orgánu dárce

Info

Publication number: CZ288968B6
Application number: CZ19981553A
Authority: CZ
Inventors: John Martin Doyle; Cormac Gerard Kilty
Original assignee: Biotrin Intellectual Properties Limited
Priority date: 1995-12-08
Filing date: 1995-12-08
Publication date: 2001-10-17
Also published as: EP0871881A1; CA2239882A1; PL180437B1; ES2172601T3; CZ9801553A3; HUT78056A; DE69525661T2; CA2239882C; BR9510669A; AU4122996A; JP2000502182A; PL328156A1; ATE213835T1; EP0871881B1; WO1997022003A1; DE69525661D1; AU710668B2

Abstract

Zp sob ur ov n nebo zji ov n p° tomnosti analytu d rcovsk ho org nu ve v podstat ned rcovsk biologick tekutin , za p° tomnosti nebo nep° tomnosti odpov daj c ho analytu p° jemce, kter² ukazuje na po kozen d rcovsk ho org nu po xenotransplantaci, a umo uje identifikovat po kozen xenotransplant tu u p° jemce, zahrnuje zachycen nebo detekov n uveden ho analytu d rce pomoc protil tky, kter je bu to a) specifick pro analyt d rcovsk ho org nu a nevykazuje zk° enou reakci s odpov daj c m homologick²m analytem p° jemce; nebo b) schopn zk° en reakce s uveden²m analytem d rcovsk ho org nu, kde jej reaktivity s analytem d rcovsk ho org nu a s homologick²m analytem p° jemce jsou kvantitativn odli iteln , a na p° m m nebo nep° m m stanoven analyzovan ho parametru d rcovsk ho org nu.\

Description

(57) Anotace:

Způsob určování nebo zjišťováni přítomnosti analytu dárcovského orgánu ve v podstatě nedárcovské biologické tekutině, za přítomnosti nebo nepřítomnosti odpovídajícího analytu příjemce, který ukazuje na poškození dárcovského orgánu po xenotransplantaci, a umožňuje identifikovat poškození xenotransplantátu u příjemce, zahrnuje zachyceni nebo detekování uvedeného analytu dárce pomocí protilátky, která je buďto a) specifická pro analyt dárcovského orgánu a nevykazuje zkříženou reakci s odpovídajícím homologickým analytem příjemce; nebo b) schopná zkřížené reakce s uvedeným analytem dárcovského orgánu, kde její reaktivity s analytem dárcovského orgánu a s homologickým analytem příjemce jsou kvantitativně odlišitelné, a na přímém nebo nepřímém stanovení analyzovaného parametru dárcovského orgánu.

(13) Druh dokumentu: B6 (51)Int. Cl.⁷··

G01N 33/53

G01N 33/68

G01N 33/573

Způsob určování nebo zjišťování poškození dárcovského orgánu po xenotransplantaci pomocí analýzy látek pocházejících z orgánu dárce

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu zjišťování poškození dárcovského orgánu po xenotransplantaci, a to určením nebo detekcí přítomnosti analyzovaného parametru dárcovského orgánu v biologické tekutině.

Dosavadní stav techniky

V současné době se svět potýká s nedostatkem dárcovských orgánů pro alotransplantaci (např. jater, ledvin a srdcí). Objevily se návrhy, a bylo i prokázáno, že tento problém lze, byť dočasně, překonat použitím orgánů zvířat před vlastní ortotopickou transplantací. Chari, R. S., et al. (TheNew England Joumal of Medicína 1994; 33, č. 4, s. 234-237) řešili selhání funkce jater ex vivo perfúzí prasečích jater s následnou ortotopickou transplantací jater. Jeden pacient tak zůstal ve stabilizovaném stavu po dobu 10 dní a poté u něj byla úspěšně provedena ortotopická transplantace jater. Dřívější pokusy o transplantaci orgánů mezi různými živočišnými druhy (xenotransplantace) však dosud nebyly úspěšné kvůli jevu, označovaném jako hyperakutní rejekce, kdy dojde během několika hodin od implantace příjemci kodhojení (rejekci) nově transplantovaného orgánu, který není imunitním systémem hostitele přijat. Pokrok, dosažený v poslední době v oblasti molekulární genetiky, umožnil vývoj transgenních zvířat (hlavně vepřů), jejichž orgány jsou geneticky upraveny tak, aby byly po přenosu do orgánů jiných živočišných druhů méně imunogenní (např. člověk versus primát jiný než člověk) (Transplant News 1995; 5, č. 9). V této zprávě se předpokládá možnost, že imunotoíerance se zajistí expresí genu pro lidský „faktor akcelerace rozkladu“ v transgenním orgánu, který zabrání aktivaci komponent komplementu hostitele (např. komplexu Cb3) a omezí tak hyperakutní rejekci na minimum. Stejně jako v případě transplantace orgánů stejných živočišných druhů (alotransplantace) však rejekce xenograftu stále ještě představuje problém, snímž se musí transplantolog potýkat, a který je dále komplikován zjevnou skutečností, že u příjemce štěpu jsou přítomny tkáně různých živočišných druhů.

Klasické testy jatemí funkce nedokáží rozlišit mezi analyzovanými parametry dárcovského a příjemcovského (např. prasečího a lidského) orgánu. Například měření sérových hladin alaninaminotransferázy (ALT) a aspartátaminotransferázy (AST) nerozliší mezi prasečími a lidskými enzymy, takže jakákoli snaha o identifikaci posttransplantačního vývoje je naprosto bezpředmětná. Podobná situace existuje v případě analýzy parametrů renálního xenotransplantátu. Je třeba konstatovat, že v současnosti prostě neexistuje žádný obecně uznávaný proteinový markér zachovalosti (nepoškození) ledvin.

Glutathion S-transferázy (GSTs) představují multigenní rodinu proteinů, sestávající hlavně z isoforem třídy alfa (aGST), mí (pGST), pí (uGST) a theta (0GST), definovaných isoelektrickým bodem, které mají na starosti detoxifikaci řady xenobiotik hlavně prostřednictvím konjugace glutathionu (Beckett, G. J. a Hayes, J. D., Advanes in Clinical Chemistry 1993; 30, s. 281-380). Vzhledem k jednotné distribuci aGST a kjeho relativně vysoké hladině v játrech člověka, a vzhledem ke krátkému plazmatickému poločasu (přibližně 1 hodina), je tento enzym jako ukazatel stavu jater po transplantaci a míry poškození jater léky citlivější, než jsou aminotransferázy.

V EP-A 0 640 145 je popsána pomocná metoda k časné diagnóze rejekce u příjemců jatemího štěpu, zahrnující měření zvýšení plazmatických nebo sérových hladin aGST při nepřítomnosti jakékoli změny v plazmatických nebo sérových hladinách transamináz, nebo dříve, než k nějaké změně dojde.

-1 CZ 288968 B6

Pí glutathion S-transferáza je umístěna vcytoplazmě epitelových buněk žlučovodu v játrech; předpokládá se, že existuje pouze ve formě homodimeru. Heterogenní intrahepatální distribuce GST naznačuje, že různé isoenzymy mají in vivo jedinečné funkce v různých oblastech jater, 5 a lze tedy dospět k závěru, že měření plazmatických nebo jatemích hladin GST usnadní monitorování stavu jater jedince. Podobně jedinečná distribuce existuje i u tkání ledvin, kde se aGST vyskytuje v oblasti proximálního tubulu, a nGST vyskytuje v oblasti proximálního tubulu, a nGST se omezuje na oblast distálního tubulu nefronu (Campbell, J.A.H., et al., Cancer (Philadelphia) 1991; 67, s. 1608-1613). V nedávno publikované zprávě se objevila myšlenka, že io simultánních detekcí ct/nGST v lidské moči by bylo možno využít k rozlišení mezi nefrotoxickou cyklosporinu A a rejekcí štěpu (v tomto pořadí), a to díky místně specifické povaze inzultů příslušných tkání (Sunberg, A.G.M. etal., Nephron 1994; 67, s. 308-316).

Při detekci poškození orgánového štěpu, nebo k rozpoznání poškození hostitelského a/nebo 15 dárcovského orgánu, je tudíž zapotřebí vyvinout metodu pro odlišení analyzovaných parametrů hostitele a štěpu.

Podstata vynálezu

Vynález se týká způsob určování nebo zjišťování přítomnosti analyzovaného parametru dárcovského orgánu ve v podstatě nedárcovské biologické tekutině za přítomnosti nebo nepřítomnosti homologického analyzovaného parametru příjemce, který ukazuje na poškození dárcovského orgánu po xenotransplantaci, a který umožňuje identifikovat poškození xeno25 transplantátu u příjemce, kde tento způsob je založený na zachycení nebo detekci uvedeného analyzovaného parametru dárce pomocí protilátky, která je:

a) specifická pro analyzovaný parametr dárcovského orgánu a nevykazuje zkříženou reakci s odpovídajícím homologickým analyzovaným parametrem příjemce; nebo

b) schopná zkřížené reakce s uvedeným analyzovaným parametrem dárcovského orgánu, kde reaktivity s analyzovaným parametrem dárcovského orgánu a homologickým analyzovaným parametrem příjemce mohou být kvantitativně odlišeny, a na přímém nebo nepřímém stanovení analyzovaného parametru dárcovského orgánu.

Způsob podle vynálezu umožňuje odlišit analyzované parametry hostitele od parametrů dárce, a tím získat informace o stavu xenotransplantátu a případné rejekcí, aby bylo dle potřeby možno zahájit odpovídající terapii co nejdříve po zjištění analyzovaného parametru dárcovského orgánu 40 v biologické tekutině příjemce, jak je podrobněji popsáno dále.

Biologickou tekutinou jsou zde míněny tělesné tekutiny jako je např. žluč, plazma, sérum a moč, jakož i tkáňová podpůrná média a perfuzáty. Tyto biologické tekutiny jsou také obecně označovány jako matrix.

Termínem dárcovský orgán se míní orgán jako takový, a také tkáně a buňky, které představují jeho nedílnou součást nebo z něj pocházejí.

Podobně se termínu dárcovský materiál používá k označení samotného orgánu i tkání a buněk, 50 které představují nedílnou součást tohoto orgánu nebo z něj pocházejí.

Tak například mohou být dárcovským materiálem jádra, jatemí lalok jako jejich část, nebo hepatocyty. Obyčejně se v případě hepatocytů používá termínu zásobník hepatocytů (hepatocyte cartridge).

-2CZ 288968 B6

Příjemcem v obecném slova smyslu může být člověk nebo primát jiný než člověk.

Vhodný dárcovský materiál tedy může pocházet z jiného primáta, než z člověka, nebo ze zvířete, jako je např. vepř, který je fyziologicky a biochemicky podobný člověku.

Dárcovským zvířetem může být transgenní zvíře.

Xenotransplantaci lze provést in vivo nebo ex vivo.

Orgánem vhodným pro xenotransplantaci je srdce, ledviny nebo játra.

Dárcovským analyzovaným parametrem je s výhodou protein, zejména enzym.

Ve výhodném provedení bude dárcovský analyzovaný parametr dárce-specifický. Je-li přítomen odpovídající analyzovaný parametr příjemce, je výhodou, má-li tento analyzovaný parametr příjemce nižší stupeň homologie s uvedeným analyzovaným parametrem dárcovského orgánu. Analyzovaný parametr dárcovského orgánu může mít i vyšší stupeň homologie (např. větší než 80% homologii) s odpovídajícím analyzovaným parametrem příjemce, a přesto jej lze stále ještě detekovat způsobem podle dále popsaného vynálezu.

Výhodným enzymem je glutathion S-transferáza, zejména aGST.

Výhodně se zachycený analyzovaný parametr dárcovského orgánu určuje pomocí imunoanalýzy. Mezi vhodné typy imunoanalýzy patří enzymoimunoeseje.

Tak lze v případě prasečí aGST v lidské biologické tekutině zachytit prasečí aGST pomocí IgG [protilátky proti prasečí aGST], která se váže přímo nebo nepřímo na pevnou část, případně pomocí IgG[protilátky proti lidské aGST], která vykazuje zkříženou reaktivitu.

Získali jsme králičí polyklonální IgG [protilátku proti prasečí aGST], která je vysoce specifická vůči prasečí aGST. V případě, že tato protilátka také vykáže nižší stupeň (5-10 %) zkřížené reaktivity s lidskou aGST, zejména při vysokých koncentracích lidské aGST, pak lze lidskou aGST stanovit samostatně, a může být správně vypočteno množství prasečí aGST, což je popsáno dále.

Identifikovali jsme monoklonální protilátku proti lidské aGST s téměř 100% zkříženou reaktivitou vůči prasečí aGST, což je popsáno dále v příkladu 3.

Enzymoimunoesej může být sendvičového nebo semikompetitivního typu, jak popsáno dále v příkladech 1 a 2. _t

Jedním z aspektů vynálezu je testování dárcovského materiálu na viabilitu před xenotransplantací.

Způsob podle vynálezu rovněž umožňuje testovat viabilitu dárcovského materiálu měření analyzovaného parametru dárcovského orgánu v biologické tekutině, která protéká dárcovským materiálem.

Lze tak detekovat, kromě způsobu podle tohoto vynálezu, analyzovaný parametr pomocí kterékoli známé metody. Pokud je například analyzovaným parametrem orgánu enzym, pak lze uvedený orgánový parametr analyzovat a detekovat enzymovou eseji s použitím substrátu pro tento enzym.

-3CZ 288968 B6

Přehled obrázků

Na obr. 1 je schéma sendvičové enzymoimunoeseje z příkladu 1.

Na obr. 2 jsou vynesené hodnoty absorbance při 460/630 nm versus koncentrace aGST (pg/l) při použití imunometrické enzymoimunoeseje sendvičového typu pro prasečí aGST z příkladu 1.

Na obr. 3 je schéma kompetitivní enzymoimunoeseje z příkladu 2.

Na obr. 4 jsou vynesené hodnoty absorbance při 540/630 nm versus koncentrace aGST (pg/l) při použití imunometrické enzymoimunoeseje kompetitivního typu pro prasečí aGST z příkladu 2.

Na obr. 5 je analýza SDS-PAGE lidské a prasečí aGST.

Na obr. 6 je analýza „imunoblot“ lidské a prasečí aGST pomocí IgG[protilátky proti lidské aGST] a konjugátu kozí IgG[protilátky proti králičímu IgG]-HRP.

Na obr. 7 je analýza „imunoblot“ lidské a prasečí aGST pomocí IgGfprotilátky proti prasečí aGST] a konjugátu kozí IgG[protilátky proti králičímu IgG]-HRP.

Na obr. 8 je analýza „imunoblot“ lidské a prasečí aGST] a konjugátu kozí IgG[protilátky proti myší IgG]-HRP.

Příklady provedení vynálezu

Vynález bude blíže vysvětlen v následujících příkladech.

Příprava A

Čištění prasečí aGST aGST byla získána z prasečích jater pomocí afinitní chromatografie a chromatofokusace (pH 9,5-6,0). Přesné podrobnosti postupu při čištění jsou následující:

a. 30 g prasečích jater bylo homogenizováno po dobu 2 minut v homogenizačním pufru v poměru jeden díl ke třem dílům pufru za použití Waringova mísidla (Waring je ochranná známka). Homogenizační pufr měl následující složení:

mM Tris-HCl

250 mM glukózy

5mM EDTA pH 7,8 pg/l leupeptinu pg/l pepstatinu

b. Jatemí homogenát byl centrifugován při 10 000 g po dobu 60 minut.

c. Supematant byl poté separován na koloně s afinitou pro glutathion (GSH)-Sepharosu, která byla předem ekvilibrována 10 mM Tris pH 9,1. Ekvilibrační pufr se znovu použil keluci nenavázaného proteinu. Nakonec se k eluci nevázané GST z afinitní kolony použilo 50 mM Tris pH 9,1 s obsahem 5 mM GSH.

-4CZ 288968 B6

d. Eluovaný materiál byl poté dialyzován proti 25 mM ethanolaminu pH 9,5 a aplikován na chromofokusační kolonu (PBE94, dodala firma Pharmacia). Elučním pufrem byl Polybuffer 96 (Polybuffer 96 je ochranná známka), připravený podle pokynů výrobce.

Příprava B

Výroba a čištění protilátek

Vyčištěná prasečí aGST se subkutánně (s.c.) injikovala novozélanským bílým králíkům podle dále uvedeného časového harmonogramu a sérum bylo hodnoceno na reaktivitu proti aGST. Titr IgGfprotilátky proti prasečí aGST] byl určován semikvantitativní „dot blot“ analýzou, a jakmile byl dostatečný, byli králíci usmrceni vykrvácením a z krve získáno sérum. Protein A afinitní chromatografií bylo z králičího séra odděleno celkové množství IgG, který byl použit jak k potažení mikrotitrační destičky (semikompetitivní ELA - příklad 2), tak i kbiotinylaci (sendvičová EIA - příklad 1). Monoklonální IgG[protilátky proti lidské aGST] byly získány z fakultní nemocnice v Nijmegen (Nizozemí) jako ascites, a před použitím nebyly vyčištěny.

Harmonogram imunizace (obecně):

1. den: Byl proveden zkušební odběr 5 ml preséra z ucha králíka a poté se 0,5 ml prasečího antigenu aGST (100 pg) smíchalo se stejným objemem Freundova úplného adjuvans. Antigen aadjuvans byly homogenizovány tak, aby vznikla dokonalá emulze. Tato směs byla poté injikována s.c. na několika místech do zad králíka, kterému byla předtím vyholena srst.

28. den: Byl proveden zkušební odběr 5 ml séra z ucha králíka a poté se 0,5 ml antigenu (100 pg) smíchalo se stejným objemem Freundova úplného adjuvans. Antigen a adjuvans byly homogenizovány tak, aby vznikla dokonalá emulze. Tato směs byla poté injikována s.c. na několika místech do zad králíka.

42. den: Byl proveden zkušební odběr 10 ml krve z ucha králíka.

56. den: Králíkovi byla podána druhá „boost“, jak uvedeno pro 28. den.

70. den: Byl proveden zkušební odběr 10 ml krve z ucha králíka. Když byl titr dostatečně vysoký, byl králík utracen a bylo odebráno co nejvíce krve.

Příprava C

Imunoblotting

Všechny polyklonální a monoklonální IgG použité v následujících příkladech byly zkontrolovány na reaktivitu a zkříženou reaktivitu proti lidské a prasečí aGST (v tomto pořadí) pomocí následujících kombinací imunoblotů:

(a) králičí IgG[protilátka proti lidské aGST] byla použita k testování nitrocelulózových membrán, obsahujících imobilizovanou lidskou a prasečí aGST.

(b) králičí IgG[protilátka proti prasečí aGST] byla použita k testování nitrocelulózových membrán obsahujících imobilizovanou lidskou a prasečí aGST.

(c) myší IgG[protilátka proti lidské aGST] byla použita k testování nitrocelulózových membrán obsahujících imobilizovanou lidskou a prasečí aGST.

-5CZ 288968 B6

Detekce „imunoblot“ byla provedena následujícím způsobem:

1. U lidské i prasečí aGST (0,5 pg/dráha) byla provedena elektroforéza na 15 % SDS-PAGE a byly včleněny markéry molekulární hmotnosti.

2. Po elektroforéze se polyakrylamidový gel odřízl a jedna polovina byla obarvena, zatímco zbytek byl použit k elektroforetickému transferu na nitrocelulózu.

3. Po elektroforetickém transferu byly nitrocelulózové membrány blokovány po dobu 1 hodiny 5% (w/v) činidlem Marvel (Marvel je ochranná známka) v blokačním pufru PBST (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok obsahující 0,05 % (w/v) TWEEN-20).

4. Poté byly připraveny následující roztoky:

(i) králičí IgG[protilátka proti lidské aGST] v 1% (w/v) Marvel v PBST (ii) králičí IgG[protilátka proti prasečí aGST] v 1% (w/v) Marvel v PBST (iii) myší IgG[protilátka proti lidské aGST] v 1% (w/v) Marvel v PBST a přidány do membrán ihned po odlití blokačního pufru. Inkubace s roztoky protilátek se nechala probíhat po dobu jedné hodiny.

5. Nitrocelulózové membrány byly poté promyty v PBST (2* vždy po dobu 5 minut).

6. Poté by připraven konjugát anti-králičí IgG-HRP (1/1000 v 1% (w/v) Marvel v PBST) a přidán do roztoků uvedených výše pod bodem 4 (i) a (ii). Rovněž byl připraven konjugát antimyší IgG-HRP (1/1000) a přidán do roztoku uvedeného výše pod bodem 4 (iii). Konjugáty protilátek různých živočišných druhů (králík/myš), použité k imunodetekci, byly získány od společnosti Bio-Rad Laboratories Limited.

7. Po jednohodinové inkubaci s konjugáty protilátek různých živočišných druhů byla reagencia zlikvidována a membrány byly promyty, jak uvedeno výše v bodě 5.

8. Poté byl připraven substrát diaminobenzidinu a přidán do membrán. Hnědý precipitát na nitrocelulózové membráně znamenal pozitivní reakci.

Příprava D

Syntéza konjugátu prasečí aGST-křenová peroxidáza (horseradish peroxidase, HRP)

Konjugáty aGST-HRP byly syntetizovány za použití metodologie konjugace thioetheru. Pomocí SMCC (sukcinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyklohexan 1-karboxylát) byly do molekul aGST zavedeny reaktivní maleimidové skupiny a na HRP byly navázány maskované sulphydrylové skupiny (Dunanc, R.J.S., et al., Anal. Biochem. 1982; 132, 68-73). Po odmaskování za účelem vytvoření reaktivních sulphydrylových skupin se maleimidem aktivované aGST a HRP-SH smíchaly dohromady a nechaly se reagovat po dobu 4,5 hodiny. Výsledný konjugt aGST-HRP, vzniklý kovalentní thioetherovou vazbou, byl přenesen do objemově 50% glycerolu a uchováván při teplotě -20 °C pro použití při semikompetitivní ELA v příkladu 2.

-6CZ 288968 B6

Příprava E

Biotinylace IgG[protilátky proti prasečí aGST]

Biotinylovaná IgGfprotilátka proti prasečí aGST] byla připravena navázáním vyčištěné polyklonální IgG[protilátky proti prasečí aGST], která byla získána imunizací králíků vyčištěnou aGST (příprava B), na N-hydroxysukcinimid-Biotin (NHS-Biotin) v zásaditém prostředí. Reakcí nespotřebovaný NHS-Biotin byl poté odstraněn extenzivní dialýzou, biotinylovaný IgG byl rozdělen na alikvoty a uchováván ve zmrazeném stavu při teplotě -20 °C až do použití.

Příklad 1

Sendvičová enzymoimunoesej

Postup je schematicky znázorněn na obr. 1.

a. Mikrotitrační deska Nunc Maxisorp (Nunc Maxisorp je ochranná známka) byla potažena myší monoklonální IgG[protilátkou proti lidské aGST] (viz příprava B) imobilizovanou pomocí kozích fragmentů F(ab)₂ [protilátky proti myšímu IgG]. Takový způsob potažení protilátek slouží k orientaci vazebných míst Mab a zlepšuje i citlivost eseje tím, že omezuje na minimum adherencí indukovanou denaturaci zachycovací protilátky. Mikrotitrační desky byly blokovány roztokem proteinu/glukózy.

b. Jako kalibrátor eseje byla použita prasečí aGST, která byla purifikována z jater (příprava A) okamžitě po exspiraci a uchovávaná při teplotě 2-8 °C nebo -20 °C.

c. K usnadnění detekce zachycené/imobilizované aGST byly použity biotinylované konjugáty IgG[protilátky proti prasečí aGST].

d. Poté byl k detekci celého sendvičového komplexu antigenu použit konjugát Streptavidinu a křenové peroxidázy (HRP) ve spojení s užitím substrátu tetramethylbenzidinu (TMB).

e. Enzymová reakce byla ukončena přidáním 1 N H₂SO₄ a byla změřena absorbance při 450 nm, jako referenční vlnová délka byla použita vlnová délka 630 nm. Intenzita barev odpovídá kocentraci aGST a po vynesení Á450/630nm versus koncentrace (pg/l) lze stanovit koncentraci neznámých vzorků (viz obr. 2). Celková doba trvání eseje byla kratší než 3,5 hodiny.

Příklad 2

Semikompetitivní enzymoimunoesej

Postup je schematicky znázorněn na obr. 3.

a. V tomto případě byly desky Nunc Maxisorp potaženy polyklonální IgG[protilátkou proti prasečí aGST] imobilizovanou pomocí proteinu A, protože bylo zjištěno, že potažení přímo polyklonálním IgG neusnadnilo zachycení aGST, nejspíše v důsledku denaturace IgG při navázání na mikrotitrační desku.

b. aGST, značená HRP, byla v tomto případě použita jako konjugát a byla přidána do mikrojamky k neznačenému kalibračnímu vzorku. Tak se spustila reakce kompetičního typu mezi HRP značenou aGST a neznačenou aGST.

-7CZ 288968 B6

c. Po uplynutí dostatečné inkubační doby, za normálních okolností 60 minut, byla mikrotitrační deska promyta a přidal se substrát TMB.

d. Enzymová reakce byla zastavena přidáním 1 N H2SO4 a byla změřena absorbance při

450 nm s použitím 630 nm jako referenční vlnové délky. Intenzita barev je v inverzním vztahu ke koncentraci aGST a po vynesení A|5o/63Onm versus koncentrace (pg/l) lze kvantifikovat neznámé vzorky (viz obr. 4).

Příklad 3

Hodnocení čistoty reagencií imunoeseje

Imunoblotting se prováděl postupem popsaným v přípravě C. Výsledky jsou uvedeny na 15 obr. 5 až 8.

Klíč k drahám na obr. 5 až 8.

Dráha 1: markéry molekulární hmotnosti.

Dráha 2: lidská aGST (0,5 pg).

Dráha 3: prasečí aGST (0,5 pg).

Obr. 5 ilustruje čistotu lidské a prasečí aGST před použitím k imunizaci králíků (v obou případech ji indikuje jednoduchý pás) a potvrzuje absenci jakýchkoli jiných lidských nebo 25 prasečích proteinů, které by jinak mohly přispívat k nižší specificitě analýzy. Analýza typu „immunoblot“ reaktivity protilátek ukazuje, že IgGfprotilátka proti lidské aGST] je vysoce specifická vůči lidské aGST a nevykazuje významnou zkříženou reaktivitu vůči prasečí aGST (obr. 6), což bylo prokázáno silnou intenzitou signálu lidské aGST ve srovnání se slabou intenzitou signálu prasečí aGST. Tento nález je podepřen nepřítomností reaktivity prasečí aGST. 30 Tento nález je podepřen nepřítomností reaktivity prasečí aGST (faGSTJp), je-li zkoumána enzymoimunoesejí se specifitou na lidskou aGST ([aGST]h). Tento test je pod názvem HEPKIT dodáván společností Biotrin Intemational Limited, Mount Merrion, County Dublin, Irsko. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1, která představuje hodnocení reaktivity [aGST]p pomocí HEPKITu společnosti Biotrin. Je zřejmé, že při stanovení [aGST]p pomocí HEPKITu ke 35 zkřížené reaktivitě nedochází.

Tabulka 1

[aGSTJh (pg/l)	A450/630 nm
0,00	0,069
1,25	0,156
2,50	0,332
5,00	0,627
10,0	1,088
20,0	1,495
40,0	1,762
PC	0,839 (6,9 pg/l)

-8CZ 288968 B6

Tabulka 1 - pokračování

[aGST]p (pg/l)	A450/630 nm
8	0,012
40	0,010
200	0,012
1000	0,014

PC = pozitivní kontrola

Významnost této maximálně důležité skutečnosti spočívá vtom, že enzymoimunoesej ke stanovení lidské aGST je pro detekci lidské aGST specifická. Jakoukoliv přítomnost lidské aGST ve vzorcích, v nichž se bude měřit i prasečí aGST, lze tudíž detekovat specificky, bez zkřížené kontaminace prasečím antigenem. Nepřítomnost zkřížené reaktivity v enzymoimuno10 eseji lidské aGST a nález přibližně 5-10% zkřížené reaktivity mezi IgGfprotilátkou proti prasečí aGST] a lidskou aGST (obr. 7), což indikuje slabá intenzita signálu lidské aGST ve srovnání se silnou intenzitou signálu prasečí aGST, znamená, že výsledky imunoeseje na prasečí aGST mohou být korigovány s ohledem na možný příspěvek lidské aGST, provede-li se současně s enzymoimunoesejí pro zjištění prasečí aGST také kvantifikace lidské aGST enzymoimunoesejí 15 HEPKIT.

Pokud se například ve vzorku zjistí hodnoty:

esej aGST (pg/l) prasečí EIA (prasečí aGST) 10 000

HEPKIT EIA (lidská aGST) 1000 znamená to, je-li předpokládána přibližně 7% zkřížená reaktivita lidské aGST v prasečí ELA, že příspěvek lidské aGST k hodnotám prasečí aGST činí

1000/100 X 7 = 70 pg/l.

Je tedy přítomno 10 000 - 70 = 9930 pg/l prasečí aGST.

Dále kvýše uvedenému je na obr. 8 ilustrována rozsáhlá zkřížená reaktivita mezi myší IgG[protilátkou proti lidské aGST] a prasečí aGST, kterou indikuje srovnatelná intenzita příslušných pásů/signálů. Pro tento jev bylo této protilátky výhodně použito v sendvičové imunoeseji pro prasečí aGST v příkladu 1 jako „zachycovací“ protilátky, nebo jako protilátky k potažení desek.

Příklad 4

Specificita eseji

Protože se eseje v příkladech 1 a 2 budou používat přednostně k detekování prasečí aGST vneprasečích biologických tekutinách, je třeba zhodnotit citlivost a specificitu těchto eseji pomocí prasečí aGST přítomné v následujících matrix:

- lidská moč

- lidské sérum

- lidská plazma

- lidská žluč

-9CZ 288968 B6

- tkáňově podpůrná média

K provedení této analýzy byla prasečí aGST „nasazena“ do všech výše uvedených matrix a následně analyzována použitím imunoesejí uvedených v příkladech 1 a 2. Kromě kvantitativní detekce aGST byla hodnocena i linearita eseje (paralelismus), a tím provedena zkouška citlivosti. Protože je nutné, aby esej svou specificitou zajistila detekci pouze prasečí aGST, a aby jakýkoli výskyt lidské aGST nezpůsobil významnou interferenci, byla ve vzorcích prasečí aGST, porušených různým množstvím lidské aGST, zjišťována a měřena potenciální zkřížená reaktivita lidské aGST. Pokud existuje významná sekvenční homologie mezi oběma isoenzymy, nejedná se o pouhý triviální problém, a případ musí být řešen extenzivním testováním antiséra [protilátky proti prasečí aGST] na potenciální zkříženou reaktivitu s lidskou aGST.

Výsledky měření prasečí aGST v různých vzorových matrix, zjištěné pomocí enzymoimunoesejí sendvičového a semikompetitivního typu, jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

Hodnoty prasečí aGST v upravených vzorcích, zjištěné sendvičovou a semikompetitivní imunoesejí

Oček, hodn. (pg/i)	Ředidlo vzorku M	Plazma-lidská (pg/i)	MEM (kompl.) (Hgd)	TC-100 (kompl.) (pgfl)	Moč-lidská (pg/i)
s	K	S	K	S	K	S	K	s	K
0	61,4	19,4	0	—	0	46,8	0	73	0	84
4000	4530	3853	4299	Neměř.	4135	3643	4754	3889	4189,5	3936
2000	2980	2699	2500	Neměř.	2262	2420	2059	2071	2165,2	1912
1000	-	-	1041	Neměř.	1180	1247	983	953	844,5	857
500	507	446	249	Neměř.	512	485	540	562	392,8	454
250	279	260	85	Neměř.	290	211	273	266	151,9	218
125	128	140	0	Neměř.	136	188	197	163	17,9	126

Klíč:

1. S: Sendvičová enzymoimunoesej

2. K: Semikompetitivní enzymoimunoesej

3. Vzorky naředěny v poměru 1/5 pro kompetitivní esej (v rozmezí 0-1000 pg/l), poté dále naředěny do poměru 1/100 pro sendvičovou esej (v rozmezí 0-40 pg/l)

4. MEM a TC-100: tkáňově podpůrná média

Pozn. překl.: neměř = neměřitelné

Z tabulky 2 je zřejmé, že prasečí aGST lze zachytit a kvantifikovat ve všech testovaných matrix. Bylo prokázáno, že prasečí aGST je možno detekovat jak v lidské plazmě, tak i v lidské moči, aje tedy možno usnadnit posouzení stavu jatemího a ledvinného xenotransplantátu (v tomto pořadí). Za zmínku stojí, že se matrix plazmy ukázal jako neslučitelný se semikompetitivní imunoesejí, snad v důsledku interakce IgG s imobilizovaným proteinem A, což vedlo k hodnotovým anomáliím. Jinak se zdá, že všechny další tekutiny jsou sloučitelné s oběma typy eseji. Zvláště významná je možnost detekce prasečí aGST v tkáňově podpůrných médiích, což

-10CZ 288968 B6 by mělo zajistit možnost hodnocení xenotransplantátu ještě před vlastním výkonem, nebo umožnit analýzu viability izolovaných prasečích hepatocytů (přítomných v zásobnících), neboť tyto systémy jsou obvykle uchovávány v klasických podpůrných médiích. Dále může zjištěná kompatibilita vzorových matrix značně usnadnit detekci aGST v médiích, která jsou používána k udržování dárcovských orgánů (např. jater) ex vivo, kdy je orgán extrakorporálně v kontaktu s kultivačním médiem.

Příklad 5

Hodnocení interference lidské aGST v sendvičové enzymoimunoeseji prasečí aGST

V sendvičové enzymoimunoeseji prasečí aGST v příkladu 1 byla vyhodnocována interference lidské aGST. Interference byla zjišťována jako zvýšené hodnoty absorbance. Byla-li koncentrace lidské aGST v mikrojamce nižší než 25 pg/l (ekvivalent koncentrace vzorku 125 pg/l při zředění ředidlem v poměru 1/5), nebyla v eseji pozorována žádná interference. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3

[aGST)]p [aGST]h (ug/Q.	Absorbance 450/630 nm
20	—	0,869
20	6	0,875
20	12	0,875
20	25	0,881
20	50	0,975

Klíč:

aGST p - prasečí aGST aGST h - lidská aGST

Výsledky uvedené v tabulce 3 demonstrují specificitu imunoesejí k detekci prasečí aGST. Z uvedených dat je zřejmé, že lidská aGST v prováděné enzymoimunoeseji neinterferuje ani při tak vysokých koncentracích vzorku jako je 125 pg/l (25 pg/l x 5), což představuje hodnotu 15krát a 6krát vyšší, než je horní hranice normálních hodnot pro lidskou aGST v séru a v moči (v tomto pořadí). Je patmé, že při vyšších hladinách lidské aGST (> 250 pg/l, 50 pg/l * 5) k jisté interferenci dochází. Bylo vypočítáno, že existuje 5-10% zkřížená reaktivita mezi lidskou aGST a IgG[protilátkou proti prasečí aGST]. Souběžně stanovení hladin aGST kvantitativní imunoesejí pro lidskou i prasečí aGST však umožní přesně vypočíst množství přítomné lidské aGST, a toto množství pak vzít v úvahu při kvantifikaci prasečí aGST v lidských biologických tekutinách.

Je třeba dále poznamenat, že imunoesejí podle vynálezu lze použít rovněž k detekci prasečí aGST v prasečích biologických tekutinách, jak by tomu bylo v případě provádění in vitro nebo in vivo toxikologických studií s vepři nebo prasečími orgány. Toto zjištění je významné, protože je známo, že prasečí a lidská fyziologie a biochemie jsou poměrně podobné, a proto se vepři často používají jako zvířecí modely k predici lékové toxicity u člověka.

Claims

1. Způsob určování nebo zjišťování přítomnosti analytu pocházejícího z dárcovského orgánu ve v podstatě nedárcovské biologické tekutině, za přítomnosti nebo nepřítomnosti odpovídajícího analytu příjemce, který ukazuje na poškození dárcovského orgánu po xenotransplantaci a umožňuje identifikovat poškození xenotransplantátu u příjemce, kde tento způsob zahrnuje zachycení nebo detekování uvedeného analytu dárcovského orgánu pomocí protilátky, vyznačuj ící se tím, že tato protilátka je buďto

a) specifická pro analyt dárcovského orgánu a nevykazuje zkříženou reakci s odpovídajícím homologickým analytem příjemce; nebo

b) schopná zkřížené reakce s uvedeným analytem dárcovského orgánu, přičemž její reaktivity s analytem dárcovského orgánu a s homologickým analytem příjemce jsou kvantitativně odlišitelné, a na přímém nebo nepřímém stanovení analytu dárcovského orgánu.

2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že příjemcem je člověk.

3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že příjemcem je primát jiný než člověk.

4. Způsob podle některého z nároků laž 3, vyznačující se tím, že dárcovský orgán pochází z vepře.

5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že orgánem je ledvina.

6. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že orgánem jsou játra.

7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že analytem dárcovského orgánu je protein.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že analytem dárcovského orgánu je enzym.

9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že enzymem je glutathion Stransferáza (GST).

10. Způsob podle nároku 9, v y z n a č u j í c í se tím, že enzymem je alfa-GST.

11. Způsob podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že dárcovský orgán pochází z vepře a protilátkou je polyklonální protilátka proti prasečí alfa-GST.

12. Způsob podle některého z předcházejících nároků 4ažll,vyznačující se tím, že protilátkou je protilátka proti lidské alfa-GST, která vykazuje v podstatě 100% zkříženou reaktivitu vůči prasečí alfa-GST.

-12CZ 288968 B6

13. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že jakákoli přítomná lidská alfa-GST se detekuje s využitím specifické protilidské alfa-GST v odděleném systému vzorků.

5 14. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že dárcovský materiál se testuje na viabilitu před xenotransplantací.