KR20160126055A - 당쇄를 포함하는 표적 물질의 검출용 시약, 검출 방법, 및 당쇄를 포함하는 표적 물질을 검출하기 위해서 이용되는 담체 및 그 제조 방법 - Google Patents

당쇄를 포함하는 표적 물질의 검출용 시약, 검출 방법, 및 당쇄를 포함하는 표적 물질을 검출하기 위해서 이용되는 담체 및 그 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특정한 당쇄를 포함하는 당단백질 등의 검출에 유용한 표적 물질의 검출 방법, 표적 물질의 검출용 시약, 담체 및 상기 담체의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

당쇄를 포함하는 표적 물질의 검출용 시약, 검출 방법, 및 당쇄를 포함하는 표적 물질을 검출하기 위해서 이용되는 담체 및 그 제조 방법{REAGENT FOR DETECTING TARGET SUBSTANCE CONTAINING SUGAR CHAIN, DETECTION METHOD, CARRIER USED IN DETECTION OF TARGET SUBSTANCE CONTAINING SUGAR CHAIN, AND METHOD FOR MANUFACTURING SAID CARRIER}
본 발명은 표적 물질의 검출용 시약에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 특정한 당쇄를 포함하는 당단백질 등의 검출에 유용한 표적 물질의 검출 방법, 표적 물질의 검출용 시약, 담체 및 상기 담체의 제조 방법에 관한 것이다.
당쇄는 일반적으로 글리코시드 결합에 의해서 공유결합한 복수의 단당으로 구성되는 화합물이다. 이러한 당쇄는, 예를 들면 단백질 또는 지질과 결합해 당단백질 또는 당지질을 형성한다.
당쇄를 포함하는 표적 물질 등을 분석하는 방법으로서는, 예를 들면 당쇄와 결합하는 렉틴을 이용하여 상기 당쇄 또는 표적 물질을 분석하는 방법이 제안되어 있다(예를 들면, 특허문헌 1 및 2를 참조).
특허문헌 1에 기재된 방법은 당쇄에 상호작용을 나타내는 단백질과 당쇄 또는 복합 당질 상의 당쇄와의 상호작용을 이용하여 당쇄 구조를 해석하는 방법이다. 특허문헌 1에 기재된 방법에서는 상기 당쇄에 상호작용을 나타내는 단백질인 렉틴이, 에폭시기를 활성기로서 가지는 화합물을 통해서 기판에 고정화된 어레이가 이용되고 있다.
또, 특허문헌 2에 기재된 방법은 당단백질인 Mac-2 결합 단백질(Mac-2-binding protein; 이하, 「M2BP」라고도 함)의 당쇄와 결합하는 렉틴인 위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda)의 렉틴(Wisteria floribunda Agglutinin)(이하, 「WFA」라고도 함) 등을 이용하여 M2BP를 측정하는 방법이다. 특허문헌 2에 기재된 방법에서는 상기 렉틴으로서 상기 렉틴에 비오틴이 결합한 비오틴화 렉틴이 스트렙타아비딘을 통해서 고정화된 자성 입자, 상기 렉틴이 고정화된 어레이 등이 이용되고 있다.
이들 특허문헌 1 및 2에 기재된 방법에서는 렉틴의 활성을 충분히 발현시켜 당쇄를 검출하기 위해서, 천연의 렉틴의 서브유닛 구조를 유지한 상태로 상기 렉틴이 고상으로 고정화되어 있다.
미국 특허 출원 공개 제2007/202535호 명세서 미국 특허 출원 공개 제2012/172247호 명세서
그러나, 렉틴은 당쇄와의 반응시에, 입체 구조가 유지되고 있는 것을 필요로 하지만, 용액 중에서 장기간에 걸쳐 입체 구조를 안정적으로 유지하는 것이 어렵고, 충분한 반응성을 확보하기 어렵다.
본 발명은 상기 종래 기술의 실정을 감안하여 이루어진 것으로, 표적 물질에 대한 높은 반응성을 가지고, 게다가 보존 안정성이 뛰어난 표적 물질의 검출용 시약, 표적 물질을 검출하기 위해서 이용되는 담체 및 상기 담체의 제조 방법 및 높은 감도 및 높은 재현성을 확보할 수 있는 표적 물질의 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 하나의 측면은 WFA와 결합하는 당쇄를 포함하는 표적 물질을 검출하기 위한 시약으로서, WFA가 2량체화된 2량체 WFA가 고상 담체에 고정화된 2량체 WFA 고정화 담체를 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 표적 물질의 검출용 시약을 포함한다.
본 실시 형태에 관한 표적 물질의 검출용 시약은 2량체 WFA 고정화 담체를 함유하고 있으므로, 당쇄, 특히 말단에 N-아세틸-D-갈락토사민[IUPAC명: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토오스] 잔기(이하, 「GalNAc 잔기」라고도 함)를 가지는 당쇄에 대한 결합능을 유지하면서도, 천연에 존재하는 WFA(4량체 WFA)가 고상 담체에 고정화된 담체를 함유하는 시약과 비교해서 상기 당쇄에 대한 높은 반응성을 가지고, 게다가 보존 안정성이 뛰어나다. 따라서, 본 실시 형태에 관한 표적 물질의 검출용 시약을 당쇄를 포함하는 표적 물질의 검출에 이용함으로써, 높은 감도 및 높은 재현성을 얻을 수 있다.
본 실시 형태에 관한 표적 물질의 검출용 시약에서는 2량체 WFA가, 비오틴과 비오틴 결합 단백질을 통해서 고상 담체에 고정화되어 있는 것이 바람직하다.
또, 본 실시 형태에 관한 표적 물질의 검출용 시약에서는 2량체 WFA가 비오틴화 2량체 WFA이며, 또한 고상 담체에 비오틴 결합 단백질이 고정화되어 있고, 비오틴화 2량체 WFA가 비오틴 결합 단백질을 통해서 고상 담체에 고정화되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 측면은 WFA와 결합하는 당쇄를 포함하는 표적 물질의 검출 방법으로서, (A) WFA가 2량체화된 2량체 WFA가 고상 담체에 고정화된 2량체 WFA 고정화 담체와, 표적 물질을 포함하는 시료와, 표적 물질에 특이적으로 결합하는 표지 물질을 접촉시킴으로써, 고상 담체 상에 2량체 WFA와 표적 물질과 표지 물질을 포함하는 복합체를 형성시키는 공정, 및 (B) 공정(A)에서 얻어진 복합체 중의 표지 물질을 측정함으로써, 표적 물질을 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 물질의 검출 방법을 포함한다.
본 실시 형태에 관한 표적 물질의 검출 방법은 2량체 WFA 고정화 담체와, 표적 물질을 포함하는 시료를 접촉시킴으로써, 고상 담체 상에 2량체 WFA와 표적 물질을 포함하는 복합체를 형성시킨다는 조작이 채용되고 있다. 이러한 조작이 채용되고 있으므로, 본 실시 형태에 관한 표적 물질의 검출 방법에 의하면, 높은 반응성으로 효율적으로 2량체 WFA와 표적 물질의 당쇄를 결합시킬 수 있다. 따라서, 본 실시 형태에 관한 표적 물질의 검출 방법에 의하면, 높은 감도를 확보할 수 있다. 또, 2량체 WFA 고정화 담체에 이용되고 있는 2량체 WFA는 보존 안정성이 뛰어나다. 따라서, 본 실시 형태에 관한 표적 물질의 검출 방법에 의하면, 높은 재현성을 확보할 수 있다.
본 실시 형태에 관한 표적 물질의 검출 방법에서는 표지 물질이, 표적 물질에 특이적으로 결합하는 표지 항체인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 측면은 WFA와 결합하는 당쇄를 포함하는 표적 물질을 검출하기 위해서 이용되는 담체로서, WFA가 2량체화된 2량체 WFA와, 고상 담체를 가지고, 2량체 WFA가 고상 담체 상에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 담체를 포함한다.
본 실시 형태에 관한 담체에서는 2량체 WFA가 고상 담체 상에 고정화되어 있다. 그 때문에, 본 실시 형태에 관한 담체는 천연에 존재하는 WFA(4량체 WFA)가 고상 담체에 고정화된 담체와 비교해서 상기 당쇄에 대한 높은 반응성을 가지고, 보존 안정성이 뛰어나다. 따라서, 본 실시 형태에 관한 WFA 고정화 시약을 당쇄를 포함하는 표적 물질의 검출에 이용함으로써, 높은 감도 및 높은 재현성을 얻을 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서는 WFA와 결합하는 당쇄를 포함하는 표적 물질을 검출하기 위해서 이용되는 담체의 제조 방법으로서, (I) WFA를 2량체화하여 2량체 WFA를 얻는 공정, 및 (Ⅱ) 공정(I)에서 얻어진 2량체 WFA를 고상 담체에 고정화하여 2량체 WFA 고정화 담체를 얻는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 담체의 제조 방법을 포함한다.
본 실시 형태에 관한 담체의 제조 방법은 WFA를 2량체화하여, 얻어진 2량체 WFA를 고상 담체에 고정화한다는 조작이 채용되고 있다. 이러한 조작이 채용되고 있으므로, 본 실시 형태에 관한 담체의 제조 방법에 의하면, 천연에 존재하는 WFA(4량체 WFA)가 고정화된 담체와 비교해서 상기 당쇄에 대한 높은 반응성을 가지고, 또한 보존 안정성이 뛰어난 WFA 고정화 담체를 얻을 수 있다.
본 실시 형태에 관한 담체의 제조 방법에서는 공정(I)에서, 비오틴을 포함하는 가교제를 함유하는 용액과, WFA를 혼합하여 비오틴화 2량체 WFA를 조제하는 것이 바람직하다.
또, 본 실시 형태에 관한 담체의 제조 방법에서는 공정(Ⅱ)에서, 고상 담체로서 비오틴 결합 단백질이 고정화된 담체를 이용하여 담체 중의 비오틴 결합 단백질과 비오틴화 2량체 WFA를 결합시킴으로써 2량체 WFA를 고상 담체에 고정화하는 것이 바람직하다.
또, 본 실시 형태에 관한 담체의 제조 방법에서는 공정(I)에서, 가교제를 함유하는 용액과, WFA를 [WFA/가교제]의 몰비가 1/10 이하(다만 0을 포함하지 않음)가 되도록 접촉시킴으로써 2량체 WFA를 얻는 것이 바람직하다.
추가로, 본 실시 형태에 관한 담체의 제조 방법에서는 가교제가 2량체 WFA 중의 아미노기와 가교를 형성하는 가교제인 것이 바람직하다. 이러한 가교제는 N-히드록시숙신이미드에스테르기, 이소티오시아노기, 클로로설폰기, 클로로카르보닐기, 옥시에틸렌기, 탄소수 1~4의 클로로알킬기, 알데히드기 및 카르복실기로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 1종의 관능기를 2량체 WFA 중의 아미노기에 대한 반응기로서 가지고 있는 것이 바람직하다.
또, 비오틴과 반응기가 스페이서를 통해서 결합하고 있는 것이 바람직하다.
본 발명에 의하면, 표적 물질에 대한 높은 반응성을 가지고, 게다가 보존 안정성이 뛰어난 표적 물질의 검출용 시약, 표적 물질을 검출하기 위해서 이용되는 담체 및 상기 담체의 제조 방법 및 높은 감도 및 높은 재현성을 확보할 수 있는 표적 물질의 검출 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 시험예 1에서, WFA와 가교제의 혼합비와, 반응 산물의 예상 분자량과의 관계를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 시험예 2에서, M2BP를 표적 물질로서 이용했을 때의 WFA 감작 농도와 발광 강도의 관계를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 시험예 3에서, M2BP를 표적 물질로서 이용했을 때의 2량체 WFA 감작 농도와 발광 강도의 관계를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 시험예 4에서, M2BP를 표적 물질로서 이용했을 때의 잔존 활성의 경시적 변화를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 시험예 5에서, Muc-1을 표적 물질로서 이용했을 때의 잔존 활성의 경시적 변화를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 시험예 6에서, Muc-1을 표적 물질로서 이용했을 때의 잔존 활성의 경시적 변화를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7a는 시험예 7에서, 담관암 환자의 검체 1을 이용하여 2량체 WFA 감작 농도와 Muc-1에 대한 상대 반응성의 관계를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7b는 시험예 7에서, 담관암 환자의 검체 2를 이용하여 2량체 WFA 감작 농도와 Muc-1에 대한 상대 반응성의 관계를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7c는 시험예 7에서, 담관암 환자의 검체 3을 이용하여 2량체 WFA 감작 농도와 Muc-1에 대한 상대 반응성의 관계를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
(표적 물질의 검출용 시약)
본 실시 형태의 표적 물질의 검출용 시약(이하, 「본 실시 형태의 시약」이라고도 함)은 위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda)의 렉틴(WFA)과 결합하는 당쇄를 포함하는 표적 물질을 검출하기 위한 시약으로서, 상기 WFA가 2량체화된 2량체 WFA가 고상 담체에 고정화된 2량체 WFA 고정화 담체를 함유하고 있는 것을 특징으로 하고 있다.
천연에 존재하는 위스테리아 플로리분다의 렉틴은 4개의 서브유닛으로 구성되는 4량체의 단백질이다. 본 명세서에서, 특별히 언급이 없는 한, 4량체의 위스테리아 플로리분다의 렉틴을 단순히 「WFA」로 표기하거나, 혹은 「4량체 WFA」로 표기한다. 또, 본 명세서에서, 4량체 WFA를 2량체화함으로써 얻어진 산물을, 「2량체 WFA」로 표기한다.
WFA(4량체 WFA)는 말단에 GalNAc 잔기를 가지는 당쇄와 결합한다[필라(Piller) 등, Eur.J. Biochem., 191, 461-466(1990) 참조]. 또, WFA(4량체 WFA)는 말단에 갈락토오스(Gal) 잔기를 가지는 당쇄와도 결합한다. 본 실시 형태에서는 바람직하게는 GalNAc 잔기를 가지는 당쇄를 표적 물질로 한다. 본 발명자들은 4량체 WFA를 2량체화하여 얻어진 2량체 WFA도, 상기와 같은 당쇄에 결합하는 활성을 가지고 있는 것을 알아냈다. 또, 본 발명자들은 상기 2량체 WFA를 고정화한 고상 담체를 이용한 시약이, 4량체 WFA를 고정화한 고상 담체를 이용한 시약과 비교해서 높은 반응성을 나타내는 점을 알아냈다. 추가로, 본 발명자들은 상기 시약의 보존 안정성이 4량체 WFA를 이용한 시약의 보존 안정성과 비교해서 현저하게 높은 것을 알아냈다. 본 발명은 이들 지견에 근거해서 이루어진 것이다.
이와 같이, 본 실시 형태의 시약은 2량체 WFA가 고정화된 2량체 WFA 고정화 담체를 함유하고 있으므로, 상기 당쇄에 대한 높은 반응성을 가지고, 게다가 보존 안정성이 뛰어나다. 따라서, 본 실시 형태의 표적 물질의 검출용 시약을, 당쇄를 포함하는 표적 물질의 검출에 이용함으로써, 높은 감도 및 높은 재현성을 얻을 수 있다.
본 명세서에서, 상기 WFA와 결합하는 당쇄를 포함하는 표적 물질은 말단에 GalNAc 잔기 또는 Gal 잔기를 가지는 당쇄를 포함하는 물질이다. 상기 WFA와 결합하는 당쇄를 포함하는 표적 물질로서는, 예를 들면 M2BP, α1 산성 당단백질(AGP), Muc-1, 신경세포 접착 분자 L1(L1CAM), KL-6 항원 등의 당단백질이나 당지질 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되는 것은 아니다. 이들 표적 물질은 말단에 GalNAc 잔기 또는 Gal 잔기를 가지는 당쇄를 포함하고, WFA와 결합하는 점에서 공통되고 있다.
M2BP 및 AGP는 간장의 섬유화나 간장암의 마커로서 이용된다. 따라서, 본 실시 형태의 시약에 의한 M2BP 및 AGP의 검출 결과는 피험자의 간장의 섬유화 레벨을 판정하는 지표가 될 수 있다.
Muc-1은 담관암의 마커로서 이용된다. 따라서, 본 실시 형태의 시약에 의한 Muc-1의 검출 결과는 피험자의 담관이 담관암을 가지고 있는지 여부의 지표가 될 수 있다.
L1CAM는 담관암, 대장암, 유방암, 신경계 또는 중피(中皮)성의 종양 등의 종양 마커로서 이용된다. 따라서, 본 실시 형태의 시약에 의한 L1CAM의 검출 결과는 피검사자의 담관, 대장, 유방, 신경계, 중피 등이 종양을 가지고 있는지 여부의 지표가 될 수 있다.
KL-6 항원은 간질성 폐렴의 마커로서 이용된다. 따라서, 본 실시 형태의 시약에 의한 KL-6 항원의 검출 결과는 피검사자의 폐장(肺臟)의 섬유화 레벨을 판정하는 지표가 될 수 있다.
본 실시 형태의 시약에 이용되는 고상 담체는 입자, 기판, 멤브레인 등이어도 된다. 입자로서는, 예를 들면 자성 입자, 폴리스티렌 입자, 라텍스 입자 등이 이용된다. 기판으로서는, 예를 들면 유리 기판, 실리콘 기판, 폴리스티렌제의 플레이트 등이 이용된다. 멤브레인으로서는, 예를 들면 니트로셀룰로오스 멤브레인, 폴리불화비닐리덴 멤브레인 등이 이용된다. 고상 담체로서 입자를 이용하는 경우에는 상기 입자는 용매 중에 분산되어 있는 것이 바람직하다. 용매로서는, 예를 들면 정제수, 완충액 등이 예시된다. 상기의 고상 담체 중, 고상 담체와 반응액의 분리 및 용매의 치환이 용이한 점에서, 자성 입자를 이용하는 것이 바람직하다.
고상 담체로서 상기 자성 입자를 이용하는 경우, 상기 자성 입자의 평균 입자 지름은 본 실시 형태의 2량체 WFA 고정화 담체의 용도 등에 따라 상이한 점에서, 2량체 WFA 고정화 담체의 용도 등에 따라 적절히 결정하는 것이 바람직하다. 상기 자성 입자의 평균 입자 지름은 통상 1~3μm, 바람직하게는 1.5~2.5μm, 보다 바람직하게는 1.8~2.2μm이다. 또한 상기 평균 입자 지름은 레이저 회절식 입도 분포 측정 장치[(주) 시마즈 제작소 제, 상품명: SALD 시리즈]를 이용하여 광산란법에 따라 측정함으로써 구해진 값이다.
상기 2량체 WFA는 비오틴과 비오틴 결합 단백질을 통해서 상기 고상 담체에 고정화되어 있는 것이 바람직하다. 비오틴 결합 단백질은 비오틴에 대한 결합성을 가지는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 아비딘, 스트렙타아비딘, 타마비진(등록상표) 등이 예시된다.
비오틴과 비오틴 결합 단백질을 이용하는 경우, 상기 2량체 WFA가 비오틴화 2량체 WFA이며, 또한 상기 고상 담체에 비오틴 결합 단백질이 고정화되어 있고, 상기 비오틴화 2량체 WFA가 상기 비오틴 결합 단백질을 통해서 상기 고상 담체에 고정화되어 있는 것이 바람직하다. 이 경우, 고상 담체에 고정화되는 비오틴 결합 단백질의 양은 2량체 WFA 고정화 담체의 용도 등에 따라 상이한 점에서, 2량체 WFA 고정화 담체의 용도 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.
본 실시 형태의 시약에서의 2량체 WFA 고정화 담체의 함유량은 본 실시 형태의 시약의 용도 등에 따라 상이한 점에서, 본 실시 형태의 시약의 용도에 따라 적절히 결정하는 것이 바람직하다. 본 실시 형태의 시약에서의 2량체 WFA 고정화 담체의 함유량은 결합 가능량의 관점에서, 바람직하게는 0.1질량% 이상, 보다 바람직하게는 0.48질량% 이상이며, 자동 분석기에서의 교반 효율의 관점에서, 바람직하게는 2질량% 이하, 보다 바람직하게는 1질량% 이하이다.
본 실시 형태의 시약은 표지 물질을 포함하고 있어도 된다. 표지 물질은 시그널 발생 물질과, 표적 물질 결합부를 포함한다. 시그널 발생 물질은 표적 물질 결합부를 통해서 표적 물질에 결합하고 있다.
시그널 발생 물질은 시그널을 발생하는 물질이어도 되고, 시그널을 발생시키는 물질을 가지고 있어도 된다. 시그널을 발생하는 물질로서는 구체적으로는 형광 색소, 방사성 동위체 등을 들 수 있다. 시그널을 발생시키는 물질은 화학 반응을 촉매함으로써 반응액에 발광, 형광, 발색 등의 시그널을 발생시키는 물질이면 된다. 시그널을 발생시키는 물질로서는 구체적으로는 알칼리포스파타제, 퍼옥시다제 등의 효소가 예시된다. 상기 효소를 이용하는 경우에는 효소에 기질을 반응시켜, 반응 산물로부터 발생하는 발광, 형광 또는 발색이 검출된다.
표적 물질 결합부는 표적 물질에 특이적으로 결합하는 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 표적 물질 결합부로서는 적합하게는 표적 물질에 특이적으로 결합하는 항체가 이용된다. 표적 물질 결합부는 표적 물질에 특이적으로 결합하는 1차 물질(예를 들면, 항체 등)과, 1차 물질에 결합하고, 또한 시그널 발생 물질을 포함하는 물질(예를 들면, 표지 항체 등)으로 구성되어 있어도 된다. 이 경우, 시그널 발생 물질은 2 종류의 항체를 통해서 표적 물질에 결합하게 된다. 또한 3 종류 이상의 항체를 통해서 표적 물질에 결합시키는 것도 가능하지만, 반응 공정이 많아져, 검출 감도의 저하 등을 초래할 가능성을 고려할 필요가 있다. 표적 물질 결합부로서 이용되는 항체는, 예를 들면 커런트·프로토콜스·인·이뮤놀로지(Current Protocols in Immunology)에 기재된 방법[[존 E. 콜리건(John E. Coligan) 편, 존 와일리 & 선즈사(John Wiely & Sons, Inc), 1992년 발행] 등에 기재된 관용의 방법에 의해, 당쇄를 포함하는 표적 물질의 전부 또는 일부, 상기 표적 물질과 WFA의 결합 부위를 이용하여 동물을 면역함으로써 용이하게 제작할 수 있다. 표지 물질에 의한 상기 항체의 표지는 표지 물질의 종류에 따른 수법으로 용이하게 행할 수 있다. 또한 본 실시 형태에서는 상기 항체 대신에, 상기 항체를 정제 후, 펩티다제 등에 의해 처리함으로써 얻어진 항체 단편을 이용하여도 된다.
상기 표지 물질은 바람직하게는 상기 표적 물질에 특이적으로 결합하는 표지 항체이다.
또, 본 실시 형태의 시약은 안정화제, pH조정제, 킬레이트제, 비특이 반응 억제제, 방부제 등을 적절히 함유하고 있어도 된다.
2량체 WFA 고정화 담체 및 표지 물질은 각각 다른 용기에 수용된 시약 키트로도 제공될 수 있다. 본 명세서에서, 「시약」은 시약 키트도 포함한다. 또, 시약 키트는 다른 용기에 수용된 세정액을 포함하고 있어도 된다. 표지 물질이 효소를 가지는 경우에는 상기 효소에 대한 기질을 추가로 포함하고 있어도 된다.
이상 설명한 바와 같이, 본 실시 형태의 시약은 말단에 GalNAc 잔기 또는 Gal 잔기를 가지는 당쇄에 대한 높은 반응성을 가지고, 게다가 보존 안정성이 뛰어난 점에서, 말단에 GalNAc 잔기 또는 Gal 잔기를 가지는 당쇄를 포함하는 물질의 검출에 이용함으로써, 높은 감도 및 높은 재현성을 얻을 수 있다. 따라서, 본 실시 형태의 시약은 당쇄를 포함하는 표적 물질, 특히 말단에 GalNAc 잔기 또는 Gal 잔기를 가지는 당쇄를 포함하는 표적 물질의 검출(정성적 검출 또는 정량적 검출)에 유용하다.
(2량체 WFA 고정화 담체 및 그 제조 방법)
본 실시 형태의 2량체 WFA 고정화 담체는 WFA와 결합하는 당쇄를 포함하는 표적 물질을 검출하기 위해서 이용되는 담체로서, 2량체 WFA와, 고상 담체를 가지고, 상기 2량체 WFA가 상기 고상 담체 상에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하고 있다.
이와 같이, 본 실시 형태의 2량체 WFA 고정화 담체는 상기 2량체 WFA가 상기 고상 담체 상에 고정화되어 있으므로, 말단에 GalNAc 잔기 또는 Gal 잔기를 가지는 당쇄에 대해서 높은 반응성을 가지고, 게다가 보존 안정성이 뛰어나다. 본 실시 형태의 2량체 WFA 고정화 시약을, 상기 당쇄를 포함하는 표적 물질의 검출에 이용함으로써, 높은 감도 및 높은 재현성을 얻을 수 있다.
본 실시 형태의 2량체 WFA 고상 담체는 상술한 본 실시 형태의 시약에 포함되는 2량체 WFA 고정화 담체와 동일하다.
다음에, 본 실시 형태의 담체(2량체 WFA 고상 담체)의 제조 방법(이하, 「본 실시 형태의 제조 방법」이라고도 함)을 설명한다. 본 실시 형태의 제조 방법은 WFA와 결합하는 당쇄를 포함하는 표적 물질을 검출하기 위해서 이용되는 2량체 WFA 고정화 담체의 제조 방법으로서,
(I) 상기 WFA를 2량체화하여 2량체 WFA를 얻는 공정, 및
(Ⅱ) 상기 공정(I)에서 얻어진 2량체 WFA를 고상 담체에 고정화하여 2량체 WFA 고정화 담체를 얻는 공정,
을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.
본 실시 형태의 제조 방법에서는 우선 WFA를 2량체화하여 2량체 WFA를 얻는다[공정(I)]. 상기 공정(I)은 4량체 WFA를 2량체화시키는 방법에 따라 실시된다. 일반적으로 단백질의 서브유닛의 해리는 단백질 중의 설프히드릴기와 반응하는 설프히드릴 시약(SH 시약)에 의해서 실시되는 것이 많다. 그러나, 본 실시 형태에서는 비오틴을 포함하는 가교제와, 4량체 WFA를 접촉시킴으로써 효율적으로 4량체 WFA를 2량체화시킬 수 있다.
상기 공정(I)에서, 비오틴을 포함하는 가교제를 이용하는 경우, 상기 가교제는 상기 4량체 WFA 중의 아미노기와 가교를 형성하는 가교제인 것이 바람직하다. 상기 가교제로서는 구체적으로는 N-히드록시숙신이미드에스테르기, N-히드록시숙신이미드에스테르기, 이소티오시아노기, 클로로설폰기, 클로로카르보닐기, 옥시에틸렌기, 탄소수 1~4의 클로로알킬기, 알데히드기 및 카르복실기로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 1종의 관능기를 상기 4량체 WFA 중의 아미노기에 대한 반응기로서 가지고 있는 가교제가 예시된다. 상기 가교제를 이용하면, 효율적으로 4량체 WFA를 2량체화시키는 것이 가능하다.
상기 비오틴을 포함하는 가교제는 WFA와의 반응성, 제조시에서의 취급성 및 표적 물질의 검출시에서의 반응성을 향상시키는 관점에서, 비오틴과 상기 반응기가 스페이서를 통해서 결합하고 있는 것이 바람직하다. 이러한 스페이서로서는, 예를 들면 아미노헥사노일기(즉, 아미노카프로일기) 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다.
또, 상기 공정(I)에서, 상기 가교제를 이용하는 경우, 가교제를 함유하는 용액과, 상기 WFA를 접촉시킴으로써 2량체 WFA를 얻을 수 있다. 구체적으로는 상기 공정(I)에서, 상기 비오틴을 포함하는 가교제를 이용하는 경우, 상기 비오틴을 포함하는 가교제를 함유하는 용액과, WFA를 혼합하여 비오틴을 포함하는 2량체 WFA(예를 들면, 비오틴화 2량체 WFA 등)를 조제할 수 있다. [WFA/가교제]의 몰비는 바람직하게는 1/10 이하, 보다 바람직하게는 1/20 이하이다. 한편, 상기 [WFA/가교제]의 몰비의 하한값은 WFA 고정화 담체의 용도 등에 따라 2량체 WFA가 얻어진 범위에서 적절히 결정할 수 있다. 상기 [WFA/가교제]의 몰비는 가교제의 사용량과 생성하는 2량체 WFA의 수율의 밸런스를 고려하면, 1/100 이상으로 할 수 있다.
다음에, 상기 공정(I)에서 얻어진 2량체 WFA를 고상 담체에 고정화하여 2량체 WFA 고정화 담체를 얻는다[공정(Ⅱ)]. 고상 담체에 대한 2량체 WFA의 고정화는 특별히 한정되는 것이 아니고, 예를 들면 비오틴과 비오틴 결합 단백질의 특이적 결합, 정전 상호작용, 소수적인 상호작용, 수소 결합, 공유 결합, 변성 작용에 의한 물리적 흡착 등을 이용할 수 있다.
공정(I)에서, 비오틴을 포함하는 가교제를 함유하는 용액과, WFA를 혼합하여 비오틴을 포함하는 2량체 WFA를 조제한 경우에는 공정(Ⅱ)에서, 상기 고상 담체로서 비오틴 결합 단백질이 고정화된 담체를 이용하여 상기 담체 중의 비오틴 결합 단백질과 상기 비오틴화 2량체 WFA를 결합시킴으로써 상기 2량체 WFA를 상기 고상 담체에 고정화하는 것이 바람직하다.
이상 설명한 바와 같이, 본 실시 형태의 2량체 WFA 고정화 담체는 천연에 존재하는 WFA가 고정화된 담체와 비교해서 말단에 GalNAc 잔기 또는 Gal 잔기를 가지는 당쇄에 대한 높은 반응성을 가지고, 게다가 보존 안정성이 뛰어나다. 따라서, 말단에 GalNAc 잔기 또는 Gal 잔기를 가지는 당쇄를 포함하는 물질의 검출에 이용함으로써, 높은 감도 및 높은 재현성을 얻을 수 있다. 따라서, 본 실시 형태의 2량체 WFA 고정화 담체는 당쇄를 포함하는 표적 물질, 특히 말단에 GalNAc 잔기 또는 Gal 잔기를 가지는 당쇄를 포함하는 표적 물질의 검출(정성적 검출 또는 정량적 검출)에 유용하다.
(표적 물질의 검출 방법)
본 실시 형태의 검출 방법은 WFA와 결합하는 당쇄를 포함하는 표적 물질을 검출하는 방법(이하, 「본 실시 형태의 검출 방법」이라고도 함)이다.
본 실시 형태의 검출 방법에서는 우선 2량체 WFA 고정화 담체와, 상기 표적 물질을 포함하는 시료와, 표지 물질을 접촉시킴으로써, 상기 고상 담체 상에 상기 2량체 WFA와 상기 표적 물질과 표지 물질을 포함하는 복합체를 형성시킨다[공정(A)].
공정(A)에서는 2량체 WFA 고정화 담체로서 전술한 실시 형태의 2량체 WFA 고정화 담체를 이용할 수 있다.
공정(A)에서는 표지 물질로서 전술한 본 실시 형태의 시약에 포함되는 표지 물질을 이용할 수 있다.
공정(A)에서는 2량체 WFA 고정화 담체와, 표적 물질을 포함하는 시료와, 표지 물질의 접촉 순서는 특별히 한정되지 않는다. 즉, 상기 접촉 순서는 하기 (a)~(c)의 어느 하나여도 된다:
(a) 우선 2량체 WFA 고정화 담체와 시료를 접촉시킨 후, 얻어진 혼합물에 표지 물질을 접촉시키는 것,
(b) 우선 2량체 WFA 고정화 담체와 표지 물질을 접촉시킨 후, 얻어진 혼합물에 시료를 접촉시키는 것,
(c) 우선 시료와 표지 물질을 접촉시킨 후, 얻어진 혼합물에 2량체 WFA 고정화 담체를 접촉시키는 것.
상기 공정(A)에서, 상기 시료와 접촉시키는 상기 2량체 WFA 고정화 담체의 양은 상기 시료의 종류, 상기 2량체 WFA 고정화 담체 중의 2량체 WFA의 양, 2량체 WFA 고정화 담체의 보존 상태(액체 보존 또는 동결 건조 보존) 등에 의해 상이한 점에서, 상기 시료의 종류, 상기 2량체 WFA 고정화 담체 중의 2량체 WFA의 양, 2량체 WFA 고정화 담체의 보존 상태(액체 보존 또는 동결 건조 보존) 등에 따라 적절히 결정하는 것이 바람직하다.
상기 시료와 상기 2량체 WFA 고정화 담체의 접촉시에서의 온도는 2량체 WFA의 입체 구조가 유지되고, 또한 2량체 WFA와 당쇄의 결합 반응을 실시하는데 적합한 온도이면 된다. 상기 온도는 통상 4~50℃, 바람직하게는 15~42℃이다.
상기 시료와 상기 2량체 WFA 고정화 담체의 접촉 후, 얻어진 산물을 세정하여 복합체를 형성하고 있지 않는 유리된 표적 물질 및 유리된 2량체 WFA 고정화 담체를 제거하는 것이 바람직하다. 상기 산물의 세정에 이용되는 세제로서는, 예를 들면 완충제, 계면활성제, 소 혈청 알부민(BSA) 등을 포함하는 세제; 정제수 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다.
다음에, 상기 공정(A)에서 얻어진 복합체 중의 표적 물질을 검출한다[공정(B)].
상기 공정(B)에서, 복합체 중의 표지 물질로부터 발생하는 시그널을 측정함으로써 복합체 중의 표적 물질을 검출할 수 있다. 표지 물질이 형광 색소나 방사성 동위체를 포함하는 경우에는 형광이나 방사능 등의 시그널을 측정할 수 있다. 또, 표지 물질이 효소인 경우에는 복합체에 효소의 기질을 반응시켜, 효소 반응의 산물로부터 발생하는 발광, 형광, 발색 등의 시그널을 측정할 수 있다. 측정 결과는 표적 물질의 양과 상관하기 때문에, 표적 물질을 정성적 또는 정량적으로 검출할 수 있다.
실시예
이하, 실시예 등에 의해, 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한 이하에서, 평균 입자 지름은 레이저 회절식 입도 분포 측정 장치[(주) 시마즈 제작소 제, 상품명: SALD 시리즈]를 이용하여 광산란법에 따라 측정함으로써 구해진 값이다.
(실험예 1)
WFA[VECTOR Laboratories(벡터 래버러토리즈)사 제, 상품명: Wisteria floribunda Lectin]를 상기 WFA의 농도가 2.5mg/mL가 되도록 20mM 인산 완충액(pH7.5)에 첨가해 WFA 함유 용액을 얻었다.
얻어진 WFA 함유 용액에, 비오틴을 포함하는 가교제인 5-(N-숙신이미딜옥시카르보닐)펜틸D-비오틴아미드[(주) 도진카가쿠 연구소 제, 상품명: Biotin-AC5-Osu]를 WFA/가교제(몰비)가 1/100이 되도록 첨가했다. 얻어진 용액을 25℃에서 90분간 인큐베이션함으로써, 상기 WFA와 상기 비오틴을 포함하는 가교제를 반응시켜 반응 산물을 얻었다.
(실험예 2~5)
실험예 1에서, WFA/가교제(몰비)를 1/100으로 하는 대신에, WFA/가교제(몰비)를 5/100(실험예 2), 10/100(실험예 3), 25/100(실험예 4) 또는 50/100(실험예 5)으로 한 것을 제외하고, 실험예 1에서 동일한 조작을 실시하여 반응 산물을 얻었다.
(시험예 1)
실험예 1~5에서 얻어진 반응 산물을 고속 액체 크로마토그래피에 의해, 이하의 조건으로 분석해 반응 산물의 예상 분자량을 구했다.
·용출 용매: 인산 완충액(pH 6.5)
·분리 컬럼: 겔 여과 컬럼
[도소(주) 제, 상품명: TSKgel G3000SWXL]
·분자량 마커: 사일로글로불린(분자량 669000)
γ-글로불린(분자량 158000)
오브알부민(분자량 44000)
미오글로빈(분자량 17000)
비타민 12(분자량 13000)
시험예 1에서, WFA와 가교제의 혼합비와, 반응 산물의 예상 분자량의 관계를 조사한 결과를 도 1에 나타낸다. 또한 비오틴화된 4량체의 WFA(이하, 「비오틴화 4량체 WFA」라고도 함)의 분자량의 이론값은 116000이다. 또, 비오틴화된 2량체의 WFA(이하, 「비오틴화 2량체 WFA」라고도 함)의 분자량의 이론값은 58000이다. 비오틴화된 단량체의 WFA(이하, 「비오틴화 단량체 WFA」라고도 함)의 분자량의 이론값은 29000이다.
도 1에 나타내는 바와 같이, WFA와 가교제의 혼합비(체적비)가 25/100 이상인 경우(실험예 4 및 5), 반응 산물의 예상 분자량이 122000인 것으로부터, 실험예 4 및 5에서 얻어진 반응 산물은 비오틴화 4량체 WFA인 것이 시사된다.
한편, WFA와 가교제의 혼합비가 25/100 미만인 경우(실험예 1~3), 상기 혼합비가 감소할수록, 반응 산물의 예상 분자량이 감소하는 경향이 있는 것을 알 수 있다. WFA와 가교제의 혼합비가 1/100인 경우(실험예 1)의 반응 산물의 예상 분자량이 56000인 것으로부터, 실험예 1에서 얻어진 반응 산물은 비오틴화 2량체 WFA인 것이 시사된다. 또, 상기 혼합비가 5/100인 경우(실험예 2)의 반응 산물의 예상 분자량이 64000인 것으로부터, 실험예 2에서 얻어진 반응 산물은 대부분이 2량체화 WFA인 것이 시사된다. 추가로, 상기 혼합비가 10/100인 경우(실험예 3)의 반응 산물의 예상 분자량이 96000인 것으로부터, 실험예 3에서 얻어진 반응 산물은 비오틴화 2량체 WFA와 비오틴화 4량체 WFA의 혼합물인 것이 시사된다.
따라서, 이들 결과로부터 WFA와 가교제의 혼합비(체적비)가 10/100 이하인 경우, 비오틴화 2량체 WFA가 얻어진 것이 시사된다.
(실시예 1)
(1) WFA 함유 용액의 조제
WFA[VECTOR Laboratories(벡터 래버러토리즈)사 제, 상품명: Wisteria floribunda Lectin]를 2.5mg/mL가 되도록 20mM 인산 완충액(pH7.5)에 첨가해 WFA 함유 용액을 얻었다.
(2) WFA와 가교제의 반응
실시예 1의 (1)에서 얻어진 WFA 함유 용액에, 비오틴을 포함하는 가교제로서 비오틴과 반응기가 스페이서를 통해서 결합하고 있는 가교제인 5-(N-숙신이미딜옥시카르보닐)펜틸D-비오틴아미드[(주) 도진카가쿠 연구소 제, 상품명: Biotin-AC5-Osu]를 WFA/가교제(몰비)가 1/100이 되도록 첨가했다. 얻어진 용액을 25℃에서 90분간 인큐베이션함으로써, 상기 WFA와 상기 가교제를 반응시켜 반응 산물을 얻었다.
(3) 비오틴화 2량체 WFA의 정제
실시예 1의 (2)에서 얻어진 반응 산물을 고속 액체 크로마토그래피에 의해, 이하의 조건에서 정제해 비오틴화 2량체 WFA를 얻었다.
·용출 용매: 인산 완충액(pH 6.5)
·분리 컬럼: 겔 여과 컬럼
[도소(주) 제, 상품명: TSKgel G3000SWXL]
(4) STA 결합 입자 함유액의 조제
스트렙타아비딘이 자성 입자(평균 입자 지름 2μm)의 표면에 고정화된 복합체(자성 입자 1g당 스트렙타아비딘의 양: 2.9~3.5mg; 이하, 「STA 결합 자성 입자」라고도 함)를 0.01M HEPES 완충액(pH7.5)으로 3회 세정했다. 세정 후의 STA 결합 자성 입자를 STA 농도가 18~22μg/mL(STA 결합 자성 입자의 농도가 0.48~0.52mg/mL)되도록 0.01M HEPES 완충액(pH7.5)에 첨가해 STA 결합 입자 함유액을 얻었다.
(5) 2량체 WFA 고정화 담체의 조제
실시예 1의 (3)에서 얻어진 비오틴화 2량체 WFA를 상기 비오틴화 2량체 WFA의 농도(2량체 WFA 감작 농도)가 5μg/mL(실험 번호 1-1), 10μg/mL(실험 번호 1-2), 20μg/mL(실험 번호 1-3) 또는 30μg/mL(실험 번호 1-4)가 되도록 실시예 1의 (4)에서 얻어진 STA 결합 입자 함유액에 첨가해, STA 결합 자성 입자의 스트렙타아비딘과 비오틴화 2량체 WFA의 비오틴을 결합시켰다. 얻어진 산물을 0.1M MES 완충액(pH6.5)으로 3회 세정해 2량체 WFA 고정화 담체를 얻었다. 얻어진 2량체 WFA 고정화 담체를 MES 완충액, HEPES 완충액 등의 굿스 완충액; 인산 완충액 등에 현탁하여 2량체 WFA 고정화 담체 함유액을 얻었다.
(비교예 1)
(1) WFA의 환원 및 비오틴화
환원제[350mM 2-머캅토에틸아민, 나카라이테스크(주) 제, 상품명: 2-머캅토 에틸아민염산염] 88μL와 WFA[VECTOR Laboratories(벡터 래버러토리즈)사 제, 상품명: Wisteria floribunda Lectin] 2000μg를 혼합해 25℃에서 90분간 인큐베이션함으로써 WFA를 환원했다. 다음에, 얻어진 환원 WFA를 N-비오티닐-N'-[2-(N-말레이미드)에틸]피페라진염산염[(주) 도진카가쿠 연구소 제, 상품명: Biotin-PE-maleimide]에 의해서 비오틴화해 반응 산물을 얻었다.
(2) 예측 분자량의 산출
시험예 1에서, 실험예 1~5에서 얻어진 반응 산물을 이용하는 대신에, 비교예 1의 (1)에서 얻어진 반응 산물을 이용한 것을 제외하고, 시험예 1과 동일한 조작을 실시해 반응 산물의 예상 분자량을 구했다. 그 결과, 비교예 1의 (1)에서 얻어진 반응 산물의 예상 분자량이 29000인 것으로부터, 비교예 1의 (1)에서 얻어진 반응 산물은 비오틴화 단량체 WFA인 것이 시사된다.
(3) 비오틴화 단량체 WFA의 정제
실시예 1의 (3)에서, 실시예 1의 (2)에서 얻어진 반응 산물을 이용하는 대신에, 비교예 1의 (1)에서 얻어진 반응 산물을 이용한 것을 제외하고, 실시예 1의 (3)와 동일한 조작을 실시해 비오틴화 단량체 WFA를 얻었다.
(4) 단량체 WFA 고정화 담체의 조제
비교예 1의 (3)에서 얻어진 비오틴화 단량체 WFA를 상기 비오틴화 단량체 WFA의 농도(단량체 WFA 감작 농도)가 5μg/mL(실험 번호 2-1), 10μg/mL(실험 번호 2-2), 20μg/mL(실험 번호 2-3) 또는 30μg/mL(실험 번호 2-4)가 되도록 실시예 1의 (4)에서 얻어진 STA 결합 입자 함유액에 첨가해, STA 결합 자성 입자의 스트렙타아비딘과 비오틴화 단량체 WFA의 비오틴을 결합시켰다. 얻어진 산물을 0.1M MES 완충액(pH6.5)으로 3회 세정해 단량체 WFA 고정화 담체를 얻었다. 이 단량체 WFA 고정화 담체를 0.1M MES 완충액(pH6.5), 0.1M HEPES 완충액(pH7.5) 등에 현탁하여 단량체 WFA 고정화 담체 함유액을 얻었다.
(비교예 2)
WFA[VECTOR Laboratories(벡터 래버러토리즈)사 제, 상품명: Wisteria floribunda Lectin]를 5μg/mL(실험 번호 3-1), 10μg/mL(실험 번호 3-2), 20μg/mL(실험 번호 3-3) 또는 30μg/mL(실험 번호 3-4)가 되도록 실시예 1의 (4)에서 얻어진 STA 결합 입자 함유액에 첨가해, STA 결합 자성 입자의 스트렙타아비딘과 비오틴화 4량체 WFA의 비오틴을 결합시켰다. 얻어진 산물을 0.1M MES 완충액(pH6.5)으로 3회 세정해 4량체 WFA 고정화 담체를 얻었다. 이 4량체 WFA 고정화 담체를 0.1M MES 완충액(pH6.5), 0.1M HEPES 완충액(pH7.5) 등에 현탁하여 4량체 WFA 고정화 담체 함유액을 얻었다.
(시험예 2)
0.01M HEPES 완충액(pH7.5) 50μL와 피검 시료[0.1~100μg/mL 당단백질 M2BP 함유 수용액] 10μL를 혼합해 42℃에서 2분간 인큐베이션했다.
얻어진 혼합물에, 실시예 1에서 얻어진 2량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 1-1~1-4), 비교예 1에서 얻어진 단량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 2-1~2-4) 또는 비교예 2에서 얻어진 4량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 3-1~3-4) 30μL를 첨가했다. 이것을 42℃에서 1분간 인큐베이션해 피검 시료 중의 M2BP와 2량체 WFA 고정화 담체, 단량체 WFA 고정화 담체 또는 4량체 WFA 고정화 담체를 반응시켰다.
얻어진 반응 산물을 세정액[20mM 트리스(pH7.4)와 0.1질량% Tween20과 0.1질량% 아지드화나트륨과 0.8질량% 염화나트륨을 포함하는 수용액] 100~700μL로 4회 세정했다.
세정 후, 0.1U/mL 알칼리포스파타제 표지 항M2BP 항체 용액(항체 농도 0.01~100μg/mL) 100μL를 첨가했다. 얻어진 혼합물을 42℃에서 2.5분간 인큐베이션했다. 그 후, 상기 세정액 100~700μL로 4회 세정했다.
세정 후, 반응 용액[0.1M 2-아미노-2-메틸-1-프로판올(pH9.6)과 1mM 염화마그네슘과 0.1질량% 아지드화나트륨을 포함하는 수용액] 50μL 및 기질 함유 용액[어플라이드 바이오 시스템즈사 제, 상품명: CDP-Star with Sapphirine-Ⅱ] 100μL를 첨가했다. 이것을 42℃에서 5분간 인큐베이션해 알칼리포스파타제 반응을 실시했다.
그 후, 전자동 면역 측정 장치[시스멕스(주) 제, 상품명: HISCL-2000i]를 이용하여 파장 300~650nm에서의 발광 강도를 측정했다.
시험예 2에서, M2BP를 표적 물질로서 이용했을 때의 WFA 감작 농도와 발광 강도의 관계를 조사한 결과를 도 2에 나타낸다. 도면 중, 흰색 삼각은 실시예 1에서 얻어진 2량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 1-1~1-4)을 이용했을 때의 발광 강도, 흰색 사각은 비교예 1에서 얻어진 단량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 2-1~2-4)을 이용했을 때의 발광 강도, 흰색 원은 비교예 2에서 얻어진 4량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 3-1~3-4)을 이용했을 때의 발광 강도를 나타낸다.
도 2에 나타내는 바와 같이, 2량체 WFA 고정화 담체를 이용한 경우(흰색 삼각), 감작 농도 10μg/mL 이상이면, 감작 농도에 관계없이 높은 발광 강도가 얻어진 것을 알 수 있다. 이것에 비해, 단량체 WFA 고정화 담체 또는 4량체 WFA 고정화 담체를 이용한 경우에는 감작 농도 10μg/mL 이상에서는 높은 발광 강도를 나타내지만, 감작 농도 20μg/mL 이상에서는 발광 강도가 크게 저하되는 것을 알 수 있다.
상기 발광 강도의 저하는 높은 감작 농도에 의해서 M2BP와 렉틴의 결합에 어떠한 입체 구조상의 장해가 생겼던 것이 원인이라고 예상된다. 즉, 감도를 향상시키기 위해서 다량의 단량체 WFA 또는 4량체 WFA를 사용해도, 반대로 감도가 저하되게 된다. 한편, 2량체 WFA는 높은 감작 농도여도 M2BP와의 결합을 저해하는 장해는 발생하지 않는 것으로 생각되고, 고감도화를 위해서 다량의 렉틴을 고상 담체 상에 감작할 수 있는 것을 알 수 있다.
(실시예 2)
실시예 1에서, WFA/가교제(몰비)를 1/100으로 하는 대신에, WFA/가교제(몰비)를 1/10[실험 번호 4-1(WFA 감작 농도 5μg/mL), 실험 번호 4-2(WFA 감작 농도 10μg/mL), 실험 번호 4-3(20μg/mL) 혹은 실험 번호 4-4(30μg/mL)]로 한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 조작을 실시해 2량체 WFA 고정화 담체 함유액을 얻었다.
(실시예 3)
실시예 1에서, WFA/가교제(몰비)를 1/100으로 하는 대신에, WFA/가교제(몰비)를 1/20[실험 번호 5-1(WFA 감작 농도 5μg/mL), 실험 번호 5-2(WFA 감작 농도 10μg/mL), 실험 번호 5-3(20μg/mL) 혹은 실험 번호 5-4(30μg/mL)]로 한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 조작을 실시해 2량체 WFA 고정화 담체 함유액을 얻었다.
(실시예 4)
실시예 1에서, WFA/가교제(몰비)를 1/100으로 하는 대신에, WFA/가교제(몰비)를 1/40[실험 번호 6-1(WFA 감작 농도 5μg/mL), 실험 번호 6-2(WFA 감작 농도 10μg/mL), 실험 번호 6-3(20μg/mL) 혹은 실험 번호 6-4(30μg/mL)]로 한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 조작을 실시해 2량체 WFA 고정화 담체 함유액을 얻었다.
(실시예 5)
실시예 1에서, WFA/가교제(몰비)를 1/100으로 하는 대신에, WFA/가교제(몰비)를 1/60[실험 번호 7-1(WFA 감작 농도 5μg/mL), 실험 번호 7-2(WFA 감작 농도 10μg/mL), 실험 번호 7-3(20μg/mL) 혹은 실험 번호 7-4(30μg/mL)]로 한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 조작을 실시해 2량체 WFA 고정화 담체 함유액을 얻었다.
(실시예 6)
실시예 1에서, WFA/가교제(몰비)를 1/100으로 하는 대신에, WFA/가교제(몰비)를 1/80[실험 번호 8-1(WFA 감작 농도 5μg/mL), 실험 번호 8-2(WFA 감작 농도 10μg/mL), 실험 번호 8-3(20μg/mL) 혹은 실험 번호 8-4(30μg/mL)]로 한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 조작을 실시해 2량체 WFA 고정화 담체 함유액을 얻었다.
(실시예 7)
실시예 1에서, WFA/가교제(몰비)를 1/100으로 하는 대신에, WFA/가교제(몰비)를 1/120[실험 번호 9-1(WFA 감작 농도 5μg/mL), 실험 번호 9-2(WFA 감작 농도 10μg/mL), 실험 번호 9-3(20μg/mL) 혹은 실험 번호 9-4(30μg/mL)]로 한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 조작을 실시해 2량체 WFA 고정화 담체 함유액을 얻었다.
(실시예 8)
실시예 1에서, WFA/가교제(몰비)를 1/100으로 하는 대신에, WFA/가교제(몰비)를 1/160[실험 번호 10-1(WFA 감작 농도 5μg/mL), 실험 번호 10-2(WFA 감작 농도 10μg/mL), 실험 번호 10-3(20μg/mL) 혹은 실험 번호 10-4(30μg/mL)]로 한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 조작을 실시해 2량체 WFA 고정화 담체 함유액을 얻었다.
(실시예 9)
실시예 1에서, WFA/가교제(몰비)를 1/100으로 하는 대신에, WFA/가교제(몰비)를 1/200[실험 번호 11-1(WFA 감작 농도 5μg/mL), 실험 번호 11-2(WFA 감작 농도 10μg/mL), 실험 번호 11-3(20μg/mL) 혹은 실험 번호 11-4(30μg/mL)]로 한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 조작을 실시해 2량체 WFA 고정화 담체 함유액을 얻었다.
(시험예 3)
시험예 2에서, 실시예 1~9에서 얻어진 2량체 WFA 고정화 담체 함유액을 이용한 것을 제외하고, 시험예 2와 동일한 조작을 실시해 발광 강도를 측정했다.
시험예 3에서, M2BP를 표적 물질로서 이용했을 때의 WFA 감작 농도와 발광 강도의 관계를 조사한 결과를 도 3에 나타낸다. 도면 중, 흰색 마름모꼴형은 WFA/가교제(몰비)가 1/10인 2량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 4-1~4-4)을 이용했을 때의 발광 강도, 흰색 사각은 WFA/가교제(몰비)가 1/20인 2량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 5-1~5-4)을 이용했을 때의 발광 강도, 흰색 삼각은 WFA/가교제(몰비)가 1/40인 2량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 6-1~6-4)을 이용했을 때의 발광 강도, 크로스는 WFA/가교제(몰비)가 1/60인 2량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 7-1~7-4)을 이용했을 때의 발광 강도, 흰색 원은 WFA/가교제(몰비)가 1/80인 2량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 8-1~8-4)을 이용했을 때의 발광 강도, 흑색 마름모꼴형은 WFA/가교제(몰비)가 1/100인 2량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 1-1~1-4)을 이용했을 때의 발광 강도, 흑색 사각은 WFA/가교제(몰비)가 1/120인 2량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 9-1~9-4)을 이용했을 때의 발광 강도, 흑색 삼각은 WFA/가교제(몰비)가 1/160인 2량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 10-1~10-4)을 이용했을 때의 발광 강도, 및 흑색 원은 WFA/가교제(몰비)가 1/200인 2량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 11-1~11-4)을 이용했을 때의 발광 강도를 나타낸다.
도 3에 나타내는 바와 같이, 2량체 WFA 고정화 담체 함유액을 이용했을 때의 발광 강도는 WFA/가교제(몰비)에 의한 변동이 비교적 작은 것을 알 수 있다.
(시험예 4)
실시예 1에서 얻어진 2량체 WFA 고정화 담체 함유액[WFA 감작 농도: 20μg/mL(실험 번호 1-3)]를 37℃에서 14일간 인큐베이션해 계시적으로 채취했다. 채취된 2량체 WFA 고정화 담체 함유액을 이용하여 시험예 2와 동일한 조작을 실시해 발광 강도를 측정했다.
다음에, 인큐베이션 전의 2량체 WFA 고정화 담체 함유액을 이용했을 때의 발광 강도(대조의 발광 강도)에 대한 소정 시간 경과 후의 2량체 WFA 고정화 담체 함유액을 이용했을 때의 발광 강도의 상대값(2량체 WFA 고정화 담체의 잔존 활성)를 구해 잔존 활성의 경시적 변화를 조사함으로써, 2량체 WFA 고정화 담체의 보존 안정성을 평가했다.
또, 상기에서 실시예 1에서 얻어진 2량체 WFA 고정화 담체 함유액을 이용하는 대신에, 비교예 2에서 얻어진 4량체 WFA 고정화 담체 함유액[WFA 감작 농도: 10μg/mL(실험 번호 1-2)]를 이용한 것을 제외하고, 상기와 동일한 조작을 실시해, 4량체 WFA 고정화 담체의 보존 안정성을 평가했다.
경과 시간 0일 시점에서의 M2BP와의 결합 활성을 100으로 했을 때의 잔존 활성을 도 4에 나타낸다. 도면 중, 흑색 사각은 2량체 WFA 고정화 담체 함유액의 잔존 활성, 흑색 마름모꼴형은 4량체 WFA 고정화 담체 함유액의 잔존 활성을 나타낸다.
또, 도 4에 나타내는 바와 같이, 2량체 WFA 고정화 담체는 M2BP와의 결합 활성에 대해서, 인큐베이션 개시부터 14일간 경과 후에서, 높은 잔존 활성을 가지고 있는 것을 알 수 있다. 도 4에 나타낸 결과로부터, 2량체 WFA 고정화 담체의 잔존 활성은 4량체 WFA 고정화 담체의 결합 활성에 관한 잔존 활성과 비교해서 높은 것을 알 수 있다. 따라서, 2량체 WFA 고정화 담체는 4량체 WFA 고정화 담체와 비교해서 보존 안정성이 뛰어난 것을 알 수 있다.
(시험예 5)
(1) 2량체 WFA 고정화 담체의 보관
실시예 1에서 얻어진 2량체 WFA 고정화 담체 함유액을 2~8℃로 유지된 냉장고 내에서 보관했다. 보관 개시부터 0개월 경과시, 1개월 경과시, 3개월 경과시, 6개월 경과시 및 7개월 경과시에 2량체 WFA 고정화 담체 함유액의 일부를 채취했다.
(2) Muc-1과의 반응성에 근거한 2량체 WFA 고정화 담체의 보존 안정성의 평가
0.01M HEPES 완충액(pH7.5) 50μL와 피검 시료로서 담관암 환자 혈청 검체[프롬덱스(PROMMDDX)사 제, 상품명: Bileduct cancer] 10μL를 혼합했다. 이 혼합물을 42℃에서 2분간 인큐베이션했다.
그 후, 시험예 5의 (1)에서 채취된 2량체 WFA 고정화 담체 함유액 30μL를 첨가했다. 이것을 42℃에서 1분간 인큐베이션함으로써, 피검 시료 중의 Muc-1으로 2량체 WFA 고정화 담체를 반응시켰다.
이 반응 산물을 세정액[20mM 트리스(pH7.4)와 0.1질량% Tween20과 0.1질량% 아지드화나트륨과 0.8질량% 염화나트륨을 포함하는 수용액] 100~700μL로 4회 세정했다.
세정 후, 0.1U/mL 알칼리포스파타제 표지 항Muc-1 항체 용액 100μL를 첨가했다. 이것을 42℃에서 2.5분간 인큐베이션했다. 그 후, 상기 세정액 100~700μL로 4회 세정했다.
세정 후의 반응 산물에 반응 용액[0.1M 2-아미노-2-메틸-1-프로판올(pH9.6)과 1mM 염화마그네슘과 0.1질량% 아지드화나트륨을 포함하는 수용액] 50μL 및 기질 함유 용액[어플라이드 바이오 시스템즈사 제, 상품명: CDP-Star with Sapphirine-Ⅱ] 100μL를 첨가했다. 이것을 42℃에서 5분간 인큐베이션해 알칼리포스파타제 반응을 실시했다.
그 후, 얻어진 반응 산물에 대해, 전자동 면역 측정 장치[시스멕스(주) 제, 상품명: HISCL-2000i]를 이용하여 파장 300~650nm에서의 발광 강도를 측정했다.
다음에, 인큐베이션 전의 2량체 WFA 고정화 담체 함유액을 이용했을 때의 발광 강도(대조의 발광 강도)에 대한 소정 시간 경과 후의 2량체 WFA 고정화 담체 함유액을 이용했을 때의 발광 강도의 상대값(2량체 WFA 고정화 담체의 잔존 활성)를 구해 잔존 활성의 경시적 변화를 조사함으로써, 2량체 WFA 고정화 담체의 보존 안정성을 평가했다.
경과 시간 0개월 시점의 Muc-1과의 결합 활성을 100으로 했을 때의 잔존 활성을 도 5에 나타낸다.
도 5에 나타내는 바와 같이, 2량체 WFA 고정화 담체는 보관 개시부터 7개월 경과 후에서, 높은 잔존 활성을 가지고 있었다. 따라서, 2량체 WFA 고정화 담체는 보존 안정성이 뛰어난 것을 알 수 있다.
(시험예 6)
실시예 1에서 얻어진 2량체 WFA 고정화 담체 함유액을 2~8℃로 유지된 냉장고 내에서 보관하는 대신에 37℃에서 인큐베이션하는 것, 보관 개시부터 0개월 경과시, 1개월 경과시, 3개월 경과시, 6개월 경과시 및 7개월 경과시에 2량체 WFA 고정화 담체 함유액의 일부를 채취하는 대신에 인큐베이션 개시부터 0일 경과 후, 1일 경과시, 3일 경과시, 7일 경과시 및 14일 경과시에 2량체 WFA 고정화 담체 함유액의 일부를 채취하는 것을 제외하고, 시험예 5와 동일한 조작을 실시해 2량체 WFA 고정화 담체의 보존 안정성을 평가했다.
경과 시간 0일 시점에서의 Muc-1과의 결합 활성을 100으로 했을 때의 잔존 활성을 도 6에 나타낸다.
도 6에 나타내는 바와 같이, 2량체 WFA 고정화 담체는 인큐베이션 개시부터 14일간 경과해도 높은 잔존 활성을 유지하고 있는 것을 알 수 있었다. 따라서, 2량체 WFA 고정화 담체는 보존 안정성이 뛰어난 것을 알 수 있다.
(시험예 7)
0.01M HEPES 완충액(pH7.5) 50μL와 피검 시료 10μL를 혼합해 얻어진 혼합물을 42℃에서 2분간 인큐베이션했다. 피검 시료로서 담관암 환자 검체 1~3[프롬덱스(PROMMDDX) 공급, 상품명: Bileduct cancer]를 이용했다.
그 후, 실시예 1에서 얻어진 2량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 1-1~1-4), 비교예 1에서 얻어진 단량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 2-1~2-4) 또는 비교예 2에서 얻어진 4량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 3-1~3-4) 30μL를 첨가했다. 이들을 42℃에서 1분간 인큐베이션해 피검 시료 중의 Muc-1와 2량체 WFA 고정화 담체를 반응시켰다.
얻어진 반응 산물을 세정액[20mM 트리스(pH7.4)와 0.1질량% Tween20과 0.1질량% 아지드화나트륨과 0.8질량% 염화나트륨을 포함하는 수용액] 100~700μL로 4회 세정했다.
세정 후, 0.1U/mL 알칼리포스파타제 표지 항Muc-1 항체 용액 100μL를 첨가했다. 이것을 42℃에서 2.5분간 인큐베이션했다. 그 후, 상기 세정액 100~700μL로 4회 세정했다.
세정 후의 반응 산물에, 반응 용액[0.1M 2-아미노-2-메틸-1-프로판올(pH9.6)과 1mM 염화마그네슘과 0.1질량% 아지드화나트륨을 포함하는 수용액] 50μL 및 기질 함유 용액[어플라이드 바이오 시스템즈사 제, 상품명: CDP-Star with Sapphirine-Ⅱ] 100μL를 첨가했다. 이것을 42℃에서 5분간 인큐베이션해 알칼리포스파타제 반응을 실시했다.
그 후, 전자동 면역 측정 장치[시스멕스(주) 제, 상품명: HISCL-2000i]를 이용하여 파장 300~650nm에서의 발광 강도를 측정했다. 다음에, WFA 감작 농도가 5μg/mL인 2량체 WFA 고정화 담체 함유액 실험 번호 1-1)을 이용했을 때의 발광 강도를 100으로 했을 때의 상대 반응성을 구했다.
시험예 7에서, Muc-1을 표적 물질로서 이용했을 때의 WFA 감작 농도와 발광 강도의 관계를 조사한 결과를 도 7a~c에 나타낸다. 도면 중, 흰색 원은 실시예 1에서 얻어진 2량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 1-1~1-4)을 이용했을 때의 발광 강도, 흰색 사각은 비교예 1에서 얻어진 단량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 2-1~2-4)을 이용했을 때의 발광 강도, 흰색 삼각은 비교예 2에서 얻어진 4량체 WFA 고정화 담체 함유액(실험 번호 3-1~3-4)을 이용했을 때의 발광 강도를 나타낸다. 또, 도 7a는 담관암 환자의 검체 1을 이용했을 때의 2량체 WFA 감작 농도와 상대 반응성의 관계, 도 7b는 담관암 환자의 검체 2를 이용했을 때의 2량체 WFA 감작 농도와 상대 반응성의 관계, 도 7c는 담관암 환자의 검체 3을 이용했을 때의 2량체 WFA 감작 농도와 상대 반응성의 관계를 나타낸다.
도 7a~c에 나타내는 바와 같이, 2량체 WFA 고정화 담체를 이용했을 때의 상대 반응성(흰색 원)은 검체 1~3의 어느 검체를 이용한 경우여도 WFA 감작 농도에 관계없이, 단량체 WFA 고정화 담체(흰색 사각) 또는 4량체 WFA 고정화 담체(흰색 삼각)를 이용했을 때의 상대 반응성과 비교해서 높았다. 따라서, 2량체 WFA 고정화 담체에 의하면, WFA 감작 농도에 관계없이, 검체 중에 포함되는 Muc-1 등과 같이, WFA와 결합하는 당쇄를 포함하는 표적 물질에 대해, 높은 반응성을 나타내는 것을 알 수 있다.
이상의 결과로부터, 2량체 WFA 고정화 담체는 4량체 WFA 고정화 담체 및 단량체 WFA 고정화 담체와 비교해서 상기 당쇄에 대한 높은 반응성을 가지고 있는 것을 알 수 있다. 게다가, 2량체 WFA 고정화 담체는 보존 안정성이 뛰어난 것을 알 수 있다.
본 출원은 2014년 2월 27일 및 2015년 1월 9일에 각각 출원된 일본 특허 출원 특원 2014-036777호 및 특원 2015-002865호에 관한 것이며, 이들 특허 청구의 범위, 명세서, 도면 및 요약서의 모두는 본 명세서 중에 참조로서 포함된다.

Claims (13)

  1. 위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda)의 렉틴(WFA)과 결합하는 당쇄를 포함하는 표적 물질을 검출하기 위한 시약으로서,
    상기 WFA가 2량체화된 2량체 WFA가 고상 담체에 고정화된 2량체 WFA 고정화 담체를 함유하고 있는 표적 물질의 검출용 시약.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 2량체 WFA가 비오틴과 비오틴 결합 단백질을 통해서 상기 고상 담체에 고정화되어 있는 시약.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 2량체 WFA가 비오틴화 2량체 WFA이며, 또한 상기 고상 담체에 비오틴 결합 단백질이 고정화되어 있고,
    상기 비오틴화 2량체 WFA가 상기 비오틴 결합 단백질을 통해서 상기 고상 담체에 고정화되어 있는 시약.
  4. 위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda)의 렉틴(WFA)과 결합하는 당쇄를 포함하는 표적 물질의 검출 방법으로서,
    (A) 상기 WFA가 2량체화된 2량체 WFA가 고상 담체에 고정화된 2량체 WFA 고정화 담체와, 상기 표적 물질을 포함하는 시료와, 상기 표적 물질에 특이적으로 결합하는 표지 물질을 접촉시킴으로써, 상기 고상 담체 상에 상기 2량체 WFA와 상기 표적 물질과 상기 표지 물질을 포함하는 복합체를 형성시키는 공정, 및
    (B) 상기 공정(A)에서 얻어진 복합체 중의 표지 물질을 측정함으로써, 상기 표적 물질을 검출하는 공정
    을 포함하는 표적 물질의 검출 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 표지 물질이 상기 표적 물질에 특이적으로 결합하는 표지 항체인 방법.
  6. 위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda)의 렉틴(WFA)과 결합하는 당쇄를 포함하는 표적 물질을 검출하기 위해서 이용되는 담체로서,
    상기 WFA가 2량체화된 2량체 WFA와, 고상 담체를 가지고,
    상기 2량체 WFA가 상기 고상 담체 상에 고정화되어 있는 담체.
  7. 위스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda)의 렉틴(WFA)과 결합하는 당쇄를 포함하는 표적 물질을 검출하기 위해서 이용되는 담체의 제조 방법으로서,
    (I) 상기 WFA를 2량체화하여 2량체 WFA를 얻는 공정, 및
    (Ⅱ) 상기 공정(I)에서 얻어진 2량체 WFA를 고상 담체에 고정화하여 2량체 WFA 고정화 담체를 얻는 공정,
    을 포함하는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 공정(I)에서, 비오틴을 포함하는 가교제를 함유하는 용액과, WFA를 혼합하여 비오틴화 2량체 WFA를 조제하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 공정(Ⅱ)에서, 상기 고상 담체로서 비오틴 결합 단백질이 고정화된 담체를 이용하여 상기 담체 중의 비오틴 결합 단백질과 상기 비오틴화 2량체 WFA를 결합시킴으로써 상기 2량체 WFA를 상기 고상 담체에 고정화하는 방법.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 공정(I)에서, 상기 가교제를 함유하는 용액과, 상기 WFA를 [WFA/가교제]의 몰비가 1/10 이하(다만 0을 포함하지 않음)가 되도록 접촉시킴으로써 상기 2량체 WFA를 얻는 방법.
  11. 청구항 8에 있어서,
    상기 가교제가 상기 2량체 WFA 중의 아미노기와 가교를 형성하는 가교제인 방법.
  12. 청구항 8에 있어서,
    상기 가교제가 N-히드록시숙신이미드에스테르기, 이소티오시아노기, 클로로설폰기, 클로로카르보닐기, 옥시에틸렌기, 탄소수 1~4의 클로로알킬기, 알데히드기 및 카르복실기로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 1종의 관능기를 상기 2량체 WFA 중의 아미노기에 대한 반응기로서 가지고 있는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 비오틴과 상기 반응기가 스페이서를 통해서 결합하고 있는 방법.
KR1020167026583A 2014-02-27 2015-01-30 당쇄를 포함하는 표적 물질의 검출용 시약, 검출 방법, 및 당쇄를 포함하는 표적 물질을 검출하기 위해서 이용되는 담체 및 그 제조 방법 KR101939891B1 (ko)

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