JPH0694708A

JPH0694708A - 抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体の検出方法

Info

Publication number: JPH0694708A
Application number: JP26813492A
Authority: JP
Inventors: Kazuyoshi Suzuki; 一好鈴木; Takashi Suzuki; 隆鈴木
Original assignee: NKK Corp; Nippon Kokan Ltd
Current assignee: JFE Engineering Corp
Priority date: 1992-09-09
Filing date: 1992-09-09
Publication date: 1994-04-08

Abstract

(57)【要約】【目的】抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体の検
出方法を提供する。【構成】不溶性担体に固定した精製グルタミン酸デカ
ルボキシラーゼに水性生物試料を接触させ、水性生物試
料中の抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体を精製グ
ルタミン酸デカルボキシラーゼに結合させて抗原抗体反
応複合体を生成させ、続いて抗グルタミン酸デカルボキ
シラーゼ抗体に結合することができると共に標識を有す
る抗体を加え、前記抗原抗体複合体に結合した前記のグ
ルタミン酸デカルボキシラーゼに対する抗体の前記標識
からの信号を検出する。【効果】Ｉ型糖尿病の診断を正確且つ高精度に行うこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗グルタミン酸デカル
ボキシラーゼ抗体の検出方法に関する。本発明方法によ
り、特には血清試料中の抗グルタミン酸デカルボキシラ
ーゼ抗体を検出することにより、Ｉ型糖尿病の診断を正
確に高精度で迅速に行うことができる。

【０００２】

【従来の技術】Ｉ型糖尿病の原因は、膵臓β細胞が破壊
されることによりインスリン産生が減少することによ
る。疾患発病の機序は、膵臓β細胞に対する自己抗体が
産生され、この自己抗体が膵臓β細胞を破壊しているも
のと思われる。事実、患者血中には膵臓細胞を認識する
自己抗体が存在する。従来、この自己抗体が認識する膵
臓由来抗原として、分子量６４ＫＤの膜結合性タンパク
質の存在が示唆されてきたが、確認はされていなかっ
た。１９９０年にＳ．Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖらは、Ｉ型
糖尿病患者血清中に存在する自己抗原が、膵臓細胞に存
在するグルタミン酸デカルボキシラーゼ〔ＧＡＤ：γ−
ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａ
ｓｅ，分子量６４ＫＤ：γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）が
合成されるので、ＧＡＢＡ合成酵素とも称される〕であ
ることを示し、このＧＡＤを指標にして、Ｉ型糖尿病の
診断を行った〔Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３４７，ｐ１５
１−１５６，１９９０〕。

【０００３】Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖらが行った前記の診
断は、ラットの膵臓細胞を³⁵Ｓメチオニン存在下で培養
してラベル化６４ＫＤ含有画分を調製し、この画分を患
者血清と接触させて免疫沈降反応を発生させ、得られた
沈殿物を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、オート
ラジオグラフィーで抗原抗体反応生成物の存在を確認す
るものであった。この方法は、それ以前の測定方法、例
えば、ＩＣＡ（Ｉｓｌｅｔｃｅｌｌｃｙｔｏｐｌａ
ｓｍｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）法、ＩＣＳＡ（Ｉｓ
ｌｅｔＣｅｌｌＳｕｒｆａｃｅＡｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ）法、ＩＡＡ（ＩｎｓｕｌｉｎＡｕｔｏａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ）法、又は糖負荷試験などと比較して正確
で判定精度が高く、Ｉ型糖尿病発症の予測が可能になる
点でも優れている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、Ｂａｅ
ｋｋｅｓｋｏｖらの方法では、生きたままの膵臓細胞を
用いるので取り扱いに注意が必要であり、更にその細胞
中へ放射性アミノ酸を導入する操作や、タンパク質分解
を阻止する条件下でＧＡＤ含有粗画分を調製するなどの
作業が必要であり、極めて煩雑であった。その上、調製
したＧＡＤ含有粗画分は弱い放射性物質³⁵Ｓでラベルし
てあるため、半減期及び感度の面で測定終了までの時間
に制約があった。

【０００５】従って、本発明の目的は、取扱が容易で、
常に一定の結果が得られ、測定時間にも制約のない、抗
グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体の検出方法を提供
し、これによってＩ型糖尿病を正確に高精度に診断する
ことができる手段を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】前記の目的は、本発明の
第１の方法、すなわち、不溶性担体に固定した精製グル
タミン酸デカルボキシラーゼに水性試料を接触させ、水
性試料中の抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体を精
製グルタミン酸デカルボキシラーゼに結合させて抗原抗
体反応複合体を生成させ、続いて抗グルタミン酸デカル
ボキシラーゼ抗体に結合することができると共に標識を
有する抗体を加え、前記抗原抗体複合体に結合した前記
のグルタミン酸デカルボキシラーゼに対する抗体の前記
標識からの信号を検出することを特徴とする、水性試料
中の抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体の検出方法
（以下、固定化ＧＡＤサンドイッチ法と称することがあ
る）によって達成することができる。

【０００７】また、前記の目的は、本発明の第２の方
法、すなわち、不溶性担体に固定した精製グルタミン酸
デカルボキシラーゼに、標識を有する既知量の抗グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼ抗体と水性試料とを接触さ
せ、精製グルタミン酸デカルボキシラーゼに結合した又
は結合しなかった標識を有する抗グルタミン酸デカルボ
キシラーゼ抗体の標識からの信号を検出することを特徴
とする、水性試料中の抗グルタミン酸デカルボキシラー
ゼ抗体の検出方法（以下、固定化ＧＡＤ競合法と称する
ことがある）によって達成することもできる。

【０００８】また、前記の目的は、本発明の第３の方
法、すなわち、標識を付した精製グルタミン酸デカルボ
キシラーゼと水性試料とを接触させ、その水性試料中の
抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体と前記の標識を
付した精製グルタミン酸デカルボキシラーゼとの抗原抗
体反応複合体を生成させ、その抗原抗体反応複合体の前
記標識からの信号を検出することを特徴とする、水性試
料中の抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体の検出方
法（以下、免疫沈降非競合法と称することがある）によ
って達成することもできる。

【０００９】更に、前記の目的は、本発明の第４の方
法、すなわち、不溶性担体に固定したビオチン類に、ア
ビジン類と、ビオチン類を担持した精製グルタミン酸デ
カルボキシラーゼと、水性試料とを接触させて、前記の
不溶性担体に固定したビオチン類に、前記アビジン類及
び前記ビオチン類担持精製グルタミン酸デカルボキシラ
ーゼを介して、前記水性試料中の抗グルタミン酸デカル
ボキシラーゼ抗体を結合させ、続いて抗グルタミン酸デ
カルボキシラーゼ抗体に結合することができると共に標
識を有する抗体を加え、前記の不溶性担体に結合した前
記抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体に結合した前
記標識抗体の前記標識からの信号を検出することを特徴
とする、水性試料中の抗グルタミン酸デカルボキシラー
ゼ抗体の検出方法（以下、固定化ビオチンサンドイッチ
法と称することがある）によって達成することができ
る。

【００１０】また更に、前記の目的は、本発明の第５の
方法、すなわち、不溶性担体に固定したビオチン類に、
アビジン類と、ビオチン類を担持した精製グルタミン酸
デカルボキシラーゼと、水性試料と、標識を有する既知
量の抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体とを接触さ
せ、前記の不溶性担体に固定したビオチン類に、前記ア
ビジン類及び前記ビオチン類担持精製グルタミン酸デカ
ルボキシラーゼを介して結合した又は結合しなかった、
前記の標識を有する抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ
抗体の標識からの信号を検出することを特徴とする、水
性試料中の抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体の検
出方法（以下、固定化ビオチン競合法と称することがあ
る）によって達成することもできる。

【００１１】本発明方法で用いる水性試料は、抗グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼ抗体を含有するおそれのある
試料であれば特に制限されるものではないが、一般には
生物学的試料、特には体液、例えば血清又は尿であり、
特には血清である。本発明方法では、精製酵素ＧＡＤを
用いるので、水性試料のｐＨを適当な緩衝液によって、
中性付近に調整するのが好ましい。また試料調製は室温
でもかまわないが、保存する場合には凍結状態が好まし
い。試料は適当な緩衝液で希釈し、使用する。

【００１２】本発明で用いる精製ＧＡＤは、哺乳動物、
例えば、ラット、マウス又はブタの脳又は膵臓から得る
ことができる。すなわち、これらの摘出臓器を適当な緩
衝液中で破砕し、遠心分離処理して得た破砕液の上清を
数段階のカラム・クロマトグラフィーで処理して、ＧＡ
Ｄ精製品を得る。このＧＡＤの至適ｐＨは７．０付近で
あるので、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）を使
用し、ＧＡＤ酵素活性の失われない条件下で精製を行
う。精製段階においては、タンパク質分解を避けるた
め、タンパク分解酵素阻害剤を含有する緩衝液を用い、
低温下（例えば約４℃）にて分離、精製を行う。

【００１３】本発明の第１の方法（固定化ＧＡＤサンド
イッチ法）及び第２の方法（固定化ＧＡＤ競合法）で
は、前記の精製ＧＡＤを不溶性担体に固定して用いる。
不溶性担体としては、免疫学的測定法で公知の任意の担
体（例えば、ウエル、ラテックス粒子又はビーズ）を用
いることができる。不溶性担体に精製ＧＡＤを固定する
方法も特に限定されず、精製ＧＡＤを直接又は適当な架
橋剤を介して担体に固定させることができる。精製ＧＡ
Ｄを直接担体に固定させる場合には、精製ＧＡＤ溶液と
担体（ウェルラテックス粒子、ビーズ等）を適当な時間
（１〜２４時間）、適当な温度（４〜４０℃）でインキ
ュベートすれば良い。

【００１４】前記の架橋剤としてはアビジン類とビオチ
ン類との組合せ及び／又はモノクローナル抗体を用いる
ことができる。本明細書において「アビジン類」とは、
アビジン及びその類似物質（例えば、ストレプトアビジ
ン）を意味し、「ビオチン類」とは、ビオチン、その類
似物質及びその誘導体（例えば、ビオシチン、デスチオ
ビオチン、オキシビオチン、ビスノルビオチン又はテト
ラノルビオチン）を意味する。

【００１５】アビジン類とビオチン類との組合せを用い
る場合には、公知の方法により、最初にアビジン類を不
溶性担体に固定する〔例えば、日本産科婦人科学会雑誌
ＡＣＴＡＯＢＳＴＧＹＮＡＥＣＪＰＮＶｏ
ｌ．３６，Ｎｏ．５，ｐ７６３〜ｐ７７０；核医学，２
７巻２号（１９９０）ｐ１５５〜ｐ１６３参照〕。一
方、別途に精製ＧＡＤにビオチン類を結合させておき、
このビオチン類担持精製ＧＡＤを、前記の不溶性担体固
定化アビジン類に接触させ、アビジン類とビオチン類を
結合させ、こうしてアビジン類とビオチン類とを介し
て、精製ＧＡＤを不溶性担体に固定させることができ
る。なお、精製ＧＡＤにビオチン類を結合させるには、
精製ＧＡＤを０．１Ｍ−ＮａＨＣＯ₃（ｐＨ８．２〜
８．６）で透析した後、架橋剤と結合したビオチン（Ｎ
−ヒドロキシサクシニイミドビオチン；ピアス社等）と
混合反応させ、ＰＢＳ等の緩衝液で透析して、ビオチン
類担持ＧＡＤを得ることができる。

【００１６】架橋剤として、精製酵素ＧＡＤと特異的に
反応するモノクローナル抗体を用いることができる。こ
のモノクローナル抗体を、直接又はアビジン類とビオチ
ン類とを介して不溶性担体に固定する。ここで用いるモ
ノクローナル抗体は公知の方法により、精製ＧＡＤを免
疫源とし、ＧＡＤとの反応特異性を用いてスクリーニン
グすることによって確立したハイブリドーマから得るこ
とができる。前記モノクローナル抗体は公知の方法で前
記不溶性担体に固定することができる。アビジン類とビ
オチン類を用いる場合には、最初にアビジン類を不溶性
担体に固定し、更に別途に調製しておいたビオチン類担
持モノクローナル抗体を接触させてアビジン類とビオチ
ン類を結合させ、こうしてアビジン類とビオチン類とを
介して、モノクローナル抗体を不溶性担体に固定させる
ことができる。モノクローナル抗体にビオチン類を結合
させるには、前記のように、Ｎ−ヒドロキシサクシニイ
ミドビオチン等を用いてビオチン類担持抗体を得る。

【００１７】本発明の第３の方法では、前記の精製ＧＡ
Ｄに標識を担持させて用いる。標識は特に制限されない
が、例えば、放射性同位体（例えば、¹²⁵Ｉ、
¹³¹Ｉ）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）、蛍光物
質（例えば、フルオレセインイソチオシアネート）を挙
げることができる。これらの標識は公知の方法で精製Ｇ
ＡＤに付すことができる。例えば、放射性同位体で標識
する場合は、クロラミンＴ法を使用すればよい。また、
本発明の第４及び第５の方法で用いる、ビオチン類を担
持した精製ＧＡＤは、前記の方法で精製ＧＡＤにビオチ
ン類を結合させて調製することができる。

【００１８】本発明の第１、第２、第４及び第５の方法
では、被検水性試料中に含まれている検査対象物質・抗
グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体と競合的に精製Ｇ
ＡＤと反応させる抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗
体（好ましくはモノクローナル抗体）、或いは、精製Ｇ
ＡＤに特異的に結合した検査対象物質・抗グルタミン酸
デカルボキシラーゼ抗体に結合できる抗体（好ましくは
モノクローナル抗体）にも標識を付すことがある。この
場合に用いることのできる標識も特に制限されないが、
例えば、放射性同位体（例えば、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ）、酵
素（例えば、ペルオキシダーゼ）、又は蛍光物質（例え
ば、フルオレセインイソチオシアネート）を挙げること
ができる。これらの標識は公知の方法で抗体に付すこと
ができる。また、前記の第１〜第５の方法において用い
た各標識からの信号（例えば、放射能活性、酵素活性又
は蛍光）は各々公知の方法で検知することができる。

【００１９】本発明の第１の方法（固定化ＧＡＤサンド
イッチ法）は、被検水性試料中に含まれている検査対象
物質・抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体を、精製
酵素ＧＡＤを利用して検出又は測定するに当たり、精製
ＧＡＤを固相に固定し、水性試料中の検査対象物質・抗
グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体を前記精製ＧＡＤ
に結合させ、形成された抗原抗体複合体に標識抗体を結
合させるサンドイッチ法である。

【００２０】この方法では、前記の種々の方法で不溶性
担体に固定した精製ＧＡＤを用いることができる。次
に、必要により適当な緩衝液で希釈した水性試料を加え
ると、水性試料中に抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ
抗体が存在する場合には、その抗体が特異的に前記の固
定化ＧＡＤと結合し、不溶性担体上に抗原抗体反応複合
体が形成される。複合体が形成された担体を洗浄した
後、抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体と結合する
ことができると共に標識を有する抗体を添加して前記複
合体に特異的に結合させ、前記複合体に結合しなかった
抗体を洗浄除去し、前記複合体に結合した標識化抗体の
標識からの信号を検出することにより、試料中の抗グル
タミン酸デカルボキシラーゼ抗体の存在を確認すること
ができる。添加する標識化抗体の量と、複合体結合標識
化抗体の標識からの信号とを比較して、試料中の抗グル
タミン酸デカルボキシラーゼ抗体量を定量することもで
きる。

【００２１】この固定化ＧＡＤサンドイッチ法は、具体
的には、例えばＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅ
ｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）によっ
て行うのが好ましい。ＥＬＩＳＡでは、標識として酵
素、例えば、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダ
ーゼを用い、それらの酵素に応じた基質溶液を加えて呈
色させ、マイクロプレートリーダーなどで測定する。

【００２２】本発明の第２の方法（固定化ＧＡＤ競合
法）は、被検水性試料中に含まれている検査対象物質・
抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体を、精製酵素Ｇ
ＡＤを利用して検出又は測定するに当たり、精製ＧＡＤ
を固相に固定し、水性試料中の検査対象物質・抗グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼ抗体と既知量の標識抗グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼ抗体とを競合的に前記精製Ｇ
ＡＤに結合させ、精製ＧＡＤに結合した又は結合しなか
った標識抗体の量から検査対象物質の量を測定する競合
法である。

【００２３】この方法では、前記と同様の種々の方法で
不溶性担体に固定した精製ＧＡＤを用い、必要により適
当な緩衝液で希釈した水性試料と、既知量（予め正確に
測定した一定量）の標識抗グルタミン酸デカルボキシラ
ーゼ抗体（水性試料中の抗グルタミン酸デカルボキシラ
ーゼ抗体と結合部位において競合するもの）とを同時に
接触させる。一定時間攪拌すると、水性試料中に抗グル
タミン酸デカルボキシラーゼ抗体が存在する場合には、
その試料中の抗体と標識抗グルタミン酸デカルボキシラ
ーゼ抗体とが競合的に精製ＧＡＤと結合するので、固定
化ＧＡＤと結合した標識抗グルタミン酸デカルボキシラ
ーゼ抗体、及び固定化ＧＡＤと結合しなかった標識抗グ
ルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体を、例えば洗浄など
によって分離し、それらのいずれか一方を測定すること
により、試料中の抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗
体量を定量することもできる。標識物としては、ペルオ
キシダーゼ等の酵素を用いてもよいし、放射性物質のヨ
ード等を用いても良い。

【００２４】本発明の第３の方法（免疫沈降非競合法）
は、被検水性試料中に含まれている検査対象物質・抗グ
ルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体を、精製酵素ＧＡＤ
を利用して検出又は測定するに当たり、標識精製ＧＡＤ
に水性試料中の検査対象物質・抗グルタミン酸デカルボ
キシラーゼ抗体を結合させ、生成した抗原抗体複合体に
結合した標識抗体の量から検査対象物質の量を測定する
非競合法である。この免疫沈降非競合法では、最初に、
必要により適当な緩衝液中の標識化精製ＧＡＤと、必要
により適当な緩衝液で希釈した水性試料とを接触させ
る。水性試料中に抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗
体が存在すると、その抗体が特異的に前記の標識化精製
ＧＡＤと結合し、抗原抗体反応複合体が形成される。こ
うして得られた複合体を分離し、前記標識からの信号を
検出することにより、試料中の抗グルタミン酸デカルボ
キシラーゼ抗体の存在を確認することができる。添加す
る標識化精製ＧＡＤの量と、抗原抗体反応複合体の標識
からの信号とを比較して、試料中の抗グルタミン酸デカ
ルボキシラーゼ抗体量を定量することもできる。

【００２５】この免疫沈降非競合法は、具体的には、例
えばＲＩＡ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）によ
って行うのが好ましい。ＲＩＡでは、標識として放射性
同位体を有する精製ＧＡＤの緩衝液と、緩衝液で希釈し
た水性試料とをプラスチックチューブ内で接触させる。
水性試料中に抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体が
存在すると、抗原抗体反応複合体が生成するので、これ
をプロティンＧ・ビーズによって吸着、沈殿させ、電気
泳動にかけ、放射性同位体を適当な感光紙に露光して現
像すると、分子量約６４ＫＤにバンドが現れ、このバン
ドから抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体の存在及
び／又は量を検出又は測定することができる。あるいは
電気泳動を実施することなく、プロテインＧ・ビーズに
吸着した放射能活性を測定することにより、同様の検出
又は測定が可能である。

【００２６】本発明の第４の方法（固定化ビオチンサン
ドイッチ法）では、被検水性試料中に含まれている検査
対象物質・抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体を、
精製酵素ＧＡＤを利用して検出又は測定するに当たり、
まず、不溶性担体に固定したビオチン類に、アビジン類
と、ビオチン類を担持した精製ＧＡＤと、水性試料とを
接触させる。すると、固定化ビオチン類にアビジン類が
結合し、続いてそのアビジン類にビオチン類担持精製Ｇ
ＡＤが結合する。水性試料中に抗グルタミン酸デカルボ
キシラーゼ抗体が存在する場合には、その試料中の抗体
が精製ＧＡＤに結合するので、結局、測定対象抗体が、
ビオチン類−アビジン類−ビオチン類担持精製ＧＡＤを
介して不溶性担体に固定される。測定対象抗体が固定さ
れた担体を洗浄した後、抗グルタミン酸デカルボキシラ
ーゼ抗体と結合すると共に標識を有する抗体を添加して
前記測定対象抗体に特異的に結合させ、前記測定対象抗
体に結合しなかった抗体を洗浄除去し、前記測定対象抗
体に結合した標識化抗体の標識からの信号を検出するこ
とにより、試料中の抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ
抗体の存在を確認することができる。添加する標識化抗
体の量と、複合体結合標識化抗体の標識からの信号とを
比較して、試料中の抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ
抗体量を定量することもできる。

【００２７】この固定化ビオチンサンドイッチ法を実施
するには、例えば既知の方法によってビオチン類で標識
したタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）を不溶
性担体に固定化した後、アビジン類を添加して洗浄し、
続いてビオチン標識精製ＧＡＤを加えて洗浄する。こう
してタンパク質−ビオチン類−アビジン類を介して不溶
性担体に固定されたＧＡＤに被検水性試料を加える。

【００２８】本発明の第５の方法（固定化ビオチン競合
法）では、被検水性試料中に含まれている検査対象物質
・抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体を、精製酵素
ＧＡＤを利用して検出又は測定するに当たり、不溶性担
体に固定したビオチン類に、アビジン類と、ビオチン類
を担持した精製ＧＡＤと、水性試料と、既知量の標識抗
グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体（水性試料中の抗
グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体と結合部位におい
て競合するもの）とに接触させる。前記の固定化ビオチ
ンサンドイッチ法と同様に、固定化ビオチン類にアビジ
ン類が結合し、続いてそのアビジン類にビオチン類担持
精製ＧＡＤが結合する。水性試料中に抗グルタミン酸デ
カルボキシラーゼ抗体が存在する場合には、その試料中
の抗体が既知量の標識抗グルタミン酸デカルボキシラー
ゼ抗体と競合的に前記固定化ＧＡＤに結合し、固定化Ｇ
ＡＤに結合した又は結合しなかった標識抗体の量から検
査対象物質の量を測定することができる。

【００２９】前記の固定化ビオチンサンドイッチ法又は
固定化ビオチン競合法を実施する際には、ビオチン類
を、例えば特開平４−５８１５５号公報記載の方法によ
り、例えば、ビオチン類担持タンパク質（例えば、ビオ
チン化アルブミン）の形で不溶性担体に固定することが
できる。また、これらの方法で用いる不溶性担体も、前
記と同様に、免疫学的測定法で公知の任意の担体（例え
ば、ウエル、ラテックス又はビーズ）である。

【００３０】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。参考例１：精製グルタミン酸デカルボキシラーゼの調製（１）ＧＡＤの精製マウス脳（約３０個）を、約５倍量の氷冷５mMエチレン
ジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、１mMアミノエ
チルイソチオウロニウムブロミド（ＡＥＴ）、０．１mM
フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）及び
０．５mMピリドキサル燐酸中でホモジナイズし、得られ
た細胞破砕液を７％酢酸でｐＨ５．４に調整した。５１
℃で５分間攪拌してから遠心処理（１５，０００×ｇ；
１時間）し、その上清を、５mM燐酸緩衝液（ｐＨ６．
３）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム（２×１
０cmカラム）に通した。次に、非結合タンパク質を前記
緩衝液で洗浄した後、結合タンパク質を０〜２００mMの
ＫＣｌ濃度勾配を用いて溶出した。各画分のグルタミン
酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）活性を測定した後、Ｇ
ＡＤ活性部分を採取し、２５０mM−ＫＣｌ含有５mM燐酸
緩衝液（ｐＨ６．３）で透析した。透析液を、前記の緩
衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（２×１
０cmカラム）に通し、２００mlの５〜３００mM燐酸緩衝
液濃度勾配で結合タンパク質を溶出した。各フラクショ
ンのＧＡＤ活性を測定し、活性部分を採取した。採取し
た活性画分を１５０mM燐酸緩衝液（ｐＨ６．３）で透析
した後、同じ緩衝液で平衡化したフェニルセファロース
カラム（１×１０cmカラム）に通し、燐酸濃度を１５０
mMから５mMに直線的に減少させながら、同時にＴｒｉｔ
ｏｎｘ−１００の濃度を０％から１％直線的に上昇さ
せ、結合タンパク質を溶出した。ＧＡＤ活性部分を集
め、５mM燐酸緩衝液で透析し、濃縮を行い、５mM燐酸緩
衝液（ｐＨ６．３）で平衡化した分子篩いカラム（東ソ
ー；Ｓ−３０００ＨＰＬＣカラム）に通した。同じ緩
衝液で溶出した後、ＧＡＤ活性画分を集め、この画分を
精製ＧＡＤとし、以下の実施例及び比較例で使用した。
ＧＡＤ活性の測定は下記のように実施した。すなわち、
ＧＡＤ酵素を含む試料２５μｌに、２０mM−Ｌ−グルタ
メート、０．１ｎＣｉ放射性グルタミン酸（１−
¹⁴Ｃ）、５０mM燐酸カリウム、０．２mM燐酸ピリドキサ
ール及び１mM−ＡＥＴを含む溶液（ｐＨ６．８）１０μ
ｌを加え、反応を開始した。生じた放射性ＣＯ₂を１Ｍ
のハイアミン・ハイドロオキサイドに浸した濾紙に吸着
させ、その放射能活性を測定することで、ＧＡＤ活性を
測定した。

【００３１】（２）¹²⁵Ｉ標識工程前記工程（１）で得られた精製グルタミン酸デカルボキ
シラーゼ５０μｇを２５mM燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．５）５０μｌに溶解し、更に２５０mM燐酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．５）１０μｌを添加した。このタン
パク質溶液に放射性ヨウ化ナトリウム（Ｎａ¹²⁵Ｉ）
２．５μｌ（アマーシャム社；ＰＭＳ３０）及びクロラ
ミンＴ溶液（０．５mg／ml；２５mM燐酸ナトリウム含
有；ｐＨ７．５）を加え、１０分間反応させた。Ｎａ₂
Ｓ₂Ｏ₅溶液（０．５mg／ml；２５mM燐酸ナトリウム含
有；ｐＨ７．５）２５μｌで反応を停止した後、２５mM
燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１５０μｌ及びウ
シ血清アルブミン溶液（１０mg／ml；２５mM燐酸ナトリ
ウム含有；ｐＨ７．５）１２μｌを加えた。この混合液
をセファデックスＧ−２５カラム（５ml；ファルマシア
社）でゲル濾過法により、標識タンパク質含有タンパク
質画分を未反応¹²⁵Ｉから分離した。こうして得られた
タンパク質画分を以下の実施例及び比較例で使用した。

【００３２】参考例２：血清試料の調製臨床所見（血糖値、多尿、口渇など）によって糖尿病
（但し、Ｉ型又はII型の判別はされていない）と診断さ
れている患者９名（Ａ〜Ｉ）、及び健常人１名（Ｊ）か
らそれぞれ血清を採取した。この得られた１０種の試料
を以下の実施例及び比較例で用いた。

【００３３】実施例１：ＲＩＡによる測定（１）前記参考例２で調製した各血清試料５μｌをマイ
クロチューブ中に入れ、前記参考例１（２）で調製した
¹²⁵Ｉ標識精製グルタミン酸デカルボキシラーゼ０．６
２５μｇを含むＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）２０μｌの
溶解液を前記マイクロチューブに加え、２５℃にて１時
間ときどき攪拌しながらインキュベーションした。１時
間後に遠心処理（１０，０００ｒｐｍ；２分間）して沈
殿を分離した。（２）次に、前記（１）で得た沈殿１０μｌをプロット
し、電気泳動槽（第一化学社製）に入れて室温で６０mA
にて５０分間電気泳動を行った。分子量マーカーとして
は、カルボニックアンヒドラーゼ（２９ＫＤ）、卵白ア
ルブミン（４３ＫＤ）、ウシ血清アルブミン（６８Ｋ
Ｄ）、ホスホリラーゼｂ（９７ＫＤ）及びミオシン（２
００ＫＤ）を使用した。その後、濾紙上でゲルを１時間
乾燥させた後、Ｘ線フィルムに１５時間感光してオート
ラジオグラフィーをとった。得られた結果を図１に示
す。なお、図１において、レーンＡ〜レーンＩは、それ
ぞれ糖尿病患者Ａ〜Ｉからの各血清試料、そしてレーン
Ｊは健常人Ｊからの血清である。図１から明らかなよう
に、レーンＢ、Ｄ、Ｇ及びＨでは６４ＫＤ付近に¹²⁵Ｉ
による明瞭なバンドが観察され、血清中に抗グルタミン
酸デカルボキシラーゼ自己抗体をもつので、Ｉ型糖尿病
患者であることがわかる。

【００３４】実施例２：ＥＬＩＳＡによる測定前記参考例１（１）で得られた精製グルタミン酸デカル
ボキシラーゼを適当量のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で
希釈し、０．５μｇ／ml濃度の分散液を、９６ウエルＥ
ＬＩＳＡプレート（ヌンク，イムノモジュール）に１０
０μｌ／ウエルの量で分注し、４℃で一晩放置して酵素
を固定させた。各ウエルを生理食塩水−０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０（１００μｌ）で洗浄した後、１％ＢＳＡを
含むＰＢＳ溶液でブロッキング処理を行い、前記参考例
２で調製した１０種の血清試料をＰＢＳで約１００倍に
希釈した希釈液を１００μｌ／ウエルの量で分注し、室
温で２時間放置した。次に、各ウエルを生理食塩水−
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（１００μｌ）で洗浄した
後、ＨＲＰ標識抗ヒト抗体（フナコシ薬品）約０．１μ
ｇ／mlを含有する二次抗体液１００μｌを各ウエルに加
え、室温で１時間放置した。続いて、各ウエルを生理食
塩水−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（１００μｌ）で洗浄
した後、オルトフェニレンジアミン０．２５mg／mlとＨ
₂Ｏ₂０．０１５％とを含む基質液１００μｌを各ウエ
ルに分注し、室温で３０分間放置した。２Ｎ−Ｈ₂ＳＯ
₄を加えて反応を停止させ、反応液の吸光度を４９２ｎ
ｍにて分光光度計（タイテック，マルチスキャンＭＣＣ
−３４０）で測定した。ΔＯＤ値（６４Ｋ値−ＢＳＡ
値）の結果を表１に示す。表１において、健常人（Ｊ）
からの血清試料のΔＯＤ値（０．１５１）よりもかなり
高い数値を示した血清は糖尿病患者Ｄ及びＨからの血清
試料であり、これらの患者の糖尿病は、前記実施例１の
結果を併せ考慮すれば、Ｉ型糖尿病と判断することがで
きる。また、糖尿病患者Ｂ及びＧからの血清試料のΔＯ
Ｄ値（０．２３６及び０．１９２）は、健常人（Ｊ）か
らの血清試料のΔＯＤ値（０．１５１）と比較して、そ
れほど高くはないが、前記実施例１の結果を併せ考慮す
れば、Ｉ型糖尿病と判断することができる。更に、他の
糖尿病患者Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ及びＩは、前記実施例１及び
２の結果からII型糖尿病であると判断することができ
る。

【００３５】比較例１：ＩＣＡ／ＩｇＧ法カニクイザルから膵臓組織を摘出し、約５mm立方の組織
ブロックを作成した。このブロックを包埋剤（Ｏ．Ｃ．
Ｔ．コンパウンド；マイルス）に包埋し、クライオスタ
ットで厚さ５μｍの切片を作成した。その凍結切片をス
ライド・グラスに固定し、直ちに冷風（ドライヤー）で
乾燥した後、前記参考例２で調製した血清試料２５〜５
０μｌを組織切片上に滴下し、室温で１時間静置し、Ｐ
ＢＳで洗浄した後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトイムノグロブリ
ン〔ＴＡＧＯ〕で染色し、再びＰＢＳで洗浄した後、蛍
光顕微鏡（オリンパス）で観察し、ランゲルハウス氏島
に認められる特異的蛍光から判定した結果を表１に示
す。表１において、＋は陽性、−は陰性、±は疑陽性、
そして空欄は未検査である。なお、このＩＣＡ（Ｉｓｌ
ｅｔｃｅｌｌｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ）法では、組織調製が煩雑で、一定した結果
を得るための切片の調製に特殊な技術が必要である。ま
た、判定はサンプル上の蛍光を顕微鏡下で肉眼で判定す
るので、観察者の主観が入り、客観性に乏しい。更に、
Ｉ型糖尿病以外の自己免疫疾患でも陽性となる場合があ
る。

【００３６】比較例２：ＩＣＡ／ＣＦ法（蛍光抗体補体
法）前記比較例１と同様の方法で調製した組織切片に、血清
試料を滴下し、室温で３０分間放置し、ＰＢＳで洗浄し
た後、補体源（Ｃ₃を含む）を滴下した。室温で３０分
間静置してから洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣ₃（ＣＡ
ＰＰＥＬ）で染色し、再びＰＢＳで洗浄した後、蛍光顕
微鏡（オリンパス）によって観察した。ランゲルハウス
氏島に認められる特異的蛍光から判定した結果を表１に
示す。表１において、＋は陽性、±は疑陽性、そして空
欄は未検定である。なお、このＩＣＡ／ＣＦ法も、前記
のＩＣＡ／ＩｇＧ法と同様に、煩雑で、判定に客観性に
乏しく、Ｉ型糖尿病以外の自己免疫疾患でも陽性となる
場合がある。

【００３７】比較例３：ＩＣＳＡ法ラットの膵臓を摘出し、コラゲナーゼ（シグマ）で処理
してランゲルハウス氏島を単離した。この膵細胞をＭＥ
Ｍ培地で１昼夜培養した後、ランゲルハウス氏島を分散
し、ランゲルハウス氏島単離細胞を得た。参考例２で調
製した血清試料と混和し、３７℃で３０分間静置した。
細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心処理し、得られた細
胞をハンクス氏液で洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗ヒト抗体
（ＭＢＬ）と３７℃にて３０分間反応させた。続いて、
ハンクス氏液約５mlで洗浄してから、蛍光顕微鏡（オリ
ンパス）で蛍光発色細胞を観察し、蛍光を発する細胞が
２０％以上の場合を陽性とした。１５％以上２０％未満
の場合を疑陽性、１５％未満の場合を陰性と判定した。
結果を表１に示す。表１において、−は陰性、そして空
欄は未検定である。このＩＣＳＡ（ＩｓｌｅｔＣｅｌ
ｌＳｕｒｆａｃｅＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）法では、
生きた膵臓細胞の調製操作が煩雑で、しかも、調製細胞
の均一性が得られないので、測定結果にばらつきが生じ
る。また、細胞表面上の蛍光を顕微鏡下で肉眼で判別す
るため、判定に主観が入り、客観的評価に欠ける。更
に、Ｉ型糖尿病以外の自己免疫疾患でも、陽性となる場
合がある。

【００３８】

【表１】

【００３９】

【発明の効果】本発明によれば、生きた膵臓細胞の調製
や細胞培養などの煩雑な操作が不要になり、しかも安定
な酵素を用いるので、測定結果も安定したものとなる。
また、正確で高精度で迅速な測定を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】電気泳動の結果を示す図面に代わる写真であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】不溶性担体に固定した精製グルタミン酸
デカルボキシラーゼに水性試料を接触させ、水性試料中
の抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体を精製グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼに結合させて抗原抗体反応複
合体を生成させ、続いて抗グルタミン酸デカルボキシラ
ーゼ抗体に結合することができると共に標識を有する抗
体を加え、前記抗原抗体複合体に結合した前記のグルタ
ミン酸デカルボキシラーゼに対する抗体の前記標識から
の信号を検出することを特徴とする、水性試料中の抗グ
ルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体の検出方法。
【請求項２】精製グルタミン酸デカルボキシラーゼを
不溶性担体に直接固定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】不溶性担体に固定したアビジン類、及び
そのアビジン類に結合したビオチン類を介して精製グル
タミン酸デカルボキシラーゼを不溶性担体に固定する請
求項１に記載の方法。
【請求項４】不溶性担体に固定した抗グルタミン酸デ
カルボキシラーゼモノクローナル抗体を介して精製グル
タミン酸デカルボキシラーゼを不溶性担体に固定する請
求項１に記載の方法。
【請求項５】不溶性担体に固定したアビジン類、その
アビジン類に結合したビオチン類、及びそのビオチン類
に結合した抗グルタミン酸デカルボキシラーゼモノクロ
ーナル抗体を介して精製グルタミン酸デカルボキシラー
ゼを不溶性担体に固定する請求項１に記載の方法。
【請求項６】不溶性担体に固定した精製グルタミン酸
デカルボキシラーゼに、標識を有する既知量の抗グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼ抗体と水性試料とを接触さ
せ、精製グルタミン酸デカルボキシラーゼに結合した又
は結合しなかった標識を有する抗グルタミン酸デカルボ
キシラーゼ抗体の標識からの信号を検出することを特徴
とする、水性試料中の抗グルタミン酸デカルボキシラー
ゼ抗体の検出方法。
【請求項７】精製グルタミン酸デカルボキシラーゼを
不溶性担体に直接固定する請求項６に記載の方法。
【請求項８】不溶性担体に固定したアビジン類、及び
そのアビジン類に結合したビオチン類を介して精製グル
タミン酸デカルボキシラーゼを不溶性担体に固定する請
求項６に記載の方法。
【請求項９】不溶性担体に固定した抗グルタミン酸デ
カルボキシラーゼモノクローナル抗体を介して精製グル
タミン酸デカルボキシラーゼを不溶性担体に固定する請
求項６に記載の方法。
【請求項１０】不溶性担体に固定したアビジン類、そ
のアビジン類に結合したビオチン類、及びそのビオチン
類に結合した抗グルタミン酸デカルボキシラーゼモノク
ローナル抗体を介して精製グルタミン酸デカルボキシラ
ーゼを不溶性担体に固定する請求項６に記載の方法。
【請求項１１】標識を付した精製グルタミン酸デカル
ボキシラーゼと水性試料とを接触させ、その水性試料中
の抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体と前記の標識
を付した精製グルタミン酸デカルボキシラーゼとの抗原
抗体反応複合体を生成させ、その抗原抗体反応複合体の
前記標識からの信号を検出することを特徴とする、水性
試料中の抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体の検出
方法。
【請求項１２】不溶性担体に固定したビオチン類に、
アビジン類と、ビオチン類を担持した精製グルタミン酸
デカルボキシラーゼと、水性試料とを接触させて、前記
の不溶性担体に固定したビオチン類に、前記アビジン類
及び前記ビオチン類担持精製グルタミン酸デカルボキシ
ラーゼを介して、前記水性試料中の抗グルタミン酸デカ
ルボキシラーゼ抗体を結合させ、続いて抗グルタミン酸
デカルボキシラーゼ抗体に結合することができると共に
標識を有する抗体を加え、前記の不溶性担体に結合した
前記抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体に結合した
前記標識抗体の前記標識からの信号を検出することを特
徴とする、水性試料中の抗グルタミン酸デカルボキシラ
ーゼ抗体の検出方法。
【請求項１３】不溶性担体に固定したビオチン類に、
アビジン類と、ビオチン類を担持した精製グルタミン酸
デカルボキシラーゼと、水性試料と、標識を有する既知
量の抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体とを接触さ
せ、前記の不溶性担体に固定したビオチン類に、前記ア
ビジン類及び前記ビオチン類担持精製グルタミン酸デカ
ルボキシラーゼを介して結合した又は結合しなかった、
前記の標識を有する抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ
抗体の標識からの信号を検出することを特徴とする、水
性試料中の抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体の検
出方法。