JP5283085B2 - 癌診断キットおよび癌診断方法 - Google Patents
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Description
本発明は、新規な癌診断技術に関するものであり、より詳細には、ＣＣＤＣ６２の発現または抗ＣＣＤＣ６２抗体の存在を指標とする癌診断キットおよび癌診断方法に関するものである。
癌に対する効果的な検査法、診断法および治療法を確立するためには、対象となる癌に高頻度で発現しかつ抗原性が強い癌抗原を見出すことが必要である。しかし、消化器癌、特に胃癌、大腸癌には、検査、診断あるいは治療に有用な癌抗原が少ない。それゆえ、消化器癌の検査、診断あるいは治療に有用な癌抗原を開発することは極めて重要である。
ヒト癌の検査、診断あるいは治療には、副作用の観点から、種々の癌において発現しているが、正常組織では精巣に限局している癌・精巣抗原（Ｃａｎｃｅｒ−Ｔｅｓｔｉｓ抗原、以下「ＣＴ抗原」と記す）が最も有用と考えられている。現在までに、約４０個のＣＴ抗原が同定、報告されている。しかしながら、これらのＣＴ抗原のすべてが癌患者に対して強い免疫原性を有しているわけではなく、癌の診断、検査のマーカー、あるいは癌治療に有望なＣＴ抗原は限られている。
現在報告されている代表的なＣＴ抗原としては、ＭＡＧＥ（非特許文献１参照）、ＳＳＸ（非特許文献２参照）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（非特許文献３参照）が挙げられる。ＭＡＧＥおよびＮＹ−ＥＳＯ−１は欧米を中心に臨床応用され、一定の効果が得られた例もある（例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１の臨床応用については非特許文献４参照）。このように、癌治療等への応用に現在最も有望とされているものはＮＹ−ＥＳＯ−１といえる。
van der Bruggen P, Traversari C, Chomez P, Lurquin C, De Plaen E, van den Eynde B, Knuth A, Boon T.A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science 254: 1643-1647, 1991. Gure AO, Tureci O, Sahin U, Tsang S, Scanlan MJ, Jager E, Knuth A, Pfreundschuh M, Old LJ, Chen YT. SSX: a multigene family with several members transcribed in normal testis and human cancer. Int. J. Cancer 72: 965-971, 1997. Chen YT, Scanlan, MJ, Sahin U, Tureci O, Gure AO, Tsang S, Williamson B, Stockert E, Pfreundschuh M, Old LJ. A testicular antigen aberrantly expressed in human cancers detected by autologous antibody screening. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1914-1918, 1997. Jager E, Gnjatic S, Nagata Y, Stockert E, Jager D, Karbach J, Neumann A, Rieckenberg J, Chen YT, Ritter G, Hoffman E, Arand M, Old LJ, Knuth A. Induction of primary NY-ESO-1 immunity: CD8+ T lymphocyte and antibody responses in peptide-vaccinated patients with NY-ESO-1+ cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 12198-12203, 2000. Stockert E, Jager E, Chen YT, Scanlan MJ, Gout I, Karbach J, Arand M, Knuth A, Old LJ. A survey of the humoral immune response of cancer patients to a panel of human tumor antigens. J. Exp. Med. 187: 1349-1354, 1998. Kurashige T, Noguchi Y, Saika T, Ono T, Nagata Y, Jungbluth AA, Ritter G, Chen YT, Stockert E, Tsushima T, Kumon H, Old LJ, Nakayama E. NY-ESO-1 expression and immunogenicity associated with transitional cell carcinoma: correlation with tumor grade. Cancer Res. 61: 4671-4674, 2001. Nakada T, Noguchi Y, Sato S, Ono T, Saika T, Kurashige T, Gnjatic S, Ritter G, Chen YT, Stockert E, Nasu Y, Tsushima T, Kumon H, Old LJ, Nakayama E. NY-ESO-1 mRNA expression and immunogenicity in advanced prostate cancer. Cancer Immunity 3: 10, 2003. Sugita Y, Wada S, Fujita S, Nakata T, Sato S, Noguchi Y, Jungbluth AA, Yamaguchi M, Chen YT, Stockert E, Gnjatic S, Williamson B, Scanlan MJ, Ono T, Sakita I, Yasui M, Miyoshi Y, Tamaki Y, Matsuura N, Noguchi S, Old LJ, Nakayama E, Monden M. NY-ESO-1 expression and immunogenicity in malignant and benign breast tumors.Cancer Res. 64: 2199-2204, 2004. Fujita S, Wada H, Jungbluth AA. Sato S, Nakata T, Noguchi Y, Doki Y, Yasui M, Sugita Y, Yasuda T, Yano M, Ono T, Chen YT, Higashiyama M, Gnjatic S, Old LJ, Nakayama E, Monden M. NY-ESO-1 expression and immunogenicity in esophageal cancer.Clin. Cancer Res. 10: 6551-6558, 2004. Nakamura, S, Nouso K, Noguchi Y, Higashi T, Ono T, Jungbluth AA, Chen YT, Old LJ, Nakayama E, Shiratori Y. Expression and immunogenicity of NY-ESO-1 in hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol. Hepatol. 21: 1281-1285, 2006.
van der Bruggen P, Traversari C, Chomez P, Lurquin C, De Plaen E, van den Eynde B, Knuth A, Boon T.A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science 254: 1643-1647, 1991. Gure AO, Tureci O, Sahin U, Tsang S, Scanlan MJ, Jager E, Knuth A, Pfreundschuh M, Old LJ, Chen YT. SSX: a multigene family with several members transcribed in normal testis and human cancer. Int. J. Cancer 72: 965-971, 1997. Chen YT, Scanlan, MJ, Sahin U, Tureci O, Gure AO, Tsang S, Williamson B, Stockert E, Pfreundschuh M, Old LJ. A testicular antigen aberrantly expressed in human cancers detected by autologous antibody screening. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1914-1918, 1997. Jager E, Gnjatic S, Nagata Y, Stockert E, Jager D, Karbach J, Neumann A, Rieckenberg J, Chen YT, Ritter G, Hoffman E, Arand M, Old LJ, Knuth A. Induction of primary NY-ESO-1 immunity: CD8+ T lymphocyte and antibody responses in peptide-vaccinated patients with NY-ESO-1+ cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 12198-12203, 2000. Stockert E, Jager E, Chen YT, Scanlan MJ, Gout I, Karbach J, Arand M, Knuth A, Old LJ. A survey of the humoral immune response of cancer patients to a panel of human tumor antigens. J. Exp. Med. 187: 1349-1354, 1998. Kurashige T, Noguchi Y, Saika T, Ono T, Nagata Y, Jungbluth AA, Ritter G, Chen YT, Stockert E, Tsushima T, Kumon H, Old LJ, Nakayama E. NY-ESO-1 expression and immunogenicity associated with transitional cell carcinoma: correlation with tumor grade. Cancer Res. 61: 4671-4674, 2001. Nakada T, Noguchi Y, Sato S, Ono T, Saika T, Kurashige T, Gnjatic S, Ritter G, Chen YT, Stockert E, Nasu Y, Tsushima T, Kumon H, Old LJ, Nakayama E. NY-ESO-1 mRNA expression and immunogenicity in advanced prostate cancer. Cancer Immunity 3: 10, 2003. Sugita Y, Wada S, Fujita S, Nakata T, Sato S, Noguchi Y, Jungbluth AA, Yamaguchi M, Chen YT, Stockert E, Gnjatic S, Williamson B, Scanlan MJ, Ono T, Sakita I, Yasui M, Miyoshi Y, Tamaki Y, Matsuura N, Noguchi S, Old LJ, Nakayama E, Monden M. NY-ESO-1 expression and immunogenicity in malignant and benign breast tumors.Cancer Res. 64: 2199-2204, 2004. Fujita S, Wada H, Jungbluth AA. Sato S, Nakata T, Noguchi Y, Doki Y, Yasui M, Sugita Y, Yasuda T, Yano M, Ono T, Chen YT, Higashiyama M, Gnjatic S, Old LJ, Nakayama E, Monden M. NY-ESO-1 expression and immunogenicity in esophageal cancer.Clin. Cancer Res. 10: 6551-6558, 2004. Nakamura, S, Nouso K, Noguchi Y, Higashi T, Ono T, Jungbluth AA, Chen YT, Old LJ, Nakayama E, Shiratori Y. Expression and immunogenicity of NY-ESO-1 in hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol. Hepatol. 21: 1281-1285, 2006.
しかし、本発明者らが、様々な上皮系腫瘍の患者についてＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体産生能を調べたところ、膀胱癌で７％（９／１２４、非特許文献６参照）、前立腺癌で４．６％（１０／２１８、非特許文献７参照）、乳癌で１．６％（１／６２、非特許文献８参照）、食道癌で３．９％（２／５１、非特許文献９参照）、肝臓癌で２．２％（２／９２、非特許文献１０参照）であり、何れの癌種においても抗体産生能がそれほど高くない。このように、過去に報告されているＣＴ抗原は、上皮系腫瘍患者の血清中に抗体が存在する頻度が極めて低い。
また、過去に報告されているＣＴ抗原が胃癌や大腸癌などの消化器癌において発現している例はまれであり、しかも消化器癌患者における抗体産生の頻度もきわめて少ない。例えば、大腸癌患者のＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ、ＳＳＸに対する抗体産生能は何れも０％であることが報告されている（非特許文献５参照）。また、本発明者らが５８例の大腸癌患者血清を用いて調べたＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体産生能は０％であった（未発表）。さらに、本発明者らの胃癌患者血清を用いた予備的解析においても、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体を証明できていない。
このように、胃癌や大腸癌などの消化器系癌を含む上皮系腫瘍の診断に有用な癌抗原を見出すことは容易ではなく、それゆえ消化器系癌の診断に有用な癌抗原の開発が非常に強く望まれている。
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、消化器癌を始めとする上皮系腫瘍の検査、診断あるいは治療に有用な癌抗原（好ましくはＣＴ抗原）を用いる新規な癌診断技術を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために、正常精巣由来のｃＤＮＡライブラリーと胃癌患者血清とを用いたＳＥＲＥＸ（serological analysis of cancer antigens by recombinant cDNA expression cloning）法を実施し、陽性クローン中のＣＣＤＣ６２がＣＴ抗原であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明に係るキットは、癌を診断するためのキットであって、配列番号１もしくは３に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。
また、本発明に係るキットは、癌を診断するためのキットであって、配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドを備えていることを特徴としている。
また、本発明に係るキットは、癌を診断するためのキットであって、配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体を備えていることを特徴としている。
上記本発明に係るキットは、上皮系腫瘍または皮膚癌の診断に用いられることが好ましく、胃癌、大腸癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌、腎癌、前立腺癌および悪性黒色腫から選択される少なくとも１種の診断に用いられることがより好ましい。
本発明に係る癌診断方法は、配列番号１もしくは３に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドが被験体由来の試料中に存在するレベルを測定するポリヌクレオチド測定工程を包含することを特徴としている。
また、本発明に係る癌診断方法は、配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドが被験体由来の試料中に存在するレベルを測定するポリペプチド測定工程を包含することを特徴としている。
また、本発明に係る癌診断方法は、配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体が被験体由来の試料中に存在するレベルを測定する抗体測定工程を包含することを特徴としている。
上記本発明に係る癌診断方法は、上皮系腫瘍または皮膚癌の診断に用いられることが好ましく、胃癌、大腸癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌、腎癌、前立腺癌および悪性黒色腫から選択される少なくとも１種の診断に用いられることがより好ましい。
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。
本発明者らは、特定の胃癌患者血清を用いて、正常精巣由来のｃＤＮＡライブラリーに対するＳＥＲＥＸ法を実施した。その結果、陽性クローンがＣＣＤＣ６２発現クローンであること、ならびに胃癌患者の血清中に抗ＣＣＤＣ６２抗体が存在することを見出した。すなわち、ＣＣＤＣ６２が胃癌患者における癌抗原であることを見出した。さらに、ＣＣＤＣ６２の発現解析を行い、ＣＣＤＣ６２がヒト正常組織では精巣のみに強く発現していること、一方、癌組織および癌細胞株において発現が認められることを確認した。これらの知見に基づいて、ＣＴ抗原であるＣＣＤＣ６２を用いる本発明を完成させるに至った。
ＳＥＲＥＸ（serological analysis of cancer antigens by recombinant cDNA expression cloning）法は、患者血清中に存在する抗体が認識する抗原遺伝子を、癌組織由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーの中から同定する方法であり（Sahin U, Tureci O, Schmitt H, Cochlovius B, Johannes T, Schmits R, Stenner F, Luo G, Schobert I, Pfreundschuh M. Human neoplasms elicit multiple specific immune responses in the autologous host. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Dec 5;92(25):11810-3.）、癌抗原のスクリーニング方法として優れていることが知られている。ただし、本発明は、自己の癌組織由来のｃＤＮＡライブラリーではなく正常精巣由来のｃＤＮＡライブラリーを用いることによって初めて成し得たものである。
以上のように、ヒトのＣＣＤＣ６２の配列は知られているが、ＣＣＤＣ６２について、疾患との関連性について何ら報告されていない。ＣＣＤＣ６２の癌での発現および癌患者血清中の抗ＣＣＤＣ６２抗体の存在は、本発明者らが初めて見出したものである。
配列番号１には、ヒトＣＣＤＣ６２遺伝子のtranscript variant 1の塩基配列が示されており、配列番号２には、ヒトのＣＣＤＣ６２遺伝子のtranscript variant 1によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列が示されている。また、配列番号３には、ヒトＣＣＤＣ６２遺伝子のtranscript variant 2の塩基配列が示されており、配列番号４には、ヒトのＣＣＤＣ６２遺伝子のtranscript variant 2によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列が示されている。なお、ヒトＣＣＤＣ６２遺伝子の塩基配列は、transcript variant 1がNM_032573として、transcript variant 2がNM_201435として、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている。
〔１．癌診断方法〕
本発明は、癌診断方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る癌診断方法は、被験体由来の試料におけるＣＣＤＣ６２の発現レベルを測定し、このレベルをコントロール（例えば、正常レベル）と比較することにより癌を診断する方法である。すなわち、本実施形態に係る癌診断方法は、ポリヌクレオチド測定工程またはポリペプチド測定工程を包含している。ＣＣＤＣ６２の発現レベルは、当該分野において公知の手法を用いて転写産物（ｍＲＮＡ）量または翻訳産物（タンパク質）量を測定することにより決定することができる。
本発明は、癌診断方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る癌診断方法は、被験体由来の試料におけるＣＣＤＣ６２の発現レベルを測定し、このレベルをコントロール（例えば、正常レベル）と比較することにより癌を診断する方法である。すなわち、本実施形態に係る癌診断方法は、ポリヌクレオチド測定工程またはポリペプチド測定工程を包含している。ＣＣＤＣ６２の発現レベルは、当該分野において公知の手法を用いて転写産物（ｍＲＮＡ）量または翻訳産物（タンパク質）量を測定することにより決定することができる。
また、別の実施形態において、本発明に係る癌診断方法は、被験体由来の試料における抗ＣＣＤＣ６２抗体のレベルを測定し、このレベルをコントロール（例えば、正常レベル）と比較することにより癌を診断する方法である。すなわち、本実施形態に係る癌診断方法は、抗体測定工程を包含している。抗ＣＣＤＣ６２抗体のレベルは被験体由来の血清における抗ＣＣＤＣ６２抗体のレベルを測定することにより決定することができる。
本発明の癌診断方法の適用対象となる被験体は特に限定されるものではなく広く動物一般を含むが、ヒトであることが好ましい。被験体がヒトである場合、癌患者や癌を有する疑いのある患者のみでなく、健常人も被験体となり得る。
本発明の癌診断方法に用いられる被験体由来の試料としては、被験体から得られたもの（すなわち、被験体から分離されたもの）であれば特に限定されない。例えば、血液（血清、血漿、血球等）、尿、糞便、喀痰、腹水、腹腔洗浄液、生検組織、外科的に切除された検体などを挙げることができる。
正常レベルとは、正常健康個体（健常人）におけるＣＣＤＣ６２のｍＲＮＡの発現レベル、ＣＣＤＣ６２のタンパク質の発現レベル、あるいは抗ＣＣＤＣ６２抗体のレベルを意味する。正常レベルは、比較すべき被験体由来の試料（すなわち、本発明のポリヌクレオチド測定工程、ポリペプチド測定工程または抗体測定工程において用いられる試料）と同一の正常細胞、組織、体液を試料として用いて測定されたものであることが好ましい。また、正常レベルは正常な健康個体からなる集団の平均を用いることがより好ましい。
本明細書中において使用される場合、「診断」は、「判定」だけでなく「検査」、「検出」および「予測」も包含される。すなわち、癌を診断するとは、被験体が癌を有しているか否かの判定または予測、進行度合いの判定または予測、治療効果の判定または予測を行うことが意図され、より好ましくは、被験体が癌を有しているか否かの検査／検出／予測、進行度合いの検査／検出／予測、治療効果の検査／検出／予測を行うことが意図される。
また、診断の対象となる癌の種類は特に限定されるものではないが、上皮系腫瘍または皮膚癌であることが好ましい。上皮系腫瘍としては、例えば、胃癌、大腸癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、卵巣上皮癌、前立腺癌などを挙げることができる。また、皮膚癌としては、悪性黒色腫を挙げることができる。
（１）ｍＲＮＡレベルを指標とする癌診断方法
一実施形態において、本発明に係る癌診断方法は、被験体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、配列番号１もしくは３に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドが被験体由来の試料中に存在するレベルを測定するポリヌクレオチド測定工程を包含するものであればよい。なお、ポリヌクレオチドにはＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれる。
一実施形態において、本発明に係る癌診断方法は、被験体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、配列番号１もしくは３に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドが被験体由来の試料中に存在するレベルを測定するポリヌクレオチド測定工程を包含するものであればよい。なお、ポリヌクレオチドにはＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれる。
本実施形態では、ポリヌクレオチド測定工程において、ＣＣＤＣ６２のｍＲＮＡレベルを測定すればよい。
ｍＲＮＡレベルを測定する方法としては、特定のｍＲＮＡレベルを測定できる方法であれば特に限定されず、公知の方法から適宜選択して用いられる。例えば、ＣＣＤＣ６２のｍＲＮＡまたはこれらのｃＤＮＡの塩基配列あるいはその相補配列の一部からなるポリヌクレオチドであって、ＣＣＤＣ６２のいずれかのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに部位特異的に結合（ハイブリダイズ）するポリヌクレオチドを含むプライマーやプローブを用いた方法が挙げられる。上記プライマーやプローブは、ＣＣＤＣ６２のｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡと部位特異的塩基対を形成するものであれば、ｍＲＮＡを測定／検出するための様々な修飾がされたものであってよい。
上記プライマーとして使用するポリヌクレオチドは、配列番号１もしくは３に示される塩基配列またはその相補配列に基づいて設計されるものであれば限定されない。例えば、配列番号５〜８のいずれかに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。これらのポリヌクレオチドは、本発明者らが実際にＲＴ−ＰＣＲを実施した際に用いたプライマーであり、ＣＣＤＣ６２のｃＤＮＡを特異的に増幅させるものであることが実証されている。上記プローブとして使用するポリヌクレオチドは、配列番号１もしくは３に示される塩基配列に基づいて設計されるものであれば限定されない。なお、目的のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を特異的に増幅させるプライマーとして利用可能なポリヌクレオチドは当該ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を特異的に検出するためのプローブとして使用可能であることは当該分野において周知である。
上述のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに部位特異的に結合するポリヌクレオチドを含むプライマーやプローブを用いてｍＲＮＡを測定する公知の方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、コンペティティブＰＣＲ法、ｉｎ Ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法、ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法などを挙げることができる。
例えば、上記ＲＴ−ＰＣＲ法は、試料から調製したトータルＲＮＡやｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型に目的領域をＰＣＲで増幅する方法である。さらに、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、ｃＤＮＡを鋳型に目的領域をＰＣＲ増幅する際に、リアルタイムモニタリング用試薬を用いて増幅産物の生成過程をリアルタイムでモニタリングし、解析する方法である。リアルタイムモニタリング試薬としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）Ｇｒｅｅｎや、ＴａｑＭａｎ（登録商標：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）プローブ等が挙げられる。
例えば、上記ＤＮＡアレイ法は、支持体上にＣＣＤＣ６２のｃＤＮＡまたはそのフラグメントを固定化し、試料から調製したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとインキュベートする。この際、上記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを蛍光標識等することにより、支持体上に固定化したＤＮＡと試料から調製したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出し、試料中のｍＲＮＡレベルを測定することができる。
上記比較工程においては、ポリヌクレオチド測定工程で測定した試料中のＣＣＤＣ６２のｍＲＮＡレベルを正常レベルと比較すればよい。正常レベルは、上述のように、比較すべき被験体由来の試料（すなわち、本実施形態のポリヌクレオチド測定工程において用いられる試料）と同一の正常細胞、組織、体液を試料として用いて、同一の方法で測定されたものであることが好ましい。正常レベルは、正常な健康個体に由来する試料をポリヌクレオチド測定工程と同時に測定されることにより得られてもよく、背景データとして蓄積されているデータが用いられてもよい。被験体由来の試料におけるｍＲＮＡレベルが正常レベルより高い場合に、被験体は癌を有していると判定することが可能である。正常レベルより高い場合とは、好ましくは２倍高いレベルであり、より好ましくは３倍高いレベルである。
（２）タンパク質レベルを指標とする癌診断方法
一実施形態において、本発明に係る癌診断方法は、被験体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドが被験体由来の試料中に存在するレベルを測定するポリペプチド測定工程を包含するものであればよい。
一実施形態において、本発明に係る癌診断方法は、被験体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドが被験体由来の試料中に存在するレベルを測定するポリペプチド測定工程を包含するものであればよい。
本実施形態では、ポリペプチド測定工程において、ＣＣＤＣ６２タンパク質のレベルを測定すればよい。
タンパク質の発現レベルを測定する方法としては、特定のタンパク質レベルを測定できる方法であれば特に限定されず、公知の方法から適宜選択して用いられる。例えば、ＣＣＤＣ６２タンパク質に特異的に結合する抗体を使用する方法を挙げることができる。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等）でもよい。
抗体を用いてタンパク質レベルを測定する公知の方法としては、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫検定法）、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、免疫組織化学法、抗体アレイ法などを挙げることができる。これらの中でも、より感度がよく、簡便という点から、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。
上記比較工程においては、ポリペプチド測定工程で測定した試料中のＣＣＤＣ６２タンパク質のレベルを正常レベルと比較すればよい。正常レベルは、上述のように、比較すべき被験体由来の試料（すなわち、本実施形態のポリペプチド測定工程において用いられる試料）と同一の正常細胞、組織、体液を試料として用いて、同一の方法で測定されたものであることが好ましい。正常レベルは、正常な健康個体に由来する試料をポリペプチド測定工程と同時に測定されることにより得られてもよく、背景データとして蓄積されているデータが用いられてもよい。被験体由来の試料におけるタンパク質レベルが正常レベルより高い場合に、被験体は癌を有していると判定することが可能である。正常レベルより高い場合とは、好ましくは２倍高いレベルであり、より好ましくは３倍高いレベルである。
（３）抗体レベルを指標とする癌診断方法
一実施形態において、本発明に係る癌診断方法は、被験体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体が被験体由来の試料中に存在するレベルを測定する抗体測定工程を包含するものであればよい。
一実施形態において、本発明に係る癌診断方法は、被験体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体が被験体由来の試料中に存在するレベルを測定する抗体測定工程を包含するものであればよい。
本実施形態では、抗体測定工程において、抗ＣＣＤＣ６２抗体のレベルを測定すればよい。なお、抗ＣＣＤＣ６２抗体のレベルの測定に用いる試料は、血清であることが好ましいが、抗体レベルの測定が可能な試料であれば特に限定されない。
抗体のレベルを測定する方法としては、特定の抗原に対する抗体力価のレベルを測定する方法や、目的の抗体に対する抗体を用いる方法であれば特に限定されず、公知の方法から適宜選択して用いられる。例えば、抗原であるＣＣＤＣ６２タンパク質を用いたＥＬＩＳＡ法、タンパク質アレイを挙げることができる。抗体の力価測定に用いる抗原タンパク質は、生体試料から精製して取得することも可能であるが、組換えタンパク質として取得することが好ましい。組換えタンパク質は、ＣＣＤＣ６２遺伝子を挿入した発現ベクターを宿主に導入して発現させ、精製することにより取得することができる。
上記比較工程においては、抗体測定工程で測定した試料中の抗ＣＣＤＣ６２抗体のレベルを正常レベルと比較すればよい。正常レベルは、正常な健康個体に由来する試料（好ましくは血清）を抗体測定工程と同時に測定されることにより得られてもよく、背景データとして蓄積されているデータが用いられてもよい。被験体由来の試料における抗ＣＣＤＣ６２抗体のレベルが正常レベルより高い場合に、被験体は癌を有していると判定することが可能である。正常レベルより高い場合とは、好ましくは２倍高いレベルであり、より好ましくは３倍高いレベルである。
〔２．キット〕
本発明は、癌診断に用いられるキットを提供する。本発明に係るキットは、上述した診断法を実施するに必要な試薬または器具が備えられていればよい。本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは試薬または器具の各々を使用するための指示書が備えられている。本明細書中にてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に試薬などが内包されている状態が意図される。「指示書」は、紙またはその他の媒体に印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に記録されていてもよい。本発明に係るキットは、癌の診断に適用するために必要な試薬または器具があわせて備えられていてもよい。
〔２．キット〕
本発明は、癌診断に用いられるキットを提供する。本発明に係るキットは、上述した診断法を実施するに必要な試薬または器具が備えられていればよい。本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは試薬または器具の各々を使用するための指示書が備えられている。本明細書中にてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に試薬などが内包されている状態が意図される。「指示書」は、紙またはその他の媒体に印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に記録されていてもよい。本発明に係るキットは、癌の診断に適用するために必要な試薬または器具があわせて備えられていてもよい。
一実施形態において、本発明に係るキットは、上記ｍＲＮＡレベルを指標とする癌診断方法に適用され得るキットであり得る。本実施形態に係るキットは、被験体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、配列番号１もしくは３に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドを備えているものであればよい。配列番号１もしくは３に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、ＣＣＤＣ６２のｍＲＮＡを測定するために使用するプライマー、プローブを挙げることができる。本キットはＣＣＤＣ６２のｍＲＮＡ発現レベルの測定に好適に用いることができる。
本実施形態に係るキットは、ＣＣＤＣ６２のｍＲＮＡ測定用のＲＴ−ＰＣＲキットまたはＣＣＤＣ６２のｍＲＮＡ測定用のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲキットを構成することができる。また、ユーザーの選択によりＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの何れかを選択できるキットとすることもできる。この場合、本実施形態に係るキットは、ＣＣＤＣ６２のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅するためのプライマーセットを備えていればよく、当該プライマーセット以外のキットの構成品は特に限定されないが、例えば、組織または細胞からＲＮＡを調製するための試薬、逆転写酵素、逆転写反応に用いる緩衝液、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ用試薬、リアルタイムＰＣＲ用試薬、ＰＣＲ用チューブ、ＰＣＲ用プレートなどを備えていることが好ましい。
別の実施形態において、本発明に係るキットは、上記タンパク質レベルを指標とする癌診断方法に適用され得るキットであり得る。本実施形態に係るキットは、被験体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体を備えているものでもよい。本キットはＣＣＤＣ６２タンパク質のレベル測定に好適に用いることができる。
さらなる実施形態において、本発明に係るキットは、上記抗体レベルを指標とする癌診断方法に適用され得るキットであり得る。本実施形態に係るキットは、被験体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドを備えているものでもよい。この場合、本実施形態に係るキットは抗ＣＣＤＣ６２抗体の力価レベルの測定に好適に用いることができる。また、本実施形態に係るキットは、抗ＣＣＤＣ６２抗体に対する抗体を備えているものでもよい。このような抗体を作製する技術は当該分野において周知である。
本実施形態に係るキットはＥＬＩＳＡ用キットとして構成され得る。このようなキットには、ＣＣＤＣ６２タンパク質に特異的に結合する抗体あるいはＣＣＤＣ６２タンパク質が予めＥＬＩＳＡ用プレートに固定化（固相化）された状態でキットに含まれていることが好ましい。さらに、ＣＣＤＣ６２タンパク質に特異的に結合する抗体が固相化されたＥＬＩＳＡ用プレートとＣＣＤＣ６２タンパク質が固相化されたＥＬＩＳＡ用プレートとの両方を備えるキットであれば、ＣＣＤＣ６２タンパク質のレベルと抗ＣＣＤＣ６２抗体のレベルとの両方を測定できるキットとすることができる。
上記ＥＬＩＳＡ用プレート以外のキットの構成品は特に限定されないが、例えば、標識された二次抗体、発色用試薬、洗浄用緩衝液などを備えていることが好ましい。
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、核酸の抽出、切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定、等一般の遺伝子組換えに必要な方法は、特に記載のない限り、各操作に使用する市販の試薬、機器装置等に添付されている説明書や、実験書（例えば「Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd Ed（Sambrookら(2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press）」）に基本的に従った。
〔実施例１：ＳＥＲＥＸ法による胃癌患者血清中の抗体が認識する抗原の解析〕
ＳＥＲＥＸ法は、図１に概略を示したように、癌患者から摘出した癌組織から直接ｍＲＮＡを抽出し作製したｃＤＮＡ発現ライブラリーから、癌患者の血清を用いて癌抗原を検索する方法である。本実施例１では、胃癌の診断に有用な癌・精巣抗原を単離すべく、正常精巣由来のｃＤＮＡライブラリーと胃癌患者血清とを用いたＳＥＲＥＸ法を実施した。
ＳＥＲＥＸ法は、図１に概略を示したように、癌患者から摘出した癌組織から直接ｍＲＮＡを抽出し作製したｃＤＮＡ発現ライブラリーから、癌患者の血清を用いて癌抗原を検索する方法である。本実施例１では、胃癌の診断に有用な癌・精巣抗原を単離すべく、正常精巣由来のｃＤＮＡライブラリーと胃癌患者血清とを用いたＳＥＲＥＸ法を実施した。
（１）胃癌患者血清
原発巣および肝転移巣共に縮小傾向を示した胃腺癌患者から血清を得た。なお、この血清は、正常精巣から得たタンパク質画分と強く反応することを予め確認したものを選択した。血清をＴＢＳ（Tris-Buffered Saline）で１０倍に希釈した後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０／Ｙ１０８９のアフィニティーカラム（BioDynamics Lab Inc., Tokyo）を用いて抗バクテリア抗体（大腸菌およびファージに対する非特異的抗体）の吸収処理を行った。
原発巣および肝転移巣共に縮小傾向を示した胃腺癌患者から血清を得た。なお、この血清は、正常精巣から得たタンパク質画分と強く反応することを予め確認したものを選択した。血清をＴＢＳ（Tris-Buffered Saline）で１０倍に希釈した後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０／Ｙ１０８９のアフィニティーカラム（BioDynamics Lab Inc., Tokyo）を用いて抗バクテリア抗体（大腸菌およびファージに対する非特異的抗体）の吸収処理を行った。
（２）ｃＤＮＡ発現ライブラリーの作製
Quick Prep Micro mRNA purification kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA)を用いて、正常精巣Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA）からｍＲＮＡを精製した。５μｇのｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、γＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖｅｃｔｏｒ（Stratagene）に組み換えてファージにパッケージングし、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを作製した。
Quick Prep Micro mRNA purification kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA)を用いて、正常精巣Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA）からｍＲＮＡを精製した。５μｇのｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、γＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖｅｃｔｏｒ（Stratagene）に組み換えてファージにパッケージングし、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを作製した。
（３）正常精巣ｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニング
１５０ｍｍプレートあたり約４，０００個のファージを蒔き、６〜８時間培養した。ＩＰＴＧで誘導した蛋白質を直径１３５ｍｍニトロセルロースメンブラン（Schleicher & Schuell, Dassel, Germany）に転写した後、抗バクテリア抗体を吸収した胃癌患者血清（ＴＢＳで２００倍に希釈）とさらに１５時間反応させ、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pa., USA）で検出した。この時、抗体産生細胞に由来するＩｇＧクローンを除去するために、メンブランを予め二次抗体のみで処理した。陽性クローンを単離し、それぞれ直径８２ｍｍあるいは４７ｍｍのメンブランを用いて２次、３次スクリーニングを行い、単クローン化した。
１５０ｍｍプレートあたり約４，０００個のファージを蒔き、６〜８時間培養した。ＩＰＴＧで誘導した蛋白質を直径１３５ｍｍニトロセルロースメンブラン（Schleicher & Schuell, Dassel, Germany）に転写した後、抗バクテリア抗体を吸収した胃癌患者血清（ＴＢＳで２００倍に希釈）とさらに１５時間反応させ、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pa., USA）で検出した。この時、抗体産生細胞に由来するＩｇＧクローンを除去するために、メンブランを予め二次抗体のみで処理した。陽性クローンを単離し、それぞれ直径８２ｍｍあるいは４７ｍｍのメンブランを用いて２次、３次スクリーニングを行い、単クローン化した。
（４）インサートｃＤＮＡの塩基配列の決定
陽性クローンをｉｎ ｖｉｖｏエキシジョンによりｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドにした後、インサートｃＤＮＡの塩基配列を解析し（ABI PRISM R310 Genetic Analyzer; PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）、遺伝子データベース（http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）によるホモロジー検索を行った。
陽性クローンをｉｎ ｖｉｖｏエキシジョンによりｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドにした後、インサートｃＤＮＡの塩基配列を解析し（ABI PRISM R310 Genetic Analyzer; PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）、遺伝子データベース（http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）によるホモロジー検索を行った。
（５）結果
約２０万クローンをスクリーニングした結果、表１に示した５５個の陽性クローンを単離した。
約２０万クローンをスクリーニングした結果、表１に示した５５個の陽性クローンを単離した。
ホモロジー検索の結果、２３種類の遺伝子を同定した（ＯＹ−ＳＴ−１〜２３）。これらのうち、データベースによる正常組織発現の検索により、４種類の遺伝子は精巣特異的であった（表１）。他の１９種類の遺伝子については正常組織に広範囲に発現しているか、あるいは発現のデータは得られなかった。
精巣特異的に発現する遺伝子として、ＯＹ−ＳＴ−３（G kinase anchoring protein 1（ＧＫＡＰ１））が２クローン得られた。ＧＫＡＰ１については、本発明者らによって現在出願中である（現在未公開）。また、ＯＹ−ＳＴ−６（synaptonemal complex protein 1, SYCP1（SCP-1））が１クローン得られた。ＳＣＰ−１（ＯＹ−ＳＴ−６）はＳＥＲＥＸ法が開発された初期に発見された代表的ながん・精巣抗原（ＣＴ抗原）の一つであるが、その免疫原性は弱いことが知られている（Tureci, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998）。
ＯＹ−ＳＴ−１８は２クローン単離され、ホモロジー検索の結果、ＣＣＤＣ６２（coiled-coil domain containing 62）であったが、各クローンはそれぞれtranscript variant 1（CCDC62-1, NM_032573：配列番号１）およびtranscript variant 2（CCDC62-2, NM_201435：配列番号３）であった。なお、ＣＣＤＣ６２がヒト癌を含む疾患に関連するという報告はない。
〔実施例２：ＣＣＤＣ６２の発現解析〕
ＣＣＤＣ６２(variant 1)特異的プライマーとして、
C62-1-S（sense: 5'-TCCCCGGCAAGTGAGCTAAT-3'、配列番号５）
C62-1-AS（antisense: 5'-ATACATCCCCATTCCCGAGG-3'、配列番号６)
ＣＣＤＣ６２(variant 2)特異的プライマーとして、
C62-2-S（sense: 5'-AAGTCAGAGGTCCCAGAAGA-3'、配列番号７）
C62-2-AS（antisense: 5'-CTATGCAGGGGTTCTTTCTC-3'、配列番号８)
を、ＤＮＡ合成機で合成した。ヒト正常組織由来ｃＤＮＡ（MTC panel, BD Biosciences Clontech）および各種癌由来ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、遺伝子の発現を解析した。
ＣＣＤＣ６２(variant 1)特異的プライマーとして、
C62-1-S（sense: 5'-TCCCCGGCAAGTGAGCTAAT-3'、配列番号５）
C62-1-AS（antisense: 5'-ATACATCCCCATTCCCGAGG-3'、配列番号６)
ＣＣＤＣ６２(variant 2)特異的プライマーとして、
C62-2-S（sense: 5'-AAGTCAGAGGTCCCAGAAGA-3'、配列番号７）
C62-2-AS（antisense: 5'-CTATGCAGGGGTTCTTTCTC-3'、配列番号８)
を、ＤＮＡ合成機で合成した。ヒト正常組織由来ｃＤＮＡ（MTC panel, BD Biosciences Clontech）および各種癌由来ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、遺伝子の発現を解析した。
癌組織は、手術あるいは生検によって得られた組織の提供を受けた。なお、実施例１および２に用いた癌患者または健常人由来の試料は、すべて、あらかじめ担当医により口頭および文書で直接提供者に説明し、インフォームドコンセントを得たものについてのみ提供を受けた。癌患者または健常人由来の試料は匿名化を行い、個人情報は厳重に保護したうえで研究に用いた。本研究の内容およびインフォームドコンセントのための説明文書および同意文書については、岡山大学大学院医歯薬学研究科「ヒトゲノム・遺伝子解析研究」倫理委員会の承認を受けている。
癌細胞株として、１１種類の肺癌細胞株、８種類の悪性黒色腫細胞株、３種類の前立腺癌細胞株を用いた。悪性黒色腫細胞株については米国スローン・ケタリング癌研究所で樹立されたものであり、当該研究所から本発明者らが入手したものである。これら以外の細胞株は、癌研究に一般に用いられているものであり、通常、公知の細胞保存機関等から入手可能である。
癌組織および癌細胞株については、それぞれｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し（RNeasy; Qiagen, Hilden, Germany）、ＭＭＬＶ逆転写酵素とoligo(DT)15プライマーによりｃＤＮＡを合成した（Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads; Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK）。ＣＣＤＣ６２についてのＲＴ−ＰＣＲは、変性を９４℃で１分間、アニーリングを６０℃で１分間、および伸長を７２℃で１．５分間からなるサイクルを３５サイクル行った。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動で解析した。合成したｃＤＮＡについて同時にＧ３ＰＤＨ遺伝子の増幅を確認した。
ＣＣＤＣ６２−１ ｍＲＮＡおよびＣＣＤＣ６２−２ ｍＲＮＡについて、１４種類の正常組織における発現を、ＣＣＤＣ６２−１特異的プライマーまたはＣＣＤＣ６２−２特異的プライマーを用いて解析した。その結果、精巣にのみ強い発現が確認された（図２の（ａ））。また、ヒト正常組織におけるＣＤＣＣ６２遺伝子の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によって定量的に解析した。ｃＤＮＡは、２μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡよりランダムプライマーで合成した（High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits, Applied Biosystems, Foster City, CA）。ＣＣＤＣ６２特異的ＴａｑＭａｎプローブ（TaqMan Gene Expression Assays, Applied Biosystems）を用いてABI PRISM 7700 Sequence Detection System （Applied Biosystems）で定量的に解析した。用いたＴａｑＭａｎプローブはＣＣＤＣ６２の２種類のスプライスバリアント (ＣＣＤＣ６２−１およびＣＣＤＣ６２−２)に共通する配列に特異的なプローブである（AssayID: Hs00261486）。内在性コントロールとして、Ｇ３ＰＤＨを用いた（TaqMan Pre-Developed Assay Reagents, Applied Biosystems）。ＣＣＤＣ６２の発現は、キャリブレーターとして用いた正常精巣に対する発現の比として表した。精巣に強い発現が確認され、これは同様に解析した代表的なＣＴ抗原であるＮＹ−ＥＳＯ−１と同等の発現であった（図２の（ｂ））。
各種の癌組織におけるＣＣＤＣ６２−１ ｍＲＮＡおよびＣＣＤＣ６２−２ ｍＲＮＡの発現を解析した結果、ＣＣＤＣ６２−１の発現は認められなかった。ＣＣＤＣ６２−２について各種の癌組織における発現を、特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法で解析した結果を表２に示す。
ＣＣＤＣ６２−２ ｍＲＮＡは、口腔癌、食道癌、胃癌、乳癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌、腎癌に発現が観察された（図３）。特に、胃癌では８／１１７（７％）、肺癌では５／１９（２６％）、前立腺癌では３／９（３３％）の発現が確認された。また、肺癌および前立腺癌に由来する癌細胞株においても、発現が確認された。さらに、悪性黒色腫では３／８（３８％）の高発現が確認された。
〔実施例３：肺癌患者血清のＳＥＲＥＸ同定抗原に対する反応性〕
ＣＣＤＣ６２−１、ＣＣＤＣ６２−２、およびもう１種類の同定されたＣＴ抗原であるＧＫＡＰ１クローンと肺癌患者血清との反応性を、ファージプラークアッセイ法で解析した（図４）。
ＣＣＤＣ６２−１、ＣＣＤＣ６２−２、およびもう１種類の同定されたＣＴ抗原であるＧＫＡＰ１クローンと肺癌患者血清との反応性を、ファージプラークアッセイ法で解析した（図４）。
調べた２９人の肺癌患者血清のうち、４人がＣＣＤＣ６２−２に陽性であった。さらに、２人がＧＫＡＰ１に陽性であった。ＣＣＤＣ６２−１に対してはすべての患者血清が反応しなかった（表３）。また、これらの抗原は、調べた７人の健常人血清とは全く反応しなかった。
〔実施例４：癌患者のＣＣＤＣ６２−２タンパク質に対する液性免疫応答の解析〕
ＣＣＤＣ６２−２タンパク質のＣ−末端（アミノ酸残基３６６−６８４）コードするｃＤＮＡをｐＧＥＸ−６Ｐ−１発現ベクターに導入した。これを大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した。ＩＰＴＧで誘導して得られたＧＳＴ融合ＣＣＤＣ６２−２タンパク質を、ＧＳＴｒａｐ ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製した。
ＣＣＤＣ６２−２タンパク質のＣ−末端（アミノ酸残基３６６−６８４）コードするｃＤＮＡをｐＧＥＸ−６Ｐ−１発現ベクターに導入した。これを大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した。ＩＰＴＧで誘導して得られたＧＳＴ融合ＣＣＤＣ６２−２タンパク質を、ＧＳＴｒａｐ ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製した。
ＥＬＩＳＡ法により癌患者のＣＣＤＣ６２−２に対する液性免疫応答を解析した（図５の（ａ））。具体的には、ＧＳＴ融合組換えＣＣＤＣ６２−２タンパク質（１μｇ／ｍｌ）を９６ｗｅｌｌプレートに吸着させ（１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）、５％ ＦＣＳ／ＰＢＳで１時間ブロッキングした後、血清（１００μｌ）を加えて２時間反応させた。プレートを洗浄した後、パーオキシデース標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch）と１時間反応させた。基質（１，２−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｌｉｄｅ）で発色させた後、１９１人の癌患者血清および４１人の健常人血清について吸光度を測定した。抗体価を４００倍希釈血清で評価し、健常人のＯＤ値（４９０ｎｍ）の平均の４ＳＤ以上を陽性とした。その結果を表４に示す。
１９１人中１３人（６．８％）が抗体陽性であった。健常人は、調べた４１人すべて陰性であった。胃癌患者では１０４人中６人（５．８％）が、肺癌患者では７６人中５人（６．６％）、大腸癌患者では１１人中２人（１８％）が抗体陽性であった。
胃癌及び肺癌患者血清についてウェスタンブロット法により検討した（図５の（ｂ））。具体的には、組換えＣＣＤＣ６２−２タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後に、ニトロセルロース膜上に転写し、１００倍に希釈したＥＬＩＳＡ陽性および陰性癌患者血清と反応させた。反応後のタンパク質を、パーオキシデース標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出することによって、血清中抗体がＣＣＤＣ６２−２タンパク質に特異的であるかを解析した。その結果、ＥＬＩＳＡ陽性患者血清中の抗体はＣＣＤＣ６２−２タンパク質に特異的であることが確認された。
本発明により、胃癌、大腸癌などの消化器癌の診断に有効なＣＴ抗原を用いた新規な癌診断キットおよび癌診断方法を提供することができる。当該ＣＴ抗原は、消化器癌に限定されず、乳癌、頭頸部癌、肺癌、腎癌、前立腺癌などの他の上皮系腫瘍や、悪性黒色腫などの皮膚癌の診断にも有効に利用することができる。
発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内において、いろいろと変更して実施することができるものである。
本発明は、癌の検査または診断（癌の存在の有無、進行度合の決定、または癌患者の予後判定など）、癌予防または癌治療（例えば癌ワクチン）などに用いるための、癌抗原遺伝子、ベクター、タンパク質、抗体、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）などのパネルを提供することができる。これらを単独でまたは組み合わせて用いることにより、あるいはキットとして用いることにより、癌の悪性度、癌の組織型、治療効果または予後の判定が可能になる。ＣＣＤＣ６２を用いることにより、精度の高い癌の検査または診断を行うことができる。さらに、本発明者らがすでに同定しているＣＴ抗原（例えば、ＯＹ−ＴＥＳ−１、ＲＦＸ４、ＡＫＡＰ３、ＸＡＧＥ−１、ＧＫＡＰ１）と組み合わせることにより、さらに広範な癌種に応用し得る。
本発明は癌の診断に用いるものであり、癌を対象とした医学、医療の発展に寄与するだけでなく、臨床検査薬産業、試薬産業、医療機器産業等において利用することができる。
Claims (15)
- 配列番号３に示される塩基配列の第２１４６〜３０４４位の部分配列を含んでいるプライマーを備えており、該プライマーは、配列番号１に示される塩基配列の第２１４６〜２４８１位の部分配列からなるオリゴヌクレオチドではない、癌を診断するためのキット。
- 配列番号４に示されるアミノ酸配列の部分配列からなりかつ配列番号４に示されるアミノ酸配列の第６６８〜６８４位を含むポリペプチドを備えており、該ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドではない、癌を診断するためのキット。
- ＣＣＤＣ６２−２タンパク質と特異的に結合するがＣＣＤＣ６２−１タンパク質と結合しない抗体を備えている、癌を診断するためのキット。
- 上皮系腫瘍または皮膚癌の診断に用いられることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のキット。
- 胃癌、大腸癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌、腎癌、前立腺癌および悪性黒色腫から選択される少なくとも１種の診断に用いられることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のキット。
- 請求項１に記載のキットを用いて、配列番号３に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドが被験体由来の試料中に存在するレベルを測定するポリヌクレオチド測定工程を包含することを特徴とする癌診断を補助するデータを提供する方法。
- 請求項３に記載のキットを用いて、配列番号４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドが被験体由来の試料中に存在するレベルを測定するポリペプチド測定工程を包含することを特徴とする癌診断を補助するデータを提供する方法。
- 請求項２に記載のキットを用いて、被験体由来の試料において、配列番号４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体のレベルを測定する抗体測定工程を包含することを特徴とする癌診断を補助するデータを提供する方法。
- 上皮系腫瘍または皮膚癌の診断に用いられることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の癌診断を補助するデータを提供する方法。
- 胃癌、大腸癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌、腎癌、前立腺癌および悪性黒色腫から選択される少なくとも１種の診断に用いられることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の癌診断を補助するデータを提供する方法。
- 上記プライマーが、配列番号７および８のいずれかに示される塩基配列からなる、請求項１に記載のキット。
- 上記ポリペプチドが、配列番号４に示されるアミノ酸配列の第３６６〜６８４位からなる、請求項２に記載のキット。
- 上記抗体が、配列番号４に示されるアミノ酸配列の第３６６〜６８４位からなるポリペプチドによって惹起される、請求項３に記載のキット。
- 上皮系腫瘍または皮膚癌の診断に用いられることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のキット。
- 胃癌、大腸癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌、腎癌、前立腺癌および悪性黒色腫から選択される少なくとも１種の診断に用いられることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のキット。
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