JP2002515591A

JP2002515591A - 結腸癌を診断し、モニターし、そして病期決定する新規方法

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Publication number: JP2002515591A
Application number: JP2000549767A
Authority: JP
Inventors: マシナ，ロベルト・エイ; ヤン，フェイ; スン，ヨンミン
Original assignee: ダイアデクスアス・インコーポレーテッド
Priority date: 1998-05-21
Filing date: 1999-05-12
Publication date: 2002-05-28
Anticipated expiration: 2019-05-12
Also published as: DE69929785T2; EP1080227A1; EP1080227A4; ATE317451T1; JP3538381B2; WO1999060161A1; EP1080227B1; CA2328128A1; DE69929785D1

Abstract

(57)【要約】本発明は結腸癌を検出し、診断し、モニターし、病期決定し、そして予後判定するための新規方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、部分的に、癌、特に結腸癌を検出し、診断し、モニターし、病期決
定し、そして予後判定するための、新たに開発されたアッセイに関する。発明の背景結腸癌は、米国において、二番目に多く頻繁に診断される悪性腫瘍（ｍａｌｉ
ｇｎａｎｃｙ）である。胃腸管の癌、特に結腸癌は、非常に治療可能であり、そ
して腸（ｂｏｗｅｌ）に局在する場合、しばしば治癒可能な疾患である。しかし
、現在、結腸癌は、癌での死亡の二番目に多い原因である。手術が主な治療であ
り、そして患者のおよそ５０％が治癒する。手術後の再発が主な問題であり、そ
してしばしば死の究極的な原因である。結腸癌の予後は、明らかに、腸壁を通じ
た腫瘍の浸透の度合いおよび結節関与の有無に関連する。これらの２つの特性が
、本疾患に関し開発されたすべての病期決定系の基本を成す。腸閉塞および腸穿
孔は、予後不良の指標である。癌胎児性抗原（ＣＥＡ）および炭水化物抗原１９
−９（ＣＡ１９−９）の血清レベルが治療前に上昇している場合もまた、有意
に予後が陰性である。

【０００２】疾患頻度が高く（新規の結腸癌症例は毎年およそ１６０，０００）、高リスク
群が同定され、原発病巣の増殖が遅いことが立証され、初期病巣では生存率が高
く、そしてスクリーニング試験が比較的単純でそして正確であるため、結腸癌に
関するスクリーニングは、５０歳以上のすべての成人、特に結腸直腸癌患者の一
親等の親族である成人のための、日常的な医療の一部であるべきである。

【０００３】結腸癌を検出し、診断し、モニターし、病期決定し、そして予後判定するため
に用いられる方法は、患者の結果に非常に重要である。例えば、初期結腸癌と診
断された患者は、一般的に、遠隔転移結腸癌と診断された患者の生存率に比べ、
はるかに高い５年生存率を有する。治療決定は、通常、病期決定のためのより古
いＤｕｋｅｓまたは修飾Ａｓｔｌｅｒ−Ｃｏｌｌｅｒ（ＭＡＣ）分類計画を参考
にして行われる。しかし、明らかに、初期結腸癌を検出するための、より感度が
高くそして特異的な新規診断法が必要である。

【０００４】さらに、結腸癌患者は、最初の療法後、そして補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）療
法中、療法に対する反応を測定し、そして転移の持続または再発疾患を検出する
ため、綿密にモニターしなければならない。したがって、結腸癌再発を検出する
のに、より感度が高くそして特異的な結腸癌マーカーが、明らかに必要である。

【０００５】結腸癌を管理する、別の重要な段階は、患者の疾患の病期を決定することであ
る。病期決定は、予後判定に有用である可能性があり、そして最適な療法を設計
するための規準を提供する。病理学的な病期決定は、より正確な予後を提供する
ため、現在、結腸癌の病理学的な病期決定が、臨床的な病期決定より好ましい。
しかし、臨床的な病期決定は、病理学的評価のための組織を得る侵襲処置に依存
しないため、臨床的な病期決定法が少なくとも病理学的な病期決定と同程度に正
確であれば、臨床的病理決定が好ましいであろう。結腸癌の病期決定は、細胞、
組織、または体液において、侵襲の異なる病期の間を区別することが可能な新規
マーカーを検出することにより、改善されるであろう。

【０００６】本発明において、９つの結腸特異的遺伝子（ＣＳＧ）を介し、結腸癌、特に結
腸、胃、および小腸癌を検出し、診断し、モニターし、病期決定し、そして予後
判定するための方法が提供される。これらの９つのＣＳＧは、とりわけ、配列番
号１、２、３、４、５、６、７、８または９のいかなるものでもよいポリヌクレ
オチド配列を含む遺伝子により発現される天然タンパク質を指す。あるいは、本
明細書において、９つのＣＳＧにより、配列番号１、２、３、４、５、６、７、
８または９の配列のポリヌクレオチド配列のいかなるものでもよいものを含む遺
伝子によりコードされる天然ｍＲＮＡ、あるいは配列番号１、２、３、４、５、
６、７、８または９のポリヌクレオチド配列のいかなるものでもよいものを含む
遺伝子のレベルを意味する。

【０００７】本発明の他の目的、特徴、利点および側面は、以下の説明から当業者に明らか
になるであろう。しかし、以下の説明および特定の実施例は、本発明の好ましい
態様を示す一方で、例示の手段としてのみ提示されることが理解されなければな
らない。開示される発明の精神および範囲内の多様な変化および修飾は、以下の
説明を読むことにより、そして本開示の他の部分を読むことにより、当業者に容
易に明らかになるであろう。発明の概要これらの、そして他の目的に向け、患者における結腸癌の存在を診断するため
の方法であって、患者由来の細胞、組織または体液の試料におけるＣＳＧのレベ
ルを測定し、そしてＣＳＧの該測定レベルを、コントロールの、好ましくは同じ
種類の細胞、組織、または体液におけるＣＳＧのレベルと比較する、ここでコン
トロールにおけるＣＳＧレベルに対する患者における測定ＣＳＧレベルの増加は
、結腸癌と関連する、ことを含む前記方法を提供するのが、本発明の目的である
。

【０００８】本発明の別の目的は、患者における転移性結腸癌を診断する方法であって、患
者由来の細胞、組織または体液の試料におけるＣＳＧレベルを測定し、そして該
測定ＣＳＧレベルを、コントロールの、好ましくは同じ種類の細胞、組織、また
は体液におけるＣＳＧのレベルと比較する、ここでコントロールにおけるＣＳＧ
レベルに対する患者における測定ＣＳＧレベルの増加は、転移している癌と関連
する、ことを含む前記方法を提供することである。

【０００９】本発明の別の目的は、患者における結腸癌を病期決定する方法であって、結腸
癌を有する患者を同定し、該患者から得た細胞、組織、または体液の試料におけ
るＣＳＧのレベルを測定し、そして該測定ＣＳＧレベルを、コントロールの、好
ましくは同じ種類の細胞、組織または体液におけるＣＳＧのレベルと比較するこ
とを含む前記方法を提供することである。コントロールにおけるＣＳＧレベルに
対する患者における測定ＣＳＧレベルの増加は、進行している癌と関連する可能
性があり、一方、コントロールに対する患者における測定ＣＳＧの減少したまた
は同等のレベルは、後退または緩解している癌と関連する可能性がある。

【００１０】本発明の別の目的は、転移の開始に関し、患者における結腸癌をモニターする
方法を提供することである。該方法は、転移していることが知られていない結腸
癌を有する患者を同定し、該患者から得た細胞、組織、または体液の試料におけ
るＣＳＧのレベルを定期的に測定し、そして該測定ＣＳＧレベルを、コントロー
ルの、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液におけるＣＳＧのレベルと
比較する、ここでコントロールＣＳＧレベルに対する測定ＣＳＧレベルの増加は
、転移している癌と関連する、ことを含む前記方法を提供することである。

【００１１】本発明のさらに別の目的は、患者における結腸癌の病期の変化をモニターする
方法であって、結腸癌を有する患者を同定し、該患者から得た細胞、組織、また
は体液の試料におけるＣＳＧのレベルを定期的に測定し、そして該測定ＣＳＧレ
ベルを、コントロールの、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液におけ
るＣＳＧのレベルと比較する、ここでコントロールＣＳＧレベルに対する測定Ｃ
ＳＧレベルの増加は、進行している癌と関連し、そしてコントロールＣＳＧレベ
ルに対する測定ＣＳＧレベルの減少は、後退または緩解している癌と関連する、
ことを含む前記方法を提供することである。

【００１２】本発明の他の目的、特徴、利点および側面は、以下の説明から当業者に明らか
になるであろう。しかし、以下の説明および特定の実施例は、本発明の好ましい
態様を示す一方で、例示の手段としてのみ提示されることが理解されなければな
らない。開示される発明の精神および範囲内の多様な変化および修飾は、以下の
説明を読むことにより、そして本開示の他の部分を読むことにより、当業者に容
易に明らかになるであろう。発明の詳細な説明本発明は、ＣＳＧレベルを健常ヒトコントロールにおけるＣＳＧレベルと比較
することにより、癌を検出し、診断し、モニターし、病期決定し、そして予後判
定するための、定量的かつ定性的な診断アッセイおよび方法に関する。本明細書
において、「ＣＳＧレベル」により、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８
または９のいかなるものでもよいポリヌクレオチド配列を含む遺伝子により発現
される天然タンパク質のレベルを意味する。あるいは、本明細書において、「Ｃ
ＳＧレベル」により、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８または９のポリ
ヌクレオチド配列のいかなるものでもよいものを含む遺伝子のいかなるものでも
よいものによりコードされる天然ｍＲＮＡ、あるいは配列番号１、２、３、４、
５、６、７、８または９のポリヌクレオチド配列のいかなるものでもよいものを
含む遺伝子のレベルを意味する。こうしたレベルは、好ましくは、少なくとも１
つの細胞、組織および／または体液で測定され、正常および異常レベルの決定を
含む。したがって例えば、正常なコントロール体液、細胞、または組織試料に比
較した、いかなる１つでもよいＣＳＧタンパク質の過剰発現を診断するため、本
発明に一致した診断アッセイを用い、結腸癌を含む癌の存在を診断してもよい。
本発明の方法において、９つのＣＳＧのいずれを単独で測定してもよいし、ある
いは９つをすべて共にまたはいかなる組み合わせで測定してもよい。

【００１３】「コントロール」により、癌でないヒト患者および／または該患者由来の非癌
性試料を意味し、また、本明細書において、健常ヒトコントロールも指す；転移
に関し診断するまたはモニターするための方法において、コントロールはまた、
信頼できる方法により、転移していない結腸癌を有すると決定されたヒト患者由
来の試料も含んでもよい。

【００１４】本発明の方法はすべて、所望により、ＣＳＧと共に他の癌マーカーのレベルを
測定することを含んでもよい。ＣＳＧに加え、本発明に有用な他の癌マーカーは
、試験される癌に依存するであろうし、そして当業者に知られる。

【００１５】診断アッセイ本発明は、ヒト健常コントロール由来の、好ましくは同じ種類の細胞、組織ま
たは体液におけるＣＳＧのレベルと比較した、細胞、組織または体液におけるＣ
ＳＧのレベルの変化に関し解析することにより、結腸癌の存在を診断する、ここ
で健常ヒトコントロールに対する患者におけるＣＳＧレベルの増加は、結腸癌の
存在と関連する、ための方法を提供する。本発明を限定することなく、典型的に
は、定量的な診断アッセイに関し、試験された患者が癌を有することを示す陽性
の結果は、ＣＳＧなどの癌マーカーの細胞、組織、または体液レベルが、健常ヒ
トコントロールの、好ましくは同じ細胞、組織、または体液におけるより、少な
くとも２倍高く、そして最も好ましくは少なくとも５倍高いものである。

【００１６】本発明はまた、転移の開始に関し、まだ転移していない結腸癌を有する患者に
おいて、転移性結腸癌を診断する方法も提供する。本発明の方法において、転移
している可能性がある（が、転移していることが既に知られていない）結腸癌を
有すると疑われるヒト癌患者が同定される。これは、当業者に知られる多様な手
段により達成される。例えば、結腸癌の場合、典型的には、患者は、伝統的な検
出法の後、結腸癌と診断される。

【００１７】本発明において、細胞、組織、または体液におけるＣＳＧレベルの存在の決定
は、転移していない結腸癌および転移している結腸癌の間を区別するのに、特に
有用である。既存の技術では、転移している結腸癌および転移していない結腸癌
の間を区別するのは困難であり、そして適切な治療選択は、しばしばこうした知
識に依存する。

【００１８】本発明において、こうした細胞、組織、または体液において測定される癌マー
カーレベルは、ＣＳＧであり、そして健常ヒトコントロールの、好ましくは同じ
種類の細胞、組織、または体液におけるＣＳＧレベルと比較される。すなわち、
観察される癌マーカーが、血清中のＣＳＧのみである場合、本レベルは、好まし
くは健常ヒト患者の血清におけるＣＳＧレベルと比較される。健常ヒトコントロ
ールに対する患者におけるＣＳＧの増加は、転移している結腸癌に関連する。

【００１９】本発明を限定することなく、典型的には、定量的な診断アッセイに関し、試験
されるまたはモニターされる患者における癌が転移していることを示す陽性の結
果は、ＣＳＧなどの癌マーカーの細胞、組織または体液レベルが、健常患者の、
好ましくは同じ細胞、組織、または体液におけるより、少なくとも２倍高く、そ
して最も好ましくは少なくとも５倍高いものである。

【００２０】本明細書において、健常ヒトコントロールには、癌でないヒト患者および／ま
たは該患者由来の非癌性試料が含まれ；転移に関し診断するまたはモニターする
ための方法において、健常ヒトコントロールはまた、信頼できる方法により、転
移していない結腸癌を有すると決定されたヒト患者由来の試料も含んでもよい。

【００２１】病期決定本発明はまた、ヒト患者における結腸癌を病期決定する方法も提供する。本方法は、こうした癌を有するヒト患者を同定し；こうした患者由来の細胞、
組織、または体液の試料を、ＣＳＧに関し、解析することを含む。その後、該方
法は、こうした細胞、組織、または体液におけるＣＳＧレベルを、健常ヒトコン
トロール試料の、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液と比較する、こ
こで健常ヒトコントロール試料に対する患者におけるＣＳＧレベルの増加は、進
行している癌と関連し、そしてＣＳＧのレベルの減少は、後退または緩解してい
る癌と関連する。

【００２２】モニターさらに提供されるのは、転移の開始に関し、こうした癌を有するヒトにおける
結腸癌をモニターする方法である。該方法は、転移していることが知られていな
い癌を有するヒト患者を同定し；こうした患者由来の細胞、組織、または体液の
試料をＣＳＧに関し定期的に解析し；こうした細胞、組織、または体液における
該ＣＳＧレベルを、健常ヒトコントロール試料の、好ましくは同じ種類の細胞、
組織、または体液におけるＣＳＧのレベルと比較する、ここで健常ヒトコントロ
ールに対する患者におけるＣＳＧレベルの増加は、転移している癌と関連する、
ことを含む。

【００２３】本発明にさらに提供されるのは、こうした癌を有するヒトにおける結腸癌の病
期の変化をモニターする方法である。該方法は、こうした癌を有するヒト患者を
同定し；こうした患者由来の細胞、組織、または体液の試料をＣＳＧに関し定期
的に解析し；こうした細胞、組織、または体液における該ＣＳＧレベルを、健常
ヒトコントロール試料の、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液におけ
るＣＳＧのレベルと比較する、ここで健常ヒトコントロールに対する患者におけ
るＣＳＧレベルの増加は、病期が進行している癌と関連し、そしてＣＳＧのレベ
ルの減少は、病期が後退または緩解している癌と関連する、ことを含む。

【００２４】転移の開始に関する、こうした患者のモニターは、定期的であり、そして好ま
しくは、原則として年４回行われる。しかし、癌、特定の患者、および癌の病期
に応じ、この頻度はより多くてもまたは少なくてもよい。

【００２５】アッセイ技術宿主由来の試料における、本発明のＣＳＧなどの、遺伝子発現のレベルを決定
するのに用いてもよいアッセイ技術は、当業者に周知である。こうしたアッセイ
法には、ラジオイムノアッセイ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ、
免疫組織化学アッセイ、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ、競合
結合アッセイ、ウェスタンブロット解析およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。
とりわけ、ＥＬＩＳＡは、生物学的流体における遺伝子の発現タンパク質を診断
するのに、しばしば好ましい。商業的供給源から容易に入手可能でない場合、Ｅ
ＬＩＳＡアッセイは、まず、ＣＳＧに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル
抗体を調製することを含む。さらに、一般的に、ＣＳＧに特異的に結合するレポ
ーター抗体が調製される。レポーター抗体は、検出可能な試薬、例えば放射能、
蛍光または酵素的試薬、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素またはアルカリ
ホスファターゼに付着している。

【００２６】ＥＬＩＳＡを実行するため、ＣＳＧに特異的な抗体を、ポリスチレンプレート
など、抗体に結合する固体支持体上でインキュベーションする。その後、非特異
的タンパク質、例えばウシ血清アルブミンとインキュベーションすることにより
、プレート上のいかなる未結合のタンパク質結合部位も、被覆される。次に、解
析しようとする試料を、プレート中でインキュベーションし、その間、ＣＳＧは
、ポリスチレンプレートに付着している特異的抗体に結合する。未結合試料を緩
衝液で洗い流す。ＣＳＧに特異的に向けられ、そして西洋ワサビペルオキシダー
ゼに連結されているレポーター抗体をプレートに加え、その結果ＣＳＧに結合し
ているいかなるモノクローナル抗体に対してもレポーター抗体が結合する。その
後、未結合レポーター抗体を洗い流す。その後、比色基質を含む、ぺルオキシダ
ーゼ活性のための試薬をプレートに添加する。ＣＳＧ抗体に結合している固定化
ペルオキシダーゼは、呈色反応産物を生じる。既定の期間に現れた色の量は、試
料に存在するＣＳＧタンパク質の量に比例する。定量的結果は、典型的には、標
準曲線に照合することにより、得られる。

【００２７】競合アッセイを使用してもよく、該アッセイでは、ＣＳＧに特異的な抗体が、
固体支持体に付着しており、そして標識ＣＳＧおよび宿主由来の試料を該固体支
持体上に流す。すると、固体支持体に付着している、検出される標識の量は、試
料におけるＣＳＧの量と相関し得る。核酸法を用い、結腸癌のマーカーとしてＣ
ＳＧｍＲＮＡを検出してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および他の
核酸法、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および核酸配列に基づく増幅（ＮＡ
ＳＡＢＡ）を用い、多様な悪性腫瘍の診断およびモニターのため、悪性細胞を検
出してもよい。例えば、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、何千もの他のｍ
ＲＮＡ種の複合混合物における、特定のｍＲＮＡ集団の存在を検出するのに用い
ることが可能な、強力な技術である。ＲＴ−ＰＣＲでは、まず逆転写酵素を使用
し、ｍＲＮＡ種を相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写し；その後ｃＤＮＡを標準
的ＰＣＲ反応におけるように、増幅する。したがって、ＲＴ−ＰＣＲは、増幅に
より、単一種のｍＲＮＡの存在を明らかにすることが可能である。したがって、
ｍＲＮＡが該ｍＲＮＡを産生する細胞に非常に特異的である場合、ＲＴ−ＰＣＲ
を用い、特定の種類の細胞の存在を同定することが可能である。

【００２８】固体支持体上にアレー化されているクローンまたはオリゴヌクレオチドに対す
るハイブリダイゼーション（すなわち、格子化（gridding））を用い、その遺伝
子の発現を検出し、そしてかつ該遺伝子の発現レベルを定量化してもよい。本ア
プローチにおいて、ＣＳＧ遺伝子をコードするｃＤＮＡは、支持体に固定されて
いる。支持体は、限定されるわけではないが、ガラス、ニトロセルロース、ナイ
ロンまたはプラスチックを含む、いかなる適切な種類でもよい。ＣＳＧ遺伝子を
コードするＤＮＡの少なくとも一部は、支持体に付着し、そしてその後、目的の
組織から単離されたＲＮＡでもまたはＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピー
でもよい解析物とインキュベーションする。支持体結合ＤＮＡおよび解析物の間
のハイブリダイゼーションを、限定されるわけではないが、解析物の放射能標識
または蛍光標識、あるいはハイブリッドを検出するよう設計された二次分子を含
む、いくつかの手段により、検出しそして定量化してもよい。遺伝子発現レベル
の定量化は、解析物由来のシグナルの強度を、既知の標準から決定されるものと
比較することにより、行ってもよい。標準は、標的遺伝子をｉｎｖｉｔｒｏ転
写し、収量を定量化し、そしてその後その要素を用いて標準曲線を生成すること
により、得てもよい。

【００２９】上記の試験は、多様な患者細胞、体液および／または組織抽出物（ホモジェネ
ートまたは可溶化組織）、例えば組織生検および検死素材由来の試料に対し、行
ってもよい。本発明に有用な体液には、血液、尿、唾液、またはいかなる他の体
の分泌物またはその派生物も含まれる。血液には、全血、血漿、血清、またはい
かなる血液派生物を含んでもよい。

【００３０】

【実施例】

本発明は、以下の実施例により、さらに説明される。これらの実施例は、特定
の態様に言及することにより、もっぱら本発明を例示するためにのみ提供される
。これらの例示は、本発明の特定の側面を例示するが、限定を表現せず、または
開示される発明を制限しない。実施例１：ＣＳＧＩｎｃｙｔｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、カリフォルニア州パロアル
トから入手可能なＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）データベースの一部として以下の
検索ツールを用い、検索を行い、そしてＣＳＧを同定した：１．ライブラリー比較（１つのライブラリーを他の１つのライブラリーと比較す
る）は、腫瘍で発現され、そして正常組織に存在しないまたは正常組織で、より
低いレベルで発現されるクローンの同定を可能にする。２．サブセット化（ｓｕｂｓｅｔｔｉｎｇ）は、ライブラリー比較と類似である
が、ライブラリーのプールで発現され、そして第二のライブラリーのプールに存
在しないまたは第二のライブラリーのプールで、より低いレベルで発現されるク
ローンの同定を可能にする。３．転写画像化は、存在量に基づき、単一のライブラリーまたはライブラリーの
プールにおけるすべてのクローンをリストアップする。その後、電子ノーザン（
ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＮｏｒｔｈｅｒｎ）を用い、個々のクローンを調べ、そ
の構成要素ＥＳＴの組織供給源を決定してもよい。４．タンパク質機能：Ｉｎｃｙｔｅは、既知のタンパク質に対する相同性に基づ
き、タンパク質機能を持つ可能性があるＥＳＴのサブセットを同定してきている
。本データベースのいくつかの例には、転写因子およびプロテアーゼが含まれる
。我々は、その構成要素ＥＳＴが疾患特異性を示すクローンに関し、本データベ
ースを検索することにより、いくつかのリード遺伝子（ｌｅａｄ）を同定した。

【００３１】電子サブトラクション、転写画像化およびタンパク質機能検索を用い、その構
成要素ＥＳＴが、特定の腫瘍由来のライブラリーでのみ、または該ライブラリー
で、より頻繁に見られるクローンを同定した。各ＥＳＴが生じた場所を確かめる
ことにより、個々の候補クローンを詳細に調べた。

【００３２】表１：ＣＳＧ

【００３３】

【表１】

【００３４】別に詳細に記載される場合を除き、当業者に周知でそして日常的な標準的技術
を用い、以下の実施例を行った。以下の実施例の日常的な分子生物学的技術は、
標準的な実験室マニュアル、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，第二版；Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ニ
ューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）に記載されるように行っ
てもよい。実施例２：ＣＳＧ遺伝子発現の相対定量化蛍光Ｔａｑｍａｎプローブを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲは、ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性を利用した、定量化検出系であ
る。該方法は、５’レポーター色素および下流の３’消光色素で標識された内部
蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（Ｔａｑｍａｎ）を使用する。ＰＣＲ中、Ｔａ
ｑＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性は、レポーターを放出し
、その蛍光をその後、モデル７７００配列検出系（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）のレーザー検出
装置により、検出してもよい。

【００３５】内因性コントロールの増幅を用い、反応に添加された試料ＲＮＡの量を標準化
し、そして逆転写酵素（ＲＴ）効率を正規化する。シクロフィリン、グリセルア
ルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）または１８Ｓリボソーム
ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のいずれかをこの内因性コントロールとして用いる。調べた
すべての試料の間の相対定量化を計算するため、１つの試料に関する標的ＲＮＡ
レベルを、比較結果の基本として用いる（基準値（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ））。
「基準値」に対し相対的な定量化は、標準曲線法または比較法を用い、得ること
が可能である（ＵｓｅｒＢｕｌｌｅｔｉｎ＃２：ＡＢＩＰＲＩＳＭ７
７００配列検出系）。

【００３６】ＣＳＧの組織分布、並びに正常および腫瘍組織におけるレベルを評価するため
、正常組織、腫瘍組織から、そして腫瘍および対応正常組織から、総ＲＮＡを抽
出した。続いて、逆転写酵素で第一鎖ｃＤＮＡを調製し、そしてＣＳＧに特異的
なプライマーおよびＴａｑｍａｎプローブを用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行っ
た。ＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００配列検出装置を用い、結果を解析した。無名
数（ａｂｓｏｌｕｔｅｎｕｍｂｅｒ）は、基準値に比較したＣＳＧの相対発現
レベルである。

【００３７】比較例比較のため、診断マーカーＰＳＡ（前立腺特異的抗原）およびＰＬＡ２（ホス
ホリパーゼＡ２）をコードする遺伝子に関する類似のｍＲＮＡ発現解析を行った
。ＰＳＡは、臨床実験室で現在入手可能な、唯一の癌スクリーニングマーカーで
ある。一連の正常組織のプールを解析した際、ＰＳＡは非常に高いレベルで前立
腺に発現し、乳房および精巣では発現が非常に低かった。１４の異なる組織由来
の５５以上の対応する試料を解析したデータにより、正常組織試料で見られる組
織特異性が確認された。前立腺組織の１２の対応する試料に関し、癌および正常
隣接組織におけるＰＳＡ発現を比較した。ＰＳＡの相対レベルは、１０の癌試料
において、より高かった（８３％）。最近得られた臨床データにより、前立腺癌
の病期が後期であることの病期決定マーカーとしてＰＬＡ２を利用することが支
持される。本明細書に記載されるｍＲＮＡ発現データは、解析した１２の前立腺
対応試料のうち８つでｍＲＮＡの過剰発現を示した（６６％）。ＰＬＡ２は、小
腸、前立腺、肝臓、および膵臓で、高レベルのｍＲＮＡ発現を示した。

【００３８】配列番号３；クローン番号１３４１７０１；遺伝子番号２９６３４（Ｃｌｎ１
０６）の測定表２に示される無名数は、１２の正常な異なる組織におけるＣｌｎ１０６（配
列番号３）の相対発現レベルである。すべての値は、正常精巣（基準値）に比較
したものである。これらのＲＮＡ試料は、商業的に入手可能なプールであり、異
なる個体由来の特定の組織の試料をプールすることにより生じたものである。

【００３９】表２：プール試料におけるＣｌｎ１０６発現の相対レベル

【００４０】

【表２】

【００４１】表２の相対発現レベルは、ＣＳＧＣｌｎ１０６（配列番号３）に関し、ｍＲ
ＮＡ発現が、前立腺（１６）に比較し、正常上行結腸のプール（１１０）で６倍
以上高いことを示す。相対発現レベル１の、基準値である精巣は、Ｃｌｎ１０６
（配列番号３）のｍＲＮＡを発現する唯一の他の組織である。これらの結果は、
本ＣＳＧのｍＲＮＡ発現は、結腸に非常に特異的であることを立証する。

【００４２】表２における無名数は、異なる個体由来の特定の組織の試料のプールを解析し
て得た。これらを、表３−５における単一の個人の組織試料から得たＲＮＡから
生じた無名数と比較することは不可能である。

【００４３】表３−５における無名数は、５７対の対応する試料におけるＣｌｎ１０６（配
列番号３）の相対発現レベルである。すべての値は、正常精巣（基準値）に比較
したものである。対応する対は、特定の組織の癌試料由来のｍＲＮＡおよび同一
個体の同一組織の正常隣接試料由来のｍＲＮＡにより、形成される。

【００４４】表３−５：個々の試料におけるＣｌｎ１０６発現の相対レベル

【００４５】

【表３】

【００４６】

【表４】

【００４７】

【表５】

【００４８】０＝陰性対応試料を解析した際、結腸で発現レベルがより高く、本組織に関し高い度合
いの組織特異性が示された。これらの結果により、一連の正常プール試料で得ら
れた組織特異性結果（表２）が確認される。さらに、同一個体由来の癌試料およ
び同種同系正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現レベルを比較した。本比較は、癌
病期に関する特異性の目安を提供する（例えば正常隣接試料に比較した癌試料に
おける、より高いｍＲＮＡ発現レベル）。表３−５は、それぞれの正常隣接組織
と比較した１５の結腸癌組織（結腸試料＃１、２、３、４、５、６、８、９、１
０、１２、１３、１６、２０、２１、および２２）におけるＣｌｎ１０６（配列
番号３）の過剰発現を示す。試験した結腸対応試料の６５％に関し、癌組織にお
ける過剰発現が見られる（総数２３の結腸対応試料）。対応試料Ｐａｎ７１Ｘ
Ｌは、膵臓における続発癌であり、該個体における原発癌は十二指腸癌であった
。

【００４９】要するに、高レベルの組織特異性に加え、試験した結腸対応試料の６５％での
ｍＲＮＡ過剰発現は、ＣＳＧＣｌｎ１０６（配列番号３）が、結腸癌の診断マ
ーカーであることを立証する。

【００５０】配列番号４；クローン番号８１６２５７；遺伝子番号４０６４５２（Ｃｌｎ１
０７）の測定表６に示される無名数は、１２の正常な異なる組織におけるＣＳＧＣｌｎ１
０７（配列番号４）の相対発現レベルである。すべての値は、正常小腸（基準値
）に比較したものである。これらのＲＮＡ試料は、商業的に入手可能なプールで
あり、異なる個体由来の特定の組織の試料をプールすることにより生じたもので
ある。

【００５１】表６：プール試料におけるＣｌｎ１０７発現の相対レベル

【００５２】

【表６】

【００５３】表６の相対発現レベルは、ＣＳＧＣｌｎ１０７（配列番号４）のｍＲＮＡ発
現が、次に高い発現組織（腎臓の０．２）に比較し、正常上行結腸のプール（３
．２）で１０倍以上高く、小腸（１）で５倍高く、そして胃（０．３）で１．５
倍高いことを示す。解析されたプール組織試料のうち７つは陰性であり、そして
前立腺は、Ｃｌｎ１０７（配列番号４）に関し０．１の相対発現を示した。これ
らの結果は、Ｃｌｎ１０７ｍＲＮＡ発現は、結腸、小腸に非常に特異的であり
、そしてより低い度合いで胃に特異的であることを立証する。

【００５４】表６における無名数は、異なる個体由来の特定の組織の試料のプールを解析し
て得た。これらを、表７−９における単一の個人の組織試料から得たＲＮＡから
生じた無名数と比較することは不可能である。

【００５５】表７−９における無名数は、５７対の対応する試料におけるＣｌｎ１０７（配
列番号４）の相対発現レベルである。すべての値は、正常精巣（基準値）に比較
したものである。対応する対は、特定の組織の癌試料由来のｍＲＮＡおよび同一
個体の同一組織の正常隣接試料由来のｍＲＮＡにより、形成される。

【００５６】表７−９：個々の試料におけるＣｌｎ１０７発現の相対レベル

【００５７】

【表７】

【００５８】

【表８】

【００５９】

【表９】

【００６０】０＝陰性対応試料を解析した際、結腸、胃、および小腸で発現レベルがより高く、結腸
組織に関し高い度合いの組織特異性が示された。これらの結果により、一連の正
常プール試料で得られた組織特異性結果（表６）が確認される。さらに、同一個
体由来の癌試料および同種同系正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現レベルを比較
した。本比較は、癌病期に関する特異性の目安を提供する（例えば正常隣接試料
に比較した癌試料における、より高いｍＲＮＡ発現レベル）。表７−９は、それ
ぞれの正常隣接組織と比較した１１の結腸癌組織（結腸試料＃５、７、１０、１
１、１２、１３、１５、１７、１８、２０、および２１）におけるＣｌｎ１０７
（配列番号４）の過剰発現を示す。試験した結腸対応試料の４８％に関し、癌組
織における過剰発現が見られる（総数２３の結腸対応試料）。対応試料Ｐａｎ
７１ＸＬは、膵臓における続発癌であり、該個体における原発癌は十二指腸癌で
あった。

【００６１】要するに、高レベルの組織特異性に加え、試験した結腸、胃、および小腸対応
試料のほぼ半数でのｍＲＮＡ過剰発現は、ＣＳＧＣｌｎ１０７（配列番号４）
が、結腸癌の診断マーカーであることを立証する。

【００６２】配列番号５；クローン番号７７５１３３；遺伝子番号２４５０８（Ｃｌｎ１０
８）の測定表１０に示される無名数は、１２の正常な異なる組織におけるＣＳＧＣｌｎ
１０８（配列番号５）の相対発現レベルである。すべての値は、正常小腸（基準
値）に比較したものである。これらのＲＮＡ試料は、商業的に入手可能なプール
であり、異なる個体由来の特定の組織の試料をプールすることにより生じたもの
である。

【００６３】表１０：プール試料におけるＣｌｎ１０８発現の相対レベル

【００６４】

【表１０】

【００６５】表１０の相対発現レベルは、ＣＳＧＣｌｎ１０８（配列番号５）のｍＲＮＡ
発現が、解析したいかなる他の組織における発現レベルと比較しても、正常上行
結腸のプール（２８４６．５）で１０倍以上高く、そして胃（９９８１．２）で
ほぼ１０倍高いことを示す。これらの結果は、本ＣＳＧのｍＲＮＡ発現もまた、
結腸および胃に非常に特異的であることを立証する。

【００６６】表１０における無名数は、異なる個体由来の特定の組織の試料のプールを解析
して得た。これらを、表１１−１３における単一の個人の組織試料から得たＲＮ
Ａから生じた無名数と比較することは不可能である。

【００６７】表１１−１３における無名数は、５７対の対応する試料におけるＣｌｎ１０８
（配列番号５）の相対発現レベルである。すべての値は、正常小腸（基準値）に
比較したものである。対応する対は、特定の組織の癌試料由来のｍＲＮＡおよび
同一個体の同一組織の正常隣接試料由来のｍＲＮＡにより、形成される。

【００６８】表１１−１３：個々の試料におけるＣｌｎ１０８発現の相対レベル

【００６９】

【表１１】

【００７０】

【表１２】

【００７１】

【表１３】

【００７２】０＝陰性対応試料を解析した際、結腸および胃で発現レベルがより高く、これら２つの
組織に関し高い度合いの組織特異性が示された。これらの結果により、正常プー
ル試料で得られた組織特異性結果（表１０）が確認される。さらに、同一個体由
来の癌試料および同種同系正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現レベルを比較した
。本比較は、癌病期に関する特異性の目安を提供する（例えば正常隣接試料に比
較した癌試料における、より高いｍＲＮＡ発現レベル）。表１１−１３は、それ
ぞれの正常隣接組織と比較した１３の結腸癌組織（結腸試料＃１、５、６、７、
８、９、１０、１１、１２、１３、１８、２１、および２２）におけるＣＳＧ
Ｃｌｎ１０８（配列番号５）の過剰発現を示す。試験した結腸対応試料の５６％
に関し、癌組織における過剰発現が見られる（総数２３の結腸対応試料）。対応
試料Ｐａｎ７１ＸＬは、膵臓における続発癌であり、該個体における原発癌は
十二指腸癌であった。

【００７３】要するに、高レベルの組織特異性に加え、試験した結腸、胃、および小腸対応
試料の半数以上でのｍＲＮＡ過剰発現は、本ＣＳＧ、Ｃｌｎ１０８（配列番号５
）もまた、結腸癌の診断マーカーであることを立証する。

【００７４】配列番号７；クローン番号２３４８１２２；遺伝子番号２３３７１（Ｃｌｎ１
０９）の測定表１４に示される無名数は、１２の正常な異なる組織におけるＣＳＧＣｌｎ
１０９（配列番号７）の相対発現レベルである。すべての値は、正常卵巣（基準
値）に比較したものである。これらのＲＮＡ試料は、商業的に入手可能なプール
であり、異なる個体由来の特定の組織の試料をプールすることにより生じたもの
である。

【００７５】表１４：プール試料におけるＣｌｎ１０９発現の相対レベル

【００７６】

【表１４】

【００７７】表１４の相対発現レベルは、ＣＳＧＣｌｎ１０９（配列番号７）のｍＲＮＡ
発現が、解析したいかなる他の組織における発現レベルと比較しても、正常小腸
のプール（６２６．４）で５倍以上高いことを示す。これらの結果は、Ｃｏｎ１
０９（配列番号７）ｍＲＮＡ発現は、小腸に非常に特異的であることを立証する
。

【００７８】表１４における無名数は、異なる個体由来の特定の組織の試料のプールを解析
して得た。これらを、表１５−１６における単一の個人の組織試料から得たＲＮ
Ａから生じた無名数と比較することは不可能である。

【００７９】表１５−１６における無名数は、５３対の対応する試料におけるＣｌｎ１０９
（配列番号７）の相対発現レベルである。すべての値は、正常卵巣（基準値）に
比較したものである。対応する対は、特定の組織の癌試料由来のｍＲＮＡおよび
同一個体の同一組織の正常隣接試料由来のｍＲＮＡにより、形成される。

【００８０】表１５−１６：プール試料におけるＣｌｎ１０９発現の相対レベル

【００８１】

【表１５】

【００８２】

【表１６】

【００８３】０＝陰性対応試料を解析した際、小腸、結腸および胃で発現レベルがより高く、これら
３つの結腸組織に関し高い度合いの組織特異性が示された。これらの結果により
、正常プール試料で得られた組織特異性結果（表１４）が確認される。さらに、
同一個体由来の癌試料および同種同系正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現レベル
を比較した。本比較は、癌病期に関する特異性の目安を提供する（例えば正常隣
接試料に比較した癌試料における、より高いｍＲＮＡ発現レベル）。表１５−１
６は、それぞれの正常隣接組織と比較した１５の結腸癌組織（結腸試料＃１、２
、３、６、７、８、９、１２、１３、１５、１６、１７、１９、２０、および２
１）におけるＣＳＧＣｌｎ１０９（配列番号７）の過剰発現を示す。試験した
結腸対応試料の６８％に関し、癌組織における過剰発現が見られる（総数２２の
結腸対応試料）。対応試料Ｐａｎ７１ＸＬは、膵臓における続発癌であり、該
個体における原発癌は十二指腸癌であった。

【００８４】要するに、高レベルの組織特異性に加え、試験した結腸、胃および小腸対応試
料の半数以上でのｍＲＮＡ過剰発現は、ＣＳＧＣｌｎ１０９（配列番号７）が
、結腸癌の診断マーカーであることを立証する。Ｃｌｎ１０９の読み枠によりコ
ードされるアミノ酸配列は、配列番号１０に示される。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者スン，ヨンミンアメリカ合衆国カリフォルニア州92128，サン・ホセ，サウス・ウィンチェスター・ブールヴァード 869，アパートメント 260 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA19 QQ02 QQ03 QQ08 QQ42 QQ53 QQ79 QR08 QR55 QR62 QS25 QX01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】患者における結腸癌の存在を診断するための方法であって
：（ａ）患者から得た細胞、組織または体液の試料におけるＣＳＧのレベルを測定
し；そして（ｂ）ＣＳＧの該測定レベルを、コントロールから得た細胞、組織または体液の
試料におけるＣＳＧのレベルと比較する、ここでコントロールにおけるＣＳＧレ
ベルに対する患者におけるＣＳＧの測定レベルの増加は、結腸癌の存在と関連す
ることを含む前記方法。
【請求項２】患者における転移性結腸癌を診断する方法であって：（ａ）患者から得た細胞、組織または体液の試料におけるＣＳＧのレベルを測定
し；そして（ｂ）ＣＳＧの該測定レベルを、コントロールから得た細胞、組織、または体液
の試料におけるＣＳＧのレベルと比較する、ここでコントロールにおけるＣＳＧ
レベルに対する患者における測定ＣＳＧレベルの増加は、転移している癌と関連
することを含む前記方法。
【請求項３】患者における結腸癌を病期決定する方法であって：（ａ）結腸癌を患う患者を同定し；（ｂ）該患者から得た細胞、組織または体液の試料におけるＣＳＧのレベルを測
定し；そして（ｃ）ＣＳＧの該測定レベルを、コントロールから得た細胞、組織、または体液
の試料におけるＣＳＧのレベルと比較する、ここでコントロールにおけるＣＳＧ
レベルに対するＣＳＧの該測定レベルの増加は、進行している癌と関連し、そし
てコントロールにおけるＣＳＧレベルに対するＣＳＧの該測定レベルの減少は、
後退または緩解している癌と関連することを含む前記方法。
【請求項４】転移の開始に関し、患者における結腸癌をモニターする方
法であって：（ａ）転移していることが知られていない結腸癌を有する患者を同定し；（ｂ）該患者から得た細胞、組織、または体液の試料におけるＣＳＧレベルを定
期的に測定し；そして（ｃ）ＣＳＧの定期的な該測定レベルを、コントロールから得た細胞、組織また
は体液におけるＣＳＧのレベルと比較する、ここでコントロールにおけるＣＳＧ
レベルに対する患者におけるＣＳＧのいかなる１つでもよい定期的な該測定レベ
ルの増加は、転移している癌と関連することを含む前記方法。
【請求項５】患者における結腸癌の病期の変化をモニターする方法であ
って：（ａ）結腸癌を有する患者を同定し；（ｂ）該患者から得た細胞、組織または体液の試料におけるＣＳＧのレベルを定
期的に測定し；そして（ｃ）ＣＳＧの該測定レベルを、コントロールの同じ細胞、組織、または体液の
試料におけるＣＳＧのレベルと比較する、ここでコントロールにおけるＣＳＧレ
ベルに対するＣＳＧのいかなる１つでもよい定期的な該測定レベルの増加は、病
期が進行している癌と関連し、そしてコントロールにおけるＣＳＧレベルに対す
るＣＳＧのいかなる１つでもよい定期的な該測定レベルの減少は、病期が後退ま
たは緩解している癌と関連することを含む前記方法。
【請求項６】ＣＳＧが配列番号３、４、５または７を含む、請求項１、
２、３、４または５の方法。