JP2007139656A - 食道癌診断キット - Google Patents

Abstract

【課題】新規な食道癌抗原タンパク質、並びに該抗原タンパク質に基づく食道癌診断キットを提供する。
【解決手段】被験者に由来するサンプル中の、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒト食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体の存在を検出するための手段を含むことを特徴とする食道癌診断キット、または被験者に由来するサンプル中の、配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるヒト食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体の存在を検出するための手段を含むことを特徴とする食道癌診断キット。
【選択図】なし

Description

本発明は、食道癌診断キット及び食道癌の予防又は治療用医薬に関する。

食道癌等の固形癌は悪性の腫瘍であり、特に進行性の固形癌は治療が困難で多くの場合に致命的となる。例えば、固形癌のうち食道癌（食道扁平上皮癌）は、アルコール摂取、タバコの喫煙、ヒトパピローマウイルス感染などが原因となって生じる食道の腫瘍であり、その予後は長期生存率が５％未満と悪いものである。従って、食道癌に対する対策としては癌腫の早期発見が最も重要な課題である。

癌の早期発見のためには、腫瘍マーカーは欠かせないものであるといわれてきた。いくつかの腫瘍マーカーが食道癌と関連づけられてきたが、食道扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）についていえばその陽性率は限られたものだった（非特許文献１〜５）。ＳＥＲＥＸ（serological identification of antigens by recombinant cDNA expression cloning）法は腫瘍マーカーの同定には効果的で便利な方法である（非特許文献６及び特許文献１）。この方法は腫瘍組織から調製したｃＤＮＡライブラリーを自己又は同種の血清を用いて免疫学的なスクリーニングすることにより行う。抗原は単離されたｃＤＮＡクローンの配列を調べることによって容易に同定できるので、ＳＥＲＥＸ法は大量の腫瘍抗原のスクリーニングには適している。ＳＥＲＥＸ法は多様な腫瘍に適用されてきており、１，０００以上のＳＥＲＥＸ抗原が既に同定されている（非特許文献７）。最近の食道癌へのＳＥＲＥＸ法の適用によってＮＹ−ＥＳＯ−１及びＮＹ−ＥＳＯ−２が同定されている（非特許文献８及び９）。ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原は種々の癌細胞で発現されている癌精巣抗原である。加えて、ＳＥＲＥＸ法による分析により、ｐ５３癌抑制タンパク質を含む、癌に関連したいくつかの抗原が単離されており、血清中におけるこれら抗原に対する自己抗体を腫瘍マーカーとして検出することの有用性についても報告されている（非特許文献１０）。血清中のｐ５３抗体は、表在性の癌の検出や食道扁平上皮細胞癌患者の予後予測に用いられてきた（非特許文献１１〜１３）。本発明者のグループは、人の癌において明確に抗原性の同定されたタンパク質の一覧に追加する目的で食道扁平上皮細胞癌に対してＳＥＲＥＸ法を適用し、ＴＲＯＰ２、ＳＵＲＦ１及びＨＯＯＫ２などの食道扁平上皮細胞癌の新しいＳＥＲＥＸ抗原を報告してきた（非特許文献１４及び１５）。

一方、食道癌の治療方法としては、癌組織の外科的な切除や全身性の抗癌剤投与等が行われている。しかしながら、前記のとおり、進行性に移行した食道癌の場合にはこれらの治療法も効果は少なく、また早期に発見した場合であっても、これらの治療法は患者に大きな身体的負担を負わせるという問題を有している。

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上述したように、食道癌の早期診断のための方法として、癌組織特異的な抗原タンパク質マーカーを用いた分子生物学的診断方法の有効性が指摘されており、そのための新しい抗原タンパク質マーカーも幾つか提案されている。しかしながら、その診断精度をさらに向上させるためには、抗原性の高いタンパク質をより多く準備し、それらを組み合わせて使用することが不可欠である。

従って、本発明は、新規な食道癌抗原タンパク質マーカー、並びに腫瘍マーカーとしての自己抗体に基づく食道癌診断キットを提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ヒト食道癌患者において抗ＳＬＣ２Ａ１抗体の陽性率が高いことを見出し、また該抗ＳＬＣ２Ａ１抗体を新規な腫瘍マーカーとして食道癌を診断できるという知見を得、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、被験者に由来するサンプル中の、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒト食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体の存在を検出するための手段を含むことを特徴とする食道癌診断キットである。

また本発明は、被験者に由来するサンプル中の、配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるヒト食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体の存在を検出するための手段を含むことを特徴とする食道癌診断キットである。

上記食道癌診断キットにおいて、ヒト食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体の存在を検出するための手段としては、例えば該食道癌抗原ポリペプチド又はその部分ペプチドを用いることができる。また、診断対象となる食道癌としては、限定されるものではないが、食道扁平上皮癌（ＳＣＣ）、腺癌、腺扁平上皮癌、腺様のう胞癌、及び未分化癌が挙げられる。使用可能なサンプルは、特に限定されるものではないが、血清、血液、血液細胞及び組織などである。

また、上記食道癌診断キットは、さらに、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、サイトケラチン１９フラグメント抗原（ＣＹＦＲＡ）及び扁平上皮癌関連抗原（ＳＣＣ−Ａｇ）からなる群より選択される抗原ポリペプチドの存在を検出するための手段を含んでもよい。この食道癌診断キットは、陽性率３０％以上で食道癌を診断することが可能である。

本発明に係る食道癌診断キットにより、ヒト食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体を検出することで、食道癌を高精度で診断することができる。また、該ヒト食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体は既存の腫瘍マーカーと交差することがないため、これらを併用することによりさらに高精度で食道癌を診断することが可能となる。従って、本食道癌診断キットは食道癌の早期診断に有用である。

以下、本発明を詳細に説明する。

１．新規なヒト食道癌抗原ポリペプチド
本発明は、新規抗原ポリペプチド、ＳＬＣ２Ａ１（ＳＬＣ２Ａ１／ＧＵＬＴ１ともいう）に対する抗体がヒト食道癌に高頻度に存在するという知見に基づくものである。この抗原ポリペプチドは、新規な食道癌マーカーとしての有用性を提供し、また食道癌（特に食道扁平上皮癌）の診断方法の可能性、即ち、腫瘍組織におけるＳＬＣ２Ａ１抗原の発現に代わり血清中の抗ＳＬＣ２Ａ１抗体のレベルの測定による食道癌の診断の可能性を提供するものである。

本発明者らは、食道の扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）患者中の血清ＩｇＧによって認識される抗原ＳＬＣ２Ａ１（solute carrier family 2/facilitated glucose transporter, member 1）を同定した（実施例１参照）。血清中の抗ＳＬＣ２Ａ１抗体（ｓ−ＳＬＣ２Ａ１抗体）のレベルは、細菌で発現させたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とＳＬＣ２Ａ１の融合タンパク質を用いたＥＬＩＳＡによって測定したところ、健常者に比べて食道扁平上皮癌の患者が有意に高かった（実施例２参照）。健常者の平均値＋２ＳＤをカットオフ値としたとき、５７名のＳＣＣ患者中１２名（２１％）がｓ−ＳＬＣ２Ａ１抗体陽性であった。ｓ−ＳＬＣ２Ａ１抗体の存在はいずれの臨床的病因要因、あるいは生存率とも関連しなかった（実施例３参照）。ｓ−ＳＬＣ２Ａ１抗体は他の既存の血清マーカーの陽性率とも関連しなかったことから、ｓ−ＳＬＣ２Ａ１抗体と他の既存の血清マーカーとの組み合わせは食道ＳＣＣの診断及びモニタリングに有用なマーカーになりうる。

本発明において用いるＳＬＣ２Ａ１抗原ポリペプチド（本明細書中、「食道癌抗原ポリペプチド」ともいう）のアミノ酸配列を配列番号２に、それをコードする塩基配列を配列番号１に示す。なお、ＳＬＣ２Ａ１の配列情報はアクセッション番号ＮＭ＿００６５１６としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている。また、これらの塩基配列及びアミノ酸配列については、１若しくは数個の塩基の付加、欠失、他の塩基への置換、あるいはこれらの塩基変異に基づく１若しくは数個のアミノ酸残基の付加、欠失及び他のアミノ酸への置換をも包含する。

また、本明細書中「血清中抗体」とは、食道癌患者の血清中に存在し、食道癌抗原ポリペプチドと結合する抗体を意味する。また、「抗体」は、食道癌抗原ポリペプチド又はその部分断片を免疫原として作製されたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を意味する。

本発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。また本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、本発明に係る医薬を調製するための薬剤の調製はRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に、遺伝子工学及び分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。

なお、ＳＬＣ２Ａ１が肺癌（Kurata T, et al., Jpn J Cancer Res 90: 1238-1243, 1999）、胃癌（Noguchi Y, et al., Hepatogastroenterology 46: 2683-2689, 1999）、頭頸部癌（Reisser C, et al., Int J Cancer 80: 194-198, 1999）及び膵癌（Higashi T, et al., J Nucl Med 39: 1727-1735, 1998）の組織において過剰発現していることが報告されている。従って、グルコーストランスポーターファミリーの中で、ＳＬＣ２Ａ１は腫瘍細胞の急速な成長にとって必要な因子の可能性がある。しかしながら、従来、抗ＳＬＣ２Ａ１抗体のレベルが癌患者において上昇することについては報告されていない。

２．食道癌診断キット
上述の通り、食道癌抗原ポリペプチドがヒト食道癌において発現され、またヒト食道癌には該抗原ポリペプチドに対する抗体が存在する。従って、被験者由来のサンプルにおいてこの食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体の存在、又は食道癌抗原ポリペプチドの発現を検出することによって、被験者をヒト食道癌について診断することが可能となる。

本発明に係る食道癌診断キット（以下、「本食道癌診断キット」ともいう）は、被験者に由来するサンプル中のヒト食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体の存在又はヒト食道癌抗原ポリペプチドの発現を検出するための手段を含むものである。

本食道癌診断キットは、食道癌の診断を行うための試薬キットである。このようなキットは、被検成分の種類に応じて各種のものが市販されており、本食道癌診断キットも、ヒト食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体の存在又は該抗原ポリペプチドの発現を検出するための手段（食道癌抗原ポリペプチド、抗体、プライマー、プローブなど）を用いることを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。

また、本食道癌診断キットにより、食道癌、例えば限定するものではないが、食道扁平上皮癌（ＳＣＣ）、腺癌、腺扁平上皮癌、腺様のう胞癌、及び未分化癌等について被験者を診断することが可能である。好ましくは、食道扁平上皮癌（ＳＣＣ）の診断のために用いることができる。

ここで食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体の存在、該抗原ポリペプチドの発現、及びその遺伝子の発現を検出する手段としては、
（１）食道癌抗原ポリペプチド
（２）食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体
（３）食道癌抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに基づいて設計されたプローブ又はプライマー
が挙げられる。以下、これらの手段について詳述する。

（１）食道癌抗原ポリペプチド
食道癌抗原ポリペプチドは、癌細胞が発現するポリペプチドであるため、癌を有する患者の血清中には、発現された食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体（血清中抗体）が存在する。従って、食道癌抗原ポリペプチドを使用して血清中抗体との反応を調べることによって、被験者における食道癌抗原ポリペプチドの発現を検出することができる。本明細書中、「抗原ポリペプチド」には、配列番号２に示す抗原ポリペプチドのほか、配列番号２に示す抗原ポリペプチドのうち少なくとも６個以上のアミノ酸、好ましくは６〜５００、より好ましくは８〜５０アミノ酸からなる部分ペプチドも含まれる。

これらの抗原ポリペプチドは、例えば、配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行うことによりインビトロでペプチドを発現させることにより調製することができる。また組換え発現ベクターを大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞に導入して形質転換細胞を作製すれば、この形質転換細胞からポリペプチドを発現させることができる。

抗原ポリペプチドをインビトロ翻訳で発現させる場合には、抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して組換え発現ベクターを作製し、このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、抗原ポリペプチドをインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７ １８、ｐＴ７／３ １９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩなどが例示できる。

抗原ポリペプチドを、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能な複製起点、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有するベクターにポリヌクレオチドを連結した発現ベクターを作製し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、そのポリヌクレオチドがコードしている抗原ポリペプチドを微生物から発現させることができる。この際、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ、ｐＥＴ発現系、ｐＧＥＸ発現系などが例示できる。

抗原ポリペプチドを、真核細胞で発現させる場合には、抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、真核細胞内に導入すれば、抗原ポリペプチドを形質転換真核細胞で発現させることができる。発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ、ｐＫＡ１、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。また、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１などを発現ベクターとして用いれば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として抗原ポリペプチドを発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、抗原ポリペプチドを発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。

抗原ポリペプチドを原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的の抗原ポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。

なお、以上の方法によって得られる組換え抗原ポリペプチドには、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）や緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質などが例示できる。さらに、形質転換細胞で発現されたペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたペプチドも抗原ポリペプチドとして用いることができる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。

食道癌抗原ポリペプチドを用いて、被験者由来のサンプルにおける食道癌抗原ポリペプチドの発現を検出するためには、被験者のサンプル（血清）中に、食道癌抗原ポリペプチドと結合する血清中抗体が存在するか否かを試験する。そして血清中にその抗体が存在する被験者を食道癌患者又は食道癌ハイリスク者と判定する。すなわち、食道癌抗原ポリペプチドは、食道癌患者に由来する血清中抗体と結合するポリペプチドであるから、被験者の血清と反応させた結果、サンプルがこれらの抗原ポリペプチドと結合する血清中抗体を含む場合には、食道癌患者又はそのハイリスク患者のサンプルとして判定することができる。

また、上記食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体は、既存の腫瘍マーカーと交差することがないため、他の腫瘍マーカーと併用することによって、高精度に、例えば陽性率３０％以上で食道癌を検出することが可能となる。従って、本食道癌診断キットに関して、他の食道癌マーカー、例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、サイトケラチン１９フラグメント抗原（ＣＹＦＲＡ）及び扁平上皮癌関連抗原（ＳＣＣ−Ａｇ）を併用してもよい。これらのＣＥＡ抗原、ＣＹＦＲＡ抗原及びＳＣＣ抗原を検出するための手段又はキットは市販されており、当業者であれば容易にこれらの抗原を検出することができる。また、サンプルとしては、血清中抗体が含まれるサンプル、すなわち血清を対象とすることができる。

本食道癌診断キットを用いた具体的な診断は、例えば食道癌診断キットに含まれる食道癌抗原ポリペプチドに被験者血清を接触させ、該食道癌抗原ポリペプチドと被験者血清中の抗体とを液相中において反応させることにより行う。さらに血清中の抗体と特異的に結合する標識化抗体を反応させて、標識化抗体のシグナルを検出すればよい。標識化抗体に使用する標識としては、酵素、放射性同位体又は蛍光色素を使用することができる。酵素は、代謝回転数が大きいこと、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常の酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）に用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。

酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。

放射性同位体としては、^１２５Ｉや^３Ｈ等の通常のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で用いられているものを使用することができる。放射性同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。

蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。蛍光色素を用いる場合には、蛍光光度計や蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。

さらにまた、標識化抗体には、マンガンや鉄等の金属を結合させたものも含まれる。このような金属結合抗体を体内に投与し、ＭＲＩ等によって金属を測定することによって、血清中抗体の存在、すなわち食道癌抗原ポリペプチドの発現を検出することができる。

シグナルの検出は、例えば、ウエスタンブロット分析を採用することができる。あるいは、抗原ポリペプチド＋血清中抗体＋標識化抗体の結合体を、公知の分離手段（クロマト法、塩析法、アルコール沈殿法、酵素法、固相法等）によって分離し、標識化抗体のシグナルを検出するようにしてもよい。

また、抗原ポリペプチドを固相（プレート、メンブレン、ビーズ等）上に固定化し、この固相上において被験者血清の抗体との結合を試験することもできる。抗原ポリペプチドを固相上に固定化することによって、未結合の標識化結合分子を容易に除去することができる。また特に、数十種類の抗原ポリペプチドを固定化したメンブレンを用いるプロテインアレイ法では、０．０１ｍｌ程度の被験者血清を用いて多種類の抗体の発現を短時間で解析することができる。

このように抗体の存在に基づいて食道癌の診断を行う場合、抗原ポリペプチドが発現した時点から免疫系によって抗体の産生が促進されるため、腫瘍の進展段階（ステージ）によらず、早期段階で高感度（陽性率２０％以上）に該抗体を検出することができ、食道癌を診断することができる。

（２）食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体
食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体は、癌細胞において発現された食道癌抗原ポリペプチドと結合することができるため、該抗体を用いてサンプル中の食道癌抗原ポリペプチドとの反応を検出することによって、該サンプルが癌患者又はハイリスク者に由来するか否かを診断することができる。

食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり、それぞれ食道癌抗原ポリペプチドのエピトープに結合することができる全体分子、及びＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片等が全て含まれる。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、抗原ポリペプチドやその一部断片を免疫原として動物を免疫した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。

また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、１９９０年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996）に従い作製することができる。

また食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体には、標識物質によって標識化された抗体も含まれる。そのような標識化抗体の詳細については、上記を参照されたい。

食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体を用いて被験者由来のサンプル中の食道癌抗原ポリペプチドの発現を検出し、ヒト食道癌を診断する場合には、被験者のサンプル中に、食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体又はその標識化抗体と結合する抗原ポリペプチドが存在するか否かを試験し、サンプル中にその抗原ポリペプチドが存在する被験者を食道癌患者又はそのハイリスク者と判定する。すなわち、ここで使用する抗体又は標識化抗体は、食道癌細胞で発現している抗原ポリペプチドと特異的に結合する抗体であるから、この抗体と結合する抗原ポリペプチドを含むサンプルを、食道癌患者又はそのハイリスク患者の試料として判定することができる。また、サンプルとしては、食道癌抗原ポリペプチドが発現されるサンプルであれば特に限定されるものではなく、血液や血液細胞（単核球等）、組織を対象とすることができる。

また別の態様は、抗体と抗原ポリペプチドとの結合を液相系において行う方法である。例えば、標識化抗体とサンプルとを接触させて標識化抗体と抗原ポリペプチドを結合させ、この結合体を上記と同様の方法で分離し、標識シグナルを同様の方法で検出する。

液相系での診断の別の方法は、食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体（一次抗体）とサンプルとを接触させて一次抗体と抗原ポリペプチドを結合させ、この結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体＋抗原ポリペプチド結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をビオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域（例えば、Ｆｃ領域）を認識する抗体（三次抗体）を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は上記と同様とすることができる。

また別の態様は、抗体と抗原ポリペプチドとの結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量の抗原ポリペプチド検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体（一次抗体）を固相（樹脂プレート、メンブレン、ビーズ等）に固定化し、この固定化抗体に抗原ポリペプチドを結合させ、非結合ペプチドを洗浄除去した後、プレート上に残った抗体＋抗原ポリペプチド結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この二次抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、「ＥＬＩＳＡ（enzyme linked immunosorbent assay）」として広く用いられている方法である。一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。シグナルの検出は上記と同様とすることができる。

（３）プライマー又はプローブ
本食道癌診断用キットは、食道癌抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全部若しくは一部の配列又はその相補配列を含むプライマー又はプローブを含むものであってもよい。該プライマー又はプローブは、被験者由来のサンプル中に発現している抗原ポリペプチドのｍＲＮＡ又はｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡと特異的に結合して、サンプル中の抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の発現、すなわち抗原ポリペプチドの発現を検出することが可能である。

プライマー及びプローブは、当業者に公知の手法に従って、抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列番号１の塩基配列に基づき設計することができる。プライマー及びプローブ設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。

プライマーとして実質的な機能を有する長さとしては、１０塩基以上が好ましく、さらに好ましくは１６〜５０塩基であり、さらに好ましくは２０〜３０塩基である。またプローブとして実質的な機能を有する長さとしては、１０塩基以上が好ましく、さらに好ましくは１６〜５０塩基であり、さらに好ましくは２０〜３０塩基である。

また設計の際には、プライマー又はプローブの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。Ｔｍとは、任意のポリヌクレオチド鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、鋳型ＤＮＡ又はＲＮＡとプライマー又はプローブとが二本鎖を形成してアニーリング又はハイブリダイズするためには、アニーリング又はハイブリダイゼーションの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、設計しようとするプライマー又はプローブのＴｍは、増幅反応又はハイブリダイゼーションを行う上で重要な因子である。Ｔｍの確認には、公知のプライマー又はプローブ設計用ソフトウエアを利用することができ、本発明で利用可能なソフトウエアとしては、例えばＯｌｉｇｏＴＭ［National Bioscience Inc.（米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等などが挙げられる。またＴｍの確認は、ソフトウエアを使わず、自ら計算することによっても行うことができる。その場合には、最近接塩基対法（Nearest Neighbor Method）、Ｗａｌｌａｎｃｅ法、ＧＣ％法等に基づく計算式を利用することができる。本発明では、平均Ｔｍが約４５〜５５℃であることが好ましい。

プライマー又はプローブとして特異的なアニーリング又はハイブリダイズが可能な条件としては、その他にもＧＣ含量などがあり、そのような条件は当業者に周知である。

上述のように設計したプライマー及びプローブは、当業者に公知の方法に従って調製することができる。さらに、当業者には周知のように、プライマー又はプローブには、アニーリング又はハイブリダイズする部分以外の配列、例えばタグ配列などの付加配列が含まれていてもよく、上述したプライマー又はプローブにそのような付加配列が付加されたものも本発明の範囲内に含まれるものとする。

被験者由来のサンプルにおける食道癌抗原ポリペプチドの発現を検出するためには、上記プライマー及び／又はプローブをそれぞれ増幅反応又はハイブリダイゼーション反応において用い、その増幅産物又はハイブリッド産物を検出する。

サンプルとしては、便や血液、血液細胞（単核球等）を対象とすることができる。また増幅反応又はハイブリダイゼーション反応を行う場合には、通常は、被験者由来のサンプルから被検核酸を調製する。被検核酸は、核酸であればＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡは、当技術分野で周知の方法を適宜使用して抽出することができる。例えば、ＤＮＡを抽出する場合には、フェノール抽出及びエタノール沈殿を行う方法、ガラスビーズを用いる方法など、またＲＮＡを抽出する場合には、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、又はチオシアン酸グアジニウム−フェノール−クロロホルム（ＡＧＰＣ）法などを利用することができる。以上のように調製したサンプル又は被検核酸を用いて、以下に示す増幅反応及び／又はハイブリダイゼーション反応を行う。

プライマーを用いて被検核酸を鋳型とした増幅反応を行い、その特異的増幅反応を検出することにより、サンプル中の食道癌抗原ポリペプチドの発現の検出を行うことができる。

増幅手法としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理を利用した公知の方法を挙げることができる。増幅は、増幅産物が検出可能なレベルになるまで行う。

例えば、ＰＣＲ法は、被検核酸であるＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼにより、一対のプライマー間の塩基配列を合成するものである。ＰＣＲ法によれば、変性、アニーリング及び合成からなるサイクルを繰り返すことによって、増幅断片を指数関数的に増幅させることができる。ＰＣＲの最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。

またＲＴ−ＰＣＲ法では、まず、被検核酸であるＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素反応によりｃＤＮＡを作製し、その後、作製したｃＤＮＡを鋳型として一対のプライマーを用いてＰＣＲ法を行うものである。

なお、増幅手法として競合ＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法等の定量的ＰＣＲ法などを採用することにより、定量的な検出が可能となる。

上記増幅反応後に特異的な増幅反応が起こったか否かを検出するには、増幅反応により得られる増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、アガロースゲル電気泳動法等を利用して、特定のサイズの増幅断片が増幅されているか否かを確認することにより、特異的な増幅反応を検出することができる。

あるいは、増幅反応の過程で取り込まれるｄＮＴＰに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。放射性同位体としては、^３２Ｐ、^１２５Ｉ、^３５Ｓなどを用いることができる。また蛍光物質としては、例えば、フルオレセン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＳＲ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）などを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。

これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識体の導入方法としては、放射性同位体を用いるランダムプライム法が挙げられる。

標識したｄＮＴＰを取り込んだ増幅産物を観察する方法としては、上述した標識体を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法でもよい。例えば、標識体として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ−カウンターなどにより計測することができる。また標識体として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーなどを用いて検出することができる。

以上のようにして特異的な増幅反応が検出された場合には、サンプル中に食道癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子が発現している、すなわち食道癌抗原ポリペプチドが発現していることとなる。従って、サンプル中に抗原ポリペプチドが発現している被験者を食道癌患者又はハイリスク者と診断する。

また、プローブを用いてサンプル又は被検核酸に対するハイブリダイゼーション反応を行い、その特異的結合（ハイブリッド）を検出することにより、食道癌抗原ポリペプチドの発現を検出することもできる。

ハイブリダイゼーション反応は、プローブが食道癌抗原ポリペプチドに由来するポリヌクレオチドのみと特異的に結合するような条件、すなわちストリンジェントな条件下で行う必要がある。そのようなストリンジェントな条件は当技術分野で周知であり、特に限定されない。ストリンジェントな条件としては、例えばナトリウム濃度が、１０〜３００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭであり、温度が２５〜７０℃、好ましくは４２〜５５℃における条件が挙げられる。

ハイブリダイゼーションを行う場合には、プローブに蛍光標識（フルオレセイン、ローダミンなど）、放射性標識（³²Ｐなど）、酵素標識（アルカリホスファターゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ等）、ビオチン標識等の適当な標識を付加することができる。従って、本食道癌診断用キットには、上記のような標識を付加したプローブも含まれる。

標識化プローブを用いた検出は、サンプル又はそれから調製した被検核酸とプローブとをハイブリダイズ可能なように接触させることを含む。「ハイブリダイズ可能なように」とは、上述したストリンジェントな条件下にて特異的な結合が起こる環境（温度、塩濃度）において、ということである。具体的には、サンプル又は被検核酸をスライドグラス、メンブラン、マイクロタイタープレート等の適当な固相に固定化し、標識を付加したプローブを添加することにより、プローブとサンプル又は被検核酸とを接触させてハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリダイズしなかったプローブを除去した後、サンプル又は被検核酸とハイブリダイズしているプローブの標識を検出する。標識が検出された場合には、サンプル中に食道癌抗原ポリペプチドが発現していることとなる。従って、サンプル中に抗原ポリペプチドが発現している被験者を食道癌患者又はハイリスク者と診断する。

また、標識の濃度を指標とすることにより、定量的な検出も可能となる。標識化プローブを用いた検出方法の例としては、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等を挙げることができる。

また、本食道癌診断キットを用いて診断を行う場合には、被験者に由来するサンプル中の食道癌抗原ポリペプチドの発現量を測定し、その食道癌抗原ポリペプチドの発現が健常者のそれらと比較して多い被験者を食道癌患者又はそのハイリスク者と判定する。具体的な判定基準としては、被験者の食道癌抗原ポリペプチド発現量が健常者のそれと比較して、１０％以上、好ましくは３０％以上、さらに好ましくは７０％以上、最も好ましくは１００％以上である場合である。

３．食道癌の予防又は治療用医薬
３．１．食道癌抗原ポリペプチドの機能又は発現抑制
食道癌抗原ポリペプチドは、食道癌において高頻度に発現するものであるため、その発現が細胞の癌化の原因となっている可能性が高い。そのため、食道癌抗原ポリペプチドの機能又は発現を抑制すれば、細胞の癌化やその進行に対する治療効果が期待される。

従って、上記のヒト食道癌抗原ポリペプチドの機能及び発現を抑制するための手段は、食道癌の予防及び／又は治療用医薬として有効である。

かかるヒト食道癌抗原ポリペプチドの機能又は発現を抑制するための手段としては、
（１）食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体
（２）食道癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の転写を抑制可能な手段
（３）食道癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳を抑制可能な手段
が挙げられる。

（１）食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体
食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体は、被験者における食道癌抗原ポリペプチドと特異的に結合することにより、該抗原ポリペプチドの活性を抑制することができる。従って、食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体を含む医薬は、食道癌の治療又は予防に有効である。

（２）食道癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の転写を抑制可能な手段
食道癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の転写を抑制する手段としては、対象となる被験者における当該遺伝子の転写プロモーター領域を転写抑制型プロモーターと置換するために用いることが可能な発現ベクターが挙げられる。また、食道癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の転写を抑制する手段としては、当該遺伝子の転写に関わる領域に転写抑制活性のある塩基配列を挿入するための発現ベクターを用いてもよい。上記のような発現ベクターの設計及び調製は当業者には周知である。

（３）食道癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳を抑制可能な手段
また、食道癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳を抑制する手段としては、いわゆるアンチセンス核酸を用いる方法が挙げられる。すなわち、当該遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸を転写する遺伝子を、プラスミドとして導入するか又は被験者のゲノムに組み込み、当該アンチセンス核酸を過剰発現させることで、食道癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子のｍＲＮＡの翻訳が抑制される。アンチセンス核酸に関する技術は、例えば哺乳動物を宿主とした場合でも知られている（Han et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 88,4313-4317; Hackett et al.(2000) Plant Physiol., 124,1079-86）。例えば、アンチセンスｍＲＮＡによるグルコーストランスポーター１の発現の抑制により、腫瘍細胞の増殖が阻害されたことが報告されている（Noguchi Y, et al., Cancer Lett 154: 175-182, 2000）。

また、食道癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳を抑制するために、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を利用することも可能である。具体的には、標的とする食道癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列に相補的な二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、食道癌抗原ポリペプチドをコードする内在性遺伝子のｍＲＮＡが分解されて、結果としてその細胞での遺伝子発現が特異的に抑制されることとなる。この手法は、哺乳動物細胞などにおいても確認されている（Hannon,GJ., Nature (2002) 418,244-251 (review)；特表２００２−５１６０６２号公報；特表平８−５０６７３４号公報）。

３．２．食道癌に対するターゲティング
食道癌抗原ポリペプチドは、食道癌において高頻度に発現するものであるため、この発現を利用して食道癌にターゲティングする手段を用いることによって、食道癌治療薬を癌部位で有効に作用させることが可能となる。

従って、上記の食道癌にターゲティングする手段もまた、食道癌の予防及び／又は治療用医薬として有効であり、本発明に係る食道癌の予防又は治療用医薬は、食道癌治療薬又は食道癌治療薬をコードする遺伝子とヒト食道癌にターゲティングする手段とを含むものである。

かかるヒト食道癌にターゲティングする手段としては、
（１）食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体
（２）食道癌抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現制御領域の塩基配列
が挙げられる。

（１）食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体
食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体は、癌細胞で高頻度に発現する抗原ポリペプチドに結合するため、この抗体に公知の食道癌治療薬（例えば抗癌剤や免疫増強剤）を結合させて患者体内に投与することによって、食道癌治療薬を癌細胞特異的に作用させることができる。

（２）食道癌抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現制御領域の塩基配列
食道癌抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現制御領域（以下、「プロモーター配列」と記載する）は、食道癌細胞で高頻度に発現する遺伝子の発現制御領域であるため、このプロモーター配列に食道癌治療薬をコードするポリヌクレオチドを連結して治療用遺伝子を作製し、これを体内に投与すれば、治療用遺伝子を癌細胞特異的に発現させることが可能となる。抗癌作用を有する物質又は抗癌作用を有する物質の前駆物質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えばｐ５３、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、インターロイキン−２、−１２、−１７、−１８、シトシンデアミナーゼ、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ等をコードする遺伝子ＤＮＡやそのｃＤＮＡ等を利用することができる。また、このプロモーター配列は、アデノウイルスやヘルペスウイルスを癌細胞特異的に増殖させて癌細胞を融解させる治療法に使用することもできる。すなわち、例えばアデノウイルスのＥ１Ａ領域の前にプロモーター配列を挿入することによって、このアデノウイルスは癌細胞においてのみ特異的に増殖し、癌細胞を融解させる。

３．３．医薬の適用対象及び投与
本発明の医薬の適用対象となる食道癌は、限定されるものではないが、食道扁平上皮癌（ＳＣＣ）、腺癌、腺扁平上皮癌、腺様のう胞癌、及び未分化癌が挙げられる。

本発明の医薬は、上記食道癌の発症を予防することを目的として、あるいは上記食道癌患者又は食道癌のリスクが高いと診断された患者に対しては症状の悪化の防止又は症状の軽減などを目的として投与することができる。

上記の手段を食道癌の治療及び／又は予防のための医薬として用いる場合には、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬組成物として用いることもできる。このときの有効成分の担体に対する割合は、１〜９０％の間で適宜調整すればよい。

本発明の医薬の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、癌原病巣に対して又は癌腫に対応した予想転移部位に対して局所注射等の局所投与を行うことが好ましい。

本発明の医薬の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤形によって異なり、これらは当業者又は医師が適宜調整すればよい。

以下、実施例を用いて本方法をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

ｃＤＮＡライブラリーの血清学的スクリーニング
（１）ファージ発現ライブラリーの構築
本実施例では、ヒト食道扁平上皮癌ＤＮＡライブラリー（Human esophageal squamous cell carcinomacDNA libraries）を構築し、それを使用した。
この研究は千葉大学大学院医学研究院の倫理委員会の承認の下に行われた。ＤＮＡについての作業は公的な許可の下に日本政府の規制に従って行われた。すべての患者は本研究に参加する前に文書でインフォームドコンセントを提出した。ヒト食道扁平上皮癌細胞株であるＴ．Ｔｎは千葉大学大学院医学研究科の臨床分子生物学教室で確立された（Takahashi K, et al., Jpn J Oral Maxillofac Surgery 36: 307-316, 1990；Shimada H, et al., Surg Today 31: 597-604, 2001）。すべてのＲＮＡはＴ．Ｔｎ細胞から酸性グアニジンチオシアネート−フェノール−クロロフォルム法で調製し、Oligotex-dT₃₀(Super)mRNA Purification Kit（タカラバイオケミカル、日本、京都）を用いて使用説明書に従い精製した（Chomczynski P and Sacchi N, Anal Biochem 162: 156-159, 1987）。ｃＤＮＡはλＺＡＰ ＩＩファージのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入した。オリジナルのライブラリーのサイズは１．８×１０^６であった。

（２）患者及び健常者血清の調製
血清は治療開始前の食道扁平上皮癌の患者５７名と健常者３１名から得た。食堂上皮癌の患者は男性５１名（８９％）及び女性６名（１１％）、年齢の中央値６５歳（４４歳−８２歳）であった。これらの検体はTumor Node Metastasis/Union Internationale Contre Cancer（pTNM/UICC）分類（Sobin LH and Wittekind CH (編): UICC TNM Classification of malignant tumors, 6th edition. John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000）に従い、病理学的に分類した。内容はステージＩ（ｎ＝１９）、ステージＩＩ（ｎ＝６）、ステージＩＩＩ（ｎ＝１３）及びステージＩＶ（ｎ＝１９）だった。

手術後、患者は通常の方法に従い、死亡又は２００５年３月までのどちらか早い時期まで臨床診察及び画像観察で経過を追った。平均観察期間は２６ヶ月であった。各検体は３，０００×ｇで５分間遠心分離し、使用するまで−８０℃で凍結した。繰り返しの凍結融解は避けた。

（３）食道癌細胞抗原の免疫学的スクリーニング
食道癌抗原はＳａｈｉｎら（Proc Natl Acad Sci USA 92: 11810-11813, 1995）によって報告されたＳＥＲＥＸ法を用いてスクリーニングした。E.coli XL1-Blue MRFはｃＤＮＡライブラリーを組み込んだλＺＡＰ ＩＩファージで感染させ、発現は１０ｍＭのＩＰＴＧ（和光純薬、日本、大阪）で３０分間処理したニトロセルロース膜（NitroBind, Osmonics Inc., Minnetonka, MN）へのブロッティングによって誘導された。ニトロセルロース膜はＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、１％のプロテアーゼフリーウシ胎児血清アルブミンを含むＴＢＳ−Ｔで１時間ブロッキングした。次いで、１：２０００に希釈した血清で１時間反応させ、洗浄後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。さらに１：５０００に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ特異Ｆ（ａｂ）’フラグメント（Jaqckson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA）と１時間反応させた。陽性反応は発色基質（０．３ｍｇ／ｍＬの塩化ニトロブルーテトラゾリウム（和光純薬）と０．１５ｍｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（和光純薬）を含む１００ｍＭ ＮａＣｌ及び５ｍＭ ＭｇＣｌ_２含有１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５））と反応させて発色させることにより検出した。陽性のクローンは単クローンとするために２回クローニングを繰り返し、血清に対する反応性をテストした。
その結果、トータルで１×１０^６のｃＤＮＡが食道扁平上皮細胞癌の患者血清を用いてスクリーニングされ、この中から１３の反応性のクローンが単離された。

（４）同定された抗原の配列解析
単クローン化したｃＤＮＡクローンはＥｘＡｓｓｉｏｓｔヘルパーファージ（Stratagene, La Jolla, CA）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ切除によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドに変換した。プラスミドのＤＮＡはファージミドにより形質転換した大腸菌ＳＯＬＲ株より得た。挿入したＤＮＡはDNA Sequencing kit BigDye Terminator（Applied Biosystems, Foster City, CA）及びABI PRISM 3700 DNA Analyzer（Applied Biosystems）を用いてジデオキシチェーンターミネーション法で配列を解析した。配列はＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴにより、公開データベース上で既知の遺伝子やタンパク質とのホモロジーを検索した。

National Center for Biotechnology Information（NCBI）のデータベースを用いたＤＮＡの配列解析とホモロジーサーチにより、ＳＬＣ２Ａ１（溶質キャリアファミリー２（促進型グルコーストランスポーター）、メンバー１）（アクセッション番号ＮＭ＿００６５１６）であることが明らかになったことから、更に検討を行った。ＳＬＣ２Ａ１は膜の輸送体（ＳＬＣ）ファミリーの一員であり、グルコースを細胞内に取り込むのに必須の膜糖タンパク質である（Mueckler M, et al., Science 229: 941-945, 1985）。ＳＬＣ２Ａ１の染色体上の位置は１ｐ３５−ｐ３１．３であり、その産物は４９２アミノ酸（５４，１１７Ｄａ）よりなる。単離されたクローンはアミノ酸の２９２位から４９２位の範囲（約２２ｋＤａ）を含んでいた。ＳＬＣ２Ａ１はCancer Immunome DatabaseのＳＥＲＥＸ抗原には登録されていなかった（Cancer Immunome Database: http://www2.licr.org/CancerImmunomeDB/）。しかし、同じファミリーのメンバーであるＳＬＣ２Ａ１１（ＮＭ＿０３０８０７）は膵臓腺癌、黒色腫及び線維筋腫のＳＥＲＥＸ抗原として登録されていた。これもグルコーストランスポーターであるが、染色体上で異なる位置にある（２２ｑ１１．２）。

食道扁平細胞癌患者における血清中ＳＬＣ２Ａ１抗体の存在
本実施例においては、食道扁平上皮細胞癌の患者中に血清ＳＬＣ２Ａ１抗体が存在するかどうかを確認するため、バクテリアで発現されたＳＬＣ２Ａ１タンパク質を用いてウエスタンブロットを実施した。

（１）組換えＳＬＣ２Ａ１タンパク質の精製
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに組み込まれたＳＬＣ２Ａ１の挿入ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断し、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３に組み込んでｐＧＥＸ−４Ｔ−３−ＳＬＣ２Ａ１を構築した。なお、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にＳＬＣ２Ａ１のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ挿入物を結合させて作製した発現ベクターはＩＰＴＧで大腸菌を処理することによりＧＳＴ−ＳＬＣ２Ａ１融合タンパク質を産生する。

ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−ＳＬＣ２Ａ１を含む大腸菌ＪＭ１０９細胞、又は対照としてのｐＧＥＸ−４Ｔ−３を２００ｍＬのルリアブロス（ＬＢ）で培養し、１ｍＭ ＩＰＴＧで２．５時間処理した。細胞は回収し、ＰＢＳで洗浄して１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍＭ ＤＴＴを含む１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で超音波により溶解した。溶解液は１０，０００×ｇで４℃、３０分間遠心した。ＧＳＴは上清に回収され、グルタチオン−セファロースによって精製された。沈殿中に回収されたＧＳＴ−ＳＬＣ２Ａ１融合タンパク質は１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍＭ ＤＴＴを含む８Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、ステップワイズで１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍＭ ＤＴＴを含む４Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に１時間、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍＭ ＤＴＴを含む２Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に１時間、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に１２時間透析した。

溶解物は４℃で１０，０００×ｇ１０分間遠心し、グルタチオン−セファロース（Amercham Biosciences, Piscataway, NJ）でアフィニティ精製した。精製したタンパク質はApollo centrifugal concentrators（Orbital Biosciences, Topsfield, MA）で濃縮した。精製ＧＳＴ−ＳＬＣ２Ａ１融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を図１に示す。図１において、レーン１は全細菌溶解物であり、レーン２はＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶解物の上清であり、レーン３はグルタチオン−セファロースアフィニティカラムクロマトグラフィー後の精製分画である。

対照としてｐＧＥＸ−４Ｔ−２のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトにＳＬＣ２Ａ１挿入物を挿入したベクター（ｐＧＥＸ−４Ｔ−２−ＳＬＣ２Ａ１）により、フレームシフト突然変異と早期翻訳終了が生じた。

（２）ウエスタンブロッティング分析
上記（１）で作製した、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−ＳＬＣ２Ａ１（ＳＬＣ２Ａ１）又は対照ｐＧＥＸ−４Ｔ−２−ＳＬＣ２Ａ１（対照、ＳＬＣ２Ａ１フレームシフト産物を発現する）を含有する大腸菌ＪＭ１０９細胞は１ｍＭのＩＰＴＧの存在下又は非存在下で２．５時間培養した。細胞はＰＢＳで洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファー中１００℃で溶解した（Laemmli U, Nature 227: 680-685, 1970）。大腸菌溶解物はＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、患者血清又は健常者血清を用いてウエスタンブロットを行った。

図２はＳＬＣ２Ａ１抗体の代表的な陽性及び陰性結果を示す。図２Ａ及びＢは、食道癌患者＃２０血清（Ａ）又は健常者＃１血清（Ｂ）を用いたウエスタンブロット分析の結果を示す。また図２Ｃは、同じサンプルを同様に抗ＧＳＴ抗体を用いて検出した（Ｃ）。矢印は、ＳＬＣ２Ａ１ ｃＤＮＡ産物を表わすＩＰＴＧにより誘導されらポリペプチドを示している。

大腸菌抽出物を抗ＧＳＴ抗体を用いて試験したとき、約３３ｋＤａ及び４７ｋＤａのポリペプチドの反応がＩＰＴＧにより目立って促進された（図２Ｃ）。このことはこれらのバンドがＩＰＴＧ誘導性のＧＳＴ融合タンパク質であることを示している。４７ｋＤａは予想される融合タンパク質の大きさ（ｐＧＥＸ−４ＴにコードされたＧＳＴ（２５ｋＤａ）とアミノ末端が削除されたＳＬＣ２Ａ１タンパク質（２２ｋＤＡ））とほぼ一致している。このポリペプチドはまた、＃２０の患者（Ｐ＃２０）の血清にも観察されたが、健常者＃１（ＨＤ＃１）の血清には見られなかった（図２Ａ及びＢ）。対照のポリペプチドは患者＃２０と健常者＃１のどちらにも反応しなかった。これらの結果は、Ｐ＃２０の血清は陽性であり、ＨＤ＃１の血清は陰性であることを示している。

（３）細菌で発現させたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ＳＬＣ２Ａ１融合タンパク質を用いたＥＬＩＳＡ
ｓ−ＳＬＣ２Ａ１抗体のレベルを分析するため、組換えタンパク質を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施した。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＳＬＣ２Ａ１融合タンパク質はＩＰＴＧで処理することにより誘導され、上記（１）のようにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼによってアフィニティー精製を行った。

ＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈調製した抗原（ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＳＬＣ２Ａ１）５０μＬをマイクロタイタープレートのウエルに添加し、室温で一晩インキュベートした。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で４回洗浄し、１０％のウシ胎児血清を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＦＣＳ）を加え、室温で１時間インキュベートしてブロッキングした。さらにプレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ＰＢＳ−ＦＣＳで１／１００に希釈した血清５０μＬを加えて１時間インキュベートした。マイクロプレートのウエルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、結合したＩｇＧ抗体をペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearchLaboratories, West Grove, PA）で１時間インキュベートし、洗浄した後、０．０２％（ｖ／ｖ）Ｈ_２Ｏ_２を含むクエン酸・リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解したペルオキシダーゼの基質（オルトフェニレンジアミン、０．４ｍｇ／ｍＬ）で検出した。反応は３０μＬの２２％硫酸で停止した。波長４９０ｎｍにおける吸光度はマイクロプレートリーダー（Emax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を用いて測定した。

結果を図３に示す。対照のＧＳＴに対する反応レベルは各血清サンプルのＧＳＴ−ＳＬＣ２Ａ１融合タンパク質に対する反応から差し引いた。図３におけるボックスプロットは、１０、２５、５０（太い平行線は中央値である）、７５、及び９０パーセンタイルを示す。ｐ値はマンホイットニー検定で算出し、それは患者と健常者におけるｓ−ＳＬＣ２Ａ１抗体レベルが０．００１未満であったことがわかった。

食道扁平上皮癌患者の抗体レベルの平均値（±ＳＤ）は２．８９２（±１．６６２）だった。これは健常者（１．５８８±０．９８２）に比べて有意に高かった（ｐ＜０．００１、図３）。

ｓ−ＳＬＣ２Ａ１抗体のレベルは健常者の平均値＋２ＳＤから設定した境界値３．５５２によって二つのグループに分類された。食道扁平上皮癌の患者の陽性率は２１％（１２／５７）であるのに対し、健常者では陽性はなかった。

次いで、ｓ−ＳＬＣ２Ａ１抗体の存在と患者の臨床病理学的特徴の関係を検討した。
（１）ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ抗原及びＳＣＣ抗原の測定
血清中の癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びＣＹＦＲＡ抗原濃度はEnzymun-Test CEA及びEnzymun-Test CYFRA21-1（ベーリンガーマンハイム、ドイツ、マンハイム）で測定した。血清中のＳＣＣ抗原はSCC Test（アボット、アメリカ）で測定した。それぞれのカットオフ値はメーカーの使用説明書に従い、ＣＥＡでは４．６ｎｇ／ｍＬ、ＣＹＦＲＡでは２．５６ｎｇ／ｍＬ、ＳＣＣでは１．５ｎｇ／ｍＬとした。このカットオフ値での特異性は９５％であった（Shimada H, et al., Surgery 133: 486-494, 2003；Shimada H, Nabeya Y, et al., J Am Coll Surg 196: 573-578, 2003）。

（２）統計的解析
生存率はすべての死亡例を考慮し、カプラン−メイヤーの積極限法を用いて計算した。グループ間の生存率の差はログランク検定を用いて決定した。フィッシャーの正確確率検定とマン・ホイットニーＵテストは二つのグループの有意差を決定するのに用いられた。すべての統計学的分析はWindows用のStat view 5.01J program（SAS, Institute Inc.）を用いて行い、０．０５未満のＰ値は統計的に意味がないものとみなした。

解析結果を表１、図４及び５に示す。

図４は、ｓ−ＳＬＣ２Ａ１抗体による血清マーカーの組み合わせアッセイの陽性率を示す。図４における灰色のボックスは慣用の血清マーカーの陽性率を示す。黒色のボックスはｓ−ＳＬＣ２Ａ１抗体と組み合わせて用いた慣用の血清マーカーの陽性率（それぞれ３２％、３７％及び４７％）を示す。また図５は、ｓ−ＳＬＣ２Ａ１抗体の検出に関して、食道ＳＣＣの陽性症例及び陰性症例のカプラン−マイヤー生存曲線を示す。ログランク検定においては、２つの曲線に有意差は見とめられなかった。

以上の結果において、ｓ−ＳＬＣ２Ａ１抗体の存在と発症位置や腫瘍深達度、ＴＮＭファクターのような臨床病理学的変数の間に相関はなかった。ｓ−ＳＬＣ２Ａ１抗体の存在と他の血清マーカーの陽性率の間に関連がなかったことから、従来の血清マーカーとｓ−ＳＬＣ２Ａ１抗体を組み合わせて用いることによって、高い陽性率を示すことが明らかになった（それぞれ３２％、３７％及び４７％、図４参照）。陽性の患者が陰性の患者よりも良い生存率を示したにも係わらず、その差は統計学的には有意ではなかった（図５参照）。

本発明に係る食道癌診断キットにより、ヒト食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体を検出することで、食道癌を高精度で診断することができる。また、該ヒト食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体は既存の腫瘍マーカーと交差することがないため、これらを併用することによりさらに高精度で食道癌を診断することが可能となる。従って、本食道癌診断キットは食道癌の早期診断に有用である。

組換えＳＬＣ２Ａ１タンパク質の精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 食道ＳＣＣ患者における血清抗体によるＳＬＣ２Ａ１の認識を示す。 ｓ−ＳＬＣ２Ａ１抗体のレベルを精製ＧＳＴ−ＳＬＣ２Ａ１タンパク質及び対照ＧＳＴタンパク質を用いたＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す。 ｓ−ＳＬＣ２Ａ１抗体による血清マーカーの組み合わせアッセイの陽性率を示す。 ｓ−ＳＬＣ２Ａ１抗体の検出に関して、食道ＳＣＣの陽性症例及び陰性症例のカプラン−マイヤー生存曲線を示す。

Claims (7)

1. 被験者に由来するサンプル中の、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒト食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体の存在を検出するための手段を含むことを特徴とする食道癌診断キット。
2. 被験者に由来するサンプル中の、配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるヒト食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体の存在を検出するための手段を含むことを特徴とする食道癌診断キット。
3. ヒト食道癌抗原ポリペプチドに対する抗体の存在を検出するための手段が該食道癌抗原ポリペプチド又はその部分ペプチドである、請求項１又は２記載の食道癌診断キット。
4. 食道癌が、食道扁平上皮癌（ＳＣＣ）、腺癌、腺扁平上皮癌、腺様のう胞癌、及び未分化癌からなる群より選択されるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の食道癌診断キット。
5. サンプルが、血清、血液、血液細胞及び組織からなる群より選択されるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の食道癌診断キット。
6. さらに、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、サイトケラチン１９フラグメント抗原（ＣＹＦＲＡ）及び扁平上皮癌関連抗原（ＳＣＣ−Ａｇ）からなる群より選択される抗原ポリペプチドの存在を検出するための手段を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の食道癌診断キット。
7. 陽性率２０％以上で食道癌を診断することができる、請求項６記載の食道癌診断キット。

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