JP4207187B2 - 膀胱癌に対する分子マーカーとしてのｈｕｒｐ遺伝子 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の背景
１）発明の分野
本発明は、ヒト被験者における膀胱癌の検出、予備スクリーニング又はモニタリングにおける分子マーカーとしてのヒトの肝癌アップレギュレート化タンパク質（hepatoma up-regulated protein）(HURP)遺伝子の使用に関し、ここで膀胱癌を有することが疑われるヒト被験者から採取したサンプルにおけるヒトHURP遺伝子の検出された発現は、膀胱癌の存在を示す。従って、本発明はヒト被験者における膀胱癌、特に膀胱の移行上皮癌（TCC）を検出するための有効な方法を提供する。本発明は更に、高い精度と利便性を有する、ヒト被験者における尿のTCCの検出、予備スクリーニング又はモニタリングのための非侵襲的方法を提供するものであり、疑わしいヒト被験者から採取された尿サンプルは、ヒトHURP遺伝子の発現を測定するために分析され、その存在は尿のTCCの存在を示す。
【０００２】
２）関連技術の記載
尿路上皮癌は、2番目に最も多く発生する尿生殖路の悪性疾患であり、また、全尿生殖器腫瘍中で2番目に多い死因である（コネティー・ビーアール（Konety BR）及びゲッツェンバーグ・アールエイチ（Getzenberg RH）: Urine based markers of urological malignancy. J Urol 165: 600-611, 2001，非特許文献1）。膀胱の移行上皮癌（TCC）は、尿路上皮新生物の90%以上の原因であり、低悪性度潜在性の乳頭状表在性病変又は浸潤性且つ致命的であり得る高グレード腫瘍として存在する。膀胱癌が局在段階の間の早期に検出される場合は、5年生存率は94%である。いったん疾患が局部的又は遠くに広がれば、5年生存率はそれぞれ49%及び6%に低下する（ドロラー・エムジェイ（Droller MJ）: Individualizing the approach to invasive bladder cancer. Contemp.Urol.，7/8月，54-61頁，1990年，非特許文献2）。従って、癌細胞がその挙動を浸潤性に変える時間を有する前に、表在性癌の再発における早期のイベント(event)を検出することが重要である。
【０００３】
計画されているフォローアップ・プロトコール（follow-up protocols）のもとでの古典的な細胞学及び膀胱鏡検査は、尿のTCCを有する患者のサーベイランスの主要な方法である。排泄された尿の細胞学を用いる低グレード腫瘍に対する低い感度は、侵襲性の膀胱鏡検査をしばしば必要とし、従って、膀胱鏡検査の間の尿道の器具使用によって、付随する不快と潜在的な感染のリスクを誘発する。初期段階で膀胱癌を特異的に検出することができる感度の良い非侵襲性の診断テストの開発は、治療をより早期に始めることにより臨床的結果を改善する。
【０００４】
“Method and probe set for detecting cancer”と題する米国特許第6,376,188号（特許文献1）、“Methods for detection of nucleic acid sequences in urine”と題する米国特許第6,251,638号（特許文献2）及び“Methods for protection of nucleic acid sequences in urine”と題する米国特許第6,287,820号（特許文献3）はそれぞれ、尿サンプルを検出するための染色体プローブのセットを用いる膀胱癌の診断について開示した。
【０００５】
“Comparative genomic hybridization (CGH)”と題する米国特許第6,335,167号（特許文献4）は、核酸配列のコピー数を検出すること、特に、テストサンプル中のヒト第8染色体のq21、ヒト第13染色体のq31-qter、ヒト第7染色体のp15-pter、ヒト第8染色体のq24-qter、ヒト第11染色体のcen-p13及びヒト第9染色体のq13-qterからなる群から選択される少なくとも1つの位置のユニーク配列の増幅を検出することによる膀胱癌の診断について開示した。
【０００６】
“Method for detecting cell proliferative disorders”と題する米国特許第6,291,163号（特許文献5）は、核酸配列の検出による被験者における癌（膀胱癌を含む）及び前癌の診断について開示し、その特徴は以下の工程に存する：（a）被験者がヘテロ接合体である遺伝子座のテストサンプルDNAを増幅させ、ここで該遺伝子座が第1及び第２対立遺伝子を含み、前記遺伝子座がマイクロサテライトDNAを含み、ここでテストサンプルDNAがテストサンプルに流れ出た臓器の細胞由来であり、テストサンプルが被験者の：尿、痰、胆汁、大便、唾液、涙、血清及び血漿からなる群から選ばれ；および、（b）第２対立遺伝子に存在するマイクロサテライトDNAのレベルに対する第１対立遺伝子に存在するマイクロサテライトDNAのレベルを測定及び比較することによる、遺伝子座での対立遺伝子の不均衡を検出し、ここで対立遺伝子の不均衡が癌又は前癌であることを示す。
【０００７】
“Method and apparatus for early diagnosis of bladder tumor in urine samples”と題するWO 01/86288（特許文献6）は、尿サンプル中の膀胱腫瘍の早期診断方法を開示し、それはサイトケラチンファミリーのタンパク質についてのマーカー及び新生物浸潤に関連する炎症性細胞を検出するのに適したリンパ球マーカーを含む群から選択される少なくとも1つの追加のマーカーを組み合わせて、量の推定のためのスタンダードとしてRNAの接近性を証明するためのβ−アクチンについてのマーカー、テロメラーゼの触媒成分（hTRT）のメッセンジャーRNAについてのマーカーを使用することによって尿中に存在する細胞から抽出されたRNAの増幅の工程、そして増幅された材料を検出する最終工程を含む。
【０００８】
“Diagnosis and treatment of cancer”と題するWO 99/63110（特許文献7）は、（i）患者の膀胱、好ましくは尿路上皮から核酸及び／又はタンパク質を含むサンプルを得る工程；および（ii）該サンプルが膀胱癌に関連するPax5核酸又はタンパク質のレベルを含むかどうかを測定する工程を含むヒト患者における膀胱癌の診断方法について開示した。
【０００９】
“Biomarkers of transitional cell carcinoma of the bladder”と題するWO 02/27329（特許文献8）は、TCC患者及びコントロール（例えば、TCCが検出できない被験者）のサンプルに区別をつけて存在するマーカーを用いて、膀胱の移行上皮癌（TCC）の診断に対する補助として使用され得るタンパク質マーカー、方法及びキットについて開示した。
【００１０】
米国特許第6,335,170号（特許文献9）は、尿路上皮又は膀胱癌細胞の発現パターンを測定する方法を開示し、以下のことを含む：尿路上皮又は膀胱癌細胞を含むサンプル中の1又はそれ以上の遺伝子の発現を測定し、それによって発現の第1パターンが形成され；発現の第１パターンから発現の第２パターンを差し引き、ここで第２パターンが、1又はそれ以上の遺伝子及び主に粘膜下組織、平滑筋又は結合組織の細胞を含むサンプルを使用して形成され、差し引く前記工程は発現の第3パターンを形成し、それはサンプル中に存在する粘膜下、平滑筋又は結合組織の細胞の割合とは無関係に尿路上皮又は膀胱癌細胞の発現を反映する。
【００１１】
膀胱癌に関する他の関連する研究は、以下を含む：
コネティー・ビーアール（Konety BR）及びゲッツェンバーグ・アールエイチ（Getzenberg RH）: Urine based markers of urological malignancy. J Urol 165: 600-611, 2001（非特許文献１）；ドロラー・エムジェイ（Droller MJ）: Individualizing the approach to invasive bladder cancer. Contemp.Urol.，7/8月，54-61頁，1990年（非特許文献２）；ノムラ・エヌ（Nomura N），ミヤジマ・エヌ（Miyajima N），サズカ・ティー（Sazuka T）ら：Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. I. The coding sequences of 40 new genes (KIAA0001-KIAA0040) deduced by analysis of randomly sampled cDNA clones from human immature myeloid cell line KG-1. DNA Res 1: 27-35, 1994（非特許文献３）；バッセル・エス（Bassal S），ノムラ・エヌ（Nomura N），ヴェンター・ディー（Venter D）ら：Characterization of a novel human cell-cycle-regulated homologue of Drosophila dlg1. Genomics，77: 5-7，2001(非特許文献４)； エリス・ダブリュージェイ（Ellis WJ），ブルーメンステイン・ビーエー（Blumenstein BA），イシャク・エルエム（Ishak LM）ら：Clinical evaluation of the BTA TRAK assay and comparison to voided urine cytology and the Bard BTA test in patients with recurrent bladder tumors. The Multi Center Study Group. Urology 50: 882-887，1997（非特許文献５）；サロスディー・エムエフ（Sarosdy MF），ハドソン・エムエー（Hudson MA），エリス・ダブリュージェイ（Ellis WJ）ら：Improved detection of recurrent bladder cancer using the Bard BTA stat Test. Urology 50: 349-353, 1997（非特許文献６）； セリパ・ディー（Seripa D），パレラ・ピー（Parrella P），ガルッチ・エム（Gallucci M）ら：Sensitive detection of transitional cell carcinoma of the bladder by microsatellite analysis of cells exfoliated in urine. Int J Cancer 95: 364-369, 2001（非特許文献７）；ポンスキー・エルイー（Ponsky LE），シャルマ・エス（Sharma S），パンドランジ・エル（Pandrangi L）ら：Screening and monitoring for bladder cancer: refining the use of NMP22. J Urol 166: 75-78, 2001（非特許文献８）；コネティー・ビーアール（Konety BR），ヌグイェン・ティーエス（Nguyen TS），ディア・アール（Dhir R）ら：Detection of bladder cancer using a novel nuclear matrix protein, BLCA-4. Clin Cancer Res 6: 2618-2625, 2000（非特許文献９）；ロテム・ディー（Rotem D），キャッセル・エー（Cassel A），リンデンフェルド・エヌ（Lindenfeld N）ら：Urinary cytokeratin 20 as a marker for transitional cell carcinoma. Eur Urol 37: 601-604, 2000 （非特許文献１０）；サンチェス−カルバヨ・エム（Sanchez-Carbayo M），ウルティア・エム（Urrutia M），ゴンザレス・デ・ブイトラゴ・ジェイエム（Gonzalez de Buitrago JM）ら：Evaluation of two new urinary tumor markers: bladder tumor fibronectin and cytokeratin 18 for the diagnosis of bladder cancer. Clin Cancer Res. 6: 3585-3594, 2000（非特許文献１１）；サンチェス−カルバヨ・エム（Sanchez-Carbayo M），ウルティア・エム（Urrutia M），シルヴァ・ジェイエム（Silva JM）ら：Urinary tissue polypeptide-specific antigen for the diagnosis of bladder cancer. Urology 55: 526-532, 2000（非特許文献１２）；スミス・エスディー（Smith SD），ウィーラー・エムエー（Wheeler, MA），プレシア・ジェイ（Plescia J）ら：Urine detection of survivin and diagnosis of bladder cancer. JAMA 285: 324-328, 2001（非特許文献１３）。
【００１２】
しかしながら、我々の知る限りでは、上の引用文献はいずれも、膀胱癌又は尿路上皮癌においてヒトHURP遺伝子の発現を報告していない。TCC組織サンプルがHURP mRNA転写物の再現性があり且つ有意な発現を示したことが出願人により驚くべきことに発見された。
【００１３】
この発見に基いて、腫瘍組織のサンプル及び排泄された尿のような生物学的サンプル中のヒトHURP遺伝子の発現を分析することによって、ヒト被験者の膀胱癌の検出、予備スクリーニング又はモニタリングのための正確で便利で非侵襲性の診断方法を開発することができ、検出されたヒトHURP遺伝子の発現は膀胱癌の存在を示す。
【００１４】
【特許文献１】
米国特許第6,376,188号
【００１５】
【特許文献２】
米国特許第6,251,638号
【００１６】
【特許文献３】
米国特許第6,287,820号
【００１７】
【特許文献４】
米国特許第6,335,167号
【００１８】
【特許文献５】
米国特許第6,291,163号
【００１９】
【特許文献６】
WO 01/86288
【００２０】
【特許文献７】
WO 99/63110
【００２１】
【特許文献８】
WO 02/27329
【００２２】
【特許文献９】
米国特許第6,335,170号
【００２３】
【非特許文献１】
コネティー・ビーアール（Konety BR）及びゲッツェンバーグ・アールエイチ（Getzenberg RH）: Urine based markers of urological malignancy. J Urol 165: 600-611, 2001
【００２４】
【非特許文献２】
ドロラー・エムジェイ（Droller MJ）: Individualizing the approach to invasive bladder cancer. Contemp.Urol.，7/8月，54-61頁，1990
【００２５】
【非特許文献３】
ノムラ・エヌ（Nomura N），ミヤジマ・エヌ（Miyajima N），サズカ・ティー（Sazuka T）ら：Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. I. The coding sequences of 40 new genes (KIAA0001-KIAA0040) deduced by analysis of randomly sampled cDNA clones from human immature myeloid cell line KG-1. DNA Res 1: 27-35, 1994
【００２６】
【非特許文献４】
バッセル・エス（Bassal S），ノムラ・エヌ（Nomura N），ヴェンター・ディー（Venter D）ら：Characterization of a novel human cell-cycle-regulated homologue of Drosophila dlg1. Genomics，77: 5-7，2001
【００２７】
【非特許文献５】
エリス・ダブリュージェイ（Ellis WJ），ブルーメンステイン・ビーエー（Blumenstein BA），イシャク・エルエム（Ishak LM）ら：Clinical evaluation of the BTA TRAK assay and comparison to voided urine cytology and the Bard BTA test in patients with recurrent bladder tumors. The Multi Center Study Group. Urology 50: 882-887，1997
【００２８】
【非特許文献６】
サロスディー・エムエフ（Sarosdy MF），ハドソン・エムエー（Hudson MA），エリス・ダブリュージェイ（Ellis WJ）ら：Improved detection of recurrent bladder cancer using the Bard BTA stat Test. Urology 50: 349-353, 1997
【００２９】
【非特許文献７】
セリパ・ディー（Seripa D），パレラ・ピー（Parrella P），ガルッチ・エム（Gallucci M）ら：Sensitive detection of transitional cell carcinoma of the bladder by microsatellite analysis of cells exfoliated in urine. Int J Cancer 95: 364-369, 2001
【００３０】
【非特許文献８】
ポンスキー・エルイー（Ponsky LE），シャルマ・エス（Sharma S），パンドランジ・エル（Pandrangi L）ら：Screening and monitoring for bladder cancer: refining the use of NMP22. J Urol 166: 75-78, 2001
【００３１】
【非特許文献９】
コネティー・ビーアール（Konety BR），ヌグイェン・ティーエス（Nguyen TS），ディア・アール（Dhir R）ら：Detection of bladder cancer using a novel nuclear matrix protein, BLCA-4. Clin Cancer Res 6: 2618-2625, 2000
【００３２】
【非特許文献１０】
ロテム・ディー（Rotem D），キャッセル・エー（Cassel A），リンデンフェルド・エヌ（Lindenfeld N）ら：Urinary cytokeratin 20 as a marker for transitional cell carcinoma. Eur Urol 37: 601-604, 2000
【００３３】
【非特許文献１１】
サンチェス−カルバヨ・エム（Sanchez-Carbayo M），ウルティア・エム（Urrutia M），ゴンザレス・デ・ブイトラゴ・ジェイエム（Gonzalez de Buitrago JM）ら：Evaluation of two new urinary tumor markers: bladder tumor fibronectin and cytokeratin 18 for the diagnosis of bladder cancer. Clin Cancer Res. 6: 3585-3594, 2000
【００３４】
【非特許文献１２】
サンチェス−カルバヨ・エム（Sanchez-Carbayo M），ウルティア・エム（Urrutia M），シルヴァ・ジェイエム（Silva JM）ら：Urinary tissue polypeptide-specific antigen for the diagnosis of bladder cancer. Urology 55: 526-532, 2000
【００３５】
【非特許文献１３】
スミス・エスディー（Smith SD），ウィーラー・エムエー（Wheeler, MA），プレシア・ジェイ（Plescia J）ら：Urine detection of survivin and diagnosis of bladder cancer. JAMA 285: 324-328, 2001
発明の要約
従って、本発明の第1の局面において、本発明は以下：
膀胱癌を有していると疑われる被験者から採取した生物学的サンプルを得る工程；及び
前記サンプル中のヒトHURP遺伝子の発現を検出する工程、その検出されたヒトHURP遺伝子の発現が膀胱癌の存在を示す、
を含む、ヒト被験者における膀胱癌の検出方法を提供する。
【００３６】
第2の局面において、本発明は、以下：
膀胱癌を有していると疑われる被験者から採取した生物学的サンプルを定期的に得えう工程；及び
前記サンプル中のヒトHURP遺伝子の発現を検出する工程、該検出されたヒトHURP遺伝子の発現が膀胱癌の存在を示す、
を含む、ヒト被験者における膀胱癌をモニタリングする方法を提供する：
第3の局面において、本発明はヒト被験者における膀胱癌を検出するためのプライマーセットを提供し、それは配列番号2及び配列番号4で示される配列から選択されるヌクレオチド配列を有するフォーワードプライマーと、配列番号3及び配列番号5で示される配列から選択されるヌクレオチド配列を有するリバースプライマーとを含む。
【００３７】
第4の局面において、本発明はヒト被験者における膀胱癌を検出するための診断キットを提供し、それはフォーワードプライマーとリバースプライマーの少なくとも1つのプライマー対を含み、各プライマーは、配列番号1に対応するヌクレオチド配列を有するヒトHURP遺伝子の少なくとも13ヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する。
【００３８】
本発明の上記及び他の目的、特徴及び利点は、添付図面を伴う以下の詳細な説明及び好ましい実施例を参照することよって明らかとなるであろう。
【００３９】
発明の詳細な記載
細胞周期の制御及びアポトーシスに関する遺伝子及びタンパク質は、癌の成長において重要であることが発見された。細胞周期及びアポトーシスを制御する細胞の成分の同定において当該分野での引き続く必要性がある。
【００４０】
配列番号1で示されるような全長ヌクレオチド配列を有するヒト肝癌アップレギュレート化タンパク質（HURP）遺伝子（NCBIアクセッション番号AB076695）は、Chen-Kung Chouらによって、肝癌の研究において細胞増殖に関する新規な癌関連遺伝子として最初に同定された。Chouの肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）の研究において、新規な細胞周期調節遺伝子（CCRG）が、特にヒトHCC組織のcDNAライブラリー及びマイクロアレイ・データベースにおける細胞周期依存性発現プロファイル中に存在する新規な遺伝子の検索から、肝癌アップレギュレート化タンパク質（HURP）として同定された（Chouら、原稿は発行のなめに提出された）。
【００４１】
驚くべきことに、ヒトHURP遺伝子が膀胱癌に対する有力な分子メーカー(maker)になり得ること、及びヒトHURP遺伝子が、低グレードの膀胱腫瘍を検出するのに十分感度がよく、癌でない又は臨床的に取るに足らない状態の患者の大部分を排除するのに特異的である非侵襲性の尿診断において使用され得ることを、本出願人が初めて発見した。
【００４２】
本発明によれば、ヒト被験者における膀胱癌の検出、予備スクリーニング又はモニタリングの方法が提供され、以下を含む：
膀胱癌を有していると疑われる被験者から採取した生物学的サンプルを得る工程；および
前記サンプル中のヒトHURP遺伝子の発現を検出する工程、その検出されたヒトHURP遺伝子の発現が膀胱癌の存在を示す。
【００４３】
本発明の方法は、膀胱の移行上皮癌（TCC）の検出、予備スクリーニング及びモニタリングに適用され得る。
【００４４】
好ましくは、本方法は、尿路上皮癌細胞、膀胱癌細胞又はそれらの組み合わせからなる群から選ばれる細胞を含む生物学的サンプルを用いて行われる。
【００４５】
好ましくは、該生物学的サンプルは、尿、尿路上皮生検、血液、血漿及び血清からなる群から選択される。本発明の好ましい実施態様において、生物学的サンプルは尿である。
【００４６】
ヒトHURP遺伝子は、図1及び配列番号1で示されるようなヌクレオチド配列を有し、それに基いてヒトHURP遺伝子の少なくとも13ヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが、バイオテクノロジーの分野でよく知られた慣用の方法論を用いて、前記遺伝子の発現を検出するための診断用プローブ又はプライマーとして役立つようにデザインされ得る。
【００４７】
例として、図1を参照すれば、出願人は膀胱癌を検出するための本発明の方法において有用である4つのプライマーをデザインし、以下のものを含む：
第１プライマー対：
【００４８】
【化１】
【００４９】
第２プライマー対：
【００５０】
【化２】
【００５１】
フォーワードプライマー1はリバースプライマー2と一対になることができ、フォーワードプライマー2はリバースプライマー1と一対になることができると考えられる。
【００５２】
本発明によれば、ヒトHURP遺伝子の発現は、ヒトHURP遺伝子からのmRNA転写物又はヒトHURP遺伝子のmRNA転写物から翻訳されたタンパク質の分析によって測定される。
【００５３】
ヒトHURP遺伝子のmRNA転写物からの翻訳されたタンパク質の検出は、バイオテクノロジーの分野でよく知られた慣用の方法論により行うことができる。
【００５４】
本発明の好ましい実施態様において、ヒトHURP遺伝子の発現の検出は、生物学的サンプル中のヒトHURP遺伝子のmRNA転写物の存在を検出することによって行われる。
【００５５】
好ましくは、ヒトHURP遺伝子のmRNA転写物の存在の検出は、以下の方法論：ハイブリダイゼーション、サイクリングプローブ反応（cycling probe reaction）、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ネスティッド（nested）PCR、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）、マルチプレックスPCRポリメラーゼ連鎖反応−一本鎖コンフォーメーション多型、リガーゼ連鎖反応（LCR）、制限断片長多型核酸配列ベースの増幅（NASBA）、及び転写仲介増幅（transcription-mediated amplification）（TMA）
の少なくとも1つ用いて行われる。
【００５６】
本発明の好ましい実施態様において、ヒトHURP遺伝子のmRNA転写物の存在の検出は、RT-PCRを用いて行われる。
【００５７】
本発明のより好ましい実施態様において、ヒトHURP遺伝子のmRNA転写物の存在の検出は、以下：
（a）生物学的サンプルから全RNAを抽出すること；
（b）工程（a）で抽出されたRNAを、フォーワードプライマーとリバースプライマーの少なくとも1つのプライマー対を用いて、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）処理に供すること、各プライマーは、配列番号1に対応するヌクレオチド配列を有するヒトHURP遺伝子の少なくとも13ヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し；及び
（c）ヒトHURP遺伝子のヌクレオチド配列の一部と同一又は相補的なヌクレオチド配列を有するRT-PCR産物が、工程（b）のRT-PCR処理から産生されたかどうかを検出すること、前記RT-PCR産物の存在が膀胱癌の存在を示す、
により行われる。
【００５８】
好ましくは、工程（b）で使用される各プライマーが、ヒトHURP遺伝子の少なくとも18ヌクレオチドにハイブリダイズする。
【００５９】
好ましくは、工程（b）で使用される少なくとも1つのプライマー対は、配列番号2及び配列番号4で示される配列から選ばれるヌクレオチド配列を有するフォーワードプライマーと、配列番号3及び配列番号5で示される配列から選ばれるヌクレオチド配列を有するリバースプライマーを含む。
【００６０】
本発明の好ましい実施態様において、工程（b）で使用される少なくとも1つのプライマー対は、配列番号4に対応するヌクレオチド配列を有するフォーワードプライマーと配列番号5に対応するヌクレオチド配列を有するリバースプライマーを含む。
【００６１】
本発明の好ましい実施態様において、工程（b）におけるRT-PCR処理は、配列番号2に対応するヌクレオチド配列を有する第１フォーワードプライマーと配列番号3に対応するヌクレオチド配列を有する第１リバースプライマーとを含む第１プライマー対を用いる第１増幅反応、及び配列番号4に対応するヌクレオチド配列を有する第２フォーワードプライマーと配列番号5に対応するヌクレオチド配列を有する第２リバースプライマーとを含む第２プライマー対を用いる第２増幅反応を含む。
【００６２】
本発明によれば、ヒト被験者における膀胱癌の検出のためのプライマーセットが提供され、それは配列番号2及び配列番号4で示される配列から選ばれるヌクレオチド配列を有するフォーワードプライマーと配列番号3及び配列番号5で示される配列から選ばれるヌクレオチド配列を有するリバースプライマーとを含む。
【００６３】
本発明の好ましい実施態様において、フォーワードプライマーは配列番号2で示されるヌクレオチド配列を有する。
【００６４】
本発明の他の好ましい実施態様において、フォーワードプライマーは配列番号4で示されるヌクレオチド配列を有する。
【００６５】
本発明の好ましい実施態様において、リバースプライマーは配列番号3で示されるヌクレオチド配列を有する。
【００６６】
本発明の他の好ましい実施態様において、リバースプライマーは配列番号5で示されるヌクレオチド配列を有する。
【００６７】
本発明によれば、ヒト被験者における膀胱癌の検出のための診断キットが提供され、それはフォーワードプライマーとリバースプライマーの少なくとも1つのプライマー対を含み、各プライマーは、配列番号1に対応するヌクレオチド配列を有するヒトHURP遺伝子の少なくとも13ヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する。
【００６８】
本発明の他の好ましい実施態様において、診断キットは、配列番号2に対応するヌクレオチド配列を有する第１フォーワードプライマーと配列番号3に対応するヌクレオチド配列を有する第１リバースプライマーとを含む第１プライマー対、及び配列番号4に対応するヌクレオチド配列を有する第２フォーワードプライマーと配列番号5に対応するヌクレオチド配列を有する第２リバースプライマーを含む第２プライマー対を含む。
【００６９】
前述したことに加え、本発明の範囲内における各種の用途があらゆるタイプの評価アッセイを使用することを含むことは、当業者なら理解するだろう。
【００７０】
例えば、RNA及びタンパク質は、その分野において公知の技術を用いてテストサンプルから単離及びアッセイされ得る。それらは、例えば、新鮮な又は凍結させた生検、ホルマリンで固定された組織、そして血液、血漿、血清、尿又は痰のような体液から単離され得る。
【００７１】
RT-PCRが使用できるが、他の技術も考えられる。これらは、PCR、ネスティッドPCR インサイチュ(in situ)ハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、高密度発現アレイ、マイクロアレイ、並びにELISA、ウェスタンブロッティング及び酵素アッセイのような特定のタンパク質産物をアッセイするための技術を含む特定のmRNA種をアッセイするための他の技術を含む。
【００７２】
本発明は以下の実施例を参照してより詳細に述べられ、それらは単に例証の目的であって、本発明の範囲を制限しようとするものではない。
【００７３】
実施例１：HURP遺伝子発現のPT-PCR分析
材料及び方法：
患者の特徴
1998年3月から2001年9月までChi Meiメディカルセンターにおいて、膀胱切開術(cystectomy)及び経尿道的切除術（transurethral resection）を用いて尿路から80のTCCサンプルを得た。遠くの肉眼的に正常な組織もまた分析のために得られ、それらは腫瘍に近接する組織サンプルとしてみなされた。全組織サンプルは液体窒素中で凍結され、-86℃で様々な期間貯蔵された。各凍結ブロックの代表的な切片は、パラフィン中に埋め込まれ、ヘマトキシリン−エオシンで染色され、サンプル中の腫瘍の状態を評価するために病理学者によって調べられた。
【００７４】
全ての標本は、世界保健機関の分類の修正を用いてグレードに分けられ、病理学的なステージング(staging)は、TNM病理学ステージングシステムに従った（Epstein JI, Amin MB, Reuter VR, et al: The World Health Organization/International Society of Urological Pathology consensus classification of urothelial (transitional cell) neoplasms of the urinary bladder. Bladder Consensus Conference Committee. Am J Surg Pathol 22: 1435-1448, 1998;及びChisholm GD, Hindmarsh JR, Howatson AG, et al: TNM (1978) in bladder cancer: use and abuse. Br J Urol 52: 500-505, 1980）。
【００７５】
膀胱腫瘍の段階は、どれほど深く腫瘍が浸潤しているかを示す。表在性腫瘍はTaと呼ばれ、T1-4は筋肉への浸潤の増加の程度を述べるのに使用される。膀胱腫瘍のグレードはI-IV（1-4）のスケールで表される。グレードは細胞の細胞学的外観を反映し、グレードIの細胞はほとんど正常であり、グレードIIの細胞はわずかに正常から外れており、グレードIIIの細胞は明らかに異常であり、グレードIVの細胞は高度に異常である。
【００７６】
RNAの単離：
全RNAは、Ultraspec（登録商標）RNA単離システム（Biotecx Laboratories Inc., Houston, Texas）を用いて凍結した組織標本又は尿のペレットから単離された。ハンドヘルドのガラス−テフロン中で、約0.5-1.0グラムの組織を1mlのUltraspec（登録商標）試薬を用いてホモジナイズした。ホモジナイゼーションの後、ホモジネートを4℃で5分間保存し、0.2mlのクロロホルムで抽出し、その後、12,000g（4℃）で15分間遠心分離した。水相のRNAを同量のイソプロパノールで沈殿させ、75%のエタノールで2回洗浄した。RNAの含有量を分光学的に評価し（A260の1 ODは40μg/mlのRNAに等しい。）、抽出物の純度はA260/280比を用いて評価し、それは全ての場合において1.75を超えた。尿の回収のために、50ミリリットルのきれいに採取された尿は、全ての患者からその日の最初の排尿で得られた。サンプルは3,000g（4℃）で20分間遠心分離され、細胞のペレットは1mlのUltraspec（登録商標）試薬と混合され、上述したのと同じ方法を用いて抽出された。
【００７７】
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応
一本鎖の相補的DNA（cDNA）は、1μlのSuperScript II逆転写酵素（Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD）とともに1μgの全RNAのoligo-dTプライミングを用いて、42℃で50分間合成された。70℃で15分間加熱した後、第１増幅反応は、10分の1の逆転写されたRNA、200μmol/LのdNTPsを含むTaqポリメラーゼバッファー、1UのDyNAzyme（登録商標）II DNAポリメラーゼ（Finnzymes Inc., Finland）、及び10μMの各ヒトHURPプライマー5'-GGATCCAATAGACACTTTGGTTTG-3'（フォーワード）及び5'-GGATCCCACCTTTCCTTCTGGTTC-3'（リバース）を用いて、94℃で1分間変性、55℃で1分間アニーリングおよび72℃で1分間伸長を30サイクルについて、その後、72℃で5分間インキュベートすることにより行われた。
【００７８】
尿標本のネスティッドPCRのために、第１増幅産物の10分の1を、ネスティッドHURPプライマー5'-CAACGAAAACAGATGCTC-3'（フォーワード）及び5'-TGAGTAGCTGATCGAGTC-3'（リバース）とともに、94℃で1分間変性、60℃で1分間アニーリング、および72℃で1分間の伸長を30サイクルについて、その後、72℃で5分間インキュベートを行う増幅の第2ラウンドに供した。
【００７９】
テンプレートとしてRTを有さないルーチンのRT-PCRのコントロールは陰性であり、テンプレートとしてpET32a(+)ベクター（Novagen Inc.から購入した）に全長のHURPヌクレオチド配列を挿入することにより図2に示すように構築されたpET32a(+)-HURPを用いたものは陽性であった。増幅産物は、1.5%アガロースゲル中0.1μgのGeneRuler（登録商標）100bp DNAラダー（MBI Fermentas, Lithuania）を用いる電気泳動を使用して分離され、エチジウムブロマイド染色を用いて可視化された。
【００８０】
データの定量化及び標準化
HURP遺伝子のmRNA発現レベルを定量化するために、全てのゲルがImage Master（登録商標）VDSビデオイメージングシステム（Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway）を用いて撮影され、LISCAPイメージキャプチャーソフトウェア（Amersham Pharmacia Biotech Inc., バージョン1.0）を用いて書類に記録した。PCR産物の光学的画素は、ImageMaster（登録商標）TotalLabソフトウェア（Amersham Pharmacia Biotech Inc., バージョン1.11）を用いて任意の単位に定量化された。
【００８１】
試験サンプルを比較するために、データの標準化は必要であった。この目的のために、β-アクチンのPCR増幅産物は、PCRにかけられたcDNAテンプレートと相対的に等しい量を表すために内部標準として使用された。平均値は平均±SD値として表され、Student's t検定を用いて比較された。
【００８２】
結果：
TCC組織サンプル及びコントロール被験者におけるHURP遺伝子の代表的な発現パターンを図3Aに示す。腫瘍に近接する部分よりも11対の腫瘍部分（患者番号：294N/T, 306N/T, 307N/T, 315N/T, 317N/T, 319N/T, 320N/T, 321N/T, 327N/T, 335N/T, 337N/T）において、相対的により多くのヒトHURP遺伝子のmRNA転写物が増幅された（図3A参照。）。組織サンプルの1対（患者番号：322N/T）のみが、両方ともヒトHURP遺伝子の検出できない転写物を示した。内部標準として、β-アクチンのPCR増幅産物（図3B参照。）が、PCRに供されたcDNAテンプレートと相対的に等しい量を表すために使用された。
【００８３】
実施例２：RT-PCR分析によるHURP遺伝子発現の腫瘍特異性の評価
HURPの過剰発現が腫瘍特異性を示すかどうかを決定するために、良性前立腺過形成（BPH）の患者由来の前立腺尿路上皮のヒトHURP転写物が、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を用いて増幅された。
【００８４】
実験は、良性前立腺過形成（BPH）の患者由来の前立腺尿路上皮のHURP転写物が、HURP遺伝子発現が腫瘍特異性を示すかどうかを決定するために逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を用いて増幅された以外は、上の実施例1に示された手順に従って行われた。
【００８５】
標準の膀胱鏡検査法を用いたBPH患者由来の前立腺尿路上皮の15の標本は、集められ、RT-PCRに供された。図4を参照すると、β-アクチン転写物はBPH尿路上皮の5つの代表的なサンプルから等しく増幅されたが、これらのサンプル中にはHURP転写物は検出されなかった。BPHサンプルに加えて、肝臓由来の4サンプル及び心臓由来の4サンプルを含む膀胱でないコントロールが試験され、これらの組織中にはHURP転写物は検出されなかった（データは示していない。）。
【００８６】
実施例３：HURP遺伝子発現のRT-PCR分析による腫瘍段階の評価
HURP遺伝子の過剰発現と腫瘍グレードとの間の可能性のある相関関係を決定するために、TCCを含む組織のサンプル及び対応の腫瘍近接組織サンプルの45対のヒトHURP転写物が分析され、β-アクチン転写物を用いて標準化された。
【００８７】
表1を参照すると、35の腫瘍近接部分（35/45, 77.8%）が腫瘍の部分よりもHURP遺伝子の発現量が少ないこと（グループI, p<0.0001）、及び10の腫瘍近接部分（10/45, 22.2%）が腫瘍部分とほとんど等しい量のHURP遺伝子を示したこと（グループII）は、注目すべきことである。
【００８８】
ゼロのグレードI、37のグレードII、31のグレードIII、12のグレードIVの病理学的同定を有する80人のTCC患者が集められ、組織サンプルのヒトHURP発現比を表IIにリストする。HURP発現と腫瘍グレードとの間に有意な相関関係は存在しないようである。それらの中で、HURP陰性の9の腫瘍、6はグレードII、1はグレードIIIそして2はグレードIVであった。
【００８９】
【表１】
【００９０】
【表２】
【００９１】
実施例４：TCCの検出のためのバイオマーカーとしてのHURP遺伝子発現の評価尿TCC検出のための新規な尿の分子マーカーとしての、尿HURPの潜在的な適用性を評価するために、新たな又は再発したTCCの7人の更なる患者が、RT-PCRを用いて尿HURPについて分析された。全RNAは尿の細胞ペレットから抽出され、oligo-dTプライミングによって逆転写された。増幅反応は、HURP特異的プライマー又はβ-アクチン特異的プライマーを用いて行われた。370塩基対のcDNAは、TCCの全患者の尿の細胞ペレットから増幅された（図5A）。対照的に、7人の更なる個人（3人は尿路感染症、2人は膀胱の慢性炎症、1人は腎細胞癌、1人はBHPを有した。）由来の尿の細胞ペレットは、HURP転写物を有しなかった。コントロールの実験において、307塩基対のβ-アクチンcDNA断片は、コントロールの被験者及びTCC患者の尿から見分けのつかないほど増幅された（図5B）。
【００９２】
本明細書中に引用された全ての特許及び参考文献は、参考として本明細書に全体として援用される。矛盾する場合は、定義を含めた本発明の説明が優先される。
【００９３】
本発明は、上記の特定の実施態様を参照して述べられたが、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく数多くの変更と変形を行うことができるのは明らかである。従って、本発明は添付のクレームに示されたようにのみ限定しようとするものである。
【００９４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はヒトHURP遺伝子のヌクレオチド配列の全長（配列番号1）を示し、ここで本発明に従ってデザインされた4つのプライマーに相補的なヌクレオチド配列は、下線が引かれ、太字になっている；
【図２】 図２は上記の実施例で用いられているベクターpET32a（Novagen Inc.）の制限地図を示し、BamH I制限部位はヒトHURP遺伝子の全長核酸配列を挿入するために使用される。
【図３】 図3A及び3Bはそれぞれ、TCC組織におけるHURP及びβ−アクチンの発現のRT-PCR分析を示し、N=腫瘍近接組織、T=腫瘍組織、および294,306,307,315,317,319,320,321,322,327,335及び337=患者の番号である。
【図４】 図４は5人の良性の前立腺過形成の患者から採取した前立腺の尿路上皮サンプルにおけるヒトHURP発現のRT-PCR分析を示し、ここで左はβ−アクチン（307bp）および右はHURP（370bp）であり、N1,N2,N3,N4及びN5=5つの良性前立腺過形成（BPH）サンプル；NC=ネガティブコントロール；そして、Mは塩基対における分子量マーカーを示す。
【図５】 図5A及び5Bはそれぞれ、排泄された尿サンプル中のHURP及びβ−アクチンの発現のRT-PCR分析を示し、ここで2,6,7,8,14,15,20,5,10,11,12,13,16及び18=患者の番号；NC：ネガティブコントロール；Mは塩基対における分子量マーカーを示す。
発明の背景
１）発明の分野
本発明は、ヒト被験者における膀胱癌の検出、予備スクリーニング又はモニタリングにおける分子マーカーとしてのヒトの肝癌アップレギュレート化タンパク質（hepatoma up-regulated protein）(HURP)遺伝子の使用に関し、ここで膀胱癌を有することが疑われるヒト被験者から採取したサンプルにおけるヒトHURP遺伝子の検出された発現は、膀胱癌の存在を示す。従って、本発明はヒト被験者における膀胱癌、特に膀胱の移行上皮癌（TCC）を検出するための有効な方法を提供する。本発明は更に、高い精度と利便性を有する、ヒト被験者における尿のTCCの検出、予備スクリーニング又はモニタリングのための非侵襲的方法を提供するものであり、疑わしいヒト被験者から採取された尿サンプルは、ヒトHURP遺伝子の発現を測定するために分析され、その存在は尿のTCCの存在を示す。
【０００２】
２）関連技術の記載
尿路上皮癌は、2番目に最も多く発生する尿生殖路の悪性疾患であり、また、全尿生殖器腫瘍中で2番目に多い死因である（コネティー・ビーアール（Konety BR）及びゲッツェンバーグ・アールエイチ（Getzenberg RH）: Urine based markers of urological malignancy. J Urol 165: 600-611, 2001，非特許文献1）。膀胱の移行上皮癌（TCC）は、尿路上皮新生物の90%以上の原因であり、低悪性度潜在性の乳頭状表在性病変又は浸潤性且つ致命的であり得る高グレード腫瘍として存在する。膀胱癌が局在段階の間の早期に検出される場合は、5年生存率は94%である。いったん疾患が局部的又は遠くに広がれば、5年生存率はそれぞれ49%及び6%に低下する（ドロラー・エムジェイ（Droller MJ）: Individualizing the approach to invasive bladder cancer. Contemp.Urol.，7/8月，54-61頁，1990年，非特許文献2）。従って、癌細胞がその挙動を浸潤性に変える時間を有する前に、表在性癌の再発における早期のイベント(event)を検出することが重要である。
【０００３】
計画されているフォローアップ・プロトコール（follow-up protocols）のもとでの古典的な細胞学及び膀胱鏡検査は、尿のTCCを有する患者のサーベイランスの主要な方法である。排泄された尿の細胞学を用いる低グレード腫瘍に対する低い感度は、侵襲性の膀胱鏡検査をしばしば必要とし、従って、膀胱鏡検査の間の尿道の器具使用によって、付随する不快と潜在的な感染のリスクを誘発する。初期段階で膀胱癌を特異的に検出することができる感度の良い非侵襲性の診断テストの開発は、治療をより早期に始めることにより臨床的結果を改善する。
【０００４】
“Method and probe set for detecting cancer”と題する米国特許第6,376,188号（特許文献1）、“Methods for detection of nucleic acid sequences in urine”と題する米国特許第6,251,638号（特許文献2）及び“Methods for protection of nucleic acid sequences in urine”と題する米国特許第6,287,820号（特許文献3）はそれぞれ、尿サンプルを検出するための染色体プローブのセットを用いる膀胱癌の診断について開示した。
【０００５】
“Comparative genomic hybridization (CGH)”と題する米国特許第6,335,167号（特許文献4）は、核酸配列のコピー数を検出すること、特に、テストサンプル中のヒト第8染色体のq21、ヒト第13染色体のq31-qter、ヒト第7染色体のp15-pter、ヒト第8染色体のq24-qter、ヒト第11染色体のcen-p13及びヒト第9染色体のq13-qterからなる群から選択される少なくとも1つの位置のユニーク配列の増幅を検出することによる膀胱癌の診断について開示した。
【０００６】
“Method for detecting cell proliferative disorders”と題する米国特許第6,291,163号（特許文献5）は、核酸配列の検出による被験者における癌（膀胱癌を含む）及び前癌の診断について開示し、その特徴は以下の工程に存する：（a）被験者がヘテロ接合体である遺伝子座のテストサンプルDNAを増幅させ、ここで該遺伝子座が第1及び第２対立遺伝子を含み、前記遺伝子座がマイクロサテライトDNAを含み、ここでテストサンプルDNAがテストサンプルに流れ出た臓器の細胞由来であり、テストサンプルが被験者の：尿、痰、胆汁、大便、唾液、涙、血清及び血漿からなる群から選ばれ；および、（b）第２対立遺伝子に存在するマイクロサテライトDNAのレベルに対する第１対立遺伝子に存在するマイクロサテライトDNAのレベルを測定及び比較することによる、遺伝子座での対立遺伝子の不均衡を検出し、ここで対立遺伝子の不均衡が癌又は前癌であることを示す。
【０００７】
“Method and apparatus for early diagnosis of bladder tumor in urine samples”と題するWO 01/86288（特許文献6）は、尿サンプル中の膀胱腫瘍の早期診断方法を開示し、それはサイトケラチンファミリーのタンパク質についてのマーカー及び新生物浸潤に関連する炎症性細胞を検出するのに適したリンパ球マーカーを含む群から選択される少なくとも1つの追加のマーカーを組み合わせて、量の推定のためのスタンダードとしてRNAの接近性を証明するためのβ−アクチンについてのマーカー、テロメラーゼの触媒成分（hTRT）のメッセンジャーRNAについてのマーカーを使用することによって尿中に存在する細胞から抽出されたRNAの増幅の工程、そして増幅された材料を検出する最終工程を含む。
【０００８】
“Diagnosis and treatment of cancer”と題するWO 99/63110（特許文献7）は、（i）患者の膀胱、好ましくは尿路上皮から核酸及び／又はタンパク質を含むサンプルを得る工程；および（ii）該サンプルが膀胱癌に関連するPax5核酸又はタンパク質のレベルを含むかどうかを測定する工程を含むヒト患者における膀胱癌の診断方法について開示した。
【０００９】
“Biomarkers of transitional cell carcinoma of the bladder”と題するWO 02/27329（特許文献8）は、TCC患者及びコントロール（例えば、TCCが検出できない被験者）のサンプルに区別をつけて存在するマーカーを用いて、膀胱の移行上皮癌（TCC）の診断に対する補助として使用され得るタンパク質マーカー、方法及びキットについて開示した。
【００１０】
米国特許第6,335,170号（特許文献9）は、尿路上皮又は膀胱癌細胞の発現パターンを測定する方法を開示し、以下のことを含む：尿路上皮又は膀胱癌細胞を含むサンプル中の1又はそれ以上の遺伝子の発現を測定し、それによって発現の第1パターンが形成され；発現の第１パターンから発現の第２パターンを差し引き、ここで第２パターンが、1又はそれ以上の遺伝子及び主に粘膜下組織、平滑筋又は結合組織の細胞を含むサンプルを使用して形成され、差し引く前記工程は発現の第3パターンを形成し、それはサンプル中に存在する粘膜下、平滑筋又は結合組織の細胞の割合とは無関係に尿路上皮又は膀胱癌細胞の発現を反映する。
【００１１】
膀胱癌に関する他の関連する研究は、以下を含む：
コネティー・ビーアール（Konety BR）及びゲッツェンバーグ・アールエイチ（Getzenberg RH）: Urine based markers of urological malignancy. J Urol 165: 600-611, 2001（非特許文献１）；ドロラー・エムジェイ（Droller MJ）: Individualizing the approach to invasive bladder cancer. Contemp.Urol.，7/8月，54-61頁，1990年（非特許文献２）；ノムラ・エヌ（Nomura N），ミヤジマ・エヌ（Miyajima N），サズカ・ティー（Sazuka T）ら：Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. I. The coding sequences of 40 new genes (KIAA0001-KIAA0040) deduced by analysis of randomly sampled cDNA clones from human immature myeloid cell line KG-1. DNA Res 1: 27-35, 1994（非特許文献３）；バッセル・エス（Bassal S），ノムラ・エヌ（Nomura N），ヴェンター・ディー（Venter D）ら：Characterization of a novel human cell-cycle-regulated homologue of Drosophila dlg1. Genomics，77: 5-7，2001(非特許文献４)； エリス・ダブリュージェイ（Ellis WJ），ブルーメンステイン・ビーエー（Blumenstein BA），イシャク・エルエム（Ishak LM）ら：Clinical evaluation of the BTA TRAK assay and comparison to voided urine cytology and the Bard BTA test in patients with recurrent bladder tumors. The Multi Center Study Group. Urology 50: 882-887，1997（非特許文献５）；サロスディー・エムエフ（Sarosdy MF），ハドソン・エムエー（Hudson MA），エリス・ダブリュージェイ（Ellis WJ）ら：Improved detection of recurrent bladder cancer using the Bard BTA stat Test. Urology 50: 349-353, 1997（非特許文献６）； セリパ・ディー（Seripa D），パレラ・ピー（Parrella P），ガルッチ・エム（Gallucci M）ら：Sensitive detection of transitional cell carcinoma of the bladder by microsatellite analysis of cells exfoliated in urine. Int J Cancer 95: 364-369, 2001（非特許文献７）；ポンスキー・エルイー（Ponsky LE），シャルマ・エス（Sharma S），パンドランジ・エル（Pandrangi L）ら：Screening and monitoring for bladder cancer: refining the use of NMP22. J Urol 166: 75-78, 2001（非特許文献８）；コネティー・ビーアール（Konety BR），ヌグイェン・ティーエス（Nguyen TS），ディア・アール（Dhir R）ら：Detection of bladder cancer using a novel nuclear matrix protein, BLCA-4. Clin Cancer Res 6: 2618-2625, 2000（非特許文献９）；ロテム・ディー（Rotem D），キャッセル・エー（Cassel A），リンデンフェルド・エヌ（Lindenfeld N）ら：Urinary cytokeratin 20 as a marker for transitional cell carcinoma. Eur Urol 37: 601-604, 2000 （非特許文献１０）；サンチェス−カルバヨ・エム（Sanchez-Carbayo M），ウルティア・エム（Urrutia M），ゴンザレス・デ・ブイトラゴ・ジェイエム（Gonzalez de Buitrago JM）ら：Evaluation of two new urinary tumor markers: bladder tumor fibronectin and cytokeratin 18 for the diagnosis of bladder cancer. Clin Cancer Res. 6: 3585-3594, 2000（非特許文献１１）；サンチェス−カルバヨ・エム（Sanchez-Carbayo M），ウルティア・エム（Urrutia M），シルヴァ・ジェイエム（Silva JM）ら：Urinary tissue polypeptide-specific antigen for the diagnosis of bladder cancer. Urology 55: 526-532, 2000（非特許文献１２）；スミス・エスディー（Smith SD），ウィーラー・エムエー（Wheeler, MA），プレシア・ジェイ（Plescia J）ら：Urine detection of survivin and diagnosis of bladder cancer. JAMA 285: 324-328, 2001（非特許文献１３）。
【００１２】
しかしながら、我々の知る限りでは、上の引用文献はいずれも、膀胱癌又は尿路上皮癌においてヒトHURP遺伝子の発現を報告していない。TCC組織サンプルがHURP mRNA転写物の再現性があり且つ有意な発現を示したことが出願人により驚くべきことに発見された。
【００１３】
この発見に基いて、腫瘍組織のサンプル及び排泄された尿のような生物学的サンプル中のヒトHURP遺伝子の発現を分析することによって、ヒト被験者の膀胱癌の検出、予備スクリーニング又はモニタリングのための正確で便利で非侵襲性の診断方法を開発することができ、検出されたヒトHURP遺伝子の発現は膀胱癌の存在を示す。
【００１４】
【特許文献１】
米国特許第6,376,188号
【００１５】
【特許文献２】
米国特許第6,251,638号
【００１６】
【特許文献３】
米国特許第6,287,820号
【００１７】
【特許文献４】
米国特許第6,335,167号
【００１８】
【特許文献５】
米国特許第6,291,163号
【００１９】
【特許文献６】
WO 01/86288
【００２０】
【特許文献７】
WO 99/63110
【００２１】
【特許文献８】
WO 02/27329
【００２２】
【特許文献９】
米国特許第6,335,170号
【００２３】
【非特許文献１】
コネティー・ビーアール（Konety BR）及びゲッツェンバーグ・アールエイチ（Getzenberg RH）: Urine based markers of urological malignancy. J Urol 165: 600-611, 2001
【００２４】
【非特許文献２】
ドロラー・エムジェイ（Droller MJ）: Individualizing the approach to invasive bladder cancer. Contemp.Urol.，7/8月，54-61頁，1990
【００２５】
【非特許文献３】
ノムラ・エヌ（Nomura N），ミヤジマ・エヌ（Miyajima N），サズカ・ティー（Sazuka T）ら：Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. I. The coding sequences of 40 new genes (KIAA0001-KIAA0040) deduced by analysis of randomly sampled cDNA clones from human immature myeloid cell line KG-1. DNA Res 1: 27-35, 1994
【００２６】
【非特許文献４】
バッセル・エス（Bassal S），ノムラ・エヌ（Nomura N），ヴェンター・ディー（Venter D）ら：Characterization of a novel human cell-cycle-regulated homologue of Drosophila dlg1. Genomics，77: 5-7，2001
【００２７】
【非特許文献５】
エリス・ダブリュージェイ（Ellis WJ），ブルーメンステイン・ビーエー（Blumenstein BA），イシャク・エルエム（Ishak LM）ら：Clinical evaluation of the BTA TRAK assay and comparison to voided urine cytology and the Bard BTA test in patients with recurrent bladder tumors. The Multi Center Study Group. Urology 50: 882-887，1997
【００２８】
【非特許文献６】
サロスディー・エムエフ（Sarosdy MF），ハドソン・エムエー（Hudson MA），エリス・ダブリュージェイ（Ellis WJ）ら：Improved detection of recurrent bladder cancer using the Bard BTA stat Test. Urology 50: 349-353, 1997
【００２９】
【非特許文献７】
セリパ・ディー（Seripa D），パレラ・ピー（Parrella P），ガルッチ・エム（Gallucci M）ら：Sensitive detection of transitional cell carcinoma of the bladder by microsatellite analysis of cells exfoliated in urine. Int J Cancer 95: 364-369, 2001
【００３０】
【非特許文献８】
ポンスキー・エルイー（Ponsky LE），シャルマ・エス（Sharma S），パンドランジ・エル（Pandrangi L）ら：Screening and monitoring for bladder cancer: refining the use of NMP22. J Urol 166: 75-78, 2001
【００３１】
【非特許文献９】
コネティー・ビーアール（Konety BR），ヌグイェン・ティーエス（Nguyen TS），ディア・アール（Dhir R）ら：Detection of bladder cancer using a novel nuclear matrix protein, BLCA-4. Clin Cancer Res 6: 2618-2625, 2000
【００３２】
【非特許文献１０】
ロテム・ディー（Rotem D），キャッセル・エー（Cassel A），リンデンフェルド・エヌ（Lindenfeld N）ら：Urinary cytokeratin 20 as a marker for transitional cell carcinoma. Eur Urol 37: 601-604, 2000
【００３３】
【非特許文献１１】
サンチェス−カルバヨ・エム（Sanchez-Carbayo M），ウルティア・エム（Urrutia M），ゴンザレス・デ・ブイトラゴ・ジェイエム（Gonzalez de Buitrago JM）ら：Evaluation of two new urinary tumor markers: bladder tumor fibronectin and cytokeratin 18 for the diagnosis of bladder cancer. Clin Cancer Res. 6: 3585-3594, 2000
【００３４】
【非特許文献１２】
サンチェス−カルバヨ・エム（Sanchez-Carbayo M），ウルティア・エム（Urrutia M），シルヴァ・ジェイエム（Silva JM）ら：Urinary tissue polypeptide-specific antigen for the diagnosis of bladder cancer. Urology 55: 526-532, 2000
【００３５】
【非特許文献１３】
スミス・エスディー（Smith SD），ウィーラー・エムエー（Wheeler, MA），プレシア・ジェイ（Plescia J）ら：Urine detection of survivin and diagnosis of bladder cancer. JAMA 285: 324-328, 2001
発明の要約
従って、本発明の第1の局面において、本発明は以下：
膀胱癌を有していると疑われる被験者から採取した生物学的サンプルを得る工程；及び
前記サンプル中のヒトHURP遺伝子の発現を検出する工程、その検出されたヒトHURP遺伝子の発現が膀胱癌の存在を示す、
を含む、ヒト被験者における膀胱癌の検出方法を提供する。
【００３６】
第2の局面において、本発明は、以下：
膀胱癌を有していると疑われる被験者から採取した生物学的サンプルを定期的に得えう工程；及び
前記サンプル中のヒトHURP遺伝子の発現を検出する工程、該検出されたヒトHURP遺伝子の発現が膀胱癌の存在を示す、
を含む、ヒト被験者における膀胱癌をモニタリングする方法を提供する：
第3の局面において、本発明はヒト被験者における膀胱癌を検出するためのプライマーセットを提供し、それは配列番号2及び配列番号4で示される配列から選択されるヌクレオチド配列を有するフォーワードプライマーと、配列番号3及び配列番号5で示される配列から選択されるヌクレオチド配列を有するリバースプライマーとを含む。
【００３７】
第4の局面において、本発明はヒト被験者における膀胱癌を検出するための診断キットを提供し、それはフォーワードプライマーとリバースプライマーの少なくとも1つのプライマー対を含み、各プライマーは、配列番号1に対応するヌクレオチド配列を有するヒトHURP遺伝子の少なくとも13ヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する。
【００３８】
本発明の上記及び他の目的、特徴及び利点は、添付図面を伴う以下の詳細な説明及び好ましい実施例を参照することよって明らかとなるであろう。
【００３９】
発明の詳細な記載
細胞周期の制御及びアポトーシスに関する遺伝子及びタンパク質は、癌の成長において重要であることが発見された。細胞周期及びアポトーシスを制御する細胞の成分の同定において当該分野での引き続く必要性がある。
【００４０】
配列番号1で示されるような全長ヌクレオチド配列を有するヒト肝癌アップレギュレート化タンパク質（HURP）遺伝子（NCBIアクセッション番号AB076695）は、Chen-Kung Chouらによって、肝癌の研究において細胞増殖に関する新規な癌関連遺伝子として最初に同定された。Chouの肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）の研究において、新規な細胞周期調節遺伝子（CCRG）が、特にヒトHCC組織のcDNAライブラリー及びマイクロアレイ・データベースにおける細胞周期依存性発現プロファイル中に存在する新規な遺伝子の検索から、肝癌アップレギュレート化タンパク質（HURP）として同定された（Chouら、原稿は発行のなめに提出された）。
【００４１】
驚くべきことに、ヒトHURP遺伝子が膀胱癌に対する有力な分子メーカー(maker)になり得ること、及びヒトHURP遺伝子が、低グレードの膀胱腫瘍を検出するのに十分感度がよく、癌でない又は臨床的に取るに足らない状態の患者の大部分を排除するのに特異的である非侵襲性の尿診断において使用され得ることを、本出願人が初めて発見した。
【００４２】
本発明によれば、ヒト被験者における膀胱癌の検出、予備スクリーニング又はモニタリングの方法が提供され、以下を含む：
膀胱癌を有していると疑われる被験者から採取した生物学的サンプルを得る工程；および
前記サンプル中のヒトHURP遺伝子の発現を検出する工程、その検出されたヒトHURP遺伝子の発現が膀胱癌の存在を示す。
【００４３】
本発明の方法は、膀胱の移行上皮癌（TCC）の検出、予備スクリーニング及びモニタリングに適用され得る。
【００４４】
好ましくは、本方法は、尿路上皮癌細胞、膀胱癌細胞又はそれらの組み合わせからなる群から選ばれる細胞を含む生物学的サンプルを用いて行われる。
【００４５】
好ましくは、該生物学的サンプルは、尿、尿路上皮生検、血液、血漿及び血清からなる群から選択される。本発明の好ましい実施態様において、生物学的サンプルは尿である。
【００４６】
ヒトHURP遺伝子は、図1及び配列番号1で示されるようなヌクレオチド配列を有し、それに基いてヒトHURP遺伝子の少なくとも13ヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが、バイオテクノロジーの分野でよく知られた慣用の方法論を用いて、前記遺伝子の発現を検出するための診断用プローブ又はプライマーとして役立つようにデザインされ得る。
【００４７】
例として、図1を参照すれば、出願人は膀胱癌を検出するための本発明の方法において有用である4つのプライマーをデザインし、以下のものを含む：
第１プライマー対：
【００４８】
【化１】
第２プライマー対：
【００５０】
【化２】
フォーワードプライマー1はリバースプライマー2と一対になることができ、フォーワードプライマー2はリバースプライマー1と一対になることができると考えられる。
【００５２】
本発明によれば、ヒトHURP遺伝子の発現は、ヒトHURP遺伝子からのmRNA転写物又はヒトHURP遺伝子のmRNA転写物から翻訳されたタンパク質の分析によって測定される。
【００５３】
ヒトHURP遺伝子のmRNA転写物からの翻訳されたタンパク質の検出は、バイオテクノロジーの分野でよく知られた慣用の方法論により行うことができる。
【００５４】
本発明の好ましい実施態様において、ヒトHURP遺伝子の発現の検出は、生物学的サンプル中のヒトHURP遺伝子のmRNA転写物の存在を検出することによって行われる。
【００５５】
好ましくは、ヒトHURP遺伝子のmRNA転写物の存在の検出は、以下の方法論：ハイブリダイゼーション、サイクリングプローブ反応（cycling probe reaction）、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ネスティッド（nested）PCR、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）、マルチプレックスPCRポリメラーゼ連鎖反応−一本鎖コンフォーメーション多型、リガーゼ連鎖反応（LCR）、制限断片長多型核酸配列ベースの増幅（NASBA）、及び転写仲介増幅（transcription-mediated amplification）（TMA）
の少なくとも1つ用いて行われる。
【００５６】
本発明の好ましい実施態様において、ヒトHURP遺伝子のmRNA転写物の存在の検出は、RT-PCRを用いて行われる。
【００５７】
本発明のより好ましい実施態様において、ヒトHURP遺伝子のmRNA転写物の存在の検出は、以下：
（a）生物学的サンプルから全RNAを抽出すること；
（b）工程（a）で抽出されたRNAを、フォーワードプライマーとリバースプライマーの少なくとも1つのプライマー対を用いて、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）処理に供すること、各プライマーは、配列番号1に対応するヌクレオチド配列を有するヒトHURP遺伝子の少なくとも13ヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し；及び
（c）ヒトHURP遺伝子のヌクレオチド配列の一部と同一又は相補的なヌクレオチド配列を有するRT-PCR産物が、工程（b）のRT-PCR処理から産生されたかどうかを検出すること、前記RT-PCR産物の存在が膀胱癌の存在を示す、
により行われる。
【００５８】
好ましくは、工程（b）で使用される各プライマーが、ヒトHURP遺伝子の少なくとも18ヌクレオチドにハイブリダイズする。
【００５９】
好ましくは、工程（b）で使用される少なくとも1つのプライマー対は、配列番号2及び配列番号4で示される配列から選ばれるヌクレオチド配列を有するフォーワードプライマーと、配列番号3及び配列番号5で示される配列から選ばれるヌクレオチド配列を有するリバースプライマーを含む。
【００６０】
本発明の好ましい実施態様において、工程（b）で使用される少なくとも1つのプライマー対は、配列番号4に対応するヌクレオチド配列を有するフォーワードプライマーと配列番号5に対応するヌクレオチド配列を有するリバースプライマーを含む。
【００６１】
本発明の好ましい実施態様において、工程（b）におけるRT-PCR処理は、配列番号2に対応するヌクレオチド配列を有する第１フォーワードプライマーと配列番号3に対応するヌクレオチド配列を有する第１リバースプライマーとを含む第１プライマー対を用いる第１増幅反応、及び配列番号4に対応するヌクレオチド配列を有する第２フォーワードプライマーと配列番号5に対応するヌクレオチド配列を有する第２リバースプライマーとを含む第２プライマー対を用いる第２増幅反応を含む。
【００６２】
本発明によれば、ヒト被験者における膀胱癌の検出のためのプライマーセットが提供され、それは配列番号2及び配列番号4で示される配列から選ばれるヌクレオチド配列を有するフォーワードプライマーと配列番号3及び配列番号5で示される配列から選ばれるヌクレオチド配列を有するリバースプライマーとを含む。
【００６３】
本発明の好ましい実施態様において、フォーワードプライマーは配列番号2で示されるヌクレオチド配列を有する。
【００６４】
本発明の他の好ましい実施態様において、フォーワードプライマーは配列番号4で示されるヌクレオチド配列を有する。
【００６５】
本発明の好ましい実施態様において、リバースプライマーは配列番号3で示されるヌクレオチド配列を有する。
【００６６】
本発明の他の好ましい実施態様において、リバースプライマーは配列番号5で示されるヌクレオチド配列を有する。
【００６７】
本発明によれば、ヒト被験者における膀胱癌の検出のための診断キットが提供され、それはフォーワードプライマーとリバースプライマーの少なくとも1つのプライマー対を含み、各プライマーは、配列番号1に対応するヌクレオチド配列を有するヒトHURP遺伝子の少なくとも13ヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する。
【００６８】
本発明の他の好ましい実施態様において、診断キットは、配列番号2に対応するヌクレオチド配列を有する第１フォーワードプライマーと配列番号3に対応するヌクレオチド配列を有する第１リバースプライマーとを含む第１プライマー対、及び配列番号4に対応するヌクレオチド配列を有する第２フォーワードプライマーと配列番号5に対応するヌクレオチド配列を有する第２リバースプライマーを含む第２プライマー対を含む。
【００６９】
前述したことに加え、本発明の範囲内における各種の用途があらゆるタイプの評価アッセイを使用することを含むことは、当業者なら理解するだろう。
【００７０】
例えば、RNA及びタンパク質は、その分野において公知の技術を用いてテストサンプルから単離及びアッセイされ得る。それらは、例えば、新鮮な又は凍結させた生検、ホルマリンで固定された組織、そして血液、血漿、血清、尿又は痰のような体液から単離され得る。
【００７１】
RT-PCRが使用できるが、他の技術も考えられる。これらは、PCR、ネスティッドPCR インサイチュ(in situ)ハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、高密度発現アレイ、マイクロアレイ、並びにELISA、ウェスタンブロッティング及び酵素アッセイのような特定のタンパク質産物をアッセイするための技術を含む特定のmRNA種をアッセイするための他の技術を含む。
【００７２】
本発明は以下の実施例を参照してより詳細に述べられ、それらは単に例証の目的であって、本発明の範囲を制限しようとするものではない。
【００７３】
実施例１：HURP遺伝子発現のPT-PCR分析
材料及び方法：
患者の特徴
1998年3月から2001年9月までChi Meiメディカルセンターにおいて、膀胱切開術(cystectomy)及び経尿道的切除術（transurethral resection）を用いて尿路から80のTCCサンプルを得た。遠くの肉眼的に正常な組織もまた分析のために得られ、それらは腫瘍に近接する組織サンプルとしてみなされた。全組織サンプルは液体窒素中で凍結され、-86℃で様々な期間貯蔵された。各凍結ブロックの代表的な切片は、パラフィン中に埋め込まれ、ヘマトキシリン−エオシンで染色され、サンプル中の腫瘍の状態を評価するために病理学者によって調べられた。
【００７４】
全ての標本は、世界保健機関の分類の修正を用いてグレードに分けられ、病理学的なステージング(staging)は、TNM病理学ステージングシステムに従った（Epstein JI, Amin MB, Reuter VR, et al: The World Health Organization/International Society of Urological Pathology consensus classification of urothelial (transitional cell) neoplasms of the urinary bladder. Bladder Consensus Conference Committee. Am J Surg Pathol 22: 1435-1448, 1998;及びChisholm GD, Hindmarsh JR, Howatson AG, et al: TNM (1978) in bladder cancer: use and abuse. Br J Urol 52: 500-505, 1980）。
【００７５】
膀胱腫瘍の段階は、どれほど深く腫瘍が浸潤しているかを示す。表在性腫瘍はTaと呼ばれ、T1-4は筋肉への浸潤の増加の程度を述べるのに使用される。膀胱腫瘍のグレードはI-IV（1-4）のスケールで表される。グレードは細胞の細胞学的外観を反映し、グレードIの細胞はほとんど正常であり、グレードIIの細胞はわずかに正常から外れており、グレードIIIの細胞は明らかに異常であり、グレードIVの細胞は高度に異常である。
【００７６】
RNAの単離：
全RNAは、Ultraspec（登録商標）RNA単離システム（Biotecx Laboratories Inc., Houston, Texas）を用いて凍結した組織標本又は尿のペレットから単離された。ハンドヘルドのガラス−テフロン中で、約0.5-1.0グラムの組織を1mlのUltraspec（登録商標）試薬を用いてホモジナイズした。ホモジナイゼーションの後、ホモジネートを4℃で5分間保存し、0.2mlのクロロホルムで抽出し、その後、12,000g（4℃）で15分間遠心分離した。水相のRNAを同量のイソプロパノールで沈殿させ、75%のエタノールで2回洗浄した。RNAの含有量を分光学的に評価し（A260の1 ODは40μg/mlのRNAに等しい。）、抽出物の純度はA260/280比を用いて評価し、それは全ての場合において1.75を超えた。尿の回収のために、50ミリリットルのきれいに採取された尿は、全ての患者からその日の最初の排尿で得られた。サンプルは3,000g（4℃）で20分間遠心分離され、細胞のペレットは1mlのUltraspec（登録商標）試薬と混合され、上述したのと同じ方法を用いて抽出された。
【００７７】
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応
一本鎖の相補的DNA（cDNA）は、1μlのSuperScript II逆転写酵素（Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD）とともに1μgの全RNAのoligo-dTプライミングを用いて、42℃で50分間合成された。70℃で15分間加熱した後、第１増幅反応は、10分の1の逆転写されたRNA、200μmol/LのdNTPsを含むTaqポリメラーゼバッファー、1UのDyNAzyme（登録商標）II DNAポリメラーゼ（Finnzymes Inc., Finland）、及び10μMの各ヒトHURPプライマー5'-GGATCCAATAGACACTTTGGTTTG-3'（フォーワード）及び5'-GGATCCCACCTTTCCTTCTGGTTC-3'（リバース）を用いて、94℃で1分間変性、55℃で1分間アニーリングおよび72℃で1分間伸長を30サイクルについて、その後、72℃で5分間インキュベートすることにより行われた。
【００７８】
尿標本のネスティッドPCRのために、第１増幅産物の10分の1を、ネスティッドHURPプライマー5'-CAACGAAAACAGATGCTC-3'（フォーワード）及び5'-TGAGTAGCTGATCGAGTC-3'（リバース）とともに、94℃で1分間変性、60℃で1分間アニーリング、および72℃で1分間の伸長を30サイクルについて、その後、72℃で5分間インキュベートを行う増幅の第2ラウンドに供した。
【００７９】
テンプレートとしてRTを有さないルーチンのRT-PCRのコントロールは陰性であり、テンプレートとしてpET32a(+)ベクター（Novagen Inc.から購入した）に全長のHURPヌクレオチド配列を挿入することにより図2に示すように構築されたpET32a(+)-HURPを用いたものは陽性であった。増幅産物は、1.5%アガロースゲル中0.1μgのGeneRuler（登録商標）100bp DNAラダー（MBI Fermentas, Lithuania）を用いる電気泳動を使用して分離され、エチジウムブロマイド染色を用いて可視化された。
【００８０】
データの定量化及び標準化
HURP遺伝子のmRNA発現レベルを定量化するために、全てのゲルがImage Master（登録商標）VDSビデオイメージングシステム（Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway）を用いて撮影され、LISCAPイメージキャプチャーソフトウェア（Amersham Pharmacia Biotech Inc., バージョン1.0）を用いて書類に記録した。PCR産物の光学的画素は、ImageMaster（登録商標）TotalLabソフトウェア（Amersham Pharmacia Biotech Inc., バージョン1.11）を用いて任意の単位に定量化された。
【００８１】
試験サンプルを比較するために、データの標準化は必要であった。この目的のために、β-アクチンのPCR増幅産物は、PCRにかけられたcDNAテンプレートと相対的に等しい量を表すために内部標準として使用された。平均値は平均±SD値として表され、Student's t検定を用いて比較された。
【００８２】
結果：
TCC組織サンプル及びコントロール被験者におけるHURP遺伝子の代表的な発現パターンを図3Aに示す。腫瘍に近接する部分よりも11対の腫瘍部分（患者番号：294N/T, 306N/T, 307N/T, 315N/T, 317N/T, 319N/T, 320N/T, 321N/T, 327N/T, 335N/T, 337N/T）において、相対的により多くのヒトHURP遺伝子のmRNA転写物が増幅された（図3A参照。）。組織サンプルの1対（患者番号：322N/T）のみが、両方ともヒトHURP遺伝子の検出できない転写物を示した。内部標準として、β-アクチンのPCR増幅産物（図3B参照。）が、PCRに供されたcDNAテンプレートと相対的に等しい量を表すために使用された。
【００８３】
実施例２：RT-PCR分析によるHURP遺伝子発現の腫瘍特異性の評価
HURPの過剰発現が腫瘍特異性を示すかどうかを決定するために、良性前立腺過形成（BPH）の患者由来の前立腺尿路上皮のヒトHURP転写物が、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を用いて増幅された。
【００８４】
実験は、良性前立腺過形成（BPH）の患者由来の前立腺尿路上皮のHURP転写物が、HURP遺伝子発現が腫瘍特異性を示すかどうかを決定するために逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を用いて増幅された以外は、上の実施例1に示された手順に従って行われた。
【００８５】
標準の膀胱鏡検査法を用いたBPH患者由来の前立腺尿路上皮の15の標本は、集められ、RT-PCRに供された。図4を参照すると、β-アクチン転写物はBPH尿路上皮の5つの代表的なサンプルから等しく増幅されたが、これらのサンプル中にはHURP転写物は検出されなかった。BPHサンプルに加えて、肝臓由来の4サンプル及び心臓由来の4サンプルを含む膀胱でないコントロールが試験され、これらの組織中にはHURP転写物は検出されなかった（データは示していない。）。
【００８６】
実施例３：HURP遺伝子発現のRT-PCR分析による腫瘍段階の評価
HURP遺伝子の過剰発現と腫瘍グレードとの間の可能性のある相関関係を決定するために、TCCを含む組織のサンプル及び対応の腫瘍近接組織サンプルの45対のヒトHURP転写物が分析され、β-アクチン転写物を用いて標準化された。
【００８７】
表1を参照すると、35の腫瘍近接部分（35/45, 77.8%）が腫瘍の部分よりもHURP遺伝子の発現量が少ないこと（グループI, p<0.0001）、及び10の腫瘍近接部分（10/45, 22.2%）が腫瘍部分とほとんど等しい量のHURP遺伝子を示したこと（グループII）は、注目すべきことである。
【００８８】
ゼロのグレードI、37のグレードII、31のグレードIII、12のグレードIVの病理学的同定を有する80人のTCC患者が集められ、組織サンプルのヒトHURP発現比を表IIにリストする。HURP発現と腫瘍グレードとの間に有意な相関関係は存在しないようである。それらの中で、HURP陰性の9の腫瘍、6はグレードII、1はグレードIIIそして2はグレードIVであった。
【００８９】
【表１】
【表２】
実施例４：TCCの検出のためのバイオマーカーとしてのHURP遺伝子発現の評価尿TCC検出のための新規な尿の分子マーカーとしての、尿HURPの潜在的な適用性を評価するために、新たな又は再発したTCCの7人の更なる患者が、RT-PCRを用いて尿HURPについて分析された。全RNAは尿の細胞ペレットから抽出され、oligo-dTプライミングによって逆転写された。増幅反応は、HURP特異的プライマー又はβ-アクチン特異的プライマーを用いて行われた。370塩基対のcDNAは、TCCの全患者の尿の細胞ペレットから増幅された（図5A）。対照的に、7人の更なる個人（3人は尿路感染症、2人は膀胱の慢性炎症、1人は腎細胞癌、1人はBHPを有した。）由来の尿の細胞ペレットは、HURP転写物を有しなかった。コントロールの実験において、307塩基対のβ-アクチンcDNA断片は、コントロールの被験者及びTCC患者の尿から見分けのつかないほど増幅された（図5B）。
【００９２】
本明細書中に引用された全ての特許及び参考文献は、参考として本明細書に全体として援用される。矛盾する場合は、定義を含めた本発明の説明が優先される。
【００９３】
本発明は、上記の特定の実施態様を参照して述べられたが、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく数多くの変更と変形を行うことができるのは明らかである。従って、本発明は添付のクレームに示されたようにのみ限定しようとするものである。
【００９４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はヒトHURP遺伝子のヌクレオチド配列の全長（配列番号1）を示し、ここで本発明に従ってデザインされた4つのプライマーに相補的なヌクレオチド配列は、下線が引かれ、太字になっている；
【図２】 図２は上記の実施例で用いられているベクターpET32a（Novagen Inc.）の制限地図を示し、BamH I制限部位はヒトHURP遺伝子の全長核酸配列を挿入するために使用される。
【図３】 図3A及び3Bはそれぞれ、TCC組織におけるHURP及びβ−アクチンの発現のRT-PCR分析を示し、N=腫瘍近接組織、T=腫瘍組織、および294,306,307,315,317,319,320,321,322,327,335及び337=患者の番号である。
【図４】 図４は5人の良性の前立腺過形成の患者から採取した前立腺の尿路上皮サンプルにおけるヒトHURP発現のRT-PCR分析を示し、ここで左はβ−アクチン（307bp）および右はHURP（370bp）であり、N1,N2,N3,N4及びN5=5つの良性前立腺過形成（BPH）サンプル；NC=ネガティブコントロール；そして、Mは塩基対における分子量マーカーを示す。
【図５】 図5A及び5Bはそれぞれ、排泄された尿サンプル中のHURP及びβ−アクチンの発現のRT-PCR分析を示し、ここで2,6,7,8,14,15,20,5,10,11,12,13,16及び18=患者の番号；NC：ネガティブコントロール；Mは塩基対における分子量マーカーを示す。
Claims (33)
- 膀胱癌を有していると疑われる被験者から得られた生物学的サンプルにおけるヒトＨＵＲＰ遺伝子の発現を検出すること、該検出されたヒトＨＵＲＰ遺伝子の発現が膀胱癌の存在を示すことを含む、ヒト被験者における膀胱癌のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出方法。
- 膀胱癌が膀胱の移行上皮癌（ＴＣＣ）である請求項１に記載の方法。
- 生物学的サンプルが尿路上皮癌細胞、膀胱癌細胞又はそれらの組み合わせからなる群から選ばれる細胞を含む、請求項１に記載の方法。
- 生物学的サンプルが尿及び尿路上皮生検からなる群から選ばれる１種以上である請求項１に記載の方法。
- 生物学的サンプルが尿である請求項４に記載の方法。
- ヒトＨＵＲＰ遺伝子が配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の方法。
- ヒトＨＵＲＰ遺伝子の発現の検出が、生物学的サンプル中のヒトＨＵＲＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の存在を検出することによって行われる、請求項６に記載の方法。
- ヒトＨＵＲＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の存在の検出が以下の方法論：
ハイブリダイゼーション、サイクリングプローブ反応（ｃｙｃｌｉｎｇ ｐｒｏｂｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、マルチプレックスＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応−一本鎖コンフォーメーション多型、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、制限断片長多型核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び転写仲介増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）の少なくとも１つを用いて行われる請求項７に記載の方法。 - ヒトＨＵＲＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の存在の検出がＲＴ−ＰＣＲを用いて行われる請求項７に記載の方法。
- ヒトＨＵＲＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の存在の検出を、以下により行う請求項７に記載の方法：
（ａ）生物学的サンプルから全ＲＮＡを抽出すること；
（ｂ）工程（ａ）で抽出されたＲＮＡを、フォーワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも１つのプライマー対を用いて逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）処理に供すること、各プライマーは、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含むヒトＨＵＲＰ遺伝子にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む；および、
（ｃ）ヒトＨＵＲＰ遺伝子のヌクレオチド配列の一部と同一か又は相補的なヌクレオチド配列を含むＲＴ−ＰＣＲ産物が、工程（ｂ）のＲＴ−ＰＣＲ処理から産生されたかどうかを検出すること、前記ＲＴ−ＰＣＲ産物の存在が膀胱癌の存在を示す。 - 工程（ｂ）で使用される少なくとも１つのプライマー対が、配列番号２及び配列番号４で示される配列から選ばれるヌクレオチド配列を含むフォーワードプライマーと、配列番号３及び配列番号５で示される配列から選ばれるヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含む、請求項１０に記載の方法。
- 工程（ｂ）で使用される少なくとも１つのプライマー対が、配列番号４で示されるヌクレオチド配列を含むフォーワードプライマーと配列番号５で示されるヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含む、請求項１０に記載の方法。
- 工程（ｂ）におけるＲＴ−ＰＣＲ処理が、配列番号２で示されるヌクレオチド配列を含む第１フォーワードプライマーと配列番号３で示されるヌクレオチド配列を含む第１リバースプライマーとを含む第１プライマー対を用いる第１増幅反応、及び配列番号４で示されるヌクレオチド配列を含む第２フォーワードプライマーと配列番号５で示されるヌクレオチド配列を含む第２リバースプライマーとを含む第２プライマー対を用いる第２増幅反応を含む、請求項１０に記載の方法。
- 膀胱癌を有していると疑われる被験者から定期的に得られた生物学的サ
ンプルにおけるヒトＨＵＲＰ遺伝子の発現を検出すること、該検出されたヒトＨＵＲＰ遺伝子の発現が、膀胱癌の存在を示すことを含む、ヒト被験者における膀胱癌のｉｎ ｖｉｔｒｏモニタリング方法。 - 膀胱癌が膀胱の移行上皮癌（ＴＣＣ）である請求項１４に記載の方法。
- 生物学的サンプルが尿路上皮癌細胞、膀胱癌細胞又はそれらの組み合わせからなる群から選ばれる細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
- 生物学的サンプルが尿及び尿路上皮生検からなる群から選ばれる１種以上である請求項１４に記載の方法。
- 生物学的サンプルが尿である請求項１７に記載の方法。
- ヒトＨＵＲＰ遺伝子が配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む請求項１４に記載の方法。
- ヒトＨＵＲＰ遺伝子の発現の検出が、生物学的サンプル中のヒトＨＵＲＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の存在を検出することによって行われる、請求項１９に記載の方法。
- ヒトＨＵＲＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の存在の検出が、以下の方法論：
ハイブリダイゼーション、サイクリングプローブ反応（ｃｙｃｌｉｎｇ ｐｒｏｂｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、マルチプレックスＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応−一本鎖コンフォーメーション多型、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、制限断片長多型核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び転写仲介増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）の少なくとも１つを用いて行われる請求項２０に記載の方法。 - ヒトＨＵＲＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の存在の検出がＲＴ−ＰＣＲを用いて行われる請求項２０に記載の方法。
- ヒトＨＵＲＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の存在の検出を、以下により行う請求項２０に記載の方法：
（ａ'）生物学的サンプルから全ＲＮＡを抽出すること；
（ｂ'）工程（ａ'）で抽出されたＲＮＡを、フォーワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも１つのプライマー対を用いて逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）処理に供すること、各プライマーは、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含むヒトＨＵＲＰ遺伝子にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む；及び、
（ｃ'）ヒトＨＵＲＰ遺伝子のヌクレオチド配列の一部と同一か又は相補的なヌクレオチド配列を含むＲＴ−ＰＣＲ産物が、工程（ｂ'）のＲＴ−ＰＣＲ処理で産生されたかどうかを検出し、前記ＲＴ−ＰＣＲ産物の存在が膀胱癌の存在を示す。 - 工程（ｂ'）で使用される少なくとも１つのプライマー対が、配列番号２及び配列番号４で示される配列から選ばれるヌクレオチド配列を含むフォーワードプライマーと配列番号３及び配列番号５で示される配列から選ばれるヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含む、請求項２３に記載の方法。
- 工程（ｂ'）で使用される少なくとも１つのプライマー対が、配列番号４で示されるヌクレオチド配列を含むフォーワードプライマーと配列番号５で示されるヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含む、請求項２３に記載の方法。
- 工程（ｂ'）におけるＲＴ−ＰＣＲ処理が、配列番号２で示されるヌクレオチド配列を含む第１フォーワードプライマーと配列番号３で示されるヌクレオチド配列を含む第１リバースプライマーを含む第１プライマー対を用いた第１増幅反応、及び配列番号４で示されるヌクレオチド配列を含む第２フォーワードプライマーと配列番号５で示されるヌクレオチド配列を含む第２リバースプライマーとを含む第２プライマー対を用いた第２増幅反応を含む、請求項２３に記載の方法。
- 配列番号２及び配列番号４で示される配列から選ばれるヌクレオチド配列を含むフォーワードプライマーと、配列番号３及び配列番号５で示される配列から選ばれるヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含む、ヒト被験者における膀胱癌を検出するためのプライマーセット。
- フォーワードプライマーが配列番号２で示されるヌクレオチド配列を含む請求項２７に記載のプライマーセット。
- フォーワードプライマーが配列番号４で示されるヌクレオチド配列を含む請求項２７に記載のプライマーセット。
- リバースプライマーが配列番号３で示されるヌクレオチド配列を含む請求項２７に記載のプライマーセット。
- リバースプライマーが配列番号５で示されるヌクレオチド配列を含む請求項２７に記載のプライマーセット。
- 配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含むヒトＨＵＲＰ遺伝子に基づいてデザインされた少なくとも１つのプライマー対を含み、前記少なくとも１つのプライマー対が配列番号２及び配列番号４に記載の配列から選択されるヌクレオチド配列を含むフォーワードプライマー、ならびに配列番号３及び配列番号５に記載される配列から選択されるヌクレオチド配列を含むリバースプライマーを含む、ヒト被験者における膀胱癌の検出のための診断キット。
- 配列番号２で示されるヌクレオチド配列を含む第１フォーワードプライマーと配列番号３で示されるヌクレオチド配列を含む第１リバースプライマーとを含む第１プライマー対、及び配列番号４で示されるヌクレオチド配列を含む第２フォーワードプライマーと配列番号５で示されるヌクレオチド配列を含む第２リバースプライマーを含む第２プライマー対を含む、請求項３２に記載の診断キット。
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