FI104376B - Hb A1c:lle spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita - Google Patents
Hb A1c:lle spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita Download PDFInfo
- Publication number
- FI104376B FI104376B FI904226A FI904226A FI104376B FI 104376 B FI104376 B FI 104376B FI 904226 A FI904226 A FI 904226A FI 904226 A FI904226 A FI 904226A FI 104376 B FI104376 B FI 104376B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- glycosylated
- antibody
- hemoglobin
- alc
- fragment
- Prior art date
Links
- 102000017011 Glycated Hemoglobin A Human genes 0.000 title description 11
- 108010014663 Glycated Hemoglobin A Proteins 0.000 title description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 83
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 30
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims description 62
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims description 62
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 39
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 33
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 26
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 11
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 10
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 9
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000003508 chemical denaturation Methods 0.000 claims description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 3
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 241001135755 Betaproteobacteria Species 0.000 claims 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 238000004182 chemical digestion Methods 0.000 claims 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 42
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 38
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 37
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 28
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 28
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 26
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 26
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 24
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 18
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 15
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 15
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 15
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 12
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 11
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 9
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 7
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 7
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- ZADPBFCGQRWHPN-UHFFFAOYSA-N boronic acid Chemical compound OBO ZADPBFCGQRWHPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 octyl glucosides Chemical class 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical compound N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 238000003691 Amadori rearrangement reaction Methods 0.000 description 2
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 2
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]propanoyl]amino]prop-2-enoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- NOGLQXZIGOQIBD-UHFFFAOYSA-N 1-(dimethylazaniumyl)propane-1-sulfonate Chemical compound CCC(N(C)C)S(O)(=O)=O NOGLQXZIGOQIBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXDZFGATLNCIOI-HSUXUTPPSA-N 1-deoxy-L-fructose Chemical group CC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO IXDZFGATLNCIOI-HSUXUTPPSA-N 0.000 description 1
- RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 2-thiobarbituric acid Chemical compound O=C1CC(=O)NC(=S)N1 RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 101100284769 Drosophila melanogaster hemo gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 101800000874 Small capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101800000996 Small capsid protein precursor Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 238000012511 carbohydrate analysis Methods 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001808 coupling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 102000006966 enzyme regulator activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040000578 enzyme regulator activity proteins Proteins 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150089730 gly-10 gene Proteins 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010004903 glycosylated serum albumin Proteins 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 108010049074 hemoglobin B Proteins 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940124452 immunizing agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Chemical group 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940116357 potassium thiocyanate Drugs 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Chemical group 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Chemical group 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
104376
Hb Alc:lle spesifisiä raonoklonaalisia vasta-aineita . Tämä hakemus on jakamalla erotettu FI-hakemuksesta 854187 5 Tämä keksintö koskee hemoglobiinin glykosyloituna
Hb Alc:na tunnetun muodon määrittämistä. Yksilön veressä olevan hemoglobiinin glykosyloitumisasteen määritys on käyttökelpoinen indeksi glukoositason tarkkailulle sokeritaudissa. Keksintö antaa käyttöön monoklonaalisia vas-10 ta-aineita, jotka tunnistavat spesifisesti glykosyloidut N-terminaaliset peptiditähteet Hb Alc:ssa.
Hemoglobiini on proteiinitetrameeri, joka muodostuu neljästä aminohappoketjusta (alayksiköstä), jossa kussakin on noin 143 osaa ja jonka kokonaismolekyylipaino 15 on noin 64 000. Molekyylin toisessa päässä (6-alayksikön NH2-pääte) on valiiniyksikkö, joka voi reagoida glukoosin kanssa. Hemoglobiinin glykosyloituminen tapahtuu ei-ent-symaattisella reaktiolla, jossa on mukana glukoosi ja valiinin α-aminoryhmä. Reagenssien välille syntyy Schiffin 20 emäsmuodostus ja glukoosille tapahtuu Amadori-uudelleenjärjestäytyminen, jolloin muodostuu 1-deoksifruktovaliini. Tämä kompleksi on kovalenttinen ja pääosin palautumaton. Glykosylointireaktiota säätelevät reagenssien, siis : hemoglobiinin ja glukoosin, konsentraatiot. Normaalilla · 25 (ei sokeritautia sairastavalla) yksilöllä noin 3 % ko- • · · · konaishemoglobiinista on glykosyloitunut. Hemoglobiinitet- • · · rameerit, joissa on 1-deoksifruktovaliini β-ketjun N-päät- teessä, identifioidaan glykosyloiduksi eli Alc-hemoglobii- ... niksi.
• · · • · · 30 Sokeritautisilla glukoositasot ovat riittävän • · · ’·) ‘ korkeita kasvattamaan glykosylaation nopeutta suoraan *:*: verrannollisena veren glukoosi tasoon, joka kuvastaa ·:· sokeritautitilan vakavuutta. Hemoglobiinissa Alc-taso on noussut noin 5-12 %:iin. Koska kiertävän hemoglobiinin- • · . 35 elinaika on noin 120 päivää, antaa glykosyloidun hemoglo- • · 2 104376 biinin mittaus arvon, joka heijastaa tämän ajanjakson keskimääräistä glukoositasoa. Erikoisesti paljon glukoosia sisältävä ateria ei heijastu korkeassa glykosyloidun hemoglobiinin tai seerumialbumiinin tasossa. Täten glykosyloi-5 dun hemoglobiinin pitoisuuden määrittämisellä saadaan totuudenmukaisempi kuva kiertävästä glukoositasosta ja siten totuudenmukaisempi kuva potilaan tilasta pitkällä aikavälillä.
US-patentissa 4 247 533 esitetään analyyttinen 10 menetelmä, jossa Hb Alc:n vasta-aineet saatiin tietystä lampaasta ruiskuttamalla Hb Alc:tä ja absorboimalla ei-gly-kosyloidulla hemoglobiinilla, jolloin saatiin polyklonaa-lisia vasta-aineita, jotka erottivat Hb Alc:n ja ei-gly-kosyloidun Hb:n. Tällaiset vasta-aineet muodostavat sitten 15 perustan kokeelle, jossa määritetään näytteessä olevan glykosyloidun hemoglobiinin osuus. Kokeessa tarvitaan kuitenkin sopivasti immunisoitu lammas ja vasta-aine- absorptiot, jotta saadaan sopiva spesifisyys. Siten on kallista ja vaikeaa tuottaa spesifisiä polyklonaalisia vasta-ainei-20 ta. Tällä absorptiomenetelmällä valmistettujen valmisteiden on raportoitu olevan matalia tiittereiltään ja af-finiteetiltaan. Tämän menetelmän toistettavuus on myös « avoin, koska ei ole olemassa selostuksia sen käytöstä ih- • · : misen hemoglobiinia sisältävien kliinisten näytteiden ana- ·:· 25 lysoinnissa.
• · · · :***; Toinen menetelmä löytää Hb Alc:lle spesifisiä vasta- • · · aineita, on esitetty US-patentissa 3 378 744. Nämä tut- kijat korvasivat immunisoivana aineena tavallisen hemoglo- ...^ biinimolekyylin synteettisellä peptidi-immunogeenillä.
• · · I,. 30 Tämä aine injektoitiin eläimeen, jolla tavallisesti ei ole • · · "*j * veressä Hb Alc:tä, esimerkiksi lampaaseen. Synteettisessä ”**: peptidi-immunogeenissä oli glykosyloitu peptiditähde, jos- ·:··; sa oli aminohapposekvenssi, joka vastaa ensimmäisiä 4-10 [ . aminohappoa hemoglobiinisekvenssissä N-päätteissä. Seuraa- • · . 35 vana esitettävät tutkimukset esittävät, että lampaan poly- • · 3 104376 klonaalisilla vasta-aineilla, jotka on saatu synteettistä peptidi-immunogeeniä vastaan, ei ole merkittävää spesifi-; syyttä glykosyloidulle muodolle, Hb Alc:lle.
Määritelmiä 5 Aminohappo_Lyhenne
Arginiini Arg
Asparagiinihappo Asp
Glutamiinihappo Glu
Lysiini Lys 10 Seriini Ser
Asparagiini Asn
Glutamiini Gin
Glysiini Gly
Proliini Pro 15 Treoniini Thr
Alaniini Ala
Histidiini His
Kysteiini Cys
Metioniini Met 20 Väliini Vai
Isoleusiini Ile *
• » I
Leusiini Leu
Tyros iini Tyr • f V·· Fenyylialaniini Phe 25 Tryptofaani Trp • · · • · • · • · · Tämä keksintö tekee mahdolliseksi määrittää erit- • · · täin spesifisesti glykosyloituja proteiineja, kuten glyko- .···, syloitua hemoglobiinia ja albumiinia ja erityisesti Hb • · · 30 Ale:tä biologisissa nesteissä, kuten veressä. Monoklonaa- • « · ‘ *, listen vasta-aineiden, jotka on saatu synteettisiä glyko- syloituja Hb Alc:ssä esiintyviä N-terminaalisia peptiditäh-*:··i teitä vastaan on havaittu sitoutuvan spesifisesti tällai- siin tähteisiin glykosyloiduissa hemoglobiinin S-alayksi- t · . 35 köissä. Vasta-aineet voidaan valmistaa erilaisilla tavan- • · 4 104376 omaisilla monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus menetelmällä. Periaatteessa vasta-aineet valmistetaan synteettisesti johdettua immunogeeniä vastaan, jossa on haluttu glykosyloitu N-terminaalinen peptiditähde kemiallisesti 5 liittyneenä immunogeeniseen kantajaan siten, että glykosy-loidussa peptidissä on vähintään 2 ja edullisesti 5-15 aminohappoyksikköä, jotka vastaavat Hb Alc:ta. Saatavat vasta-aineet ovat spesifisiä glykosyloidulle synteettiselle peptidille ja vastaavalle esillä olevalle epitoopille 10 hemoglobiini Alc -molekyylissä.
Piirrokset ovat graafisia esityksiä esimerkeissä kuvatuista kokeista Hb Alc:n immunomäärityksestä.
Kuvio 1 on kuva, joka esittää glykopeptidi l:n aiheuttamaa (PEPTIDI 1) Ab-3:n sitoutumisen Alc:hen inhibi-15 tiota. Vasta-ainetta inkuboitiin etukäteen glykopeptidin kanssa, ennen kuin se siirrettiin Alc:llä päällystetylle mikrotiitterilevylle. Monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoo Ale:n, määritettiin käyttämällä toista vasta-aine-entsyymi-konjugaattia. Tulokset on piirretty kuvioon 1 20 inhibitio-%:na, jossa 0 %:n inhibitio on arvo, joka on saatu ilman kilpailevaa ainetta. 0-0 -viiva kuvaa * · i identtistä peptidiä, jossa ei ole hiilihydraattia, ja tämä * < '.‘•ί osoittaa sitä, että hiilihydraatti on oleellinen vasta- • · aineen sitoutumiselle. Kaikki pisteet ovat kolmen kokeen •i* 25 keskiarvoja.
• · i i :***; Kuviossa 2 on piirros, joka esittää glykopeptidin 3 ··· ·*·*· aiheuttamaa (PEPTIDI 3) Ab-3:n sitoutumisen Alc:hen inhibi- tiota. Kilpaileva koe suoritettiin kuviossa 1 esitetyllä ··. tavalla.
• · · • « · I,. 30 Kuvio 3 on piirros, joka esittää glykopeptidin 4 • ♦ « \ * aiheuttamaa (PEPTIDI 4) Ab-3:n ja Ab-4:n Alc:n sitoutumisen *Σ**ί inhibitiota. Kilpaileva koe suoritettiin kuviossa 1 esite- *:··; tyllä tavalla.
’ . Kuvio 4 on tyypillinen vakiokuvaaja käytettäessä • · 35 optimaalisia analyysiolosuhteita. Kokoverivakio valmistet- • · 5 104376 tiin käyttämällä erilaisissa suhteissa denaturoitua soke-ritautipotilaan kokoverta, jossa oli 12,66 % Alc:tä, mitat-; tuna HPLC-ioninvaihdolla, ja tavallisen luovuttajan ko koverta (3,83 % Alc). Kaikki kolmoismittausten pisteet on 5 piirretty.
Kuvio 5 on vakiokuvaaja käytettäessä synteettistä peptidivakiota. Analyysi suoritettiin kuviossa 4 esitetyllä tavalla sillä poikkeuksella, että kokoveren tilalla käytettiin erilaisia määriä synteettistä glykopeptidiä 10 kilpailijana. Kaikki kolmoismääritysten arvot piirrettiin.
Kuvio 6 on piirros, joka kuvaa immunoanalyysimene-telmän vertailua boronaattiaffiniteettimenetelmään dono-reillä. Kolmoismääritysten tulokset on piirretty immuno-analyysikoordinaattiin.
15 Kuvio 7 on piirros, joka kuvaa Hb Alc -epitoopin esille saattamista erilaisissa denaturointiolosuhteissa.
Kuvio 8 on piirros, jossa esitetään lampaan immunisoinnin tuloksia esimerkin 1 (b) mukaisella synteettisellä glykopeptidillä.
20 Kuvio 9 on piirros, joka esittää sen, että hiiren monoklonaaliset vasta-aineet ovat spesifisiä Alc -hemoglo-biinille.
HB Alc:n immunoanalyyttinen määrittäminen käyttäen • « keksinnön mukaista vasta-ainereagenssia, voi tapahtua pää-25 osin millä tahansa tavallisella menetelmällä. Tällaisia • · · f ovat klassisemmat menetelmät, kuten immunodiffuusio, im- ·»« munoelektroforeesi, agglutinointimenetelmät ja komplemen-tin sitominen, samoin kuin uudemmat menetelmät, joissa on käytettävä spesifisesti havaittavia leima-aineita, kuten • · · 30 radioimmunoanalyysi ja ei-radioisotooppiset menetelmät.
• · ·
Immunoanalyysin suorittaminen Hb Alc:lle keksinnön mukai-sesti käsittää oleelliset vaiheet, joissa käsitellään ve-sipitoinen koenäyte, jotta tehokkaasti denaturoidaan siinä mahdollisesti olevasta tästä proteiinista huomattava määrä
« I
. 35 halutun lineaarisen peptidiepitoopin saattamiseksi esille, • · 6 104376 ja saatetaan denaturoitu näyte kosketukseen vasta-ainerea-genssin kanssa, ja joissa määritetään vasta-ainereagenssin sitoutuminen tähän proteiiniin. Määritysvaihe vaihtelee t tietenkin käytetyn perusimmunoanalyysimenetelmän mukaises-5 ti. Tavallinen tähän määritykseen käytetty menetelmä käsittää leimatun reagenssin käyttämistä, joka reagoi joko analyytin tai vasta-ainereagenssin kanssa ja jota käytetään tavalla, joka osoittaa immuunikompleksin muodostumisen analyytin ja vasta-ainereagenssin välille tai kil-10 pailee tällaisen muodostumisen kanssa.
Jälkimmäinen menetelmä voidaan suorittaa lukuisilla tavoilla, kuten kilpailevalla sitoutumisella, jossa leimattu reagenssi saatetaan kilpailemaan proteiinianalyytin kanssa vasta-ainereagenssiin sitoutumisesta. Vasta-aine-15 reagenssiin sitoutuneen leimatun reagenssin määrä tai vapaan vasta-ainereagenssiin sitoutumattoman leimatun reagenssin määrä, mitataan sopivasti ja nämä voidaan funktionaalisesta suhteuttaa näytteessä olevaan proteiinianalyytin määrään. Koska tämä vasta-ainereagenssi on suunnattu 20 proteiinianalyytissä olevaan lineaariseen epitooppiin, leimattu reagenssi voi olla denaturoidun proteiinin tai • « · sen denaturoidun fragmentin leimattu muoto tai edullisesti • · lineaarisen epitoopin aminohapposekvenssin sisältävä pep- • · ·,*’! tiditähteen leimattu muoto. Jälkimmäinen edullinen rea- 25 genssi voidaan valmistaa käytössä olevilla synteettisillä peptidimenetelmillä ja laitteistoilla, eikä itse proteiini*; nimolekyyliä tarvitse eristää, puhdistaa eikä denaturoida.
Toinen käyttökelpoinen immunoanalyysimenetelmä pro-teiinianalyyttien havaitsemiseksi on sandwich-menetelmänä • · · 30 tunnettu menetelmä. Tässä menetelmässä käytetään kahta • · · \ vasta-ainereagenssia, joista toinen on leimattu ja toista « *·**· käytetään alkuperin leimatun, proteiinianalyyttiin sitou- *ί”ϊ tuneen vasta-aine-reagenssin erottamiseen sitoutumattomas- ta vasta-ainereagenssista. Leimaamaton toinen vasta-aine- • · • · 7 104376 reagenssi on tyypillisesti immobilisoitu tai immobilisoi-tavissa oleva muoto, kuten alalla on tunnettua. s Radioimmunoanalyyseissä vapaat molekyylit ja si dotut molekyylit on voitava erottaa toisistaan fysikaali-5 sesti, jotta leima voidaan mitata, sillä syntyvä signaali on kvalitatiivisesti sama molemmissa molekyyleissä. Tällainen menetelmä tunnetaan alalla heterogeenisenä, koska tarvitaan faasierotus. Tunnetaan muitakin heterogeenisiä immunoanalyysimenetelmiä, kuten entsyymileimatut immuno-10 analyysit, joihin joskus viitataan ELISA-menetelminä (ks. US-patentti 3 654 090), ja fluoresenssi-immunoanalyysit (ks. US-patentit 4 201 763; 4 133 639 ja 3 992 631).
Viime aikoina on kehitetty lukuisia immunoanalyysimenetelmiä, joissa vältetään erotusvaihe käyttämällä lei-15 maa, jonka havaittavaan signaaliin vaikuttaa leimatun rea-genssin sitoutuminen sitoutuvan aineen, siis vastaaineen kanssa. Tällaiset menetelmät ovat tulleet tunnetuiksi homogeenisinä menetelminä ja silloin kuin niitä on käytettävissä, ne ovat edullisia keksinnössä, koska erotusvaihetta 20 eikä radioisotooppeja ei tarvita. Eräitä tällaisia menetelmiä ovat fluoresenssisammutus ja -lisäys (ks. US-pa- • · ’·>·’ tentti 4 160 016), energiansiirtoimmunoanalyysi (ks. US- • · '.'l patentti 3 996 345) ja kaksoisvasta-aine - eteerinen esto « * - immunoanalyysi (ks. US-patentit 3 935 074 ja 3 998 943). tt'r 25 Erityisen edullisia homogeenisiä immunoanalyysimenetelmiä ovat sellaiset menetelmät, joissa käytetään entsyymillä • · · ;*·*; katalysoituun reaktioon osallistuvaa leimaa. Esimerkkejä ovat substraattileimattu immunoanalyysi (ks. US-patentti 4 ,···, 279 992 ja GB-patenttihakemusjulkaisu 1 552 607), pros- • · · 30 teettinen ryhmä (FAD)-leimattu immunoanalyysi (ks. US- • · t patentti 4 238 565), entsyymi modulaattorileimattu immuno-'·’*· analyysi, esimerkiksi inhibiittorileimojen käyttö (ks. US- patentit 4 134 972 ja 4 273 866) ja entsyymileimattu im-munoanalyysi (ks. US-patentti 3 817 837).
• · • · β 104376
Keksinnön mukaiselle vasta-ainereagenssille on tunnusomaista, että se sitoutuu spesifisesti Hb Alc:n lineaariseen peptidiepitooppiin. Täten tässä käytetyllä termillä "vasta-ainereagenssi" viitataan mihin tahansa aineeseen, 5 jossa on vasta-aineen sitoutumispaikka, joka on spesifinen tällaiselle peptidiepitoopille. Tämä termi käsittää siten kokonaiset vasta-aineet samoin kuin niiden sopivat fragmentit ja polyfunktionaaliset muodot. Kokonaisena vasta-aineena se voi kuulua mihin tahansa tunnettujen immunoglo-10 buliinien luokkaan tai alaluokkaan, esim. IgG, IgM jne. Mitä tahansa jonkin tällaisen immunoglobuliinin fragmenttia, jolla on spesifinen sitoutumiskyky peptidiepitooppiin, voidaan myös käyttää, esimerkiksi tavallisesti Fab:na, Fab':na ja F(ab')2:na tunnettuja IgG:n frag-15 mentteja. Lisäksi voidaan käyttää immunoglobuliinien tai niiden fragmenttien aggregaatteja, polymeerejä, johdannaisia, konjugaatteja ja hybridejä, silloin kun se sopii.
Vasta-ainereagenssin immunoglobuliinilähde voidaan saada millä tahansa käytettävissä olevalla menetelmällä, 20 kuten tavanomaisilla antiseerumi- ja monoklonaalimenetel-millä. Antiseerumi voidaan saada hyvin määritellyillä • · · ’.J.* menetelmillä, joissa eläin, kuten hiiri, kani, marsu tai • · vastaava eläin immunisoidaan sopivalla immunogeenillä.
• *
Immunoglobuliineja saadaan myös somaattisella soluhybridi-25 säätiöllä, jolla saadaan tavallisesti monoklonaalisiksi
IMI W
vasta-aineiksi kutsuttuja vasta-aineita.
• · · .'j*. Monoklonaaliset vasta-ainereagenssit ovat erityisen edullisia. Hybridoomasolulinjat saadaan tuottamaan vasta-aineita vain proteiinimolekyylin lineaarista peptidiepi- • · * *... 30 tooppiosaa vastaan pikemmin kuin kokonaista proteiinia • · · *. vastaan ja tällaiset solulinjat ja niiden vasta-aineet seulotaan selektiivisesti halutun epitoopin kanssa reagoi-"·; vien monoklonaalisten vasta-aineiden, identifioimiseksi ja eristämiseksi.
• « • · 9 104376
Eräässä menetelmässä tällaisten vasta-aineiden valmistamiseksi, proteiiniketjun fragmentti, joka vastaa ja sisältää luonnostaan esiintyvän lineaarisen peptidiepi-tooppisekvenssin, liitetään proteiinikantajaan ja injek-5 toidaan laboratorioeläimeen immuunivasteen aikaansaamiseksi. Vaihtoehtoisesti immunogeeni voi sisältää proteiinin tai sen fragmentin linearisoitua tai denaturoitua muotoa. Immunisoidun eläimen lymfosyytit, kuten pernasolut, yhdistetään myeloomasolujen kanssa, jotta saadaan hybridoomia, 10 joita viljellään ja jotka seulotaan monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamista varten. Monoklonaaliset vasta-aineet seulotaan niiden vasta-aineiden suhteen, jotka ovat selektiivisiä peptidiepitoopille, ja tämä tietty solulinja kloonataan käytettäväksi tuotettaessa lisää monoklonaalis-15 ta vasta-ainetta.
Vasta-aineiden tuottamiseksi synteettistä peptidi-immunogeeniä vastaan laboratorioeläimessä, esim. BALB/c hiirissä, rotissa tai vastaavissa eläimissä, tuotetaan peptidi, joka sisältää halutun epitoopin, ja eritetään se 20 luonnostaan esiintyvästä proteiinista tai syntetisoidaan se kemiallisesti ja puhdistetaan. Tällainen proteiinifrag-mentti sisältää halutun epitoopin kaikki kriittiset amino- '. happoyksiköt ja voi sisältää muita aminohappoyksiköitä, • · joista joku tai kaikki valinnaisesti vastaavat mielenkiin-25 non kohteena olevan proteiinin aminohapposekvenssiä.
Sen varmistamiseksi, että epitoopin sisältävä pep-tidifragmentti on optimaalisesti antigeeninen, se voidaan m edullisesti liittää moninkertaisesti immunogeeniseen kan-taja-aineeseen. Immunogeeninen kantaja-aine voi olla jokin i · » 30 yleisesti tunnetuista kantaja-aineista, jotka sisältävät · · funktionaalisia ryhmiä, jotka ovat käytettävissä peptidi- * '·**· tähteeseen sitoutumiseen. Useimmissa tapauksissa kantaja on proteiini tai polypeptidi, vaikka muita aineita, kuten hiilihydraatteja, polysakkarideja, lipopolysakkarideja, » · 35 nukleiinihappoja ja vastaavia aineita, joilla on riittävä • · 10 104376 koko ja immunogeenisyys voidaan myös käyttää. Useimmiten immunogeenisten proteiinien ja polypeptidien molekyylipai-not ovat luokkaa 4 000 - 10 000 000, edullisesti suurempia kuin 15 000 ja yleisemmin suurempia kuin 50 000. Yleensä 5 yhdestä eläinlajista otetut proteiinit ovat immunogeeni-siä, kun ne viedään toisen eläinlajin verenkiertoon. Erityisen käyttökelpoisia proteiineja ovat albumiinit, globu-liinit, hemosyaniinit, gluteliinit ja vastaavat proteiinit. Muita viitejulkaisuja tämänhetkisistä tavanomaisista 10 immunogeenisistä kantaja-aineista ja hapteenien liittämisestä niihin on esitetty seuraavassa: Parker, Radioimmu noassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, New Jersey USA, 1976); Butler, J. Immunol. Meth. (1974) 7:1 - 24; Weinryb ja Shroff, Drug 15 Metab. Rev. 10; (1974) 271 - 283; Broughton ja Strong,
Clin. Chem. 22; (1976) 726 - 732; ja Playfair et al., Br. Med. Bull. 30; (1974) 24 - 31.
Tiettyyn immunogeeniseen kantaja-aineeseen kytkettyjen epitooppien lukumäärää rajoittaa vain käytettävissä 20 olevien sitoutumispaikkojen lukumäärä kantajassa, ja lukumäärä voi olla useita tuhansia tietyillä suurimolekyyli- • « painoisilla synteettisillä peptideillä, kuten polylysii-
• I
'· *: nillä. Tietyn kantajan epitooppitiheys riippuu kantajan molekyylipainosta ja käytettävissä olevien sitoutumispaik-25 kojen tiheydestä. Optimaaliset epitooppitiheydet, joilla saavutetaan immunogeenin synteesin optimaalinen helppous ja toistettavuus sekä optimaalinen vasta-ainevaste, ovat noin 10 - 50 % käytettävissä olevista sitoutumisryhmistä kantaja-aineessa.
• · · 30 Peptidifragmentit liitetään kantaja-aineeseen joi- • · · lakin sopivalla kytkentämenetelmällä. Fragmentissa olevien ”*** natiivien aminohappojen funktionaalisia ryhmiä tai frag- *·"' mentin kemiallisella muuntamisella saatuja funktionaali- siä ryhmiä käytetään tavallisesti kytkettäessä suoraan tai -itt. 35 bifunktionaalisten kytkentäaineiden välityksellä kantajan · 11 104376 funktionaalisiin ryhmiin. Edullista on suunnitella pepti-difragmentti, jossa on yksi ainutlaatuinen reaktiivinen funktionaalinen ryhmä, jotta saadaan yksiselitteinen sitoutuminen kantaja-aineeseen.
5 Monoklonaalisten vasta-aineiden, jotka on saatu synteettisiä glykosyloituja N-terminaalisia Hb Alc:ssä esiintyviä peptiditähteitä vastaan, on havaittu sitoutuvan spesifisesti tällaisiin tähteisiin hemoglobiinin glykosy-loidussa β-alayksikössä. Vasta-aineet voidaan valmistaa 10 erilaisilla menetelmillä tavallisten monoklonaaliteknii-koiden mukaisesti. Periaatteessa vasta-aineet valmistetaan synteettisesti johdettua immunogeeniä vastaan, joka sisältää halutun glykosyloidun N-terminaalisen peptiditähteen kemiallisesti sitoutuneena immunogeeniseen kantajaan, jol-15 loin glykosyloitu peptidi sisältää vähintään 2 ja edullisesti noin 5-15 aminohappoyksikköä, jotka vastaavat Hb Alc:ta. Saadut monoklonaaliset vasta-aineet ovat spesifisiä glykosyloiduille synteettisille peptideille ja vastaavalle esille saatetulle epitoopille hemoglobiini Alc- molekyylis-20 sä.
. Monoklonaaliset vasta-aineet, jotka ovat spesifisiä *;··] ihmisen veressä esiintyvälle Hb Alc:lle, erittyvät hybri- · i '· doomista, jotka on johdettu yhdistämällä myeloomasolut ja « « « · · ’. ·: synteettisellä peptidi-immunogeenillä immunisoidulta eläi- .25 meitä otetut lymfosyytit. Synteettinen peptidi-immunogeeni ··· on edullisesti muotoa: • · · • · · • · » [Glyko- (NH) Val-His-AA-R] n------Kanta j a • · · • · · • · · 30 jossa Glyko-(NH)Val vastaa ei-entsymaattisesti glykosyloi- • « · tua väliinitähdettä, His on toinen aminohappo natiivissa ’ * β-alayksikön Hb-sekvenssissä, AA on sidos tai yksi tai useampia aminohappotähteitä, R on sopiva liitosryhmä, kan-....: ta ja on immunogeeninen kantaja-aine ja n (epitooppitiheys) 35 on keskimäärin yhdestä kantajassa käytettävissä oleviin 12 104376 sitoutumispaikkojen lukumäärään. Liitosryhmä R voi olla mikä tahansa haluttu yhdistävä reagenssi ja AA voi sisältää yhden tai useamman ylimääräisen aminohappotähteen, joka vastaa hiilihydraattia sisältävää ihmisen hemoglobii-5 nin β-alayksikön N-päätettä. Ryhmä AA voidaan valita esimerkiksi seuraavista aminohapposekvensseistä tai mistä tahansa niiden jatkuvasta fragmentista, joka alkaa leusii-niyksiköllä: -Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-. Lisäksi liitos- ryhmä R voi sisältää ylimääräisiä aminohappoyksiköitä, 10 joita ei ole tavallisessa ihmisen hemoglobiinissa, mutta jotka voidaan kätevästi lisätä peptidisynteesimenetelmillä ja jotka voivat toimia funktionaalisina ryhminä sitomisessa kantaja-aineeseen. Erityisen käyttökelpoinen liitos-ryhmä on -Tyr-Tyr-Cys, jonka kautta saadaan ainutlaatuinen 15 tioliryhmä glykosyloidun peptidiyksikön liittämiseksi kontrolloidusti kantaja-aineisiin.
Keksinnön mukaiselle monoklonaaliselle Hb Alc -vasta-aineelle on tunnusomaista sen spesifisyys sitoa ihmisen hemoglobiinin β-alayksikön N-terminaalisen peptidisekvens-20 sin glykosyloitua muotoa. Tämä glykosyloitu tähde on huo-, mättävä Hb Alc:n rakenneominaisuus. Keksinnön mukainen vas- « · t ta-aine vaatii epitoopin tai determinanttikohdan, jossa on I · | ' " vähintään 1-deoksifruktosyylihiilihydraattiyksikkö, joka ·.'·.· muodostuu glukoosin ja terminaalisen amiinin välisen reak- 25 tiotuotteen Amadori-uudelleenjärjestäytymisessä, ja siitä laajeneva peptidisekvenssi, joka sisältää vähintään yhden :':*: Hb Alc:n N-terminaalisen sekvenssin aminohappoyksiköistä asemassa, joka vastaa natiivin Hb Alc:n sekvenssiä. Pepti-disekvenssissä olevat muut aminohappoyksiköt, jotka ovat • · · 30 luonteenomaisia epitoopille, voivat olla samoja tai eri- • ♦ · laisia kuin natiivissa Hb Alc:n sekvenssissä esiintyvät ***** aminohappoyksiköt. Tällä tavalla epitoopille on tunnus- omaista vähintään kaksi kontakti- tai liitoskohtaa vasta-aineen kanssa, jotka kohdat ovat ainutlaatuisia glykosy-,,f<; 35 loidulle N-terminaaliselle Hb Alc -sekvenssille. Edullises- 13 104376 ti vasta-aine sitoo spesifisesti glykosyloidun peptiditäh-teen, jolla on seuraava kaava
Gluko-(NH)Val-His-AA- 5 jossa Gluko-(NH)Val ja AA ovat edellä määritellyt. Erityisen edullisten monoklonaalisten vasta-aineiden on havaittu olevan spesifisiä glykosyloidulle dipeptiditähteelle riippumatta AA:n luonteesta. Saadaan myös vasta-aineita, jot-10 ka spesifisesti vaativat pidempiä glykosyloituja peptidi-sekvenssejä, kun AA on 1 - 12, edullisesti 1-6, aminohappoa sisältävä sekvenssi, joka vastaa ihmisen hemoglobiinin β-alayksikön N-päätettä. Tällainen monoklonaalisen vasta-aineen spesifisyys tekee mahdolliseksi Hb Alc:ssa 15 olevan, esille saatetun glykosyloidun N-terminaalisen pep-tiditähteen spesifisen havaitsemisen, kun taas hemoglobiinin ja muiden proteiinien Ja peptidien muut glykosyloidut peptidiepitoopit, joita esiintyy ihmisen verenkierrossa, jäävät oleellisesti havaitsematta.
20 Natiivin Hb Alc molekyylin glykosyloitu N-terminaa- linen peptiditähde saatetaan keksinnön mukaisten monok- • · · lonaalisten vasta-aineiden tai sen fragmenttien saataville *: sopivasti denaturoimalla tai hajottamalla analysoitavan '.‘j näytteen proteiini. Keksinnön mukaisten spesifisten vasta- t\" 25 aineiden valmistuksen onnistumisessa, jossa aikaisemmat :***: yritykset ovat epäonnistuneet, perustana oleva hypoteesi :*·*; esitetään seuraavaksi, mutta sen täsmäävyyttä ei tulisi pitää kriittisenä keksinnön mukaisen menetelmän keksin- .···, nöllisyydelle.
• · · #*..f 30 Ihmisen hemoglobiinin β-alayksikön N-terminaalinen • · « sekvenssi on hyvin samanlainen kuin vastaava hiiren hemo- *·**· globiinin sekvenssi, jolloin ensimmäiset neljä aminohappoa '•"‘ί ovat identtiset. Lisäksi hiiren hemoglobiini on glykosy- ..i.: loitunut lähes samassa määrin kuin ihmisen hemoglobiini.
• · . 35 Siten natiivissa ihmisen hemoglobiinimolekyylissä β-alayk- • · 14 104376 sikön N-terminaalinen sekvenssi ei olisi hiirelle vieras, eikä immunovastetta olisi odotettavissa. Tämä on tunnetun tekniikan mukainen päätelmä ja sen mukaisesti on valittu eläin (lammas), jolla on aivan toisenlainen hemoglobiini-5 sekvenssi, joka ei glykosyloitunut, immunovasteen havaitsemisen toivossa. Kuitenkin esillä olevassa keksinnössä on osoitettu, että kun glykosyloitu N-terminaalinen tähde altistetaan hiiren immuunisysteemille synteettisen peptidi -immunogeenin muodossa, epitooppi esiintyy rakenteena, 10 johon hiiri voi muodostaa immunologisen vasteen. Somaattisten solu kloonausmenetelmien kautta voidaan eristää hybridoomia, jotka erittävät erittäin spesifisiä vasta-aineita. Nämä vasta- aineet sitoutuvat glykosyloituun N-terminaaliseen peptiditähteeseen natiivisessa hemoglobii-15 nimolekyylissä, mikäli se on altistunut riittävästi vuorovaikutuksen saamiseksi vasta-aineen sitovan kohdan kanssa. Epitoopin altistustapaa selostetaan tarkemmin jäl-j empänä.
Vasta-ainereagenssin steerinen pääsy epitooppiin 20 voidaan saada aikaan millä tahansa tehokkaalla tavalla. Epitoopin altistumisen koskemattomassa proteiinissa ymmär- iti retään tapahtuvan fysikaalisella tai kemiallisella denatu- .* roinnilla tai hajottamisella vähintään epitoopin alueella.
• · Tällainen denaturoiminen tai hajottaminen voidaan paikal-25 listaa epitoopin alueelle tai se voi vaatia yleisempää tai pääosin täydellistä tertiaarisen ja lisäksi sekundaarisen proteiinirakenteen denaturoimista tai osittaista tai täy-dellistä proteiinin hajottamista.
Denaturoiminen voidaan suorittaa erilaisilla ta- • · · 30 voilla mukaan lukien proteiinien tavanomaiset käsittelyme- • · · *. netelmät fysikaalisilla menetelmillä, kuten lämmöllä, uit- raäänellä, korkealla tai matalalla pH:11a, kuten on edul- lista, kemiallisella denaturoinnilla hajottamalla tai ____: saattamalla vuorovaikutukseen kaotrooppisen aineen tai • · 35 liuoksessa olevan kaotroopin kanssa. Käyttökelpoisia kao- • · 15 104376 trooppisia aineita niihin rajoittumatta ovat guanidiini, urea ja erilaiset detergentit, kuten natriumdodekyylisul-faatti (SDS) ja muut niihin rajoittumatta, esim. deoksiko-laatti ja tietyt sappihappojen suolat, 3-(3-koolamidopro-5 pyyli)dimetyyli-ammonio-l-propaanisulfonaatti, orgaaniset liuottimet, kuten metanoli, propanoli ja asetonitriili, ja tietyt suolat, kuten kaliumtiosyanaatti. Ionittomat detergentit, kuten Triton X, Tween, Nonidet NP-40 ja oktyyli-glukosidit voivat myös toimia proteiinin denaturoijina. 10 Reagensseja (esim. merkaptoetanoli tai ditiotreitoli), jotka pelkistävät disulfidisidoksia, voivat olla tehokkaita denaturointiprosessin edistäjiä. Proteiinin denatu-rointi voi olla tehokkainta, mikäli käytetään kemiallisten ja/tai kemiallisten ja fysikaalisten menetelmien yhdistel-15 miä (esim. guanidiini ja lämpö, guanidiini ja SDS tai guanidiini ja ditiotreitoli). Erityisesti voimakkaat kaotroo-pit, kuten guanidiini, ovat erityisen edullisia. Tietenkin vältetään denaturointiolosuhteita, jotka saavat aikaan huomattavaa aggregaatiota, liukenemattomuutta tai proteii-20 nin saostumista siten, että riittämätön määrä esille saa- . tettua epitooppia on saatavissa liuoksessa vasta-aineeseen * · · sitoutumista varten. Riittävä määrä denaturoitua proteii- • · t • nia täytyy jäädä liuokseen tai suspensioon, jotta saavute- • · taan käyttökelpoinen immunositoutuminen. Tarvittavan liu- 25 koisuuden määrä riippuu aiotun tai halutun sitoutumisen : : olosuhteista.
• · ·
Merkittävä määrä haluttua proteiinia tietyssä koe-näytteessä voidaan denaturoida peptidiepitoopin saat-tamiseksi esille vasta-aineeseen sitoutumista varten, yh- • · · .···. 30 distämällä näyte kaotroopin vesiliuoksen kanssa, jossa
• I I
kaotrooppia on läsnä riittävä pitoisuus denaturoimaan mer- 16 104376 sen pitoisuus on edullisesti suurempi kuin 1-molaarinen 3-molaarisen liuoksen ollessa erityisen käyttökelpoinen. Denaturointiprosessia edistää merkittävästi seoksen lyhytaikainen lämmittäminen. On havaittu, että lämpötiloissa 5 alle 37 °C denaturoiminen kaotroopilla voi kestää yhdestä useaan tuntiin, kun taas 50 °C:n yläpuolella olevissa lämpötiloissa riittävä denaturoituminen voidaan saavuttaa minuutissa tai sitä nopeammin. Jotta estettäisiin vasta-aineen ja muiden myöhemmin lisättävien proteiinireagens-10 sien merkittävä denaturoiminen, laimennetaan näyte-kao-trooppiseos tavallisesti erillisenä vaiheena tai lisäämällä reagenssiliuoksia tasolle, jolla kaotrooppi ei oleellisesti pysty denaturoimaan näitä reagensseja ja joka kuitenkin pitää epitoopin saatavilla estämällä mielenkiinnon 15 kohteena olevan proteiinin merkittävän renaturoitumisen. Guanidiinin tapauksessa tämä edullisesti vaatii laimentamisen alle noin 1,0-molaariseen pitoisuuteen.
Keksinnössä hajotuksessa käytettävistä proteolyyt-tisistä entsyymeistä ei-rajoittavia esimerkkejä ovat tryp-20 siini, kymotrypsiini, proliini-spesifinen endoproteaasi, Pepsiini ja papaiini. Suoritettaessa immunoanalyysiä ana- • · · lyysiseokseen lisätään proteolyyttisten entsyymien inhi- • · • · · . biittoreita, kuten tunnettua, riittävästi estämään pro- • · ·.**: teiinianalyysiaineiden hajoamista.
25 Tarkemmin esitettynä hybridoomasolulinjoja kasvate- taan vasta-aineiden tuottamiseksi vain hemoglobiinimole- ;*j*j kyylin glukosyloituja osia vastaan pikemmin kuin koko pro- teiinia vastaan, ja tällaiset solulinjat ja niiden vasta- .·♦·. aineet seulotaan niiden monoklonaalisten vasta-aineiden • · · #30 identifioimiseksi ja eristämiseksi, jotka tämän jälkeen * * * *. reagoivat selektiivisesti glykosyloidun Hb Alc -epitoopin ***** kanssa.
Tällaisten vasta-aineiden tuottamiseksi yhdistetään proteiiniket jun fragmentti, joka vastaa luonnostaan • · . 35 esiintyvää glykosyloitua peptidisekvenssiä, proteiinikan- » ·
: I
17 104376 tajaan ja injektoidaan laboratorioeläimeen immuunivasteen aikaansaamiseksi. Immunisoidun eläimen lymfosyytit, kuten pernasolut, fuusioidaan myeloomasolujen kanssa, hybridoo-mien saamiseksi, joita kasvatetaan ja seulotaan mono-5 klonaalisten vasta-aineiden tuottamisen suhteen. Mono-klonaalisista vasta-aineista erotetaan ne, jotka ovat selektiivisiä glykosyloidulle peptidiepitoopille ja tietty solulinja kloonataan käytettäväksi tuotettaessa lisää monoklonaalista vasta-ainetta.
10 Vasta-aineen tuottamiseksi laboratorioeläimellä, esim. BALB/c -hiirissä, rotissa tai vastaavissa eläimissä, glykosyloidun hemoglobiinifragmentin tulee joko olla tuotettu ja eristetty luonnostaan esiintyvästä ihmisen hemoglobiinista tai olla kemiallisesti syntetisoitu ja puh-15 distettu. Hemoglobiinifragmentissa tulisi olla 1-deoksi- fruktoositähde ja vähintään kaksi aminohappoyksikköä, edullisesti 3, 4, 5 tai vielä useampia tähteitä, jotka vastaavat hemoglobiinin β-alayksikön N-päätettä (väliini-histidiini). Edullisesti siinä on noin 5 - 15 ja edul-20 lisemmin 7-10 yksikköä.
. Sen varmistamiseksi, että glykosyloitu peptidifrag- • « · '·/·’ mentti on optimaalisesti antigeeninen, se voidaan edulli- • · · '· ”· sesti yhdistää kantaja-aineeseen, joka on suuri immuno- •V’.' geeninen molekyyli, kuten naudan seerumialbumiini (BSA) 25 tai tulivuorikotilon hemosyaniini (KHL). Fragmentissa tu- lisi olla myös luonnostaan uudelleenjärjestäytynyt glu- :T: koosi-valiini-reaktion addukti, joka voi olla läsnä alusta * alkaen, kuten on eristetyssä luonnostaan esiintyvässä he-moglobiinifragmentissa tai edullisesti se voidaan muodos- • « .···, 30 taa synteettiseen peptidiin sen synteesin aikana tai ennen • · · peptidin liittämistä suureen proteiinikantajaan. Kantaja • · voidaan lisätä millä tavalla tahansa, joka ei tuhoa frag- mentin antigeenisyyttä.
Glykosyloitu fragmentti voidaan tuottaa kemial- * · 35 lisella tai entsymaattisella luonnostaan esiintyvän Hb:n • · is 104376 esim. Alc:n hajotuksella. Tämä fragmentti voidaan liittää kantajaan käyttäen klassisia kytkentämenetelmiä, esim. glutaraldehydi- tai karbodi-imidi-menetelmiä, ja käyttää konjugaattia immunogeeninä.
5 Edullisessa kemiallisessa menetelmässä osan tunnet- tua hemoglobiinisekvenssiä syntetisoimiseksi tarvitaan yhden tai useamman aminohappoyksikön lisäys (joita ei ole tavallisessa sekvenssissä) sen antigeenisyyden ja kytken-täominaisuuksien optimoimiseksi. Tällöin pääteyksikkö si-10 sältää tioli (SH) -ryhmän, jonka avulla se voidaan kytkeä ligandiin tavanomaisella tavalla, kuten reaktiolla bifunk-tionaalisen kytkentäreagenssin kanssa, esim. m-maleimido-bentsoyyli N-sulfosukkinimidiesterin (MBS) kanssa.
Edullisen suoritusmuodon mukaisesti synteettisen Hb 15 fragmentin lysiinipäähän, jossa on kahdeksan yksikköä NH2-valiini-histidiini-leusiini-treoniini-proliini-glutamiini-happo-glutamiinihappo-lysiini-COOH, lisättiin tyrosiinia, ja kysteiiniä, jolloin saatiin 11 yksikköä sisältävä kys-teiinipäätteinen peptidi.
20 Tämä voidaan glykosyloida tavallisella tavalla ei- , entsymaattisella reaktiolla glukoosin kanssa. Tämän jäl- ' * keen glykopeptidi kytketään suureen kantaja-aineeseen, • « · '« * jolloin saadaan antigeeni, joka annetaan vasta-aineiden tuottamista varten. Glykosyloidulle peptidiepitoopille 25 vasta-ainetta tuottavasta eläimestä saadut lymfosyytit ··· !>t>: yhdistetään sitten tavallisella tavalla hybridoomien tuot- :T: tamiseksi, jotka kloonataan, ja ne, jotka tuottavat spesi- 9 fisyydeltään halutunlaisia monoklonaalisia vasta-aineita, kloonataan edelleen. Se solulinja tai ne solulinjat, joi-30 den monoklonaalisilla vasta-aineilla on suurin selek- • « · tiivisyys glykosyloidulle epitoopille vastakohtana ei-gly- » kosyloidulle Hb: lie, saatetaan tämän jälkeen lisääntymään ja vasta-aineet otetaan talteen. Viitejulkaisuja tällai- sista monoklonaalisista vasta-ainemenetelmistä ovat Lym- .,.,j 35 phocyte Hybridomas, toim. Melchers et ai., SpringerVerlag • « 104376 (New York 1978), Nature 266:495 (1977); Science 208: 692 (1980) ja Methods in Enzymology 74 (osa B): 3 - 46 (1981).
Vasta-aineita voidaan sitten käyttää tavalliseen tapaan reagoimaan verinäytteiden kanssa, jotka sisältävät 5 tuntemattoman määrän glykosyloitua Hb:ta, ja reaktion astetta voidaan verrata kalibroitujen standardien avulla glykosyloitumisasteen määrittämistä varten. Mittaus voi tapahtua fluoresenssilla, immunoanalyysillä tai vastaavalla tavalla, liittämällä sopivia mitattavia ryhmiä monok-10 lonaalisiln vasta-aineisiin tunnetulla tavalla ilman, että niiden sitoutumisvoima Hb Alc:n glykosyloituihin epitoop-peihin pienenee.
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää reagenssitesti-liuskaan perustuvaa analyysiä, jossa karboksyyliä sisäl-15 tävä aine, kuten karboksimetyyliselluloosa, päällystetään puu- tai muoviliuskan pinnalle. Tämän jälkeen liuska upotetaan hajotettuun ja denaturoituun tuntemattomaan verinäytteeseen ja näin mahdollisesti glykosyloitunut hemoglobiini adsorboidaan. Tämän jälkeen liuska upotetaan mo-20 noklonaalisten vasta-aineiden liuokseen, jotka on sopivas- . ti leimattu (esim. entsyymi, fluoresenssi, kofaktorit « · * jne.) kohdassa, joka ei häiritse sitoutumista Hb Alc -epi- * · · • '·' toopin kanssa. Sitoutuneen vasta-aineen määrä määritetään * · liuskassa olevan leima-aineen määrän perusteella ja se 25 osoittaa tuntemattomassa näytteessä olevan glykosyloitu- ·»· neen Hb:n määrän. Leima-aineen sitoutuminen ja sen määrit-täminen suoritetaan tavanomaisella tavalla.
Liitosryhmä R edellä esitetyssä kaavassa voi olla oleellisesti mikä tahansa sopiva ja stabiili rakenne. Täi-30 lainen liitosryhmä R on tavallisesti alifaattinen ketju, • · · joka sisältää 1-20 atomia ilman vetyä ja mukaan lukien * ’ heteroatomit, kuten typpi, happi ja rikki. Glykosyloitu tähde voi olla liitettynä erilaisten ryhmien kautta, jol-loin muodostuu liitosketju R, mukaan lukien metyleeni, 35 eetteri, tioeetteri, imino ja vastaavat yhdisteet. Alan * · 20 104376 ammattimiehellä on tiedossaan suuri määrä liitosryhmiä, joista voidaan valita immunogeenin valmistamista varten. Tavallisesti glykosyloitu peptidi valmistetaan päättämällä se funktionaaliseen ryhmään, kuten amino-, karboksyyli-, 5 tioli-, hydroksyyli- tai maleimidoryhmään, joka on aktiivinen kytkentäreaktiossa sopivaan kantajamolekyylin ryhmään.
Seuraavilla esimerkeillä valaistaan kyseistä keksintöä, mutta niitä ei pidä tulkita keksintöä rajoittavik-10 si.
Esimerkki 1
Vasta-aineiden valmistaminen ja karakterisointi Hb Alc:n glykopeptidiepitoopille a) Syntetisoitiin 11 aminohappoa sisältävä peptidi, 15 jossa oli B-hemoglobiinin 8 N-terminaalista yksikköä ja kaksi tyrosiiniyksikköä ja kysteiiniyksikkö, menetelmällä, jonka ovat esittäneet Gutte, B. ja R.B. Merrifield; J. Am. Chem. Soc., 91:2,501 (1969), jolloin saatiin seuraa-vat peptidit: NH2-valiini-histidiini-leusiini-treoniini- 20 proliini-glutamiinihappo-glutaamihappo-lysiini-tyrosiini- . tyrosiini-kysteiini COOH.
i » ψ Tämän peptidin glykosyloimiseksi 200 mg tätä puh- • ♦ » • ’ distettua peptidiä saatetaan reagoimaan 0,25 molaarisen * * glukoosin kanssa 20 ml:ssa vedetöntä pyridiiniä 48 tunnin ..li' 25 ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Seos kuivataan vakuu- • · · missä. Saatava siirappi suspendoidaan uudelleen 20 milli-molaariseen kaliumfosfaattiin, pH 2,95, ja puhdistetaan HPLC:lla.
Glykopeptidin sisältävät fraktiot liuotetaan 0,1 M 30 trietyyliammoniumasetaattiin, pH 8,5, ja kromatografoidaan • · · *. Affigel-601 boronaattiaffiniteettihartsilla (Biorad), joi- ***** loin glykopeptidi adsorboituu selektiivisesti. Hartsi pes- tään 0,1 M trietyyliammoniumasetaatilla, pH 8,5, ja glyko- t
peptidi eluoidaan 0,1 M trietyyliammoniumasetaatilla, pH
• · 35 5,0. Eluaatti kylmäkuivataan.
• · 21 104376
Tuote suspendoidaan uudelleen 1 ml:aan vettä, saatetaan reagoimaan 500-kertaisen moolaarisen ylimäärän kanssa ditiotreitolia (SH-ryhmän säilyttämiseksi kys-teiinissä) ja pelkistetty peptidi puhdistetaan uudelleen 5 HPLC:lla ja kylmäkuivataan. Tämä glykopeptidi säilytetään -20 eC:ssa typen alla ennen jatkokäyttöä.
b) KLH-MBS konjugaatti, kuten aikaisemmin on esitetty julkaisussa, Lerner R. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 78:3403 (1981), saatetaan reagoimaan kohdan a) tuot- 10 teen kanssa siten, että glykopeptidiä on kaksinkertainen moolisuhde maleimidiin verrattuna kantajassa, 50 mil-limolaarisessa (mM) kaliumfosfaatissa, pH 7,2, yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa.
c) kohdan b) liuos sekoitetaan yhtä suuren tilavuu-15 den kanssa Freund'n täydellistä adjuvanttia, jolloin muodostuu vesi-öljyssä-emulsio, ja 200 pg konjugaattia injektoidaan BALB/cBy hiiriin. Hiirille annetaan tehosteannos 30. ja 60. päivinä, ne tapetaan ja niiden pernat käytetään fuusioon Kohlerin ja Milsteinin, Nature 256:495 (1975), 20 mukaisesti, jolloin saadaan lukuisia hybridoomia. Hybri-. doomat seulotaan, jotta voidaan identifioida ne, jotka « · i tuottavat monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat spesi- • « · | ' ί fisiä glykosyloidulle peptidiepitoopille.
*\ i Alc:lle spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden t 25 seulonta suoritetaan käyttäen ELISA-menetelmää, jossa vas- • · · ta-aine absorboidaan polystyreeni-mikrotiitterilevyjen :*Γ: pinnoille (Linbro). Antigeenit ovat puhdistettuja ihmisen
Alc- ja ei-glukolysoituja Ao-hemoglobiineja. Alc puhdiste- taan ihmisen punasoluhemolysaatista käyttäen kahta eri- .···, 30 laista kromatografista menetelmää. Ensimmäisessä puhdis- • · · tuksessa glykosyloitu hemoglobiini sidotaan boronaattiaf- m • * finiteettihartsin pinnalle, Pierce Chemical Co., Rockford,
Illinois, USA, tuote nro 42 000, valmistajan kuvaamalla tavalla. Tyypillisesti käytetään 1 - 5 g hemoglobiinia 100 ,,,,· 35 ml kohti boronaattihartsia ja sitoutunut (glykohemoglobii- • · 22 104376 ni) fraktio eluoidaan, kuten Pierce Chemical Co., Glyco-Test Bulletin -julkaisussa esitetään, tuote nro 42 000. Eluoitu glykohemoglobiinifraktio tasapainotetaan ionivah-vuudeltaan matalaan puskuriin ja kromatografoidaan ionin-5 vaihtohartsilla, kuten McDonald, M. et ai., J. Biol. Chem., 253:2327 - 2332 (1978) ovat esittäneet. Alc-"piikki" analysoidaan isoelektrisellä fokusoinnilla ja hiilihyd-raattianalyysillä käyttäen tiobarbituurihappoanalyysiä ja tulokset osoittavat, että tämä puhdistusmenetelmä tuotti 10 ultrapuhdasta Alc- hemoglobiinia, koska puhdistetussa materiaalissa on sekä hiilihydraattia että tavallisesta Ao-hemoglobiinista poikkeava isoelektrinen piste hemoglobiini. Samalla tavalla Ao-hemoglobiini puhdistettiin sen ominaisuuden perusteella, ettei se sitoudu boronaattiaffini-15 teettihartsiin, ja sitten se kromatografoitiin ioninvaihdolla Ao-"piikkinä" ioninvaihtokromatografisessa puhdistuksessa. Puhtaat Alc ja Ao-hemoglobiinit adsorboidaan erillisille mikrotiitterilevyille (2 pg/100 μΐ PBS/kuoppa) yön yli 4 eC:ssa. Levyjen vapaat sitoutumispaikat täyte-20 tään l-%:lla BSAtlla PBS:ssa 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja pestään sitten neljä kertaa PBSrlla. Super- . .·. natantti kustakin hybridomasolulinjasta lisätään Alc- ja * · ·
Ao-levylle ja levyjä inkuboidaan huoneenlämpötilassa 60 • · · ! I minuuttia. Levyt pestään neljä kertaa PBS:llä ja toinen • · • *' 25 vasta-aine (kanin anti-hiiri-IgG-peroksidaasi, Miles Labo-
Ml ratories, Inc., Elkhart, Indiana, USA laimennuksena 1:5 • · · 000 1 %:ssa BSA:ssa PBS:ssa) lisätään ja levyjä inkuboi- • · · V · daan 60 minuuttia huoneenlämpötilassa. Levyt pestään neljä kertaa PBS:llä ja 200 μΐ substraattiliuosta (24,3 mM sit-30 ruunahappo, 51,4 M natriumfosfaatti, pH 5,3, joka sisältää 2,2 mM o-fenyleenidiamiinia ja 5,2 mM vetyperoksidia) li-’ . sätään. Reaktio lopetetaan 20 minuutin kuluttua lisäämällä 50 μΐ 8 M H2S04:ta ja peroksidaasireaktion tuote luetaan aallonpituudella 492 nm.
• · • · 23 104376 200 lähtöhybridoomasta, jotka tuottavat vasta-aineita hemoglobiinia vastaan, yhdeksän (9) identifioidaan spesifisiksi Alc-epitoopille, kun taas 191 reagoi sekä Alc:n ja ei-glykosyloidun hemoglobiinin kanssa. Koska etukäteen 5 immunisoidun hiiren seerumilla ei esiinny havaittavaa vas-ta-ainevastetta ihmisen Ao- tai Alc -hemoglobiinille ELISA-menetelmässä, pääasiallinen immuunivaste on kahdeksaa pep-tidisekvenssiä vastaan, jotka ovat yhtä yhteisiä Alc:lle ja Ao:lle. Koska synteettinen peptidi-immunogeeni koostuu 10 hemoglobiinisekvenssin kahdeksasta aminohappotähteestä, hiirien immuunivaste kohdistuu pääasiassa peptidiä eikä hiilihydraattia vastaan (191 200:sta hybridomasta reagoi sekä Ao:n että Alc:n kanssa). Kuten on odotettua, immunisoidun hiiren seerumissa on myös laajasti ristiin reagoi-15 via vasta-aineita, jotka reagoivat sekä Ao:n että Alc:n kanssa, mikä viittaa siihen, ettei spesifisyyttä Alc:lle saavuteta, ellei hybridoomia seulota Alc:lle eikä Ao-hemo-globiinille reaktiivisuuden suhteen. Edullisia hybridoomia, jotka tuottavat vasta-aineita Alc-hemoglobiinia vas-20 taan eivätkä Ao-hemoglobiinia vastaan, talletettiin ATCC:hen identifioituina talletustunnuksin ATCC HB 8639 . ja ATCC HB 8869, 11. lokakuuta 1984 ja 10. heinäkuuta « « « .1985, vastaavasti.
• i · r < * · ! d) Alc:n kanssa vasta-aineen sitomisesta kilpaile- • ’’ 25 vien peptidien identifiointi.
• · ·
Seuraavat peptidit valmistetaan entsyymihajotuk-sella glykosyloidusta 11 aminohappoa sisältävästä lähtö-
IM
·.· · peptidistä GlykoVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Tyr-Tyr-
Cys (Glykopeptidi 1). Kaikki peptidifragmentit puhdiste-30 taan HPLC:lla ja kvantitoidaan aminohapposekvenssillä.
:*·*; Lähtöpeptidin tryptisellä hajottamisella tuotettiin pep- * . tidi Glyko-Val-His-Leu-Thr-ProGlu-Glu-Lys (Glykopeptidi 2). Proliinispesifinen endoproteaasi tuottaa peptidin Glyko-Val-His-Leu-Thr-Pro (Glykopeptidi 3). Peptidi Glyko- ·:·: 35 Val-His-FAD (Glykopeptidi 4), jossa dipeptidi on yhdistet- • m 24 104376 ty N6-aminoheksyyli-FAD:iin ja sitten glykosyloitu, valmistetaan menetelmällä, jonka ovat esittäneet Carrico ja Johnson, US-patentti nro 4 255 566, ja joka on saatu tri. Kin Yip*Itä ja tri. R. Buckler'Itä, Ames Division, Miles 5 Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana USA.
Tyypillisessä kilpailuanalyysissä kutakin peptidiä, kahdeksan nanomoolia - kahdeksan pikomoolia 100 pl:ssa PBS:ää, jossa 7,2 mM Na2HP04, 2,8 mM NaH2P04 ja 127 mM NaCl, pH 7,4, inkuboidaan 100 μ1:η kanssa monoklonaalista solu-10 viljelysupernatanttia 60 minuuttia huoneenlämpötilassa. Tämä seos lisätään polystyreeni mikrotiitterilevylle, joka on päällystetty 1 pg:lla Alc hemoglobiinia/kuoppa. Mikäli peptidi kilpailee vasta-aineen kanssa, ei vasta-aine ole vapaa sitomaan immobilisoitua Alc:ta. Levy pestään neljä 15 kertaa PBSrlla. Toinen vasta-aine kanin anti-hiiri-IgG kytkettynä piparjuuriperoksidaasiin) lisätään 30 minuutin ajaksija levy pestään PBS:lla. Substraatti (2,2 mM o-feny-leenidiamiini) ja vetyperoksidi (0,012 %) lisätään ja syn-tynyt väri mitataan aallonpituudella 492 nm. Tuotteen 20 määrä viittaa kilpailun asteeseen esim. jos tuotetta ei ole yhtään, se merkitsee sitä, että kilpaileva peptidi .kokonaan esti vasta-aineen sitoutumisen immobilisoituun Alc:n. Tulokset osoittavat, että kaikki neljä aikaisemmin I · · ,* I esitettyä glukopeptidiä mukaan lukien Gluko-Val-His-FAD, »Il 25 ovat tehokkaita kilpailijoita. Glykopeptidit 1-4 estävät • » » ···! täysin yhden vasta-aineista, Ab-4:n, sitoutumisen A,_:hen *...· (ks. kuviot 1 - 3). Glykopeptidit 2-3 mutta ei Glyko- • · · V · peptidi 4, estävät toisen vsta-aineen, Ab-3:n (ks. kuviot 1 - 4).
30 Peptidit, joilta puuttuu hiilihydraatti, eivät in- hiboi kilpailevasti, mikä osoittaa, että hiilihydraatti on • . oleellinen epitoopin komponentti ja tuottaa spesifisyyden vasta-aineiden Alc -hemoglobiinin tunnistamiselle (ks. kuvio 1).
• • * 25 104376
Esimerkki 2
Kilpaileva immunoanalyysi Hb Alc:lle Tämä kilpaileva immunoanalyysi perustuu siihen, että käytetään tiettyä määrää hapteeni-leimaa (kuten esi-5 tetään esimerkissä 5), joka kilpailee hajotetun kokoveren Alc:n kanssa immobilisoidun vasta-aineen sitomisesta. Koska vasta-aine tunnistaa sekä Alc:n että hapteenin, näytteessä oleva Alc:n määrä määrää sen hapteeni-leiman määrän, joka sitoutuu vasta-aineeseen. Koska vasta-aine on immobilisoi-10 tu voidaan kaikki sitoutumaton reagenssi poistaa yksinkertaisella pesuvaiheella. Sitoutunut leima voidaan sitten määrittää ja verrata standardiin alkuperäisissä verinäytteissä olevan Alc:n määrittämistä varten.
Analyysi on kehitetty käyttäen kokoverta näytteenä 15 ja menetelmä voidaan jakaa seuraavana esitettäviin vaiheisiin: (1) Solujen hajotus - hemoglobiinin denaturointi
Koska lopullisessa analyysissä tarvitaan kokoverta alle 0,3 μΐ, laimennetaan tarkasti pipetoitavissa oleva 20 määrä verta (5 - 50 μΐ sormenpäästä tai kokoverta) denaturoivaan liuokseen (3 M guanidiini-HCl, 10 mM Tris-HCl, pH
. 7,5) ja liuosta kuumennetaan 56 °C:ssa 2-15 minuuttia.
• · ·
Alempia lämpötiloja voidaan myös käyttää, mutta silloin · · i ! tarvitaan enemmän aikaa näytteen denaturoimiseksi täydel- ' 25 lisesti. Denaturointi (a) inaktivoi koaguloitumismekanis- • « « ;·· min, mikäli näytteitä ei ole valmistettu antikoagulanteis- • · *···' sa; (b) hajotttaa punasolut; (c) denaturoi proteaasit,
Ml \· · entsyymit jne, ja optimaalisesti saattaa esille hemoglo biinin Alc-epitoopin; (d) vaikuttaa joko steriloivasti tai :T: 30 estävästi mikro-organismien kasvuun denaturoidussa veri- näytteessä, vaikka näytettä ei olisi valmistettu ja käsi-* . telty aseptisesti (esim. veri sormenpäästä) ja (e) saa aikaan stabiilin kliinisen näytteen, jota voidaan säilyttää päiviä huoneenlämpötilassa, ilman että sillä on vaiku-*:“: 35 tusta lopulliseen analyysiin.
• · 26 104376 (2) Laimennus ja kilpailu
Pieni määrä denaturoitua kokoverta pipetoidaan tilavuudeltaan kymmenkertaiseen määrään puskuria, joka sisältää hapteeni-leiman. Tämä tehokkaasti laimentaa hemo-5 globiinin analyysiin sopivaan pitoisuuteen ja laimentaa denaturoivan aineen alhaiseen pitoisuuteen, joka ei häiritse vasta-ainetta tai entsyymiaktiivisuutta. Vasta-aineella päällystetty helmi lisätään sitten tietyksi ajaksi, jona aikana vasta-aine sitoutuu joko Alc- hemoglobiiniin 10 tai hapteeni-HRP:en.
(3) Pesu ja lukeminen
Kilpailevan inkuboinnin jälkeen helmi pestään ja leima luetaan sopivan substraatin lisäämisen jälkeen. Tämän jälkeen signaalia verrataan standardiin ja määrite-15 tään alkuperäisessä kokoverinäytteessä olevan Alc:n määrä.
Yhteenveto analyysin yksityiskohdista esitetään seuraavassa:
Helmen päällystysmenetelmä:
Polystyreenihelmet (halkaisija 0,63 cm, peilimäinen 20 pintakäsittely) valmistaa Precision Ball Company, Chicago,
Illinois, USA. Erät seulotaan, jotta saadaan helmiä, joil-. la esiintyy vähiten vaihtelua saman näytteen useissa im-
I I
,/. munoanalyysimäärityksissä. Ennen päällystämistä helmet • · ! pestään absoluuttisella metanolilla ja sen jälkeen vedel- ' ,· 25 lä. Metanolipesu vaikutti merkittävästi alentavan saman • * « ···· näytteen useiden määritysten variaatiokerrointa. Tämän • ·
*··.* jälkeen vasta-aineliuos (5 pg vasta-ainetta/100 μΐ 0,2 M
• · · V · natriumboraattia, pH 8,5, jossa on 0,02 % natriumatsidia) lisätään kosteisiin helmiin ja helmiä pyöritetään yön yli :T: 30 4 °C:ssa. Tämän jälkeen helmet pestään, tyhjät sitoutumis- kohdat täytetään 1 %:lla BSArlla PBS:ssa, jossa on 0,02 % * . natriumatsidia. Tyypillisesti päällystetään 500 - 1 000 | helmeä samalla kerralla ja niitä käytetään viikkoja ilman todisteita vasta-aineaktiivisuuden pienenemisestä. Pääl-·:··: 35 lystyskokeet, joissa käytettiin radioaktiivista vasta- • « 27 - 104376 ainetta osoittivat, että 0,5 pg vasta-ainetta sitoutuu helmeä kohti.
Helmiä käytetään tässä immunoanalyysissä, koska ne pystyvät sitomaan suhteellisen suuria proteiinimääriä.
5 Proteiinin hydrofobinen absorptio polystyreenin pinnalle on käytännöllistä, mutta se voitaisiin varmasti korvata jollakin monista menetelmistä, joissa proteiinit kiinnitetään kovalenttisesti polystyreeniin, funktionalisoi-tuihin hartseihin tai piioksidiin. Polystyreeni voi olla 10 malliltaan myös putki tai kyvetti.
Työskentelymenetelmä on seuraavananlainen: (a) Laimenna 50 μΐ kokoverta 1,0 mitään denaturointiliuosta (3 M guanidiini-HCl, 10 mM Tris, pH 7,5), kuumenna 56 °C:ssa 15 minuuttia, laimenna edelleen 15 100 pl 1,0 mitään denaturointiliuosta.
(b) Lisää 50 μΐ edellä saatua liuosta 0,5 mitään fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) pH 7,5, joka sisältää hapteeni-HPRtää. Inkuboinnit, pesut ja entsymaat-tiset reaktiot suoritetaan kätevästi 48-kuoppaisilla poly- 20 styreenikudosviljelylevyillä.
(c) Lisää vasta-aineella päällystetty helmi ja in- .kuboi 30 minuuttia huoneenlämpötilassa samalla ravistaen.
• · « (d) Pese helmet puskurilla (PBS) (tavallisesti 3 • · ! pesua 1 ml annoksilla).
• · · ’ / 25 (e) Lisää o-fenyleenidiamiinisubstraatti ja vety- • · · ···· peroksidi.
·*** (f) Pysäytä reaktio ja lue tuote 20 minuutin kulut- • · · V · tua. Edellä esitettyä analyysiä käytetään seuraavana esi tettyjen kliinisten tulosten määrittämisessä. Vakiokuvaa-: 30 ja on esitetty kuviossa 4. Kilpailu käyttäen Glykopeptidi l:tä esitetään kuviossa 5. Normaalien ja diabeettisten ' , luovuttajien arviointi esitetään kuviossa 6. Boronaattiaf- ] finiteettimääritykset on suoritettu täsmälleen valmis tajan, Pierce Chemical Co:n (GlycoTest, tuote nro 42 000) :··: 35 kuvaamalla tavalla.
• · 28 104376
Esimerkki 3
Alc -epitoopin optimaalinen esille saattaminen
Ihmisen Alc-epitoopin optimaalinen reaktiivisuus saadaan käsittelemällä natiivia hemoglobiinia (kokoveressä 5 tai hemolysaatissa) menetelmillä tai reagensseilla, jotka saattavat epitoopin esille vasta-aineen sitoutumispaikal-le. Epitoopin optimaalinen esille saattaminen voidaan saada aikaan fysikaalisella denaturoinnilla (lämpö, ultraääni, jne), kemiallisella menetelmällä, jossa käytetään 10 klassisia denaturoivia aineita (urea, guanidiini, SDS, proteaasi) tai fysikaalisten ja kemiallisten menetelmien yhdistelmällä. Tehokkain on menetelmä, jossa kokoveri (50 μΐ) lisätään 1 ml:aan liuosta, jossa on 3 M guanidiinive-tykloridia ja 10 mM Tris-HCl:a, pH 7,4 ja liuosta kuumen-15 netaan 56 °C:seen yli yhdeksi minuutiksi. Saatava näyte toimii optimaalisesti seuraavissa Alc -epitoopin immunoana-lyyseissä. Liuos voidaan laimentaa kymmenenteen osaan puskurilla, jolloin guanidiini laimenee 0,3 M:n pitoisuuteen, jolla on vähän tai ei ollenkaan vaikutusta normaaleihin 20 vasta-aine-antigeeni-vuorovaikutuksiin ja entsyymiak tiivisuuksiin ja on sopiva väliaine seuraavissa immuno- , analyyseissä.
• · » Käytetään esimerkin 2 mukaista kilpailevaa immuno- • · · i analyysiä. Kilpailija on sokeritautisen kokoveressä oleva « « · • / 25 Alc. Kokoverinäyte viedään 3,0 M guanidiiniin 20 °C:ssa, m •••j 37 eC:ssa tai 56 °C:ssa 0 - 320 minuutin ajanjaksoiksi.
*·..* Tulokset (kuvio 7) osoittavat, että ajan kuluessa ··· · 20 °C:ssa tai 37 °C:ssa, epitooppi tulee esille ja siten tehokkaasti kilpailee hapteeni-HRP konjugaatin kanssa. 30 56 °C:ssa epitooppi tulee esille maksimaalisesti viiden :*·*: minuutin kuluttua, joka on aikaisin piste, joka on määri- * , tetty tässä analyysissä. Tulokset osoittavat, että natii- ] vissa hemoglobiini Alc -tetrameerissa epitooppi on sisään päin ja saavuttamattomissa eikä kilpaile lineaarisen syn- •:··* 35 teettisen glukopeptidi-HPR konjugaatin kanssa. Kuitenkin « « 29 104376 mikäli hemoglobiini Ale denaturoidaan, tulee juuri esille saatetusta epitoopista tehokas kilpailija lineaariselle glykopeptidi-entsyymikonjugaatille.
Esimerkki 4 5 Vasta-ainespesifisyyden vertailu: Lampaan polyklo- naalinen vasta-aine verrattuna hiiren monoklonaaliseen vasteeseen
Lammas immunisoidaan, viiteen paikkaan, IM Freundin täydellisessä adjuvantissa esimerkin 1 (b) mukaisella gly-10 kopeptidi-KHL-konjugaatilla (4 mg). Tehosteinjektiot suoritetaan samalla tavalla 30 ja 60 päivän kuluttua. 60 päivän tehosteannos on Freundin epätäydellisessä apuaineessa. Etukäteen immunisoitu seerumi ja immuuniseerumi määritettään niiden AAlc- ja Ao- spesifisyyden suhteen ELISA-ana-15 lyysissä, kuten esitetään esimerkissä 1 (c). Tulokset (ks. kuvio 7) osoittavat, että synteettinen glykopeptidi stimuloi immuunivasteen ihmisen hemoglobiinia vastaan, mutta immunoglobuliinit eivät ole spesifisiä AAlc-hemoglobiinia vastaan. Tätä vastoin hiiren monoklonaaliset vasta-aineet 20 Alc:lle ovat aivan spesifisiä Alc:lle mitattuna samalla analyysillä (esimerkin 1 (c) ELISA-analyysi; ks. kuvio 8).
; Yritykset puhdistaa lampaan antiseerumista immuno- « i · .·. : affinisesti vastaainetta, joka on spesifinen Aleille,
• I I
.* eivät onnistuneet.
• » I
25 Esimerkki 5 • · « 1 1 “** Hapteeni-leima-konjugaattien valmistus Valmistet- • · tiin Glykopeptidi l:n (HPR):n konjugaatti.
• · · ’·* ' Hapteeni-HPR-konjugaatti valmistettiin saattamalla 15 mg piparjuuriperoksidaasia (HPR) reagoimaan 10-kertaisen : 30 molaarisen ylimäärän kanssa MBS:ää (ks. esimerkki 1 b) 50 ml:ssa natriumfosfaattia, 1 mM EDTA, pH 7,0. MBS-HRP-kon-jugaatti puhdistettiin geelisuodatuksella (käyttäen edellä • esitettyä puskuria) ja 0,34 mg glykopeptidihapteenia (Pe-. ' ptidi 1) lisättiin. Lopullinen hapteeni-HPR-konjugaatti '·“· 35 puhdistettiin geelisuodatuksella HPLC:lla ja käytettiin » « 104376 30 laimennuksena 1:1 000 1:100 000 esimerkin 3 mukaisessa kilpailevassa immunoanalyysissä.
Esimerkki 6
Testiliuska-immunoanalyysi Hb Alc:lle 5 a) 1 mg esimerkin 1 (c) mukaista monoklonaalista vasta-ainetta 0,1 M natriumboraattipuskurissa, pH 8,5, voidaan sekoittaa 200-kertaisen molaarisen ylimäärän fluoreseiini-isotiosyanaattia (FITC) ja antaa reagoida 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Fluoreiinilla leimattu mono-10 klonaalinen vasta-aine voidaan puhdistaa geelisuodatuk-sella.
b) Testiliuska (polystyreeni, selluloosa jne), jossa on COOH-ryhmiä, upotetaan 0,5 ml:aan tuntematonta denaturoitua hemolysaattia, pH 7,5. Liuska huuhdotaan pus-15 kurilla pH:ssa 7,5 ja upotetaan puskuroituun liuokseen, jossa on kohdan a) mukaista fluoreseiinileimattua monoklonaalista vasta-ainetta viideksi minuutiksi huoneenlämpö-tilassa. Liuska huuhdellaan uudelleen ja liuskan fluore-senssiaste kuvaa tuntemattoman näytteen Hb Alc:n astetta. 20 Esimerkki 7
Monoklonaalisen vasta-aineen liittäminen reagenssi- . liuskaan ja sen käyttö immunoanalyysissä « « · ; Whatman 1 -suodatinpaperi (7 cm) viedään 20 ml:aan I' \ jääkylmää d-H20:ta ja liuoksen pH säädetään välille 10,5 - • « i * 25 11,5 5 M NaOH:lla. Liuosta tarkkaillaan koko aktivoinnin •"j ajan ja pH pidetään välillä 10,5 - 11,5 lisäämällä tipoit- • · *···* tain 5 M NaOH:ta. Pieni sekoitussauva viedään sen dekant- ··♦ V : terilasin pohjalle, jossa suodatuspaperi on. Tämän jälkeen dekantterilasi viedään jäällä täytettyyn petrimaljaan, ·.· * 30 joko laitetaan magneettisekoittajan päälle. Dekanterila- siin lisätään 1 g kiinteää BrCN:a ja tätä inkuboidaan sa-maila sekoittaen 20 minuuttia (jäissä). Suodatinpaperi • · , poistetaan liuoksesta ja pestään 100 ml:11a jääkylmää tis lattua vettä (d-H20). Tämän jälkeen se pestään jääkylmässä 35 0,2 M Na2HP04-sitruunahappopuskurissa, pH 6,8. Vasta-aine « • · » · · • · 31 104376 (1 mg/ml 0,2M Na2HP04~sitruunahappopuskurissa, pH 6,8) lisätään ja vasta-aineen kytkeytymisen annetaan tapahtua yhden tunnin ajan. Etanoliamiinia (10 ml 1 mM:sta liuosta) lisätään täyttämään reagoimattomat paikat (15 min) ja pa-5 peri pestään fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS, 10 mM NaH2P04, 140 mM NaCl, pH 7,5) reagoimattomien komponenttien poistamiseksi.
Tämä reagenssiliuska upotetaan standardisoituun määrään tuntematonta, denaturoitua hemolysaattia, jossa on 10 vasta-ainesitoutumisen leimattu kilpailija Ale hemoglobiinille. Sopiva kilpailija on glykopeptidi (Glykopeptidi 1), joka on kovalenttisesti kiinnitetty piparjuuriperoksi-daasiin (Hapteeni-HRP). Liuska poistetaan ja huuhdotaan PBS:11a. Liuskaan sitoutunut hemoglobiinin määrä mitataan 15 (määrä on kääntäen verrannollinen näytteen Alc:han ja Alc-hemoglobiini voidaankvantitoida vertaamalla standardinäyt-teisiin.
Esimerkki 8
Alc:n ELISA-määritys 20 Tietty tilavuus denaturoitua verihemolysaattia (100 μΐ) lisätään polystyreenimikrotiitterilevyille ja . annetaan sitoutua huoneenlämpötilassa 60 minuuttia. Levy
I I I
,·, ; pestään neljä kertaa PBS: 11a, jossa on 0,05 % Tween-20:tä
I I
^ (PBST). Monoklonaalinen vasta-aine (sitoutuneena piparjuu- ’ / 25 riperoksidaasiin) lisätään (100 μΐ, 1 μg/ml) PBST:ssa ja M» •**j annetaan reagoida 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Yli- • · *···* määräinen vasta-aine poistetaan pesemällä neljä kertaa V* PBST:lla. Lisätään substraatti (o-fenyleenidiamiini, 2,2 mM) ja H202 (0,012 %) PBS:ssa ja reaktiotuote mitataan aal- 30 lonpituudella 492. Värin voimakkuus kuvaa hemolysaatissa olevaa Alc:n määrää verrattaessa standardiarvoihin.
^ *. Esimerkki 9 « «
Ale:n radioimmunoanalyysi 100 μΐ denaturoitua verihemolysaattia (200 nmoolia '.*·: 35 hemoglobiinia) sekoitetaan 7 nmoolin kanssa jodattua pep- * • · 32 104376 tidiä Glyko-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Cys (500 000 pulssia minuutissa/7 nmoolia). Monoklonaalista vasta-ainetta lisätään määrä, joka on riittävä sitomaan 50 % glykosyloidusta peptidistä, jos verihemolysaatissa on 5 tavallinen (noin 3 %) määrä Alc_ hemoglobiinia. Suuremmat hemoglobiini Alc-arvot kilpailevat peptidin kanssa samalla pienentäen vasta-aineen sitomien pulssien kokonaismäärää. Vasta-aine voidaan ottaa talteen immuunisaostamalla toisella vasta-aineella (kanin anti- hiiri-IgG) tai absorp-10 tiolla proteiini A -päällystetyille hiukkasille. Vasta-aineeseen sitoutunut jodattu peptidimäärä voidaan määrittää gammaisotooppilaskimessa ja se antaa verihemolysaatissa olevan Alc:n määrän verrattaessa standardeihin.
Tulee ymmärtää, että selitys ja esimerkit ovat va-15 laisevia mutta eivät kyseistä keksintöä rajoittavia ja muita suoritusmuotoja, jotka ovat keksinnön hengen ja suo-japiirin mukaisia, on alan ammattilaisten löydettävissä.
i i « f I f I I I
' I
* I « I · I « • f • « ·
• f I I I
« • M ft ···♦ ··· • · • · ··♦ • Φ» € · ft • · · • M • ♦ « * * · • ft ft • · · • ♦ · • ft ft · • • · ft »MH « ft ft • > » ' ft « ft
Claims (10)
1. Monoklonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti, joka sisältää vasta-aineen sitomiskohdan, tunnettu 5 siitä, että se sitoutuu spesifisesti ihmisen hemoglobiinin β-alayksikön glykosyloituun N-terminaaliseen peptidisek-venssiin.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti, tunnettu siitä, et- 10 tä se sitoutuu spesifisesti glykosyloituun peptiditäh-teeseen, jolla on kaava Glyko-(NH)Val-His-AA jossa Glyko-(NH)Vai merkitsee ei-entsymaattisesti glykosyloitunutta valiinitähdettä ja AA on sidos tai yksi 15 tai useampia lisäaminohappotähteitä.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen monoklonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti, tunnettu siitä, että AA on 1 - 12 aminohappoa sisältävä sekvenssi, joka vastaa ihmisen hemoglobiinin β-alayksikön N-päätä.
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen mono klonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti, tunnet - :ti,: t u siitä, että se on muodostettu immunogeeniä vastaan, * · joka sisältää glykosyloitua peptidiä kemiallisesti liitet-tynä immunogeeniseen kantaja-aineeseen, jolloin glykosy- ··· 25 loidussa peptidissä on vähintään kaksi aminohappoyksikköä, jotka vastaavat hemoglobiinin β-alayksikön N-päätä, tai de- IM naturoitua tai hajotettua proteiinia vastaan. • · ·
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen mono- ... klonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti, tunnet- « « · 30. u siitä, että se sitoutuu spesifisesti mainittuun glyko- I « I * syloituun N-terminaaliseen peptidisekvenssiin, kun se on saatettu esille riittävästi, jotta vasta-aineen pääsy sii-; hen on steerisesti mahdollista.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen monoklonaalinen 35 vasta-aine tai sen fragmentti, tunnettu siitä, et- « · 104376 tä mainittu glykosyloitu peptidisekvenssi on saatettu esille vasta-ainetta varten fysikaalisen tai kemiallisen dena-turoinnin tai hajotuksen avulla.
7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen monoklo-5 naalinen vasta-aine tai sen fragmentti, tunnettu siitä, että mainittu glykosyloitu peptidisekvenssi on saatettu esille vasta-ainetta varten kemiallisen denaturoinnin avulla saattamalla se kosketukseen kaotrooppisen aineen, edullisesti guanidiinin, urean, tiosyanaatin tai detergen-10 tin, kanssa.
8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen mono-klonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti, tunnet-t u siitä, että se sitoutuu spesifisesti mainittuun glyko-syloituun N-terminaaliseen peptidisekvenssiin tai hemoglo- 15 biiniin, joka on adsorboitu edullisesti polystyreenistä tai selluloosasta valmistetulle kiinteälle pinnalle.
9. Hybridoomasolulinja, joka erittää monoklonaalis-ta vasta-ainetta, joka sitoutuu spesifisesti ihmisen hemoglobiinin β-alayksikön glykosyloituun N-terminaaliseen 20 peptidisekvenssiin ja jonka ATCC-talletusnumero on HB 8639 tai 8869.
10. Hybridoomien, joiden ATCC-tunnusnumerot ovat HB : 8639 tai HB 8869, tuottamat monoklonaaliset vasta-aineet hemoglobiini Aic:lle. • I « • · « • ·· * • · · • · • · t · · • · · • * · * · · • · · • · « * · · • · · • · · • · · • « f I ( · « · « • « 35 104376
Applications Claiming Priority (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US66581184A | 1984-10-29 | 1984-10-29 | |
| US66581184 | 1984-10-29 | ||
| US76319385 | 1985-08-08 | ||
| US06/763,193 US4647654A (en) | 1984-10-29 | 1985-08-08 | Peptides useful in preparing hemoglobin A1c immunogens |
| US77973185 | 1985-09-27 | ||
| US06/779,731 US4727036A (en) | 1985-08-08 | 1985-09-27 | Antibodies for use in determining hemoglobin A1c |
| US77973085 | 1985-09-27 | ||
| US06/779,730 US4658022A (en) | 1985-08-08 | 1985-09-27 | Binding of antibody reagents to denatured protein analytes |
| FI854187A FI84107C (fi) | 1984-10-29 | 1985-10-25 | HbA1c:s immunologiska bestaemningsfoerfarande som innefattar denaturering |
| FI854187 | 1985-10-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI904226A0 FI904226A0 (fi) | 1990-08-27 |
| FI104376B true FI104376B (fi) | 2000-01-14 |
Family
ID=27514615
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI904226A FI104376B (fi) | 1984-10-29 | 1990-08-27 | Hb A1c:lle spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FI (1) | FI104376B (fi) |
-
1990
- 1990-08-27 FI FI904226A patent/FI104376B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI904226A0 (fi) | 1990-08-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4727036A (en) | Antibodies for use in determining hemoglobin A1c | |
| EP0316306B1 (en) | Monoclonal antibodies special for HB A1c | |
| US4647654A (en) | Peptides useful in preparing hemoglobin A1c immunogens | |
| US4658022A (en) | Binding of antibody reagents to denatured protein analytes | |
| EP0699306B1 (en) | Assay for cardiac troponin i | |
| CA2193323C (en) | Process for preparing a synthetic calibrator for use in sandwich immunoassays, which calibrator consists of an antibody against one of the antibodies used in the assay and of a sequence of the analyte | |
| US5296354A (en) | Kit for the specific assay of angiotensin II | |
| US5173422A (en) | Monoclonal antibodies specific for human glycoalbumin | |
| US5225354A (en) | Monoclonal antibodies specific for human glycoalbumin | |
| US5484735A (en) | Immunoassay of glycosylated proteins employing antibody directed to reductively glycosylated N-terminal amino acids | |
| EP0487621A1 (en) | IMMUNOANALYSIS OF GLYCOSYLATED PROTEINS USING ANTIBODY DIRECTED ON N-TERMINATED GLYCOSYLE AMINO ACIDS | |
| EP0257421B1 (en) | Antibodies for use in determining human glycoalbumin | |
| JP2005504512A (ja) | ｐａｎ特異的モノクローナル抗体 | |
| FI104376B (fi) | Hb A1c:lle spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita | |
| EP1364208B1 (en) | Conjugates of defined stoichiometry | |
| AU619283B2 (en) | Monoclonal antibodies specific for hb a1c | |
| JPH07110879B2 (ja) | モノクロナール抗体 | |
| IE63768B1 (en) | Monoclonal antibodies special for hb alc | |
| JPH0466870A (ja) | 新規な標識体及びそれを用いた免疫測定法 | |
| JPH03152465A (ja) | シュードウリジンの免疫学的測定方法，そのための測定試薬及び試薬キット |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB | Transfer or assigment of application |
Owner name: BAYER CORPORATION |
|
| FG | Patent granted |
Owner name: BAYER CORPORATION |
|
| MA | Patent expired |