JP3579032B2 - 血液中の腫瘍マーカー定量方法 - Google Patents
血液中の腫瘍マーカー定量方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3579032B2 JP3579032B2 JP2002035154A JP2002035154A JP3579032B2 JP 3579032 B2 JP3579032 B2 JP 3579032B2 JP 2002035154 A JP2002035154 A JP 2002035154A JP 2002035154 A JP2002035154 A JP 2002035154A JP 3579032 B2 JP3579032 B2 JP 3579032B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- blood
- concentration
- tumor marker
- carrier
- cancer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液中の腫瘍マーカー定量方法に関する。さらに詳しくは、消化器系癌及び肝癌の診断に用いられる血液中の腫瘍マーカー定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、消化器系癌及び肝癌の腫瘍マーカーの定量方法として、採血用注射器を用いて、主に患者の肘正中静脈より全血２ｍＬ以上採取し、室温で１時間以上静置した後、冷却遠心機にて１５００Ｇ、１０分間冷却遠心して血清部分と血餅部分を分け、上清（血清）部分を別の試験管に分取し、これを測定検体として定量する方法等が知られている（例えば、臨床検査マニュアル、１９８８年、文光堂、３１１〜３１６頁）。さらに通常は測定を効率的に実施するため、測定検体を凍結又は冷蔵保存して一定量の測定検体をまとめて定量する方法等が知られている（例えば、イムノアッセイ、１９８４年、ジェイエムシー、１７３〜１７４頁）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来の方法においては、健康診断等多数の被検者から採血し血液中の腫瘍マーカーを測定する場合、多数の血液から上清を分離する操作が必要であり、分離した血清を試験管で冷蔵又は冷凍で輸送・保存する必要がある等コストが高くなる問題があった。
すなわち、本発明の目的は、消化器系癌の腫瘍マーカー及び肝癌の腫瘍マーカーを簡易に定量する方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記目的を達成すべき鋭意検討した結果、特定の方法を用いることにより、消化器系癌の腫瘍マーカー及び肝癌の腫瘍マーカーを簡易に定量できることを見いだし本発明に到達した。
すなわち、本発明は、血液担持担体から血液成分を抽出し、抽出液中の腫瘍マーカー濃度と、血液成分の抽出率とから、消化器系癌の腫瘍マーカー及び／又は肝癌の腫瘍マーカーを定量することを特徴とする血液中の腫瘍マーカー定量方法である。
抽出率は、既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液を用いて血液担持担体を作成しこれから抽出された抽出液中の腫瘍マーカーの含有量を定量して抽出液の腫瘍マーカーの濃度を求め、次式から求められる。
（抽出率）＝（抽出液の腫瘍マーカーの濃度）／（血液の腫瘍マーカーの濃度）
【０００５】
【発明実施の形態】
本発明における腫瘍マーカー（抗原）は、消化器系癌及び／又は肝癌を診断するための腫瘍マーカーである。
消化器系癌としては、食道癌、胃癌、十二指腸癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、膵臓癌及び胆のう癌等が挙げられる。これらのうち、好ましくは十二指腸癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、膵臓癌及び胆のう癌であり、さらに好ましくは大腸癌、直腸癌、膵臓癌及び胆のう癌であり、特に好ましくは大腸癌、膵臓癌及び胆のう癌である。
【０００６】
消化器系癌の腫瘍マーカーとしては、例えば、次のものが挙げられる。
食道癌の場合、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＩＡＰ、フェリチン、ポリアミン、β２−ミクログロブリン、ＰＯＡ及びトリプシンインヒビター等である。
胃癌の場合、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＫＭＯ−１、ＤｕＰＡＮ−２、ＳＰａｎ−１、ＣＡ５０、ＳＬＸ、ＣＡ７２−４、ＩＡＰ、ＴＰＡ、ポリアミン、β２−ミクログロブリン、フェリチン、ＰＯＡ及びトリプシンインヒビター等である。
十二指腸癌、小腸癌、大腸癌及び直腸癌の場合、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＫＭＯ−１、ＳＰａｎ−１、ＣＡ５０、ＳＬＸ、ＣＡ７２−４、ＩＡＰ、ＴＰＡ、β２−ミクログロブリン、フェリチン、ＰＯＡ及びトリプシンインヒビター等である。
【０００７】
胆のう癌の場合、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＫＭＯ−１、ＤｕＰＡＮ−２、ＳＰａｎ−１、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、塩基性フェトプロテイン（ＢＦＰ）、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ＩＡＰ、ＴＰＡ、β２−ミクログロブリン、フェリチン、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＰＯＡ及びトリプシンインヒビター等である。
膵臓癌の場合、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＫＭＯ−１、ＤｕＰＡＮ−２、ＳＰａｎ−１、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、ＢＦＰ、ＩＡＰ、ＴＰＡ、β２−ミクログロブリン、フェリチン、ＰＯＡ、トリプシンインヒビター及びエラスターゼ１等である。
【０００８】
肝癌の腫瘍マーカーとしては、例えば、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＫＭＯ−１、ＤｕＰＡＮ−２、ＳＰａｎ−１、ＣＡ５０、ＳＬＸ、塩基性フェトプロテイン（ＢＦＰ）、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、アルカリフォスファターゼアイソザイム、γ−ＧＴＰアイソザイム、ＩＡＰ、ＴＰＡ、β２−ミクログロブリン、フェリチン、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＰＯＡ及びトリプシンインヒビター等が挙げられる。
これらの腫瘍マーカーのうち、好ましくはＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＫＭＯ−１、ＤｕＰＡＮ−２、ＳＰａｎ−１、ＳＬＸ、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、ＢＦＰ、ＩＡＰ、ＴＰＡ、β２−ミクログロブリン、フェリチン、ＰＯＡ、トリプシンインヒビター、エラスターゼ１及びＰＩＶＫＡ−ＩＩであり、さらに好ましくはＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＫＭＯ−１、ＤｕＰＡＮ−２、ＳＰａｎ−１、ＳＬＸ、ＣＡ７２−４、ＢＦＰ、ＩＡＰ、ＴＰＡ、ＰＯＡ及びＰＩＶＫＡ−ＩＩであり、特に好ましくはＡＦＰ、ＣＥＡ及びＣＡ１９−９である。
【０００９】
本発明の血液中の腫瘍マーカーの定量方法においては、腫瘍マーカー１種のみを定量してもよく、２種以上の腫瘍マーカーを定量してもよいが、癌診断の感度及び特異性の観点から２種以上の腫瘍マーカーを定量することが好ましく、さらに好ましくは２〜３種の腫瘍マーカーを定量することである。
２種以上の腫瘍マーカーを定量するには、上記の腫瘍マーカーから適宜選択することができるが、肝癌の場合、例えば、ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ及びＣＥＡからなる腫瘍マーカーより、大腸癌の場合、例えば、ＣＥＡ及びＣＡ１９−９からなる腫瘍マーカーより、膵臓癌の場合、例えば、ＣＡ１９−９及びＣＥＡからなる腫瘍マーカーより、食道癌の場合、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びＰＯＡからなる腫瘍マーカーより、胃癌の場合、例えば、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９からなる腫瘍マーカーより、十二指腸癌、小腸癌及び直腸癌の場合、例えば、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９からなる腫瘍マーカーより、胆のう癌の場合、例えば、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９からなる腫瘍マーカーより選択することが好ましく、消化器系癌及び／又は肝癌のいずれの場合も、ＡＦＰ、ＣＥＡ及びＣＡ１９−９からなる腫瘍マーカーから選択することがさらに好ましい。
【００１０】
血液担持担体中の血液は、その採取部位及び採取方法等に制限はなく、従来の採取部位及び採取方法（例えば、採血用注射器を用いて、主に肘正中静脈より全血２ｍＬ以上採取等）で得た血液の一部を本発明に用いることも当然可能であるが、該血液は、被検者への侵襲性の低減の観点から、抹消血管からの採取が好ましく、抹消血管からの採取の中でも、被検者の侵襲性低減の観点から耳朶又は指先を穿刺して採取した血液がより好ましく、被検者が自分で血液を採取できる点、穿刺時の痛感が少ない点及び血液が液滴として採取（滴下）し易い点等の観点から指先を穿刺して採取した血液が特に好ましい。
【００１１】
末梢血液を採取する方法としては、血液を採取できれば特に制限はないが、被検者自身で実施可能であるという観点から、例えば、被検者の当該部位（例えば、耳朶及び指先等）を穿刺前によくマッサージ及び／又は暖めて充血させておき、消毒ガーゼで穿刺部位を拭いて乾燥させ、ディスポーザブル・ランセット等で当該部位を穿刺して血液を得る方法等が好ましい。
【００１２】
血液担持担体中の担体としては、血液を保持することが可能である限り、担体の材質、形状等は特に制限されないが、吸着による血液の保持が容易であり、抽出により血液成分が溶出し易い材質・形状であることが好ましく、吸着による保持が容易という観点から、吸収体であることがさらに好ましい。
担体の材質としては、公知の天然高分子及び合成高分子等が使用でき、例えば、綿、羊毛、セルロース、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリウレタン、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリエステル、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、絹、フィブロイン、リグニン、ヘミセルロース、キチン、エボナイト、ゴム、ガラス、石英及びセラミックス等が挙げられる。
これらの中で、天然高分子が好ましく、さらに好ましくはセルロース及び綿であり、特に好ましくはセルロースである。
【００１３】
担体としては、公知のものが使用でき、例えば、上記の材質等からなる濾紙、不織布、織布又はシート状発泡体等からなる吸収体が挙げられる。
吸収体の孔径は、自由に設定選択できるが、平均孔径の範囲が１〜１００μｍが好ましく、より好ましくは２〜８０μｍであり、特に好ましくは５〜５０μｍの範囲である。
濾紙としては、例えば、ＪＩＳ Ｐ３８０１（１９９５年）又はＴＡＰＰＩ（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｕｌｐ ａｎｄ Ｐａｐｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）Ｔ２０５に規定される濾紙等が挙げられる。
不織布としては、例えば、ポリオレフィン不織布、ニトロセルロース不織布、セルソールアセテート不織布、ポリエステル不織布、エポキシ不織布、ガラス不織布及びセラミックス不織布等が挙げられる。
織布としては、例えば、綿布、羊毛布、セルロース布、ポリオレフィン布、ニトロセルロース布、セルロールアセテート布、エポキシ布、ガラス布及びセラミックス布等が挙げられる。
【００１４】
シート状発泡体としては、例えば、発泡ポリスチレン、発泡ポリオレフィン、発泡ポリウレタン、発泡ポリエステル、発泡エポキシ樹脂、発泡ガラス及び発泡セラミックス等が挙げられる。
これらの中で、単位体積又は単位面積当たりに吸収する血液の量が一定になりやすいという（定量精度向上）観点から、濾紙、不織布及びシート状発泡体が好ましく、さらに好ましくは濾紙及び不織布、特に好ましくは濾紙、ポリオレフィン不織布、ニトロセルロース不織布、セルソールアセテート不織布、ポリエステル不織布、エポキシ不織布、ガラス不織布及びセラミックス不織布であり、最も好ましくは濾紙である。
【００１５】
濾紙、不織布、織布又はシート状発泡体等の厚さは、適宜選択することができるが、０．１〜３．０ｍｍが好ましく、さらに好ましくは０．２〜１．０ｍｍ、特に好ましくは０．３〜０．６ｍｍである。
濾紙、不織布、織布又はシート状発泡体等の大きさ（面積）は、採血、保管及び輸送時などの操作性を考慮して自由に設定できるが、１〜２００ｃｍ２が好ましく、さらに好ましくは１０〜１５０ｃｍ２、特に好ましく２５〜１００ｃｍ２である。
【００１６】
血液の担体への担持は、血液が保持できれば特に制限されず、担体と血液とを接触させることにより担体に血液を担持させることができる。
担体と血液とを接触させる方法としては、例えば、血液に担体を浸漬する方法、担体に血液を滴下する方法及び穿刺部に担体を押し付ける方法等が挙げられる。これらのうち、簡便性の観点から、担体に血液を滴下する方法及び穿刺部に担体を押しつける方法が好ましく、さらに好ましくは担体に血液を滴下する方法である。
【００１７】
血液に担体を浸漬する場合、血液の使用量は担体が浸漬できる量であり、担体の大きさに決定されるが、０．０５〜２ｍｌが好ましく、さらに好ましくは０．１〜１ｍｌ、特に好ましくは０．１５〜０．５ｍｌである。
担体に血液を滴下する場合、血液の使用量は担体の大きさに決定されるが、０．０２〜０．５ｍｌが好ましく、さらに好ましくは０．０５〜０．３ｍｌ、特に好ましくは０．１〜０．２ｍｌである。
穿刺部に担体を押し付ける場合、血液の使用量は担体の大きさに決定されるが、０．０２〜０．５ｍｌが好ましく、さらに好ましくは０．０５〜０．３ｍｌ、特に好ましくは０．１〜０．２ｍｌである。
【００１８】
血液担持担体の血液担持部分を一定の大きさに切り取る場合（後述）、切取られる担体が保持できる量以上の血液を滴下すればよく、滴下する血液量を正確に制御する必要はない。例えば、ろ紙がワットマン社製ＢＦＣ１８０（厚さ０．４９ｍｍ）の場合、滴下した血液量が５０μＬであれば血液を保持した部分の大きさは直径約１２ｍｍである。１滴の液量は約４０〜６０μＬであるので、血液担持部分を直径６ｍｍの円形に打ちぬく場合、必要な血液の量は１〜２滴となる。
【００１９】
さらに、血液の安定性及び定量の再現性の観点から、血液を担体に保持させた後、乾燥させることが好ましく、担体に保持された血液の重量が５０重量％以下（好ましくは３０重量％以下）になるまで乾燥することがさらに好ましい。
乾燥方法としては、例えば、減圧乾燥、冷凍減圧乾燥、微加熱乾燥及び単純乾燥（風乾）等が適用でき、これらのうち、減圧乾燥、冷凍減圧乾燥及び単純乾燥が好ましく、さらに好ましくは減圧乾燥及び単純乾燥であり、特に好ましくは単純乾燥である。
【００２０】
乾燥は、腫瘍マーカーの抗原性が変化しない条件で行うことが好ましく、４０℃以下の温度で行うのがさらに好ましく、特に好ましくは１０〜３０℃で行う。減圧する場合は、０．０２〜１０Ｐａが好ましく、さらに好ましくは０．０５〜２Ｐａ、特に好ましくは０．１〜１Ｐａである。
単純乾燥する場合の湿度は、特に制限はないが、１０〜９０％ＲＨが好ましく、さらに好ましくは４０〜８０％ＲＨである。
乾燥時間は、担体の形状、保持した血液量により適宜設定できるが、担体が濾紙の場合、２０分〜１時間程度である。
【００２１】
血液保持担体を保存する場合、湿度は、８０％ＲＨ以下が好ましく、さらに好ましくは１０〜６０％ＲＨ、特に好ましくは２０〜４０％ＲＨであり、温度は、０〜４０℃が好ましく、さらに好ましくは２〜３０℃、特に好ましくは２〜１０℃である。
なお、湿度８０％ＲＨ以下を保てる状態（密閉下、乾燥剤存在の密閉下等）であれば郵便又は宅配便等により輸送することができる。
【００２２】
血液成分の抽出の前に、血液担持担体の血液担持部分を一定の大きさに切り取ってから行うことが好ましい。例えば、均一な吸収体に血液を滴下し、過剰な血液は周囲に拡散吸収させて乾燥した後、中心部を一定の形状に切り取ったものを抽出に用いる方法が好ましい。
切り取る方法としては、一定直径のパンチで打ちぬく方法及び予め入れた切取線（ミシン目等）に沿って切り出す方法等が適用できる。
【００２３】
血液担持担体から血液成分の抽出は、血液中の腫瘍マーカー（抗原）の抗原性が変化しない限り特に制限なく行うことができ、例えば、抽出用溶液に血液担持担体を浸漬し、その上清を抽出液として用いることができる。
抽出用溶液として、ｐＨが中性領域の緩衝液が使用でき、例えば、ｐＨ６〜８のグッド緩衝液及びｐＨ６〜８のリン酸緩衝液等が好ましく使用される。
【００２４】
また、抽出用溶液に、塩、界面活性剤、蛋白質及び抗原安定化剤等を添加することもできる。
塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム及び臭化リチウム等が挙げられる。
界面活性剤としては、例えば、ソルビタンラウリン酸モノエステルエチレンオキシド付加物（例えば、ツイーン２０及びツイーン４０（ＩＣＩアメリカ社））等のノニオン界面活性剤等が挙げられる。
蛋白質としては、例えば、牛血清アルブミン及びカゼイン等が挙げられる。
抗原安定化剤としては、例えば、ＥＤＴＡ等のキレート剤及びプロテアーゼインヒビター等が挙げられる。
【００２５】
定量再現性の観点から、担体に対する抽出用溶液の使用量及び抽出時間等の抽出条件を一定にする必要がある。
抽出用溶液の使用量としては、０．０５〜５ｍｌが好ましく、さらに好ましくは０．１〜１ｍｌ、特に好ましくは０．２〜０．５ｍｌである。
抽出時間としては、０．５〜４８０分が好ましく、さらに好ましくは１〜１８０分、特に好ましくは５〜６０分である。
撹拌は、ボルテックスミキサーのような装置を用いて、容器を震動して行うことが好ましく、震動回数は１００〜２０００ｒｐｍが好ましい。
【００２６】
例えば、血液担持担体から切り取った直径６ｍｍ（厚さ０．４９ｍｍ）の濾紙（ワットマン社製ＢＦＣ１８０）の場合、以下の条件等で抽出できる。
抽出用溶液組成：塩化ナトリウム含有０．０５モル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（塩化ナトリウムの含有量：緩衝液１００ｍＬ当たり０．８５ｇ、以下同じ。）
抽出用溶液の使用量：２００〜３００μＬ
抽出温度：室温（１５〜２５℃）
抽出時間：２０分〜１時間（攪拌後の放置時間）
抽出操作：担体に抽出用溶液を加えボルテックスミキサーで攪拌後（５００ｒｐｍ、１分）、上記温度で上記時間放置する。再度攪拌（ボルテックスミキサーで５００ｒｐｍ、５秒）し、１分間静置し分散したろ紙繊維を沈降させた後、上清液を採取し、腫瘍マーカー測定のための検体（抽出液）として用いる。
【００２７】
上記抽出液中の腫瘍マーカーの定量方法は特に制限されないが、定量値の再現性及び測定感度の観点から、免疫学的測定法が好ましい。
免疫学的測定法としては従来公知の方法が使用できるが、抽出液中の腫瘍マーカー濃度が血液中の濃度より低いためより定量感度の高い測定法が望ましく、例えば、放射免疫測定（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）及び化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）が好ましい。
【００２８】
放射免疫測定（ＲＩＡ）としては、固相抗体とＩ１２５標識抗体を用いた２部位サンドイッチ測定法等が挙げられ、多数の測定試薬キットが市販されている。酵素免疫測定法（ＥＩＡ）としては、固相抗体と酵素標識抗体を用いた２部位サンドイッチ測定法等が挙げられ、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等を用いた種々の測定試薬キットが市販されている。
蛍光免疫測定（ＦＩＡ）としては、固相抗体とユーロピウム標識抗体を用いた２部位サンドイッチ測定法等が挙げられる。
化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）としては、固相抗体とアクリジニウムエステル標識抗体を用いた２部位サンドイッチ測定法等が挙げられ、種々の測定試薬キットが市販されている。
これらの免疫学的測定法の中で、好ましいのは酵素免疫測定法（ＥＩＡ）であり、さらに好ましくは化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）である。
【００２９】
抽出液中の腫瘍マーカー濃度から、血液中の腫瘍マーカーの濃度を求める方法は、種々の方法が適用でき、例えば、（１）腫瘍マーカーの濃度が既知の血液を担持した血液担持担体を用いて作成した検量線を用いる方法、及び（２）腫瘍マーカーの濃度が既知の抽出液を用いて作成した検量線と腫瘍マーカーの抽出率とを用いる方法等が挙げられる。
【００３０】
（２）の方法において、抽出率は、既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液を用いて血液担持担体を作成し、これから抽出された抽出液中の腫瘍マーカーの含有量を定量して抽出液の腫瘍マーカーの濃度を求め、次式から求められる。抽出率は、以上の操作を少なくとも２回（好ましくは少なくとも３回）行い、それらの平均値を用いることが好ましい。
抽出率＝（抽出液の腫瘍マーカーの濃度）／（血液の腫瘍マーカーの濃度）
検体の血液中の腫瘍マーカー濃度は、検体から調製される抽出液中の腫瘍マーカー濃度を抽出率で除すことで求めることが出来るが、その際、血液担持担体の作成及び抽出の条件は抽出率を求めた時と同じ条件である必要がある。
【００３１】
なお、本発明で定量される腫瘍マーカーは、血液中に極低濃度で存在しているため、濃度の変動による抽出率の変動は極わずかであり、例えば、ＡＦＰの場合、０．５〜１，０００ｎｇ／ｍＬの範囲で同一の抽出率が使用できる。１，０００ｎｇ／ｍＬを越える高濃度の検体の場合、求めた抽出率と実際の抽出率とが異なる可能性はあるが、臨床的な判断に影響することはない（すなわち、ＡＦＰの場合、癌判断の境界濃度が１０ｎｇ／ｍＬであり、１，０００ｎｇ／ｍＬを越えていれば癌判断において陽性である。）。
【００３２】
また、ＣＥＡの場合、０．５〜２００ｎｇ／ｍＬの範囲で同一の抽出率が使用できる。２００ｎｇ／ｍＬを越える高濃度の検体の場合、求めた抽出率と実際の抽出率とが異なる可能性はあるが、臨床的な判断に影響することはない（すなわち、ＣＥＡの場合、癌判断の境界濃度が５ｎｇ／ｍＬであり、２００ｎｇ／ｍＬを越えていれば癌判断において陽性である。）。ＡＦＰ及びＣＥＡ以外の腫瘍マーカーについても同様であり、腫瘍マーカーの濃度よって臨床的な判断に影響することはない。
【００３３】
（１）及び（２）の方法の何れの場合も、既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液又は抽出液は、濃度の異なる２種以上を用いることが好ましい。
既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液又は抽出液の濃度は、測定する腫瘍マーカーの種類により自由に設定できるが、通常は健常人の範囲（正常域）と癌である可能性が高い範囲との境界濃度（カットオフ）を明確に測定できる濃度で設定することが好ましく、例えば、ＡＦＰの場合、カットオフは通常１０ｎｇ／ｍＬ前後であるため、（１）の方法の場合、既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液は、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬを挟んで２濃度（例えば、５ｎｇ／ｍＬ以上１０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度と１０ｎｇ／ｍＬ以上５０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度）設定することが好ましい。また、（２）の方法の場合は、抽出液中の腫瘍マーカーの濃度であるので、１０ｎｇ／ｍＬを元に抽出率を考慮した２濃度（例えば、抽出率が０．０２の場合、血液中濃度１０ｎｇ／ｍＬは抽出液中濃度０．２ｎｇ／ｍＬに相当するので０．１ｎｇ／ｍＬ以上０．２ｎｇ／ｍＬ未満の濃度と０．２ｎｇ／ｍＬ以上１ｎｇ／ｍＬ未満の濃度）に設定することが好ましい。
【００３４】
また、ＣＥＡの場合、カットオフは通常５ｎｇ／ｍＬ前後であるため、（１）の方法の場合、既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液は、少なくとも５ｎｇ／ｍＬを挟んで２濃度（例えば、２ｎｇ／ｍＬ以上５ｎｇ／ｍＬ未満の濃度と５ｎｇ／ｍＬ以上２５ｎｇ／ｍＬ未満の濃度）設定することが好ましい。また、（２）の方法の場合は、抽出液中の腫瘍マーカーの濃度であるので、５ｎｇ／ｍＬを元に抽出率を考慮した２濃度（例えば、抽出率が０．０２の場合、血液中濃度５ｎｇ／ｍＬは抽出液中濃度０．１ｎｇ／ｍＬに相当するので０．０５ｎｇ／ｍＬ以上０．１ｎｇ／ｍＬ未満の濃度と０．１ｎｇ／ｍＬ以上０．５ｎｇ／ｍＬ未満の濃度）に設定することが好ましい。
【００３５】
また、ＣＡ１９−９の場合、カットオフは通常３７Ｕ／ｍＬ前後であるため、（１）の方法の場合、既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液は、少なくとも３７Ｕ／ｍＬを挟んで２濃度（例えば、５Ｕ／ｍＬ以上３７Ｕ／ｍＬ未満の濃度と３７Ｕ／ｍＬ以上１００Ｕ／ｍＬ未満の濃度）設定することが好ましい。また、（２）の方法の場合は、抽出液中の腫瘍マーカーの濃度であるので、３７Ｕ／ｍＬを元に抽出率を考慮した２濃度（例えば、抽出率が０．０２の場合、血液中濃度３７Ｕ／ｍＬは抽出液中濃度０．７４Ｕ／ｍＬに相当するので０．１Ｕ／ｍＬ以上０．７４Ｕ／ｍＬ未満の濃度と０．７４Ｕ／ｍＬ以上２．０Ｕ／ｍＬ未満の濃度）に設定することが好ましい。
【００３６】
ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９以外の腫瘍マーカーのカットオフを列挙すると、例えばＩＡＰ：５０１μｇ／ｍＬ、フェリチン：２００ｎｇ／ｍＬ、ポリアミン：４５μｍｏｌ／ｇクレアチニン、ＰＯＡ：２０Ｕ／ｍＬ、ＫＭＯ−１：６００Ｕ／ｍＬ、ＤｕＰＡＮ−２：４００Ｕ／ｍＬ、ＣＡ５０：３６Ｕ／ｍＬ、ＣＡ７２−４：４Ｕ／ｍＬ、ＴＰＡ：１３０Ｕ／Ｌ、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ：０．１ＡＵ／ｍＬである。
【００３７】
（１）の方法では、検量線の作成に抽出操作から行う必要がある点及び検量線作成用の血液は長期間保存できないので測定の際に作成する煩わしさがあるが、抽出条件が変動しても正確な測定ができるという長所がある。一方、（２）の方法は、あらかじめ抽出率を求め、抽出操作等の条件を一定にすれば多量の検体を正確かつ簡便に測定することができる。（１）及び（２）の方法のうち、簡便さの観点から、（２）の方法が好ましい。
【００３８】
本発明の定量方法は、被検者自身で採血、担体に保持・乾燥、輸送（例えば、持参、郵便及び宅配便等）することができ、消化器系癌及び肝癌の健康診断等のように多数の検体を広い地域から集めて定量する場合に最適である。又、癌検診のほか、遠隔地の患者に対する癌治療の経過観察等においても、適用できる。
【００３９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
【００４０】
＜実施例１＞
本実施例は、血液担持担体を長期間保存しても正確に腫瘍マーカー（ＡＦＰ）を定量できることを示したものである。
１．採血及び血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
ボランティア６名（被検者Ａ〜Ｆ）の指先をよくマッサージ及び暖めて充血させておき消毒用ガーゼで穿刺部位を拭いて乾燥させてから、ディスポーザブル・ランセット（商品名「ヘモレット」、ミドリ十字株式会社製）で穿刺し、最初の血滴を拭い去り、次の血滴２滴を被検者１人当たり１０枚の採血用濾紙（品番ＢＦＣ１８０、ワットマン株式会社製）ぞれぞれに指先から直接滴下し吸収させた。次いで、室内（２５±１℃、６５±５％ＲＨ）で風乾し（風乾時間５，２０，４０，６０又は１２０分）、血液担持担体（血乾燥濾紙）を得た。
風燥時間毎に血液担持担体（血液乾燥濾紙）の重量を計測し、初期血液重量（濾紙重量を除いた値）に対する比を乾燥度を求めた（血液担持担体２枚の平均値）。この乾燥度を表１中に示した。
次いで、血液担持担体（血液乾燥濾紙）を表１記載の保存条件で保存した（保存日数０，３，７，１４，２８日）。
【００４１】
【表１】
【００４２】
２．抽出操作
以下の操作は温度２０〜２５℃の室内で実施した。
表１の条件で保存した各血液担持担体（血乾燥濾紙）の血液担持部分の中心部を、直径６ｍｍの１穴パンチ（事務用として市販されている物）で打ち抜いて濾紙片を得た。
試験管に打ち抜いた濾紙片及び塩化ナトリウム含有０．０５モル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（抽出用溶液）２５０μＬを加え、３０秒間攪拌（ボルテックスミキサーで５００ｒｐｍ）した後、３０分間放置した。その後、３０秒間同様に攪拌した後１分間静置し、上清を分取して抽出液を調製し、これを腫瘍マーカーの定量に供した。
【００４３】
３．抽出液中の腫瘍マーカー（ＡＦＰ）の定量
定量用試薬としては、臨床検査薬として和光純薬工業株式会社より発売されている「スフィアライト ＡＦＰ」を用いた。
抽出液中の腫瘍マーカー量を決定するための標準溶液は、和光純薬工業株式会社より発売されている「スフィアライト ＡＦＰコントロールセット」を用いた。
定量装置としては、オリンパス光学工業株式会社製のＳｐｈｅｒｅＬｉｇｈｔ１８０を用いた。
本試薬と装置を用いることで化学発光酵素免疫測定法により、ＡＦＰの定量ができる。
使用する定量用試薬が血清中の腫瘍マーカー濃度を測定するための臨床検査薬であり、通常測定に使用する検体量は１０μＬに設定されおり、反応時間はトータル約１５分である。抽出液中の腫瘍マーカーの定量の場合、血清中より低濃度であるため、抽出液は１００μＬ使用した。
【００４４】
４．定量結果
定量結果及び次式で求めた安定度を表２〜１１に示した。
（安定度）＝（所定保存期間後の定量値）×１００／（初期定量値）
なお、初期定量値は、血液担持担体を作成後、直ちに抽出用溶液に血液担持担体を投入し、抽出操作を開始して定量したものであり、保存期間０日として示した。
各条件で作成、保存した血液担持担体（血液乾燥濾紙）から得た抽出液中の腫瘍マーカー（抗原：ＡＦＰ）は、乾燥時間が５分の場合を除き、保存温度４℃では２８日、２５℃では７日間、安定度９０％以上の値を示した。
従って、乾燥時間が２０分以上であれば、血液担持担体（血液乾燥濾紙）中の腫瘍マーカー（抗原：ＡＦＰ）は安定であることが判った。
【００４５】
【表２】
【００４６】
【表３】
【００４７】
【表４】
【００４８】
【表５】
【００４９】
【表６】
【００５０】
【表７】
【００５１】
【表８】
【００５２】
【表９】
【００５３】
【表１０】
【００５４】
【表１１】
【００５５】
＜実施例２＞
本実施例は、血液担持担体を長期間保存しても正確に腫瘍マーカー（ＣＥＡ）を定量できることを場合で示したものである。
１．採血及び血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１と同様にして、ボランティア６名（被検者Ａ〜Ｆ）から血液担持担体（血乾燥濾紙）を調製し、表１記載の保存条件で保存した（保存日数０，３，７，１４，２８日）。
２．抽出操作
実施例１と同様にして、抽出液を調製し、これを腫瘍マーカーの定量に供した。
【００５６】
３．抽出液中の腫瘍マーカー（ＣＥＡ）の定量
測定試薬は臨床検査薬としては、和光純薬工業株式会社より発売されている「スフィアライト ＣＥＡ」を用いた。
抽出液中の腫瘍マーカー量を決定するための標準溶液は、和光純薬工業株式会社より発売されている「スフィアライト ＣＥＡコントロールセット」を用いた。
定量装置としては、オリンパス光学工業株式会社製のＳｐｈｅｒｅＬｉｇｈｔ１８０を用いた。
本試薬と装置を用いることで化学発光酵素免疫測定法により、ＣＥＡの定量ができる。
使用する定量用試薬が血清中の腫瘍マーカー濃度を測定するための臨床検査薬であり、通常測定に使用する検体量は４０μＬに設定されおり、反応時間はトータル約１５分である。抽出液中の腫瘍マーカーの定量の場合、血清中より低濃度であるため、抽出液は１００μＬ使用した。また、反応時間を２９分に延長した。
【００５７】
４．定量結果
定量結果及び実施例１と同様にして求めた安定度を表１２〜２１に示した。
なお、初期定量値は、血液担持担体を作成後、直ちに抽出用溶液に血液担持担体を投入し、抽出操作を開始して定量したものであり、保存期間０日として示した。
各条件で作成、保存した血液担持担体（血液乾燥濾紙）から得た抽出液中の腫瘍マーカー（抗原：ＣＥＡ）は、乾燥時間が５分の場合を除き、保存温度４℃では２８日、２５℃では７日間、安定度９０％以上の値を示した。
従って、乾燥時間が２０分以上であれば、血液担持担体（血液乾燥濾紙）中の腫瘍マーカー（抗原：ＣＥＡ）は安定であることが判った。
【００５８】
【表１２】
【００５９】
【表１３】
【００６０】
【表１４】
【００６１】
【表１５】
【００６２】
【表１６】
【００６３】
【表１７】
【００６４】
【表１８】
【００６５】
【表１９】
【００６６】
【表２０】
【００６７】
【表２１】
【００６８】
＜実施例３＞
本実施例は、血液担持担体を長期間保存しても正確に腫瘍マーカー（ＣＡ１９−９）を定量できることを場合で示したものである。
１．採血及び血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１と同様にして、ボランティア６名（被検者Ａ〜Ｆ）から血液担持担体（血乾燥濾紙）を調製し、表１記載の保存条件で保存した（保存日数０，３，７，１４，２８日）。
２．抽出操作
実施例１と同様にして、抽出液を調製し、これを腫瘍マーカーの定量に供した。
【００６９】
３．抽出液中の腫瘍マーカー（ＣＡ１９−９）の定量
測定試薬は臨床検査薬としては、和光純薬工業株式会社より発売されている「スフィアライト ＣＡ１９−９」を用いた。
抽出液中の腫瘍マーカー量を決定するための標準溶液は、和光純薬工業株式会社より発売されている「スフィアライト Ｃ１９−９Ａコントロールセット」を用いた。
定量装置としては、オリンパス光学工業株式会社製のＳｐｈｅｒｅＬｉｇｈｔ１８０を用いた。
本試薬と装置を用いることで化学発光酵素免疫測定法により、ＣＡ１９−９の定量ができる。
【００７０】
使用する定量用試薬が血清中の腫瘍マーカー濃度を測定するための臨床検査薬であり、通常測定に使用する検体量は１０μＬに設定されおり、反応時間はトータル約１５分である。抽出液中の腫瘍マーカーの定量の場合、血清中より低濃度であるため、抽出液は１００μＬ使用した。また、反応時間を２９分に延長した。
【００７１】
４．定量結果
定量結果及び実施例１と同様にして求めた安定度を表２２〜３１に示した。
なお、初期定量値は、血液担持担体を作成後、直ちに抽出用溶液に血液担持担体を投入し、抽出操作を開始して定量したものであり、保存期間０日として示した。
各条件で作成、保存した血液担持担体（血液乾燥濾紙）から得た抽出液中の腫瘍マーカー（抗原：ＣＡ１９−９）は、乾燥時間が５分の場合を除き、保存温度４℃では２８日、２５℃では７日間、安定度９０％以上の値を示した。
従って、乾燥時間が２０分以上であれば、血液担持担体（血液乾燥濾紙）中の腫瘍マーカー（抗原：ＣＡ１９−９）は安定であることが判った。
【００７２】
【表２２】
【００７３】
【表２３】
【００７４】
【表２４】
【００７５】
【表２５】
【００７６】
【表２６】
【００７７】
【表２７】
【００７８】
【表２８】
【００７９】
【表２９】
【００８０】
【表３０】
【００８１】
【表３１】
【００８２】
＜実施例４＞
本実施例は、本発明の方法によって求めたＡＦＰ濃度と従来の方法によるＡＦＰ濃度とが良好な相関関係にあることを示すものである。
１．標準ＡＦＰ添加血液担持担体の作成
ボランティア５名（被検者Ｇ〜Ｋ）より血液１．８ｍＬを採取し、０．９ｍＬ×２本に分割して、その一方に「スフィアライト ＡＦＰコントロールセット」の標準ＡＦＰ溶液（４００ｎｇ／ｍＬ）を１００μＬ加えて、標準ＡＦＰ添加血液を調製した。
濾紙（ＢＦＣ１８０、ワットマン株式会社製）に標準ＡＦＰ添加血液を１００μＬ滴下し、室温（２５±２℃）で１時間乾燥し、標準ＡＦＰ添加血液担持担体▲２▼を作成した。
同様にして、他一方の血液０．９ｍｌを濾紙に滴下・乾燥し、血液担持担体▲１▼を作成した。
【００８３】
２．抽出及び測定
実施例１記載の抽出方法と同様にして、標準ＡＦＰ添加血液担持担体▲１▼及び血液担持担体▲２▼からそれぞれ抽出液を調製して、抽出液中のＡＦＰ濃度を測定した。それらの結果を表３２に示した。
【００８４】
【表３２】
【００８５】
３．抽出率の設定
表３２に示した測定値から次式から抽出率を算出した。それらの結果を表３２に示した。５名の血液での抽出率の平均値を、本条件で作成及び抽出した場合の抽出率（０．０１９９）として設定した。
抽出率＝（Ｂ−Ａ）／Ｃ
Ａ：血液担持担体▲１▼から調製した抽出液中のＡＦＰ濃度
Ｂ：標準ＡＦＰ（４００ｎｇ／ｍＬ）添加血液担持担体から調製した抽出液中のＡＦＰ濃度
Ｃ：４０ｎｇ／ｍＬ（添加したＡＦＰ量）
【００８６】
４．採血
肝癌患者を含め２０名より採血を実施した。採血は実施例１記載方法（指先から採血）及び肘正中静脈から従来方法（採血用注射器を用いて、肘正中静脈より全血２ｍＬ以上採取）で実施した。肘正中静脈より採取した全血は室温で１時間以上静置した後、冷却遠心機にて１５００Ｇ、１０分間冷却遠心し、更に上清（血清）部分を分取した。
【００８７】
５．血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１記載の方法と同様にして、血液担持担体（血液乾燥濾紙）を作成した。乾燥時間は、抽出率設定の場合と同じ１時間とした。
【００８８】
６．抽出及び定量
血液担持担体について、抽出率設定の場合と同じ方法で抽出及びＡＦＰ濃度測定を実施した。
一方、従来の方法で採取、分離した血清については、実施例１記載の「スフィアライト ＡＦＰ」で、測定試薬に添付された説明書通りの条件で測定を実施した（検体量 １０μＬ）。
【００８９】
７．血液中のＡＦＰ濃度の決定
血液担持担体から調製した抽出液中のＡＦＰ濃度を抽出率（０．０１９９）で除し、血液中のＡＦＰ濃度を求めた。
従来の方法で求めた血清中のＡＦＰの濃度と本発明の方法で求めた血液中のＡＦＰ濃度を表３３に示した。また、これらの値を用いて本発明の方法によるＡＦＰ濃度と従来法によるＡＦＰ濃度との相関図を図１に示した。図１から判るように、従来法での血清中のＡＦＰ濃度と本発明の方法による血液中ＡＦＰ濃度は、良好な相関性を示した。図１中、式は相関式（Ｘ：従来法でのＡＦＰ濃度、Ｙ：本発明の方法でのＡＦＰ濃度）、Ｒは相関係数を示すものである。
【００９０】
【表３３】
【００９１】
＜実施例５＞
本実施例は、本発明の方法によって求めたＣＥＡ濃度と従来の方法によるＣＥＡ濃度とが良好な相関関係にあることを示すものである。
１．標準ＣＥＡ添加血液担持担体の作成
ボランティア５名（被検者Ｇ〜Ｋ）より血液１．８ｍＬを採取し、０．９ｍＬ×２本に分割して、その一方に「スフィアライト ＣＥＡコントロールセット」の標準ＣＥＡ溶液（０又は１５０ｎｇ／ｍＬ）をそれぞれ１００μＬ加えて、標準ＣＥＡ添加血液（０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ）を調製した。
濾紙（ＢＦＣ１８０、ワットマン株式会社製）に標準ＣＥＡ添加血液（１５０ｎｇ／ｍＬ）を１００μＬ滴下し、室温（２５±２℃）で１時間乾燥し、標準ＣＥＡ添加血液担持担体▲２▼を作成した。
同様にして、他一方の血液（０ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを濾紙に滴下・乾燥し、血液担持担体▲１▼を作成した。
【００９２】
２．抽出及び測定
実施例２記載の抽出方法と同様にして、標準ＣＥＡ添加血液担持担体▲１▼及び血液担持担体▲２▼からそれぞれ抽出液を調製して、抽出液中のＣＥＡ濃度を測定した。それらの結果を表３４に示した。
【００９３】
【表３４】
【００９４】
３．抽出率の設定
表３４に示した測定値から次式から抽出率を算出した。それらの結果を表３４に示した。５名の血液での抽出率の平均値を、本条件で作成及び抽出した場合の抽出率（０．０１９９）として設定した。
抽出率＝（Ｂ−Ａ）／Ｃ
Ａ：血液担持担体▲１▼から調製した抽出液中のＣＥＡ濃度
Ｂ：標準ＣＥＡ（１５０ｎｇ／ｍＬ）添加血液担持担体から調製した抽出液中のＣＥＡ濃度
Ｃ：１５ｎｇ／ｍＬ（添加したＣＥＡ量）
【００９５】
４．採血
大腸癌患者を含め２０名より採血を実施した。採血は実施例１記載方法（指先から採血）及び肘正中静脈から従来方法（採血用注射器を用いて、肘正中静脈より全血２ｍＬ以上採取）で実施した。肘正中静脈より採取した全血は室温で１時間以上静置した後、冷却遠心機にて１５００Ｇ、１０分間冷却遠心し、更に上清（血清）部分を分取した。
【００９６】
５．血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１記載の方法と同様にして、血液担持担体（血液乾燥濾紙）を作成した。乾燥時間は、抽出率設定の場合と同じ１時間とした。
【００９７】
６．抽出及び定量
血液担持担体について、抽出率設定の場合と同じ方法で抽出及びＣＥＡ濃度測定を実施した。
一方、従来の方法で採取、分離した血清については、実施例２記載の「スフィアライト ＣＥＡ」で、測定試薬に添付された説明書通りの条件で測定を実施した（検体量 ４０μＬ）。
【００９８】
７．血液中のＣＥＡ濃度の決定
血液担持担体から調製した抽出液中のＣＥＡ濃度を抽出率（０．０１９９）で除し、血液中のＣＥＡ濃度を求めた。
従来の方法で求めた血清中のＣＥＡの濃度と本発明の方法で求めた血液中のＣＥＡ濃度を表３５に示した。また、これらの値を用いて本発明の方法によるＣＥＡ濃度と従来法によるＣＥＡ濃度との相関図を図２に示した。図２から判るように、従来法での血清中のＣＥＡ濃度と本発明の方法による血液中ＣＥＡ濃度は、良好な相関性を示した。図２中、式は相関式（Ｘ：従来法でのＣＥＡ濃度、Ｙ：本発明の方法でのＣＥＡ濃度）、Ｒは相関係数を示すものである。
【００９９】
【表３５】
【０１００】
＜実施例６＞
本実施例は、本発明の方法によって求めたＣＡ１９−９濃度と従来の方法によるＣＡ１９−９濃度とが良好な相関関係にあることを示すものである。
１．標準ＣＡ１９−９添加血液担持担体の作成
ボランティア５名（被検者Ｇ〜Ｋ）より血液１．８ｍＬを採取し、０．９ｍＬ×２本に分割して、その一方に「スフィアライト ＣＡ１９−９コントロールセット」の標準ＣＡ１９−９溶液（０又は２００Ｕ／ｍＬ）をそれぞれ１００μＬ加えて、標準ＣＡ１９−９添加血液を調製した。
濾紙（ＢＦＣ１８０、ワットマン株式会社製）に標準ＣＡ１９−９添加血液（２００Ｕ／ｍＬ）を１００μＬ滴下し、室温（２５±２℃）で１時間乾燥し、標準ＣＡ１９−９添加血液担持担体▲２▼を作成した。
同様にして、他一方の血液（０Ｕ／ｍＬ）１００μＬを濾紙に滴下・乾燥し、血液担持担体▲１▼を作成した。
【０１０１】
２．抽出及び測定
実施例３記載の抽出方法と同様にして、標準ＣＡ１９−９添加血液担持担体▲１▼及び血液担持担体▲２▼からそれぞれ抽出液を調製して、抽出液中のＣＡ１９−９濃度を測定した。それらの結果を表３６に示した。
【０１０２】
【表３６】
【０１０３】
３．抽出率の設定
表３６に示した測定値から次式から抽出率を算出した。それらの結果を表３６に示した。５名の血液での抽出率の平均値を、本条件で作成及び抽出した場合の抽出率（０．０２０４）として設定した。
抽出率＝（Ｂ−Ａ）／Ｃ
Ａ：血液担持担体▲１▼から調製した抽出液中のＣＡ１９−９濃度
Ｂ：標準ＣＡ１９−９（２００Ｕ／ｍＬ）添加血液担持担体から調製した抽出液中のＣＡ１９−９濃度
Ｃ：２０Ｕ／ｍＬ（添加したＣＡ１９−９量）
【０１０４】
４．採血
膵臓癌患者を含め２０名より採血を実施した。採血は実施例１記載方法（指先から採血）及び肘正中静脈から従来方法（採血用注射器を用いて、肘正中静脈より全血２ｍＬ以上採取）で実施した。肘正中静脈より採取した全血は室温で１時間以上静置した後、冷却遠心機にて１５００Ｇ、１０分間冷却遠心し、更に上清（血清）部分を分取した。
【０１０５】
５．血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１記載の方法と同様にして、血液担持担体（血液乾燥濾紙）を作成した。乾燥時間は、抽出率設定の場合と同じ１時間とした。
【０１０６】
６．抽出及び定量
血液担持担体について、抽出率設定の場合と同じ方法で抽出及びＣＡ１９−９濃度測定を実施した。
一方、従来の方法で採取、分離した血清については、実施例３記載の「スフィアライト ＣＡ１９−９」で、測定試薬に添付された説明書通りの条件で測定を実施した（検体量 １０μＬ）。
【０１０７】
７．血液中のＣＡ１９−９濃度の決定
血液担持担体から調製した抽出液中のＣＡ１９−９濃度を抽出率（０．０１９９）で除し、血液中のＣＡ１９−９濃度を求めた。
従来の方法で求めた血清中のＣＡ１９−９の濃度と本発明の方法で求めた血液中のＣＡ１９−９濃度を表３７に示した。また、これらの値を用いて本発明の方法によるＣＡ１９−９濃度と従来法によるＣＡ１９−９濃度との相関図を図３に示した。図３から判るように、従来法での血清中のＣＡ１９−９濃度と本発明の方法による血液中ＣＡ１９−９濃度は、良好な相関性を示した。図２中、式は相関式（Ｘ：従来法でのＣＡ１９−９濃度、Ｙ：本発明の方法でのＣＡ１９−９濃度）、Ｒは相関係数を示すものである。
【０１０８】
【表３７】
【０１０９】
【発明の効果】
本発明の血液中の腫瘍マーカーの定量方法によると、消化器系癌の腫瘍マーカー及び肝癌の腫瘍マーカーを極めて簡易に定量することができる。
さらに、被検者自身で採血することができるので採血のための熟練者等が不要であり、被検者が採血のため病院等に出向く必要もないという簡便性も併せもつものである。
また、血液担持担体は、簡単に輸送することができるので、多数の検体を一ヶ所に集めて測定することができ輸送及び測定のコストを低減させることができる等の効果がある。
従って、本発明の定量方法は、消化器系癌及び肝癌の健康診断等の多数の検体を広い地域から集めて測定する場合に最適である。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来の方法による血清中のＡＦＰ濃度と本発明の方法による血液中のＡＦＰ濃度との相関を表すグラフである。
【図２】従来の方法による血清中のＣＥＡ濃度と本発明の方法による血液中のＣＥＡ濃度との相関を表すグラフである。
【図３】従来の方法による血清中のＣＡ１９−９濃度と本発明の方法による血液中のＣＡ１９−９濃度との相関を表すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液中の腫瘍マーカー定量方法に関する。さらに詳しくは、消化器系癌及び肝癌の診断に用いられる血液中の腫瘍マーカー定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、消化器系癌及び肝癌の腫瘍マーカーの定量方法として、採血用注射器を用いて、主に患者の肘正中静脈より全血２ｍＬ以上採取し、室温で１時間以上静置した後、冷却遠心機にて１５００Ｇ、１０分間冷却遠心して血清部分と血餅部分を分け、上清（血清）部分を別の試験管に分取し、これを測定検体として定量する方法等が知られている（例えば、臨床検査マニュアル、１９８８年、文光堂、３１１〜３１６頁）。さらに通常は測定を効率的に実施するため、測定検体を凍結又は冷蔵保存して一定量の測定検体をまとめて定量する方法等が知られている（例えば、イムノアッセイ、１９８４年、ジェイエムシー、１７３〜１７４頁）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来の方法においては、健康診断等多数の被検者から採血し血液中の腫瘍マーカーを測定する場合、多数の血液から上清を分離する操作が必要であり、分離した血清を試験管で冷蔵又は冷凍で輸送・保存する必要がある等コストが高くなる問題があった。
すなわち、本発明の目的は、消化器系癌の腫瘍マーカー及び肝癌の腫瘍マーカーを簡易に定量する方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記目的を達成すべき鋭意検討した結果、特定の方法を用いることにより、消化器系癌の腫瘍マーカー及び肝癌の腫瘍マーカーを簡易に定量できることを見いだし本発明に到達した。
すなわち、本発明は、血液担持担体から血液成分を抽出し、抽出液中の腫瘍マーカー濃度と、血液成分の抽出率とから、消化器系癌の腫瘍マーカー及び／又は肝癌の腫瘍マーカーを定量することを特徴とする血液中の腫瘍マーカー定量方法である。
抽出率は、既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液を用いて血液担持担体を作成しこれから抽出された抽出液中の腫瘍マーカーの含有量を定量して抽出液の腫瘍マーカーの濃度を求め、次式から求められる。
（抽出率）＝（抽出液の腫瘍マーカーの濃度）／（血液の腫瘍マーカーの濃度）
【０００５】
【発明実施の形態】
本発明における腫瘍マーカー（抗原）は、消化器系癌及び／又は肝癌を診断するための腫瘍マーカーである。
消化器系癌としては、食道癌、胃癌、十二指腸癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、膵臓癌及び胆のう癌等が挙げられる。これらのうち、好ましくは十二指腸癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、膵臓癌及び胆のう癌であり、さらに好ましくは大腸癌、直腸癌、膵臓癌及び胆のう癌であり、特に好ましくは大腸癌、膵臓癌及び胆のう癌である。
【０００６】
消化器系癌の腫瘍マーカーとしては、例えば、次のものが挙げられる。
食道癌の場合、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＩＡＰ、フェリチン、ポリアミン、β２−ミクログロブリン、ＰＯＡ及びトリプシンインヒビター等である。
胃癌の場合、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＫＭＯ−１、ＤｕＰＡＮ−２、ＳＰａｎ−１、ＣＡ５０、ＳＬＸ、ＣＡ７２−４、ＩＡＰ、ＴＰＡ、ポリアミン、β２−ミクログロブリン、フェリチン、ＰＯＡ及びトリプシンインヒビター等である。
十二指腸癌、小腸癌、大腸癌及び直腸癌の場合、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＫＭＯ−１、ＳＰａｎ−１、ＣＡ５０、ＳＬＸ、ＣＡ７２−４、ＩＡＰ、ＴＰＡ、β２−ミクログロブリン、フェリチン、ＰＯＡ及びトリプシンインヒビター等である。
【０００７】
胆のう癌の場合、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＫＭＯ−１、ＤｕＰＡＮ−２、ＳＰａｎ−１、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、塩基性フェトプロテイン（ＢＦＰ）、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ＩＡＰ、ＴＰＡ、β２−ミクログロブリン、フェリチン、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＰＯＡ及びトリプシンインヒビター等である。
膵臓癌の場合、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＫＭＯ−１、ＤｕＰＡＮ−２、ＳＰａｎ−１、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、ＢＦＰ、ＩＡＰ、ＴＰＡ、β２−ミクログロブリン、フェリチン、ＰＯＡ、トリプシンインヒビター及びエラスターゼ１等である。
【０００８】
肝癌の腫瘍マーカーとしては、例えば、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＫＭＯ−１、ＤｕＰＡＮ−２、ＳＰａｎ−１、ＣＡ５０、ＳＬＸ、塩基性フェトプロテイン（ＢＦＰ）、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、アルカリフォスファターゼアイソザイム、γ−ＧＴＰアイソザイム、ＩＡＰ、ＴＰＡ、β２−ミクログロブリン、フェリチン、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＰＯＡ及びトリプシンインヒビター等が挙げられる。
これらの腫瘍マーカーのうち、好ましくはＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＫＭＯ−１、ＤｕＰＡＮ−２、ＳＰａｎ−１、ＳＬＸ、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、ＢＦＰ、ＩＡＰ、ＴＰＡ、β２−ミクログロブリン、フェリチン、ＰＯＡ、トリプシンインヒビター、エラスターゼ１及びＰＩＶＫＡ−ＩＩであり、さらに好ましくはＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＫＭＯ−１、ＤｕＰＡＮ−２、ＳＰａｎ−１、ＳＬＸ、ＣＡ７２−４、ＢＦＰ、ＩＡＰ、ＴＰＡ、ＰＯＡ及びＰＩＶＫＡ−ＩＩであり、特に好ましくはＡＦＰ、ＣＥＡ及びＣＡ１９−９である。
【０００９】
本発明の血液中の腫瘍マーカーの定量方法においては、腫瘍マーカー１種のみを定量してもよく、２種以上の腫瘍マーカーを定量してもよいが、癌診断の感度及び特異性の観点から２種以上の腫瘍マーカーを定量することが好ましく、さらに好ましくは２〜３種の腫瘍マーカーを定量することである。
２種以上の腫瘍マーカーを定量するには、上記の腫瘍マーカーから適宜選択することができるが、肝癌の場合、例えば、ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ及びＣＥＡからなる腫瘍マーカーより、大腸癌の場合、例えば、ＣＥＡ及びＣＡ１９−９からなる腫瘍マーカーより、膵臓癌の場合、例えば、ＣＡ１９−９及びＣＥＡからなる腫瘍マーカーより、食道癌の場合、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びＰＯＡからなる腫瘍マーカーより、胃癌の場合、例えば、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９からなる腫瘍マーカーより、十二指腸癌、小腸癌及び直腸癌の場合、例えば、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９からなる腫瘍マーカーより、胆のう癌の場合、例えば、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９からなる腫瘍マーカーより選択することが好ましく、消化器系癌及び／又は肝癌のいずれの場合も、ＡＦＰ、ＣＥＡ及びＣＡ１９−９からなる腫瘍マーカーから選択することがさらに好ましい。
【００１０】
血液担持担体中の血液は、その採取部位及び採取方法等に制限はなく、従来の採取部位及び採取方法（例えば、採血用注射器を用いて、主に肘正中静脈より全血２ｍＬ以上採取等）で得た血液の一部を本発明に用いることも当然可能であるが、該血液は、被検者への侵襲性の低減の観点から、抹消血管からの採取が好ましく、抹消血管からの採取の中でも、被検者の侵襲性低減の観点から耳朶又は指先を穿刺して採取した血液がより好ましく、被検者が自分で血液を採取できる点、穿刺時の痛感が少ない点及び血液が液滴として採取（滴下）し易い点等の観点から指先を穿刺して採取した血液が特に好ましい。
【００１１】
末梢血液を採取する方法としては、血液を採取できれば特に制限はないが、被検者自身で実施可能であるという観点から、例えば、被検者の当該部位（例えば、耳朶及び指先等）を穿刺前によくマッサージ及び／又は暖めて充血させておき、消毒ガーゼで穿刺部位を拭いて乾燥させ、ディスポーザブル・ランセット等で当該部位を穿刺して血液を得る方法等が好ましい。
【００１２】
血液担持担体中の担体としては、血液を保持することが可能である限り、担体の材質、形状等は特に制限されないが、吸着による血液の保持が容易であり、抽出により血液成分が溶出し易い材質・形状であることが好ましく、吸着による保持が容易という観点から、吸収体であることがさらに好ましい。
担体の材質としては、公知の天然高分子及び合成高分子等が使用でき、例えば、綿、羊毛、セルロース、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリウレタン、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリエステル、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、絹、フィブロイン、リグニン、ヘミセルロース、キチン、エボナイト、ゴム、ガラス、石英及びセラミックス等が挙げられる。
これらの中で、天然高分子が好ましく、さらに好ましくはセルロース及び綿であり、特に好ましくはセルロースである。
【００１３】
担体としては、公知のものが使用でき、例えば、上記の材質等からなる濾紙、不織布、織布又はシート状発泡体等からなる吸収体が挙げられる。
吸収体の孔径は、自由に設定選択できるが、平均孔径の範囲が１〜１００μｍが好ましく、より好ましくは２〜８０μｍであり、特に好ましくは５〜５０μｍの範囲である。
濾紙としては、例えば、ＪＩＳ Ｐ３８０１（１９９５年）又はＴＡＰＰＩ（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｕｌｐ ａｎｄ Ｐａｐｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）Ｔ２０５に規定される濾紙等が挙げられる。
不織布としては、例えば、ポリオレフィン不織布、ニトロセルロース不織布、セルソールアセテート不織布、ポリエステル不織布、エポキシ不織布、ガラス不織布及びセラミックス不織布等が挙げられる。
織布としては、例えば、綿布、羊毛布、セルロース布、ポリオレフィン布、ニトロセルロース布、セルロールアセテート布、エポキシ布、ガラス布及びセラミックス布等が挙げられる。
【００１４】
シート状発泡体としては、例えば、発泡ポリスチレン、発泡ポリオレフィン、発泡ポリウレタン、発泡ポリエステル、発泡エポキシ樹脂、発泡ガラス及び発泡セラミックス等が挙げられる。
これらの中で、単位体積又は単位面積当たりに吸収する血液の量が一定になりやすいという（定量精度向上）観点から、濾紙、不織布及びシート状発泡体が好ましく、さらに好ましくは濾紙及び不織布、特に好ましくは濾紙、ポリオレフィン不織布、ニトロセルロース不織布、セルソールアセテート不織布、ポリエステル不織布、エポキシ不織布、ガラス不織布及びセラミックス不織布であり、最も好ましくは濾紙である。
【００１５】
濾紙、不織布、織布又はシート状発泡体等の厚さは、適宜選択することができるが、０．１〜３．０ｍｍが好ましく、さらに好ましくは０．２〜１．０ｍｍ、特に好ましくは０．３〜０．６ｍｍである。
濾紙、不織布、織布又はシート状発泡体等の大きさ（面積）は、採血、保管及び輸送時などの操作性を考慮して自由に設定できるが、１〜２００ｃｍ２が好ましく、さらに好ましくは１０〜１５０ｃｍ２、特に好ましく２５〜１００ｃｍ２である。
【００１６】
血液の担体への担持は、血液が保持できれば特に制限されず、担体と血液とを接触させることにより担体に血液を担持させることができる。
担体と血液とを接触させる方法としては、例えば、血液に担体を浸漬する方法、担体に血液を滴下する方法及び穿刺部に担体を押し付ける方法等が挙げられる。これらのうち、簡便性の観点から、担体に血液を滴下する方法及び穿刺部に担体を押しつける方法が好ましく、さらに好ましくは担体に血液を滴下する方法である。
【００１７】
血液に担体を浸漬する場合、血液の使用量は担体が浸漬できる量であり、担体の大きさに決定されるが、０．０５〜２ｍｌが好ましく、さらに好ましくは０．１〜１ｍｌ、特に好ましくは０．１５〜０．５ｍｌである。
担体に血液を滴下する場合、血液の使用量は担体の大きさに決定されるが、０．０２〜０．５ｍｌが好ましく、さらに好ましくは０．０５〜０．３ｍｌ、特に好ましくは０．１〜０．２ｍｌである。
穿刺部に担体を押し付ける場合、血液の使用量は担体の大きさに決定されるが、０．０２〜０．５ｍｌが好ましく、さらに好ましくは０．０５〜０．３ｍｌ、特に好ましくは０．１〜０．２ｍｌである。
【００１８】
血液担持担体の血液担持部分を一定の大きさに切り取る場合（後述）、切取られる担体が保持できる量以上の血液を滴下すればよく、滴下する血液量を正確に制御する必要はない。例えば、ろ紙がワットマン社製ＢＦＣ１８０（厚さ０．４９ｍｍ）の場合、滴下した血液量が５０μＬであれば血液を保持した部分の大きさは直径約１２ｍｍである。１滴の液量は約４０〜６０μＬであるので、血液担持部分を直径６ｍｍの円形に打ちぬく場合、必要な血液の量は１〜２滴となる。
【００１９】
さらに、血液の安定性及び定量の再現性の観点から、血液を担体に保持させた後、乾燥させることが好ましく、担体に保持された血液の重量が５０重量％以下（好ましくは３０重量％以下）になるまで乾燥することがさらに好ましい。
乾燥方法としては、例えば、減圧乾燥、冷凍減圧乾燥、微加熱乾燥及び単純乾燥（風乾）等が適用でき、これらのうち、減圧乾燥、冷凍減圧乾燥及び単純乾燥が好ましく、さらに好ましくは減圧乾燥及び単純乾燥であり、特に好ましくは単純乾燥である。
【００２０】
乾燥は、腫瘍マーカーの抗原性が変化しない条件で行うことが好ましく、４０℃以下の温度で行うのがさらに好ましく、特に好ましくは１０〜３０℃で行う。減圧する場合は、０．０２〜１０Ｐａが好ましく、さらに好ましくは０．０５〜２Ｐａ、特に好ましくは０．１〜１Ｐａである。
単純乾燥する場合の湿度は、特に制限はないが、１０〜９０％ＲＨが好ましく、さらに好ましくは４０〜８０％ＲＨである。
乾燥時間は、担体の形状、保持した血液量により適宜設定できるが、担体が濾紙の場合、２０分〜１時間程度である。
【００２１】
血液保持担体を保存する場合、湿度は、８０％ＲＨ以下が好ましく、さらに好ましくは１０〜６０％ＲＨ、特に好ましくは２０〜４０％ＲＨであり、温度は、０〜４０℃が好ましく、さらに好ましくは２〜３０℃、特に好ましくは２〜１０℃である。
なお、湿度８０％ＲＨ以下を保てる状態（密閉下、乾燥剤存在の密閉下等）であれば郵便又は宅配便等により輸送することができる。
【００２２】
血液成分の抽出の前に、血液担持担体の血液担持部分を一定の大きさに切り取ってから行うことが好ましい。例えば、均一な吸収体に血液を滴下し、過剰な血液は周囲に拡散吸収させて乾燥した後、中心部を一定の形状に切り取ったものを抽出に用いる方法が好ましい。
切り取る方法としては、一定直径のパンチで打ちぬく方法及び予め入れた切取線（ミシン目等）に沿って切り出す方法等が適用できる。
【００２３】
血液担持担体から血液成分の抽出は、血液中の腫瘍マーカー（抗原）の抗原性が変化しない限り特に制限なく行うことができ、例えば、抽出用溶液に血液担持担体を浸漬し、その上清を抽出液として用いることができる。
抽出用溶液として、ｐＨが中性領域の緩衝液が使用でき、例えば、ｐＨ６〜８のグッド緩衝液及びｐＨ６〜８のリン酸緩衝液等が好ましく使用される。
【００２４】
また、抽出用溶液に、塩、界面活性剤、蛋白質及び抗原安定化剤等を添加することもできる。
塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム及び臭化リチウム等が挙げられる。
界面活性剤としては、例えば、ソルビタンラウリン酸モノエステルエチレンオキシド付加物（例えば、ツイーン２０及びツイーン４０（ＩＣＩアメリカ社））等のノニオン界面活性剤等が挙げられる。
蛋白質としては、例えば、牛血清アルブミン及びカゼイン等が挙げられる。
抗原安定化剤としては、例えば、ＥＤＴＡ等のキレート剤及びプロテアーゼインヒビター等が挙げられる。
【００２５】
定量再現性の観点から、担体に対する抽出用溶液の使用量及び抽出時間等の抽出条件を一定にする必要がある。
抽出用溶液の使用量としては、０．０５〜５ｍｌが好ましく、さらに好ましくは０．１〜１ｍｌ、特に好ましくは０．２〜０．５ｍｌである。
抽出時間としては、０．５〜４８０分が好ましく、さらに好ましくは１〜１８０分、特に好ましくは５〜６０分である。
撹拌は、ボルテックスミキサーのような装置を用いて、容器を震動して行うことが好ましく、震動回数は１００〜２０００ｒｐｍが好ましい。
【００２６】
例えば、血液担持担体から切り取った直径６ｍｍ（厚さ０．４９ｍｍ）の濾紙（ワットマン社製ＢＦＣ１８０）の場合、以下の条件等で抽出できる。
抽出用溶液組成：塩化ナトリウム含有０．０５モル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（塩化ナトリウムの含有量：緩衝液１００ｍＬ当たり０．８５ｇ、以下同じ。）
抽出用溶液の使用量：２００〜３００μＬ
抽出温度：室温（１５〜２５℃）
抽出時間：２０分〜１時間（攪拌後の放置時間）
抽出操作：担体に抽出用溶液を加えボルテックスミキサーで攪拌後（５００ｒｐｍ、１分）、上記温度で上記時間放置する。再度攪拌（ボルテックスミキサーで５００ｒｐｍ、５秒）し、１分間静置し分散したろ紙繊維を沈降させた後、上清液を採取し、腫瘍マーカー測定のための検体（抽出液）として用いる。
【００２７】
上記抽出液中の腫瘍マーカーの定量方法は特に制限されないが、定量値の再現性及び測定感度の観点から、免疫学的測定法が好ましい。
免疫学的測定法としては従来公知の方法が使用できるが、抽出液中の腫瘍マーカー濃度が血液中の濃度より低いためより定量感度の高い測定法が望ましく、例えば、放射免疫測定（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）及び化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）が好ましい。
【００２８】
放射免疫測定（ＲＩＡ）としては、固相抗体とＩ１２５標識抗体を用いた２部位サンドイッチ測定法等が挙げられ、多数の測定試薬キットが市販されている。酵素免疫測定法（ＥＩＡ）としては、固相抗体と酵素標識抗体を用いた２部位サンドイッチ測定法等が挙げられ、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等を用いた種々の測定試薬キットが市販されている。
蛍光免疫測定（ＦＩＡ）としては、固相抗体とユーロピウム標識抗体を用いた２部位サンドイッチ測定法等が挙げられる。
化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）としては、固相抗体とアクリジニウムエステル標識抗体を用いた２部位サンドイッチ測定法等が挙げられ、種々の測定試薬キットが市販されている。
これらの免疫学的測定法の中で、好ましいのは酵素免疫測定法（ＥＩＡ）であり、さらに好ましくは化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）である。
【００２９】
抽出液中の腫瘍マーカー濃度から、血液中の腫瘍マーカーの濃度を求める方法は、種々の方法が適用でき、例えば、（１）腫瘍マーカーの濃度が既知の血液を担持した血液担持担体を用いて作成した検量線を用いる方法、及び（２）腫瘍マーカーの濃度が既知の抽出液を用いて作成した検量線と腫瘍マーカーの抽出率とを用いる方法等が挙げられる。
【００３０】
（２）の方法において、抽出率は、既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液を用いて血液担持担体を作成し、これから抽出された抽出液中の腫瘍マーカーの含有量を定量して抽出液の腫瘍マーカーの濃度を求め、次式から求められる。抽出率は、以上の操作を少なくとも２回（好ましくは少なくとも３回）行い、それらの平均値を用いることが好ましい。
抽出率＝（抽出液の腫瘍マーカーの濃度）／（血液の腫瘍マーカーの濃度）
検体の血液中の腫瘍マーカー濃度は、検体から調製される抽出液中の腫瘍マーカー濃度を抽出率で除すことで求めることが出来るが、その際、血液担持担体の作成及び抽出の条件は抽出率を求めた時と同じ条件である必要がある。
【００３１】
なお、本発明で定量される腫瘍マーカーは、血液中に極低濃度で存在しているため、濃度の変動による抽出率の変動は極わずかであり、例えば、ＡＦＰの場合、０．５〜１，０００ｎｇ／ｍＬの範囲で同一の抽出率が使用できる。１，０００ｎｇ／ｍＬを越える高濃度の検体の場合、求めた抽出率と実際の抽出率とが異なる可能性はあるが、臨床的な判断に影響することはない（すなわち、ＡＦＰの場合、癌判断の境界濃度が１０ｎｇ／ｍＬであり、１，０００ｎｇ／ｍＬを越えていれば癌判断において陽性である。）。
【００３２】
また、ＣＥＡの場合、０．５〜２００ｎｇ／ｍＬの範囲で同一の抽出率が使用できる。２００ｎｇ／ｍＬを越える高濃度の検体の場合、求めた抽出率と実際の抽出率とが異なる可能性はあるが、臨床的な判断に影響することはない（すなわち、ＣＥＡの場合、癌判断の境界濃度が５ｎｇ／ｍＬであり、２００ｎｇ／ｍＬを越えていれば癌判断において陽性である。）。ＡＦＰ及びＣＥＡ以外の腫瘍マーカーについても同様であり、腫瘍マーカーの濃度よって臨床的な判断に影響することはない。
【００３３】
（１）及び（２）の方法の何れの場合も、既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液又は抽出液は、濃度の異なる２種以上を用いることが好ましい。
既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液又は抽出液の濃度は、測定する腫瘍マーカーの種類により自由に設定できるが、通常は健常人の範囲（正常域）と癌である可能性が高い範囲との境界濃度（カットオフ）を明確に測定できる濃度で設定することが好ましく、例えば、ＡＦＰの場合、カットオフは通常１０ｎｇ／ｍＬ前後であるため、（１）の方法の場合、既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液は、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬを挟んで２濃度（例えば、５ｎｇ／ｍＬ以上１０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度と１０ｎｇ／ｍＬ以上５０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度）設定することが好ましい。また、（２）の方法の場合は、抽出液中の腫瘍マーカーの濃度であるので、１０ｎｇ／ｍＬを元に抽出率を考慮した２濃度（例えば、抽出率が０．０２の場合、血液中濃度１０ｎｇ／ｍＬは抽出液中濃度０．２ｎｇ／ｍＬに相当するので０．１ｎｇ／ｍＬ以上０．２ｎｇ／ｍＬ未満の濃度と０．２ｎｇ／ｍＬ以上１ｎｇ／ｍＬ未満の濃度）に設定することが好ましい。
【００３４】
また、ＣＥＡの場合、カットオフは通常５ｎｇ／ｍＬ前後であるため、（１）の方法の場合、既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液は、少なくとも５ｎｇ／ｍＬを挟んで２濃度（例えば、２ｎｇ／ｍＬ以上５ｎｇ／ｍＬ未満の濃度と５ｎｇ／ｍＬ以上２５ｎｇ／ｍＬ未満の濃度）設定することが好ましい。また、（２）の方法の場合は、抽出液中の腫瘍マーカーの濃度であるので、５ｎｇ／ｍＬを元に抽出率を考慮した２濃度（例えば、抽出率が０．０２の場合、血液中濃度５ｎｇ／ｍＬは抽出液中濃度０．１ｎｇ／ｍＬに相当するので０．０５ｎｇ／ｍＬ以上０．１ｎｇ／ｍＬ未満の濃度と０．１ｎｇ／ｍＬ以上０．５ｎｇ／ｍＬ未満の濃度）に設定することが好ましい。
【００３５】
また、ＣＡ１９−９の場合、カットオフは通常３７Ｕ／ｍＬ前後であるため、（１）の方法の場合、既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液は、少なくとも３７Ｕ／ｍＬを挟んで２濃度（例えば、５Ｕ／ｍＬ以上３７Ｕ／ｍＬ未満の濃度と３７Ｕ／ｍＬ以上１００Ｕ／ｍＬ未満の濃度）設定することが好ましい。また、（２）の方法の場合は、抽出液中の腫瘍マーカーの濃度であるので、３７Ｕ／ｍＬを元に抽出率を考慮した２濃度（例えば、抽出率が０．０２の場合、血液中濃度３７Ｕ／ｍＬは抽出液中濃度０．７４Ｕ／ｍＬに相当するので０．１Ｕ／ｍＬ以上０．７４Ｕ／ｍＬ未満の濃度と０．７４Ｕ／ｍＬ以上２．０Ｕ／ｍＬ未満の濃度）に設定することが好ましい。
【００３６】
ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９以外の腫瘍マーカーのカットオフを列挙すると、例えばＩＡＰ：５０１μｇ／ｍＬ、フェリチン：２００ｎｇ／ｍＬ、ポリアミン：４５μｍｏｌ／ｇクレアチニン、ＰＯＡ：２０Ｕ／ｍＬ、ＫＭＯ−１：６００Ｕ／ｍＬ、ＤｕＰＡＮ−２：４００Ｕ／ｍＬ、ＣＡ５０：３６Ｕ／ｍＬ、ＣＡ７２−４：４Ｕ／ｍＬ、ＴＰＡ：１３０Ｕ／Ｌ、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ：０．１ＡＵ／ｍＬである。
【００３７】
（１）の方法では、検量線の作成に抽出操作から行う必要がある点及び検量線作成用の血液は長期間保存できないので測定の際に作成する煩わしさがあるが、抽出条件が変動しても正確な測定ができるという長所がある。一方、（２）の方法は、あらかじめ抽出率を求め、抽出操作等の条件を一定にすれば多量の検体を正確かつ簡便に測定することができる。（１）及び（２）の方法のうち、簡便さの観点から、（２）の方法が好ましい。
【００３８】
本発明の定量方法は、被検者自身で採血、担体に保持・乾燥、輸送（例えば、持参、郵便及び宅配便等）することができ、消化器系癌及び肝癌の健康診断等のように多数の検体を広い地域から集めて定量する場合に最適である。又、癌検診のほか、遠隔地の患者に対する癌治療の経過観察等においても、適用できる。
【００３９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
【００４０】
＜実施例１＞
本実施例は、血液担持担体を長期間保存しても正確に腫瘍マーカー（ＡＦＰ）を定量できることを示したものである。
１．採血及び血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
ボランティア６名（被検者Ａ〜Ｆ）の指先をよくマッサージ及び暖めて充血させておき消毒用ガーゼで穿刺部位を拭いて乾燥させてから、ディスポーザブル・ランセット（商品名「ヘモレット」、ミドリ十字株式会社製）で穿刺し、最初の血滴を拭い去り、次の血滴２滴を被検者１人当たり１０枚の採血用濾紙（品番ＢＦＣ１８０、ワットマン株式会社製）ぞれぞれに指先から直接滴下し吸収させた。次いで、室内（２５±１℃、６５±５％ＲＨ）で風乾し（風乾時間５，２０，４０，６０又は１２０分）、血液担持担体（血乾燥濾紙）を得た。
風燥時間毎に血液担持担体（血液乾燥濾紙）の重量を計測し、初期血液重量（濾紙重量を除いた値）に対する比を乾燥度を求めた（血液担持担体２枚の平均値）。この乾燥度を表１中に示した。
次いで、血液担持担体（血液乾燥濾紙）を表１記載の保存条件で保存した（保存日数０，３，７，１４，２８日）。
【００４１】
【表１】
２．抽出操作
以下の操作は温度２０〜２５℃の室内で実施した。
表１の条件で保存した各血液担持担体（血乾燥濾紙）の血液担持部分の中心部を、直径６ｍｍの１穴パンチ（事務用として市販されている物）で打ち抜いて濾紙片を得た。
試験管に打ち抜いた濾紙片及び塩化ナトリウム含有０．０５モル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（抽出用溶液）２５０μＬを加え、３０秒間攪拌（ボルテックスミキサーで５００ｒｐｍ）した後、３０分間放置した。その後、３０秒間同様に攪拌した後１分間静置し、上清を分取して抽出液を調製し、これを腫瘍マーカーの定量に供した。
【００４３】
３．抽出液中の腫瘍マーカー（ＡＦＰ）の定量
定量用試薬としては、臨床検査薬として和光純薬工業株式会社より発売されている「スフィアライト ＡＦＰ」を用いた。
抽出液中の腫瘍マーカー量を決定するための標準溶液は、和光純薬工業株式会社より発売されている「スフィアライト ＡＦＰコントロールセット」を用いた。
定量装置としては、オリンパス光学工業株式会社製のＳｐｈｅｒｅＬｉｇｈｔ１８０を用いた。
本試薬と装置を用いることで化学発光酵素免疫測定法により、ＡＦＰの定量ができる。
使用する定量用試薬が血清中の腫瘍マーカー濃度を測定するための臨床検査薬であり、通常測定に使用する検体量は１０μＬに設定されおり、反応時間はトータル約１５分である。抽出液中の腫瘍マーカーの定量の場合、血清中より低濃度であるため、抽出液は１００μＬ使用した。
【００４４】
４．定量結果
定量結果及び次式で求めた安定度を表２〜１１に示した。
（安定度）＝（所定保存期間後の定量値）×１００／（初期定量値）
なお、初期定量値は、血液担持担体を作成後、直ちに抽出用溶液に血液担持担体を投入し、抽出操作を開始して定量したものであり、保存期間０日として示した。
各条件で作成、保存した血液担持担体（血液乾燥濾紙）から得た抽出液中の腫瘍マーカー（抗原：ＡＦＰ）は、乾燥時間が５分の場合を除き、保存温度４℃では２８日、２５℃では７日間、安定度９０％以上の値を示した。
従って、乾燥時間が２０分以上であれば、血液担持担体（血液乾燥濾紙）中の腫瘍マーカー（抗原：ＡＦＰ）は安定であることが判った。
【００４５】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
＜実施例２＞
本実施例は、血液担持担体を長期間保存しても正確に腫瘍マーカー（ＣＥＡ）を定量できることを場合で示したものである。
１．採血及び血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１と同様にして、ボランティア６名（被検者Ａ〜Ｆ）から血液担持担体（血乾燥濾紙）を調製し、表１記載の保存条件で保存した（保存日数０，３，７，１４，２８日）。
２．抽出操作
実施例１と同様にして、抽出液を調製し、これを腫瘍マーカーの定量に供した。
【００５６】
３．抽出液中の腫瘍マーカー（ＣＥＡ）の定量
測定試薬は臨床検査薬としては、和光純薬工業株式会社より発売されている「スフィアライト ＣＥＡ」を用いた。
抽出液中の腫瘍マーカー量を決定するための標準溶液は、和光純薬工業株式会社より発売されている「スフィアライト ＣＥＡコントロールセット」を用いた。
定量装置としては、オリンパス光学工業株式会社製のＳｐｈｅｒｅＬｉｇｈｔ１８０を用いた。
本試薬と装置を用いることで化学発光酵素免疫測定法により、ＣＥＡの定量ができる。
使用する定量用試薬が血清中の腫瘍マーカー濃度を測定するための臨床検査薬であり、通常測定に使用する検体量は４０μＬに設定されおり、反応時間はトータル約１５分である。抽出液中の腫瘍マーカーの定量の場合、血清中より低濃度であるため、抽出液は１００μＬ使用した。また、反応時間を２９分に延長した。
【００５７】
４．定量結果
定量結果及び実施例１と同様にして求めた安定度を表１２〜２１に示した。
なお、初期定量値は、血液担持担体を作成後、直ちに抽出用溶液に血液担持担体を投入し、抽出操作を開始して定量したものであり、保存期間０日として示した。
各条件で作成、保存した血液担持担体（血液乾燥濾紙）から得た抽出液中の腫瘍マーカー（抗原：ＣＥＡ）は、乾燥時間が５分の場合を除き、保存温度４℃では２８日、２５℃では７日間、安定度９０％以上の値を示した。
従って、乾燥時間が２０分以上であれば、血液担持担体（血液乾燥濾紙）中の腫瘍マーカー（抗原：ＣＥＡ）は安定であることが判った。
【００５８】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
＜実施例３＞
本実施例は、血液担持担体を長期間保存しても正確に腫瘍マーカー（ＣＡ１９−９）を定量できることを場合で示したものである。
１．採血及び血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１と同様にして、ボランティア６名（被検者Ａ〜Ｆ）から血液担持担体（血乾燥濾紙）を調製し、表１記載の保存条件で保存した（保存日数０，３，７，１４，２８日）。
２．抽出操作
実施例１と同様にして、抽出液を調製し、これを腫瘍マーカーの定量に供した。
【００６９】
３．抽出液中の腫瘍マーカー（ＣＡ１９−９）の定量
測定試薬は臨床検査薬としては、和光純薬工業株式会社より発売されている「スフィアライト ＣＡ１９−９」を用いた。
抽出液中の腫瘍マーカー量を決定するための標準溶液は、和光純薬工業株式会社より発売されている「スフィアライト Ｃ１９−９Ａコントロールセット」を用いた。
定量装置としては、オリンパス光学工業株式会社製のＳｐｈｅｒｅＬｉｇｈｔ１８０を用いた。
本試薬と装置を用いることで化学発光酵素免疫測定法により、ＣＡ１９−９の定量ができる。
【００７０】
使用する定量用試薬が血清中の腫瘍マーカー濃度を測定するための臨床検査薬であり、通常測定に使用する検体量は１０μＬに設定されおり、反応時間はトータル約１５分である。抽出液中の腫瘍マーカーの定量の場合、血清中より低濃度であるため、抽出液は１００μＬ使用した。また、反応時間を２９分に延長した。
【００７１】
４．定量結果
定量結果及び実施例１と同様にして求めた安定度を表２２〜３１に示した。
なお、初期定量値は、血液担持担体を作成後、直ちに抽出用溶液に血液担持担体を投入し、抽出操作を開始して定量したものであり、保存期間０日として示した。
各条件で作成、保存した血液担持担体（血液乾燥濾紙）から得た抽出液中の腫瘍マーカー（抗原：ＣＡ１９−９）は、乾燥時間が５分の場合を除き、保存温度４℃では２８日、２５℃では７日間、安定度９０％以上の値を示した。
従って、乾燥時間が２０分以上であれば、血液担持担体（血液乾燥濾紙）中の腫瘍マーカー（抗原：ＣＡ１９−９）は安定であることが判った。
【００７２】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【表２５】
【表２６】
【表２７】
【表２８】
【表２９】
【表３０】
【表３１】
＜実施例４＞
本実施例は、本発明の方法によって求めたＡＦＰ濃度と従来の方法によるＡＦＰ濃度とが良好な相関関係にあることを示すものである。
１．標準ＡＦＰ添加血液担持担体の作成
ボランティア５名（被検者Ｇ〜Ｋ）より血液１．８ｍＬを採取し、０．９ｍＬ×２本に分割して、その一方に「スフィアライト ＡＦＰコントロールセット」の標準ＡＦＰ溶液（４００ｎｇ／ｍＬ）を１００μＬ加えて、標準ＡＦＰ添加血液を調製した。
濾紙（ＢＦＣ１８０、ワットマン株式会社製）に標準ＡＦＰ添加血液を１００μＬ滴下し、室温（２５±２℃）で１時間乾燥し、標準ＡＦＰ添加血液担持担体▲２▼を作成した。
同様にして、他一方の血液０．９ｍｌを濾紙に滴下・乾燥し、血液担持担体▲１▼を作成した。
【００８３】
２．抽出及び測定
実施例１記載の抽出方法と同様にして、標準ＡＦＰ添加血液担持担体▲１▼及び血液担持担体▲２▼からそれぞれ抽出液を調製して、抽出液中のＡＦＰ濃度を測定した。それらの結果を表３２に示した。
【００８４】
【表３２】
３．抽出率の設定
表３２に示した測定値から次式から抽出率を算出した。それらの結果を表３２に示した。５名の血液での抽出率の平均値を、本条件で作成及び抽出した場合の抽出率（０．０１９９）として設定した。
抽出率＝（Ｂ−Ａ）／Ｃ
Ａ：血液担持担体▲１▼から調製した抽出液中のＡＦＰ濃度
Ｂ：標準ＡＦＰ（４００ｎｇ／ｍＬ）添加血液担持担体から調製した抽出液中のＡＦＰ濃度
Ｃ：４０ｎｇ／ｍＬ（添加したＡＦＰ量）
【００８６】
４．採血
肝癌患者を含め２０名より採血を実施した。採血は実施例１記載方法（指先から採血）及び肘正中静脈から従来方法（採血用注射器を用いて、肘正中静脈より全血２ｍＬ以上採取）で実施した。肘正中静脈より採取した全血は室温で１時間以上静置した後、冷却遠心機にて１５００Ｇ、１０分間冷却遠心し、更に上清（血清）部分を分取した。
【００８７】
５．血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１記載の方法と同様にして、血液担持担体（血液乾燥濾紙）を作成した。乾燥時間は、抽出率設定の場合と同じ１時間とした。
【００８８】
６．抽出及び定量
血液担持担体について、抽出率設定の場合と同じ方法で抽出及びＡＦＰ濃度測定を実施した。
一方、従来の方法で採取、分離した血清については、実施例１記載の「スフィアライト ＡＦＰ」で、測定試薬に添付された説明書通りの条件で測定を実施した（検体量 １０μＬ）。
【００８９】
７．血液中のＡＦＰ濃度の決定
血液担持担体から調製した抽出液中のＡＦＰ濃度を抽出率（０．０１９９）で除し、血液中のＡＦＰ濃度を求めた。
従来の方法で求めた血清中のＡＦＰの濃度と本発明の方法で求めた血液中のＡＦＰ濃度を表３３に示した。また、これらの値を用いて本発明の方法によるＡＦＰ濃度と従来法によるＡＦＰ濃度との相関図を図１に示した。図１から判るように、従来法での血清中のＡＦＰ濃度と本発明の方法による血液中ＡＦＰ濃度は、良好な相関性を示した。図１中、式は相関式（Ｘ：従来法でのＡＦＰ濃度、Ｙ：本発明の方法でのＡＦＰ濃度）、Ｒは相関係数を示すものである。
【００９０】
【表３３】
＜実施例５＞
本実施例は、本発明の方法によって求めたＣＥＡ濃度と従来の方法によるＣＥＡ濃度とが良好な相関関係にあることを示すものである。
１．標準ＣＥＡ添加血液担持担体の作成
ボランティア５名（被検者Ｇ〜Ｋ）より血液１．８ｍＬを採取し、０．９ｍＬ×２本に分割して、その一方に「スフィアライト ＣＥＡコントロールセット」の標準ＣＥＡ溶液（０又は１５０ｎｇ／ｍＬ）をそれぞれ１００μＬ加えて、標準ＣＥＡ添加血液（０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ）を調製した。
濾紙（ＢＦＣ１８０、ワットマン株式会社製）に標準ＣＥＡ添加血液（１５０ｎｇ／ｍＬ）を１００μＬ滴下し、室温（２５±２℃）で１時間乾燥し、標準ＣＥＡ添加血液担持担体▲２▼を作成した。
同様にして、他一方の血液（０ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを濾紙に滴下・乾燥し、血液担持担体▲１▼を作成した。
【００９２】
２．抽出及び測定
実施例２記載の抽出方法と同様にして、標準ＣＥＡ添加血液担持担体▲１▼及び血液担持担体▲２▼からそれぞれ抽出液を調製して、抽出液中のＣＥＡ濃度を測定した。それらの結果を表３４に示した。
【００９３】
【表３４】
３．抽出率の設定
表３４に示した測定値から次式から抽出率を算出した。それらの結果を表３４に示した。５名の血液での抽出率の平均値を、本条件で作成及び抽出した場合の抽出率（０．０１９９）として設定した。
抽出率＝（Ｂ−Ａ）／Ｃ
Ａ：血液担持担体▲１▼から調製した抽出液中のＣＥＡ濃度
Ｂ：標準ＣＥＡ（１５０ｎｇ／ｍＬ）添加血液担持担体から調製した抽出液中のＣＥＡ濃度
Ｃ：１５ｎｇ／ｍＬ（添加したＣＥＡ量）
【００９５】
４．採血
大腸癌患者を含め２０名より採血を実施した。採血は実施例１記載方法（指先から採血）及び肘正中静脈から従来方法（採血用注射器を用いて、肘正中静脈より全血２ｍＬ以上採取）で実施した。肘正中静脈より採取した全血は室温で１時間以上静置した後、冷却遠心機にて１５００Ｇ、１０分間冷却遠心し、更に上清（血清）部分を分取した。
【００９６】
５．血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１記載の方法と同様にして、血液担持担体（血液乾燥濾紙）を作成した。乾燥時間は、抽出率設定の場合と同じ１時間とした。
【００９７】
６．抽出及び定量
血液担持担体について、抽出率設定の場合と同じ方法で抽出及びＣＥＡ濃度測定を実施した。
一方、従来の方法で採取、分離した血清については、実施例２記載の「スフィアライト ＣＥＡ」で、測定試薬に添付された説明書通りの条件で測定を実施した（検体量 ４０μＬ）。
【００９８】
７．血液中のＣＥＡ濃度の決定
血液担持担体から調製した抽出液中のＣＥＡ濃度を抽出率（０．０１９９）で除し、血液中のＣＥＡ濃度を求めた。
従来の方法で求めた血清中のＣＥＡの濃度と本発明の方法で求めた血液中のＣＥＡ濃度を表３５に示した。また、これらの値を用いて本発明の方法によるＣＥＡ濃度と従来法によるＣＥＡ濃度との相関図を図２に示した。図２から判るように、従来法での血清中のＣＥＡ濃度と本発明の方法による血液中ＣＥＡ濃度は、良好な相関性を示した。図２中、式は相関式（Ｘ：従来法でのＣＥＡ濃度、Ｙ：本発明の方法でのＣＥＡ濃度）、Ｒは相関係数を示すものである。
【００９９】
【表３５】
＜実施例６＞
本実施例は、本発明の方法によって求めたＣＡ１９−９濃度と従来の方法によるＣＡ１９−９濃度とが良好な相関関係にあることを示すものである。
１．標準ＣＡ１９−９添加血液担持担体の作成
ボランティア５名（被検者Ｇ〜Ｋ）より血液１．８ｍＬを採取し、０．９ｍＬ×２本に分割して、その一方に「スフィアライト ＣＡ１９−９コントロールセット」の標準ＣＡ１９−９溶液（０又は２００Ｕ／ｍＬ）をそれぞれ１００μＬ加えて、標準ＣＡ１９−９添加血液を調製した。
濾紙（ＢＦＣ１８０、ワットマン株式会社製）に標準ＣＡ１９−９添加血液（２００Ｕ／ｍＬ）を１００μＬ滴下し、室温（２５±２℃）で１時間乾燥し、標準ＣＡ１９−９添加血液担持担体▲２▼を作成した。
同様にして、他一方の血液（０Ｕ／ｍＬ）１００μＬを濾紙に滴下・乾燥し、血液担持担体▲１▼を作成した。
【０１０１】
２．抽出及び測定
実施例３記載の抽出方法と同様にして、標準ＣＡ１９−９添加血液担持担体▲１▼及び血液担持担体▲２▼からそれぞれ抽出液を調製して、抽出液中のＣＡ１９−９濃度を測定した。それらの結果を表３６に示した。
【０１０２】
【表３６】
３．抽出率の設定
表３６に示した測定値から次式から抽出率を算出した。それらの結果を表３６に示した。５名の血液での抽出率の平均値を、本条件で作成及び抽出した場合の抽出率（０．０２０４）として設定した。
抽出率＝（Ｂ−Ａ）／Ｃ
Ａ：血液担持担体▲１▼から調製した抽出液中のＣＡ１９−９濃度
Ｂ：標準ＣＡ１９−９（２００Ｕ／ｍＬ）添加血液担持担体から調製した抽出液中のＣＡ１９−９濃度
Ｃ：２０Ｕ／ｍＬ（添加したＣＡ１９−９量）
【０１０４】
４．採血
膵臓癌患者を含め２０名より採血を実施した。採血は実施例１記載方法（指先から採血）及び肘正中静脈から従来方法（採血用注射器を用いて、肘正中静脈より全血２ｍＬ以上採取）で実施した。肘正中静脈より採取した全血は室温で１時間以上静置した後、冷却遠心機にて１５００Ｇ、１０分間冷却遠心し、更に上清（血清）部分を分取した。
【０１０５】
５．血液担持担体（血液乾燥濾紙）の作成
実施例１記載の方法と同様にして、血液担持担体（血液乾燥濾紙）を作成した。乾燥時間は、抽出率設定の場合と同じ１時間とした。
【０１０６】
６．抽出及び定量
血液担持担体について、抽出率設定の場合と同じ方法で抽出及びＣＡ１９−９濃度測定を実施した。
一方、従来の方法で採取、分離した血清については、実施例３記載の「スフィアライト ＣＡ１９−９」で、測定試薬に添付された説明書通りの条件で測定を実施した（検体量 １０μＬ）。
【０１０７】
７．血液中のＣＡ１９−９濃度の決定
血液担持担体から調製した抽出液中のＣＡ１９−９濃度を抽出率（０．０１９９）で除し、血液中のＣＡ１９−９濃度を求めた。
従来の方法で求めた血清中のＣＡ１９−９の濃度と本発明の方法で求めた血液中のＣＡ１９−９濃度を表３７に示した。また、これらの値を用いて本発明の方法によるＣＡ１９−９濃度と従来法によるＣＡ１９−９濃度との相関図を図３に示した。図３から判るように、従来法での血清中のＣＡ１９−９濃度と本発明の方法による血液中ＣＡ１９−９濃度は、良好な相関性を示した。図２中、式は相関式（Ｘ：従来法でのＣＡ１９−９濃度、Ｙ：本発明の方法でのＣＡ１９−９濃度）、Ｒは相関係数を示すものである。
【０１０８】
【表３７】
【発明の効果】
本発明の血液中の腫瘍マーカーの定量方法によると、消化器系癌の腫瘍マーカー及び肝癌の腫瘍マーカーを極めて簡易に定量することができる。
さらに、被検者自身で採血することができるので採血のための熟練者等が不要であり、被検者が採血のため病院等に出向く必要もないという簡便性も併せもつものである。
また、血液担持担体は、簡単に輸送することができるので、多数の検体を一ヶ所に集めて測定することができ輸送及び測定のコストを低減させることができる等の効果がある。
従って、本発明の定量方法は、消化器系癌及び肝癌の健康診断等の多数の検体を広い地域から集めて測定する場合に最適である。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来の方法による血清中のＡＦＰ濃度と本発明の方法による血液中のＡＦＰ濃度との相関を表すグラフである。
【図２】従来の方法による血清中のＣＥＡ濃度と本発明の方法による血液中のＣＥＡ濃度との相関を表すグラフである。
【図３】従来の方法による血清中のＣＡ１９−９濃度と本発明の方法による血液中のＣＡ１９−９濃度との相関を表すグラフである。
Claims (5)
- 血液担持担体から血液成分を抽出し、抽出液中の腫瘍マーカー濃度と、血液成分の抽出率とから、消化器系癌の腫瘍マーカー及び／又は肝癌の腫瘍マーカーを定量することを特徴とする血液中の腫瘍マーカー定量方法。
抽出率は、既知濃度の腫瘍マーカーを含む血液を用いて血液担持担体を作成しこれから抽出された抽出液中の腫瘍マーカーの含有量を定量して抽出液の腫瘍マーカーの濃度を求め、次式から求められる。
（抽出率）＝（抽出液の腫瘍マーカーの濃度）／（血液の腫瘍マーカーの濃度） - 腫瘍マーカーが、大腸癌、胆のう癌、膵臓癌及び／又は肝癌の腫瘍マーカーである請求項１記載の血液中の腫瘍マーカー定量方法。
- 腫瘍マーカーが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及び／又はＣＡ１９−９である請求項１又は２記載の血液中の腫瘍マーカー定量方法。
- 血液担持担体が、濾紙を使用してなる吸収体に血液を担持してなる請求項１〜３の何れかに記載の血液中の腫瘍マーカー定量方法。
- 血液担持担体が、指先から採取した血液を担持してなる請求項１〜４の何れかに記載の血液中の腫瘍マーカー定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002035154A JP3579032B2 (ja) | 2001-02-22 | 2002-02-13 | 血液中の腫瘍マーカー定量方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001046448 | 2001-02-22 | ||
| JP2001-46448 | 2001-02-22 | ||
| JP2002035154A JP3579032B2 (ja) | 2001-02-22 | 2002-02-13 | 血液中の腫瘍マーカー定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002323499A JP2002323499A (ja) | 2002-11-08 |
| JP3579032B2 true JP3579032B2 (ja) | 2004-10-20 |
Family
ID=26609888
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002035154A Expired - Fee Related JP3579032B2 (ja) | 2001-02-22 | 2002-02-13 | 血液中の腫瘍マーカー定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3579032B2 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004095021A1 (ja) * | 2003-04-23 | 2004-11-04 | Eisai Co. Ltd. | 疾患予後モデルの作成方法、このモデルを用いた疾患予後予測方法、このモデルによる予後予測装置、ならびにそのプログラム・記憶媒体 |
| JP2007139656A (ja) * | 2005-11-21 | 2007-06-07 | Igaku Seibutsugaku Kenkyusho:Kk | 食道癌診断キット |
| JP5041978B2 (ja) * | 2007-11-13 | 2012-10-03 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | 胃癌及び／又は大腸癌の検出方法 |
| CN104634974B (zh) | 2009-03-05 | 2017-08-08 | 独立行政法人产业技术综合研究所 | 肝内胆管癌的检出、辨别方法 |
| JP5805518B2 (ja) | 2011-12-21 | 2015-11-04 | 株式会社島津製作所 | マルチプレックス大腸がんマーカーパネル |
| US20160245815A1 (en) | 2013-10-01 | 2016-08-25 | Toray Industries, Inc. | Method for detecting pancreatic tumor, antibodies, and kit for the detection of pancreatic tumor |
| JP6677655B2 (ja) | 2015-01-26 | 2020-04-08 | 東レ株式会社 | 胆道癌の検出方法及び胆道癌検出用キット |
| JP6989871B2 (ja) | 2016-12-22 | 2022-01-12 | Ｋｍバイオロジクス株式会社 | 乾燥血液ろ紙を用いた低ホスファターゼ症のマススクリーニング検査法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08304398A (ja) * | 1995-05-02 | 1996-11-22 | Idemitsu Kosan Co Ltd | 免疫測定方法 |
| JPH10104226A (ja) * | 1996-09-30 | 1998-04-24 | Masaki Kobayashi | 血液検体採集カード |
| JP2001221794A (ja) * | 1999-12-01 | 2001-08-17 | Srl Inc | 血清分離シートを使用した血液検体の生化学的検査 |
-
2002
- 2002-02-13 JP JP2002035154A patent/JP3579032B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2002323499A (ja) | 2002-11-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2013277910B2 (en) | Quick test device and method | |
| JP6722699B2 (ja) | 生体サンプルの収集および分析デバイスならびにその使用方法 | |
| JPH02165051A (ja) | 検体の測定方法、検体測定用アッセイキット、検体測定用プロダクト及びアッセイ用トレーサー | |
| JP3579032B2 (ja) | 血液中の腫瘍マーカー定量方法 | |
| JP3691798B2 (ja) | 血液中の腫瘍マーカー定量方法 | |
| JP3691803B2 (ja) | 血液中の心不全マーカー定量方法 | |
| JPH10104226A (ja) | 血液検体採集カード | |
| JPH11201969A (ja) | 簡易遊離ヘモグロビン測定方法および測定用キット | |
| US20040197226A1 (en) | Remote site urine collection device and method of use | |
| US20050277203A1 (en) | Immunochemical filter device and methods for use thereof | |
| CN109633162A (zh) | S-100β蛋白检测试剂盒 | |
| CN113330315A (zh) | 糖尿病的微量取样检测 | |
| JP2002257826A (ja) | 血液中の腫瘍マーカー定量方法 | |
| WO1997037035A1 (en) | Whole blood analysis of prostate specific antigen spotted on a solid support | |
| JP2002257834A (ja) | 血液中の腫瘍マーカー定量方法 | |
| JP2003270238A (ja) | 体液検査用具 | |
| JP2002277474A (ja) | 血液中のホルモン定量方法 | |
| JP2002277463A (ja) | 尿中の抗原定量方法 | |
| JP2006153523A (ja) | 非浸襲性検体を用いたイムノクロマトグラフ法 | |
| JP2002340890A (ja) | タンパク質の測定方法 | |
| JP2002350449A (ja) | 乾式分析素子用の管理血清 | |
| JPH09133681A (ja) | 酵素免疫アッセイ装置及び方法 | |
| JP3664278B2 (ja) | 血漿または血清試料の調製方法 | |
| JP3076699B2 (ja) | 前立腺特異抗原の測定方法 | |
| JP4339570B2 (ja) | 血液検体キャリアー構成体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20040220 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040302 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040427 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040713 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040714 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080723 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080723 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090723 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100723 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |