JP5704570B2 - 肝内胆管がんの検出、判別方法 - Google Patents
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Description
(試験方法)
レクチンマイクロアレイは特異性の異なる40種以上の植物レクチンが同一基板上に固定化されており、分析対象となる糖タンパク質上の糖鎖との相互作用(結合性)を一斉に解析するシステムである(Kuno et al.,Nature Methods 2,851-856,2005)。これを用い肝内胆管がん特異的に染色するのに最適なレクチンを絞り込むことを試みた。本実験には、結石症合併型患者14例(同一切片内がん部・非がん部領域)、結石症非合併型患者10例(同一切片内がん部・非がん部領域)、結石症非合併型患者がん部21例、及び結石症非合併型患者非がん部14例を用いた。つまり、総解析数はがん部45例および非がん部38例となる。なお、組織切片からタンパク質を回収し、蛍光標識後レクチンアレイ解析するまでのプロトコルは松田ら(Biochem.Biophys.Res.Commun.370,259-263,2008)に従った。
まず顕微鏡により確認した各サンプルのがん部及び非がん部領域(およそ1×1mm相当)をかきとり、その組織フラグメントをあらかじめ10mMクエン酸(pH6.0)200μLを入れた1.5mL容マイクロチューブに回収した。得られた組織フラグメント入り溶液はホルマリンによる分子内および分子間架橋を解離するため95℃で90分処理した。熱処理後、20,000×g、5分、4℃で遠心分離し、上清を除いた。残りの組織フラグメント含有ペレットにPBS(−)200μLを加えた(バッファー交換工程)。更に、20,000×g、5分、4℃で遠心後、上澄みを除き、ペレットに0.5%NP40−PBS20μLを加えた。ペレットを超音波破砕により細粒化した後に、氷上で60分反応し、膜タンパク質を可溶化した。反応後、20,000×g、5分、4℃で遠心し、上清を組織抽出タンパク質として回収した。
回収したすべての組織抽出タンパク質溶液は、予め10μgずつPCRチューブに小分けしたCy3−SE(GEヘルスケア社製) に添加した。室温、暗所で1時間化学反応を行った後、反応を完全に止めるためグリシン含有バッファー180μL添加し、室温、暗所で2時間反応した。得られた溶液を蛍光標識組織切片由来タンパク質溶液とした。
蛍光標識組織切片由来タンパク質溶液はレクチンアレイ用バッファーにより2倍、8倍へ希釈され、それぞれ60μLをレクチンアレイの各反応槽へ添加した。なお8つの反応槽からなるレクチンマイクロアレイ基盤の作製は内山ら(Proteomics 8,3042-3050(2008))の手法に従った。1晩20℃にて相互作用反応させた後、各反応槽をレクチンアレイ用バッファーで3回洗浄し、定法に従いスキャニングした。得られたスキャンデータは定法に従いシグナルをNet Intensityとして数値化し、次の統計解析のために久野ら(Journal of Proteomics and Bioinformatics 1,68-72(2008))の手法に従い規格化された。
規格化されたすべてのデータは、がん部及び非がん部の2群比較検定に用いた。各データはレクチンごとにWhelch's t-testやROC曲線解析を用いて有意差検定し、肝内胆管がんで有意なシグナル上昇を示すレクチンを選定するのに用いた。
表1(肝内胆管がん組織がん部(T)及び非がん部(N)領域中糖タンパク質にの比較糖鎖プロファイリング結果)に示すようにレクチンマイクロアレイ後の統計解析から、5種のレクチンで非がん部と比較してがん部において2倍以上の結合シグナルを示し、WFAが最も特異度が高かった(4.6倍)。そこで、結石症合併型14症例、結石症非合併型10症例についてがん部及び非がん部のWFAシグナルについてWhelch's t-testにより、統計的に有意差の有無を確認したところ、それぞれ危険度はP<0.0001,P=0.0015であった。またROC曲線解析により、その感度は84%、特異度は92%、AUC0.93であった。
実施例1から、WFAによる組織染色で、組織切片中肝内胆管がんを検出できる可能性が見出されたため、肝内胆管がん患者組織切片結石非合併型症例について以下の通り検討した。
WFAによる組織染色は、染色キット:Histo-fine (ニチレイ)を用い、以下のとおり実施した。まず、ホルマリン固定肝内胆管がん患者組織切片(5μm厚)を定法に従い組織切片上に被覆しているパラフィンを脱パラフィン化した。脱パラフィン化した組織切片はPBS にて洗浄し、風乾後、10mMクエン酸バッファー(pH6.0)中に浸し、121℃、15分間オートクレーブすることで、ホルマリンによる分子間(分子内)架橋を解離した。処理後の切片は室温でしばらく放置した後、PBSに5分間3回繰り返し浸し、組織表面を洗浄した。次いで0.3% H2O2−MeOHにて10分間、室温で処理することで、内在性ペルオキシダーゼのブロッキング反応を行った。
肝内胆管がんの診断マーカーの有力候補であるWFAについて、正常肝(転移性肝がん)25例、肝内胆管がん90例、混合型肝がん10例、肝細胞がん25例の標本における発現を免疫組織化学にて検討した。表2(組織染色の結果)に示すように、正常胆管上皮では8例(32%)で、肝内胆管がんでは83例(88%)で、混合型肝がんの胆管細胞がん部分では8例(80%)で、そのがん腺管上皮にWFAリガンドの発現を認めた。混合型肝がんの肝細胞がん部分や肝細胞がんではWFAリガンドの発現を認めなかった。このことより、WFAは肝内胆管がん並びに混合型肝がんの診断マーカーとして有用であると考えられた。また、WFA発現の有無を肝内胆管がんの臨床病型分類の立場より比較検討したところ、部位(肝門部型,末梢型)や肉眼型(腫瘤形成型、胆管浸潤型、混合型、胆管内発育型)によるWFAリガンドの発現頻度の変動は認められなかった。
閉塞性黄疸を解除する目的にて胆道ドレナージが施行され、その際に採取された胆汁を検体として解析した。実施例2と同じ手順でWFA染色を実施したところ、病理組織診断及び細胞診においてがんの存在が確定された検体ではWFA陽性の細胞が確認され、細胞学的にがんと同定された。しかしながら、病理組織および細胞診において陰性であった検体ではWFAに染色される細胞は確認されなかった(図4:細胞診標本におけるWFA染色による組織化学解析の結果)。
(実験方法)
組織切片からのWFA 結合性糖タンパク質の捕獲及び当該タンパク質の同定は以下の手順に従い実施した。なお、同定されるタンパク質の種類に症例間差が生じる可能性があるため、本実験には4患者症例分の実験を行い、それらをまとめてWFA結合性タンパク質群とした。
ホルマリン固定肝内胆管がん患者組織連続切片(10μm厚)6枚を定法に従い組織切片上に被覆しているパラフィンを脱パラフィン化した。脱パラフィン化した組織切片はPBSにて洗浄後、風乾した。うち1枚を実施例2と同様の方法でWFA染色した。WFA染色組織切片スライドガラスを顕微鏡で確認し、WFA陽性領域(5×5mm 四方程度)を確定後、未染色組織切片スライドガラス5枚から、WFA陽性領域をかきとり、その組織フラグメントを予め10mMクエン酸 (pH6.0) 200μLを入れた1.5mL容マイクロチューブに回収した。
まず、25μgのビオチン化WFAを、ストレプトアビジン固定化磁気ビーズ(Dynabeads MyOne Streptavidin T-1, Dynabeads社製、100μL)に固定化し、これをWFA固定化磁気ビーズとした。予めビーズへ非特異的に結合するタンパク質を吸収するためにストレプトアビジン固定化磁気ビーズと1時間反応した組織抽出タンパク質溶液を、WFA固定化磁気ビーズへ添加し、4℃で一晩振盪反応した。結合反応後、磁石によりビーズを回収し、次いで1%Triton X-100含有PBS1mLにてビーズを2回洗浄した。洗浄後のビーズへ溶出バッファー(0.1%SDS含有PBS)100μLを加え、5分間加熱処理することで、WFA結合性タンパク質を溶出した。これをWFA結合性タンパク質溶液とした。
工程2で得られたWFA結合性タンパク質は、TCA処理により濃縮された。濃縮タンパク質溶液は、全量を5〜20% ポリアクリルアミドゲルの1ウェルへアプライし、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動した。分離後、定法により銀染色したゲルから、タンパク質染色性バンドを切り出した。定法によりゲル中のタンパク質はトリプシン処理によりペプチド断片化され、ゲルから抽出、脱塩後、質量分析装置によりそれぞれのタンパク質を同定した。
今回肝内胆管がん4症例分を用いた上述の実験により、WFA結合性タンパク質候補分子として171分子が同定された。これら候補分子のうち、本実施例では抗体が市販されている糖タンパク質47分子に限定し、以降の絞り込みを行った。候補分子の絞り込みは、各分子に関する詳細な情報をもとにしたスコアリングにより、高得点の分子を最有力分子として絞り込みを行った。
(1)トランスクリプトームレベルで、各組織での候補分子の発現情報より、肝内胆管がんで発現している場合、3点を加算する(info)。
(2)基本的に分泌タンパク質を標的とするため、シグナル配列を有する場合、3点加算する(S)。
(3)タンパク質レベルの発現情報が掲載されているProtein Human Atras (HUPO) により、肝内胆管がんでの発現、肝細胞がん組織での発現が確認された場合3点を加算し、更に正常組織で発現していない場合は2点を追加する(Hu)。
(4)既報の糖鎖付加情報より、糖鎖修飾が確認されている場合、1点加算する(Up)。
(5)既報の文献情報により、がん関連分子と報告されていたり、がんによる発現の増減の変動があると確認されていたりする場合、2点加算し、その報告がCCC関連の場合は1点加算、かつ胆汁での発現が報告されている場合はさらに1点追加する(J)。
結果を、表3に示す。表に示されるように、CA125、N−CAM−L1、 Maspin, Lactoferrin、 CollagenIV,、CathepsinWの6分子が総獲得点数8点以上(16点満点中)であったため、MUC1に加えこれらを肝内胆管がん特異的に発現するWFA結合性タンパク質の最有力候補分子とした。
この時点では、がん部と非がん部を見分けるものにすぎず、周辺領域である間質、肝実質への染色性を加味したものとなっていない。そこで、次に組織染色によるマーカーの局在を確認し、更なる絞り込みを試みた。
ホルマリン固定肝内胆管がん患者組織連続切片(5μm厚)を定法に従い組織切片上に被覆しているパラフィンを脱パラフィン化した。脱パラフィン化した組織切片はPBSにて洗浄後、10mMクエン酸(pH6.0)緩衝液中で、121℃、15分間オートクレーブによって抗原の賦活化処理を行った。PBSにて洗浄後、0.3%過酸化水素加メタノールに20分浸し、内在性ペルオキシダーゼの活性阻止を行った。PBS洗浄後、正常ウサギ血清にてブロッキングしたのち、各抗体(MY.1E12 ;0.5mg/mL,anti-CA125 ;1mg/mL, anti-Maspin ;2mg/mL, anti-N-CAM-L1 ;1mg/mL, anti-Cathepsin W ;5mg/mL, anti-CollagenIV ;5mg/mL, anti-Lactoferrin ;1mg/mL, 全てマウスIgG抗体)を加えた後、室温にて1時間反応させた。PBSにて洗浄後、ヒストファインシンプルステインキット(ニチレイ社)にて発色を行った。滅菌水にて洗浄後、ヘマトキシリンにより対比染色を行った後、封入した。
各候補分子の組織染色の典型例を図5に示す。また、その発現パターンを表4に示す。染色が見られるもの(+)、わずかながらではあるが染色が確認できたもの(−/+)、染色が見られなかったもの(−)をそれぞれ示す。胆管がん特異的に染色が見られ、組織マーカーとしてあるいは胆汁、血清マーカーとしての有用性が考えられる最有力候補群 (MUC1, CA125, N-CAM-L1, Maspin) と胆管がん特異的ではないがWFAとの組み合わせによって胆汁、血清におけるマーカーとしての可能性が考えられる候補群 (Lactoferrin,CollagenIV,CathepthinW) とに区別できる。前者を組織マーカーを含めた胆汁、血清マーカー、後者を胆汁、血清マーカーとして最終的な有力候補分子とした。
肝内胆管がんに由来するWFA結合性糖タンパク質からなる糖鎖バイオマーカーをがんマーカーとし、該糖鎖バイオマーカーの肝内胆管がん特異的糖鎖構造を検出する最良の形態としては、組織ライセートや胆汁中に含まれる糖鎖バイオマーカーを臨床上許容される性能で、かつ、臨床上適用可能な簡便な手段により検出及び判別する方法が考えられる。以下にはその例として、選抜された7つの肝内胆管がん特異的マーカー候補分子のうち、実施例2で候補分子として挙げられたMY.1E12抗体結合性MUC1分子について、肝内胆管がん患者胆汁を対象とした抗体オーバーレイ−WFAウェルプレート(図1bを参照)を用いたサンドイッチ検出分析の結果を示す。
<1.WFA固相化ウェルプレートの作製>
マイクロタイタープレート(グライナー社製 96ウェル平底高結合性プレート)へPBS緩衝液に溶解したWFA(Vector社製、2.5μg/mL)を各ウェルに100μLずつ加え、2時間室温で保温し、支持体へWFAを固相化した。未結合WFAを洗浄液である0.1%Tween20含有PBS(200μL)で2回ずつ洗浄し、ブロッキング剤である1%BSA含有洗浄液を200μLずつ加えた。2時間室温で反応後、0.1%Tween20含有PBS(200μL)で2回ずつ洗浄し、WFA固相化ウェルプレートを完成させた。
まず、胆汁のタンパク質定量をマイクロBCAタンパク質定量キット(PIERCE社製)により行った。各サンプルは上記洗浄液で200μg/mLになるように希釈し、うち100μLを1で作製したWFA固相化ウェルプレートへ添加した後、2時間室温で結合反応した。反応後、各ウェルは上記洗浄液200μLで5回洗浄し、未結合タンパク質を除去した。そこにあらかじめ0.5μg/mLへ洗浄液で調整した検出剤(MY.1E12抗体溶液)を1ウェルあたり100μLずつ加え、室温で2時間抗原抗体反応した。
肝内胆管がん患者由来胆汁30症例に加え、肝内結石症患者由来胆汁22症例分について分析を行った。その結果を図6aに示す。肝内結石症患者に比べ、肝内胆管がん患者においてS/N値が明らかに上昇しているのが分かる。その有意差はT−検定により危険度P=0.0016であった。そこで肝内胆管がん患者を陽性、肝内結石症患者を陰性としてROC曲線を作成した。その結果を図6bに示す。がんと結石症を判別する感度は90%、特異度は60%であった。この成績はこれまで報告されているいずれのマーカーによる判別結果よりも優れていることが表5(WFA−MY.1E12・サンドイッチ・ELISA法と、既報との比較:斜体が本発明実施例;既存マーカーによる検査はいずれも文献値を示す。)に示される。特に感度すなわちがんを検出する能力は90%であり既存の手法の最高値71%に比べ群を抜いて優れている。肝内胆管がんはその特性上、早期に発見でき、かつ偽陰性が少ないことが求められている。つまり感度が高いマーカーが重要である。そういう意味でも今回開発した手法は最も優れた肝内胆管がんマーカーであることが示される。
検出感度向上やバックグラウンドノイズの減少を目指し、図7(サンドイッチELISAの改良)に示すように、レクチンの固定化方法を直接法から間接法に変更した。候補分子のうちMY.1E12抗体結合性MUC1分子及びCA125について検討した。
<1.WFA固相化ウェルプレートの作製>
ストレプトアビジンコートマイクロタイタープレート(NUNC社製 96ウェル平底プレート)へPBS緩衝液に溶解したビオチン化 WFA(Vector社製、20μg/mL)を各ウェルに50μLずつ加え、1時間室温で保温し、支持体へWFAを固相化した。未結合ビオチン化 WFAを洗浄液である0.1%Tween20含有PBS(300μL)で2回ずつ洗浄し、WFA固相化ウェルプレートを完成させた。
まず、胆汁のタンパク質定量をマイクロBCAタンパク質定量キット(PIERCE社製)により行った。各サンプルは上記洗浄液で400μg/mLになるように希釈し、うち50μLを1で作製したWFA固相化ウェルプレートへ添加した後、2時間室温で結合反応した。反応後、各ウェルは上記洗浄液300μLで5回洗浄し、未結合タンパク質を除去した。そこにあらかじめ0.5μg/mLへ洗浄液で調整した検出剤(MY.1E12抗体溶液)もしくは1.0μg/mL洗浄液で調整した検出剤(Anti-CA125抗体)を1ウェルあたり50μLずつ加え、室温で2時間抗原抗体反応した。
肝内胆管がん患者由来胆汁30症例に加え、肝内結石症患者由来胆汁22症例分について分析を行った。その結果を図8aに示す。肝内結石症患者に比べ、肝内胆管がん患者においてS/N値が明らかに上昇しているのが分かる。その有意差はT−検定により危険度P=0.0015であった。そこで肝内胆管がん患者を陽性、肝内結石症患者を陰性としてROC曲線を作成した。その結果を図8bに示す。がんと結石症を判別する感度は90%、特異度は76%で、直接レクチンを固定する場合に比べ特異度が大幅に向上した。なお、図8c、dに示す通り、WFA−CA125・サンドイッチ・ELISAでは結石症患者、胆管がん患者との間の有意差は、感度57%、特異度64%程度であった。
本発明による肝内胆管がん検出、判別法の成績は従来胆汁を用いて行われている胆汁細胞診による判別結果よりも優れていることが表6(WFA−MY.1E12・サンドイッチ・ELISA法と、胆汁細胞診との比較:斜体が本発明実施例)に示される。感度すなわちがんを検出する能力は胆汁細胞診の22%(4/18)に比べ83%(15/18)であり胆汁細胞診に比べ優れている。肝内胆管がんはその特性上、早期に発見でき、かつ偽陰性が少ないことが求められている。つまり感度が高いマーカーが重要である。今回開発した手法は優れた肝内胆管がんマーカーであることが示される。
上述のとおり、高感度な検出系を確立できたため、引き続き血清を用いた検出を試みた。
(実験方法)
<1.WFA固相化ウェルプレートの作製>
ストレプトアビジンコートマイクロタイタープレート(NUNC社製 96ウェル平底プレート)へPBS緩衝液に溶解したビオチン化 WFA(Vector社製、20μg/mL)を各ウェルに50μLずつ加え、1時間室温で保温し、支持体へWFAを固相化した。未結合ビオチン化 WFAを洗浄液である0.1%Tween20含有PBS(300μL)で2回ずつ洗浄し、WFA固相化ウェルプレートを完成させた。
各血清サンプルは上記洗浄液で4μL/100μLになるように希釈し、うち50μLを1で作製したWFA固相化ウェルプレートへ添加した後、2時間室温で結合反応した。反応後、各ウェルは上記洗浄液300μLで5回洗浄し、未結合タンパク質を除去した。そこにあらかじめ0.5μg/mLへ洗浄液で調整した検出剤(MY.1E12抗体溶液)を1ウェルあたり50μLずつ加え、室温で2時間抗原抗体反応した。
胆管がん患者由来血清5症例に加え、原発性胆汁性肝硬変(PBC)患者由来血清3例、肝内結石症患者由来血清5症例、健常者血清6例分について分析を行った。その結果を図9に示す。PBC患者(b)、肝内結石症患者(c)、健常者(d)に比べ、胆管がん患者(a)において5例中3例が値で明らかに上昇しているのが分かる。
Claims (11)
- レクチンWFA結合性糖タンパク質をがんマーカーとし、被検試料における該がんマーカーをインビトロで検出することによって肝内胆管がんを検出する肝内胆管がんの検出方法であって、被検試料における肝内胆管がんマーカーの存在の検出を、レクチンWFA、がんマーカーであるレクチンWFA結合性糖タンパク質、及び、レクチンWFA結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体を用いたサンドイッチ法により行うことを特徴とする肝内胆管がんの検出方法。
- レクチンWFA結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体が、CA125、N−CAM-L1、Maspin、及びMUC1を抗原とする抗体の1又は2以上の抗体であることを特徴とする請求項1に記載の肝内胆管がんの検出方法。
- レクチンWFA、がんマーカーであるレクチンWFA結合性糖タンパク質、及び、レクチンWFA結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体を用いたサンドイッチ法を、標識化したレクチンWFA又はレクチンWFA結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する標識化した抗体を用いて行うことを特徴とする請求項1又は請求項2に記載の肝内胆管がんの検出方法。
- レクチンWFA、がんマーカーであるレクチンWFA結合性糖タンパク質、及び、レクチンWFA結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体を用いたサンドイッチ法による肝内胆管がんの検出を、レクチンWFA結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体を支持体上に固相化し、標識化したレクチンWFAにより、がんマーカーであるレクチンWFA結合性糖タンパクをサンドイッチしたレクチンオーバーレイにより行なうか、或いは、レクチンWFAを支持体上に固相化し、標識化した抗体によりがんマーカーであるレクチンWFA結合性糖タンパクをサンドイッチした抗体オーバーレイにより行なうことを特徴とする請求項1〜3の何れか1項に記載の肝内胆管がんの検出方法。
- 抗体オーバーレイ或いはレクチンWFAオーバーレイによる肝内胆管がんの検出を、マイクロアレイを用い、レクチンマイクロアレイ検出手段或いは抗体マイクロアレイ検出手段により検出することを特徴とする請求項4に記載の肝内胆管がんの検出方法。
- 肝内胆管がんのインビトロで検出するための被検試料が、胆汁又は血液からなる臨床検体であることを特徴とする請求項1〜5の何れか1項に記載の肝内胆管がんの検出方法。
- 請求項1〜6の何れか1項に記載の肝内胆管がんの検出方法を用いて、被検試料における肝内胆管がんをインビトロで検出し、肝臓に原発する悪性腫瘍における肝内胆管がんを判別することを特徴とする肝内胆管がんの判別方法。
- 標識化したレクチンWFA及びレクチンWFA結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体、或いは、レクチンWFA結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する標識化した抗体及びレクチンWFAを装備した肝内胆管がん検出及び/又は判別用キット。
- レクチンWFA結合性糖タンパクを認識し、そして結合する抗体が、CA125、N−CAM-L1、Maspin、及びMUC1を抗原とする抗体の1又は2以上の抗体であることを特徴とする請求項8に記載の肝内胆管がんの検出及び/又は判別用キット。
- レクチンWFA結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体が、支持体上に固相化した形態で調製されているか、或いは、レクチンWFAが、支持体上に固相化した形態で調製されていることを特徴とする請求項8又は請求項9に記載の肝内胆管がんの検出及び/又は判別用キット。
- レクチンWFAをビオチン化WFAとし、該レクチンWFAをストレプトアビジンコートした支持体上に固相化した形態で調製したことを特徴とする請求項10に記載の肝内胆管がんの検出及び/又は判別用キット。
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