WO2019062429A1

WO2019062429A1 - 分子标记物tcons_00016233、试剂盒及应用

Info

Publication number: WO2019062429A1
Application number: PCT/CN2018/102669
Authority: WO
Inventors: 张东山; 瞿思源; 李惠玲
Original assignee: 中南大学湘雅二医院
Priority date: 2017-09-30
Filing date: 2018-08-28
Publication date: 2019-04-04
Also published as: CN107541564A; CN107541564B

Abstract

一种分子标记物、试剂盒及应用，该分子标记物用于早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤；脓毒血症并发急性肾损伤患者血液中的上述分子标记物呈高表达，通过检测患者血液中上述分子标记物的表达水平，可以判断患者是否患有脓毒血症急性肾损伤或患脓毒血症急性肾损伤的概率。

Description

分子标记物 TCONS_00016233、试剂盒及应用技术领域

[0001] 本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及一种用于早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤的分子标记物、试剂盒及应用。

背景技术

[0002] 脓毒血症是危急重患者常见病因及并发症之一，其病死率达 50%以上。同时，脓毒血症也是重症患者发生急性肾损伤的常见原因，脓毒血症患者一旦并发急性肾损伤，其病死率可高达 70%。因此，早期诊断和治疗是降低脓毒血症相关 A KI发病率和病死率的关键。目前急性肾损伤的诊断主要依靠血肌酐及尿量，但血肌酐及尿量受多种因素影响，不能及时准确地反映肾功能变化，对 AKI诊断缺乏足够的敏感性和特异性。现已知，当肾功能丧失达 50%时肌酐浓度才会发生变化，而且肌酐达到稳态需要几天的时间，因此不能及时反映肾脏功能。此外，肌酐受到年齢、性别、种族、机体容量状况、肌肉分解代谢、蛋白质摄取、胃肠道出血及药物等诸多肾外因素影响。可见血肌酐升高往往滞后于肾功能的恶化，且不能准确反映肾功能的改变。因此，寻找高敏感性和特异性的生物学标志物，对于 AKI的早期诊断和预后评估至关重要。

[0003] 长链非编码 RNA是长度大于 200个核苷酸的非编码 RNA，研究表明，其在多种疾病的发生、发展过程中出现异常表达，能反应疾病的发展及预后，而且其在血液中表达相对稳定，作为分子标记物具有特异、灵敏、快速、方便、针对性强的优点。

技术问题

问题的解决方案

技术解决方案

[0004] 本发明的目的之一是提供一种能早期检测脓毒血症并急性肾损伤的分子标记物

，对早期诊断、预测脓毒血症并急性肾损伤有重要意义。 [0005] 一种用于早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤的分子标记物 TCONS_0001

6233，序列如 SEQ ID NO: 1所示。

[0006] 本发明的目的之二是提供上述分子标记物 TCONS_00016233的应用。即检测 TC

ONS_00016233表达水平的产品在制备早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤工具中的应用。

[0007] 所述产品包括：通过 RT-PCR或者实时定量 PCR检测 TCONS_00016233表达水平的制剂。

[0008] 用 RT-PCR检测 TCONS_00016233表达水平的特异性扩增 TCONS_00016233的引物序列为：

[0009] F: 5 ' - AACGCTCTGACATCTTCCGT-3 '

[0010] R: 5，-TTCCGAATCCACAGATGGCG-3，。

[0011] 本发明的目的之三是提供一种用于早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤的试剂盒，包含通过 RT-PCR或者实时定量 PCR检测 TCONS_00016233表达水平的试剂。

[0012] 所述的用于早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤的试剂盒，包含一对通过

RT-PCR特异性扩增 TCONSJXX) 16233的弓 |物，其引物序列为：

[0013] F: 5 ' - AACGCTCTGACATCTTCCGT-3 '

[0014] R: 5，-TTCCGAATCCACAGATGGCG-3，。

发明的有益效果

有益效果

[0015] 申请人发现 TCONS_00016233在脓毒血症并急性肾损伤患者中表达上调（图 2

) ，提示 TCONS_00016233是诊断、预测脓毒血症并急性肾损伤的分子标记物。本发明为脓毒血症急性肾损伤诊断、预测提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。

对附图的简要说明

附图说明

[0016] 图 1为 LncRNA的芯片表达谱分析结果。

[0017] A.热图； B.脓毒症 AKI与对照组和脓毒症非 AKI与对照组相比中上调的 LncRNA ， C.脓毒症 AKI与脓毒症非 AKI相比上调和下调的 LncRNA,D脓毒症 AKI与对照组和脓毒症非 AKI与对照组相比中下调的 LncRNA; E,脓毒症非 AKI与对照组上调同时在脓毒症 AKI与对照组中下调的 LncRNA, 脓毒症非 AKI与对照组上调同时在脓毒症 AKI与对照组中下调的 LncRNA; F代表 TCONS_00016233在脓毒症 AKI 与对照组相比上调，在脓毒症非 AKI与对照组相比下调。

[0018] 图 2为 RT-PCR验证了 TCONS_00016233在对照、脓毒症 AKI、脓毒症非 AKI中的表达情况， A. TCONS_00016233和内参 GAPDH电泳图谱； B为灰度分析。差异具有统计学意义。

本发明的实施方式

[0019] 以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

[0020] 实施例 1：筛选与脓毒血症并发急性肾损伤相关的分子标记物

[0021] 1. 样本收集

[0022] 收集健康人、脓毒血症非急性肾损伤、脓毒血症并发急性肾损伤患者血液标本 [0023] 2. RNA样品的制备和质量分析

[0024] 使用康为世纪公司的 Trizol提取总 RNA，具体操作步骤如下：

[0025] 1) 取 2 ml收集在柠檬酸钠处理过的试管中的全血，放入无酶离心管中；

[0026] 2) 收集血浆： 3000 rpm离心 10min，小心地从样品顶部吸走上清（血浆）放入另一无酶离心管中；

[0027] 3) 取 250μί血浆液体，转至 1.5ml的离心管中， 750μί的 TRIzol试剂，手动剧烈振荡管体至混匀。

[0028] 4) 匀浆后样品于 15-30°C孵育 5分钟。

[0029] 5) 于匀浆的样品中加入 0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体 15秒后，

15-30孵育 2SJ3分钟。 4°C下 12,000rpm离心 15分钟。

[0030] 6) 离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相

。 RNA全部被分配于水相中。吸取 50( L水相转移到新离心管中。

[0031] 7) 于新离心管加入 50( L异丙醇，混匀以沉淀其中的 RNA。混匀后 15-30°C孵育 10分钟后，于 4°C 12,000rpm离心 10分钟。

[0032] 8) 移去上清液，加入至少 l ml的 75%乙醇，清洗 RNA沉淀。振荡后 4。C 7,500 rpm离心 5分钟。

[0033] 9) 去除乙醇溶液，空气中干燥 RNA沉淀 5-10分钟。

[0034] 10) 加入无 RNA酶水 20ul，用移液器反复吹打几次。然后盖好盛有 RNA的离心管，存于 -80°C冰箱中。

[0035] 11) RNA质量分析：使用 NanoDrop® ND-1000测定将上述提取的 RNA浓度和纯度。

[0036] 3. 高通量转录组测序

[0037] 1) RNA-seq读段定位

[0038] 2) 转录丰度评估

[0039] 3) 差异表达基因检测

[0040] 4. 结果

[0041] RNA-seq结果如图 1所示，申请者预实验使用 LncRNA芯片手段研究了来自 5名健康对照、 15名脓毒症不伴 AKI患者和 15名脓毒症性 AKI患者的血浆。我们通过分析 microarray的结果得知：

[0042] (1) 相比健康人，脓毒症 AKI患者的血液样本中有 1084个 IncRNA表达上调， 9 14个 IncRNA表达下调；（2) 相比健康人，血浆中有 538个 IncRNA表达上调， 52 2个 IncRNA表达下调；（3) 脓毒症 AKI与脓毒症非 AKI相比有 1056个 IncRNA表达上调， 824个 IncRNA表达下调；（4) 脓毒症非 AKI与对照组及脓毒症 AKI与对照组相比均上调的 IncRNA有 207个，表达都下调的 IncRNA有 254个；（5) 脓毒症非 AKI与对照组上调中表达上调，脓毒症 AKI与对照组中表达下调的 IncRNA有 110个；在脓毒症非 AKI与对照组中表达下调，脓毒症 AKI与对照组中表达上调的 IncRNA有 87个。（6) TCONS_00016233在脓毒血症并急性肾损伤血液中的表达量显著高于脓毒血症非急性肾损伤及健康人的表达量 (图 1F)。

[0043] 实施例 2: RT-PCR验证差异性表达

[]

[0044] 1. 根据高通量测序的检测结果选取进行 RT-PCR验证。按照实施例 1中样本收集方式选择健康人、脓毒血症并发急性肾损伤、脓毒血症非急性肾损伤血液标本

[0045] 2. RNA提取步骤同实施例 1

[0046] 3. 逆转录：使用 ThermoFish公司的逆转录试剂盒进行操作，具体步骤如下： [0047] 1) 加入所用试剂，并存储于冰上，按照下表行相关实验。

[0048] 2) -20°C储存备用。

[0049] 4. RT-PCR扩增

[0050] 1) 引物设计

[0051] 根据 TCONS_00016233和 Gapdh的基因编码序列设计 PCR扩增的引物，由广州如期生物技术有限公司合成。具体引物序列如下： TCONS_00016233

F: 5 ' - AACGCTCTGACATCTTCCGT-3 ' (见 SEQ NO.2)

R: 5 ' -TTCCGAATCCAC AGATGGCG-3 ' (见 SEQ NO.3)

Gapdh基因：

F: 5 ' -CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3 ' (见 SEQ N0.4) R: 5 ' -GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3 ' (见 SEQ N0.5)

2) 按照下表配制 PCR反应体系（其中 Tap MasterMix预混体系购至康为世纪

[]

PCR反应程序

[]

[0061] 变性及退火重复 35-40个循环。

[0062] 琼脂糖凝胶电泳：取 KVL PCR产物在 2%琼脂糖凝胶上电泳检测， RT-PCR结果的琼脂糖电泳照片用图像分析系统进行灰度扫描，灰度扫描值（光密度扫描值 ) 为 IA，它代表凝胶上目的条带的亮度，即反应目的条带的量。 [0063] PCR产物的相对量（IA比值） =目的片段的 IA/内对照 GAPDH的 IA

[0064] 通过上述公式计算出 cDNA片段在健康对照组、脓毒症并发急性肾损伤组、脓毒血症非急性肾损伤的 IA比值，该比值为 RT-PCR产物的相对量。

[0065] 5. 结果：结果如图 2所示，与健康人相比， TCONS_00016233在脓毒症并发急性肾损伤患者血液中的表达上调；脓毒血症非急性肾损伤患者与健康人相比， T

CONS_00016233在脓毒症非急性肾损伤患者血液中的表达下调，同 RNA-seq结果一致。

[0066] 上述实施例的说明至少用于理解本发明的方法及其核心思想。在不脱离本发明原理的前提下，对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

[0067]

Claims

权利要求书

[权利要求 1] 一种分子标记物 TCONS_00016233，序列如 SEQ ID NO: 1所示。

[权利要求 2] 检测 TCONS_00016233表达水平的产品在制备早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤工具中的应用。

[权利要求 3] 根据权利要求 2所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过 RT-P

CR或者实时定量 PCR检测 TCONS_00016233表达水平的制剂。

[权利要求 4] 根据权利要求 3所述的应用，其特征在于，用 RT-PCR检测 TCONSJX)

016233表达水平的特异性扩增 TCONS_00016233的引物序列为：

F: 5 ' - AACGCTCTGACATCTTCCGT-3 '

R: 5，-TTCCGAATCCACAGATGGCG-3，。

[权利要求 5] —种用于早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤的试剂盒，其特征在于，包含通过 RT-PCR或者实时定量 PCR检测 TCONS_00016233表达水平的试剂。

[权利要求 6] 根据权利要求 5所述的用于早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤的试剂盒，其特征在于，包含一对通过 RT-PCR特异性扩增 TCONSJ) 0016233的引物，其引物序列为：

F: 5 ' - AACGCTCTGACATCTTCCGT-3 '

R: 5，-TTCCGAATCCACAGATGGCG-3，。