JP7072385B2 - ニューモシスチス肺炎を診断、予測又はモニタリングするための手段 - Google Patents
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Description
その配列がCytbタンパク質をコードするP.イロベチイ遺伝子(配列番号3)、並びに
ミトコンドリアP.イロベチイラージサブユニット(mtLSU)遺伝子(配列番号1)及びミトコンドリアP.イロベチイスモールサブユニット(mtSSU)遺伝子(配列番号2)等の、その各々の配列がP.イロベチイリボソームRNAに転写されるP.イロベチイ遺伝子
からなる群から選択される。
ヒト患者(より詳細には、ニューモシスチス・イロベチイ保因者であるヒト患者)におけるPCPに対する薬物若しくは治療の有効性を決定若しくは予測するのに、又は
PCPを有すると診断されて、PCPに対する薬物若しくは治療を受けているか、若しくは受けたヒト患者において、PCPが退行するか、若しくは治療されたかどうかを決定するのにとりわけ適している。
その配列がCytbタンパク質をコードするP.イロベチイ遺伝子(配列番号3)、並びに
ミトコンドリアP.イロベチイラージサブユニット(mtLSU)遺伝子(配列番号1)及びミトコンドリアP.イロベチイスモールサブユニット(mtSSU)遺伝子(配列番号2)等の、その各々の配列がP.イロベチイリボソームRNAに転写されるP.イロベチイ遺伝子
からなる群から選択される。
ヒト患者(より詳細には、ニューモシスチス・イロベチイ保因者であるヒト患者)におけるPCPに対する薬物若しくは治療の有効性を決定若しくは予測するのに、又は
PCPを有すると診断されて、PCPに対する薬物若しくは治療を受けているか、若しくは受けたヒト患者において、PCPが退行するか、若しくは治療されたかどうかを決定するのにとりわけ適している。
i.上記ヒト患者の気道から事前に得た生体液の試料のRNA材料において、2つの異なるP.イロベチイミトコンドリア遺伝子(それぞれ)のRNA転写物(の数又は濃度)を検出及び/又は定量化して、より詳細には、2つの異なるP.イロベチイミトコンドリア遺伝子(それぞれ)のRNA転写物(の数又は濃度)を定量化して、第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値及び第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値を得る工程と、
ii.i.の上記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値のi.の上記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値に対する比を算出する工程と、
iii.ii.の比の値を閾値(数値)と比較する工程と
を含み、
ii.の比の値が、上記閾値に等しいか、若しくは上記閾値よりも低いかどうか、又はii.の比の値が、上記閾値よりも高いかどうかに依存して、上記ヒト患者は、PCPを有するか若しくは発症する危険性が高い、又はPCPを有するか若しくは発症する危険性が低いと診断又は予測される。
ii.の比の値が、上記閾値よりも高い場合、上記ヒト患者は、PCPを有するか又は発症する危険性が低いと診断又は予測される。
ii.の比の値が、上記閾値よりも低い場合、上記ヒト患者は、PCPを有するか又は発症する危険性が低いと診断又は予測される。
PCPを有するか若しくは発症するP.イロベチイ保因者、又は
PCPを有さず発症もしていないP.イロベチイ保因者
の状態に応じて事前に確立されたP.イロベチイ保因者の参照ヒトコホートで取る値又は値の分布を比較することによって、上記閾値が事前に決定されていてもよい。
- 第1の時点及び第2の時点で、上記ヒト患者の気道から事前に得た生体液の試料のRNA材料において、RNA転写物(の数又は濃度)を定量化して、それぞれ上記第1の時点及び上記第2の時点での上記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値並びに上記第1の時点及び上記第2の時点での上記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値を得る工程であって、上記第2の時点が、上記第1の時点よりも遅く、上記第1の時点及び上記第2の時点の少なくとも1つが、上記ヒト患者が上記薬物又は治療を受けている期間に含まれ、上記RNA転写物が、2つの異なるP.イロベチイミトコンドリア遺伝子の(各々の)RNA転写物である、工程と、
- 上記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値の上記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値に対する比を算出して、上記第1の時点での上記比の値及び上記第2の時点でのその値を得る工程と、
- 上記第2の時点での上記比の値を上記第1の時点でのその値と比較する工程であって、上記第1の時点と比較した上記第2の時点での上記比の値の増加又は減少が、上記治療又は薬物が、上記ヒト患者においてPCPを治療又は緩和するのに効率的であるか、又は効率的と予想されることを示す、工程と
を含む。
- 第1の時点及び第2の時点で、上記ヒト患者の気道から事前に得た生体液の試料のRNA材料において、RNA転写物(の数又は濃度)を定量化して、それぞれ上記第1の時点及び上記第2の時点での上記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値並びに上記第1の時点及び上記第2の時点での上記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値を得る工程であって、上記第2の時点が、上記第1の時点よりも遅く、上記第1の時点及び上記第2の時点の少なくとも1つが、上記ヒト患者が上記薬物又は治療を受けている期間に含まれ、上記RNA転写物が、2つの異なるP.イロベチイミトコンドリア遺伝子の(各々の)RNA転写物である、工程と、
- 上記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値の上記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値に対する比を算出して、上記第1の時点での上記比の値及び上記第2の時点でのその値を得る工程と、
上記第2の時点での上記比の値を上記第1の時点でのその値と比較する工程であって、上記第1の時点と比較した上記第2の時点での上記比の値の増加又は減少が、上記ヒト患者において、PCPが退行するか、又は治療されたことを示す、工程と
を含む。
- BIOLINE社(BIOLINE USA Inc.社;305 Constitution Dr.; TAUNTON; MA 027080;米国)によって、カタログ番号BIO-38040又はBIO-35040で商品化されたRNA抽出対照、
- LIFE TECHNOLOGIES S.A.S.社(route de l'orme des merisiers; Immeuble Discovery - Zone Technologique; 91190 SAINT AUBIN、フランス)によって、カタログ番号4456740で商品化されているAMBION(登録商標)ERCC RNA Spike-In Controls、及び
- QIAGEN(登録商標)社(QIAGEN(登録商標)France S.A.S.社;3, avenue du Canada; LP 809; 91974 COURTABOEUF CEDEX;フランス)によって、カタログ番号211492で商品化されているRNA内部対照が挙げられる。
R=E(CYTb)-Cq(CYTb)/E(mtrDNA)-Cq(mtrDNA)
(式中、
Rは、上記比であり、
CYTBは、その配列がCytbタンパク質をコードする上記P.イロベチイ遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物であり、
mtrDNAは、その配列がP.イロベチイリボソームRNAに転写される上記P.イロベチイ遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物であり、
Eは、指示したcDNAに関する対数期での1つの増殖サイクルのPCR効率の値であり、
Cqは、指示したcDNAに関するPCR定量化サイクルの値である)
を使用して実行される。
R=E(mtSSU)-Cq(mtSSU)/E(mtLSU)-Cq(mtLSU)
(式中、
Rは、上記比であり、
mtSSUは、上記ミトコンドリアP.イロベチイmtSSU遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物であり、
mtLSUは、上記ミトコンドリアP.イロベチイmtLSU遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物であり、
Eは、指示したcDNAに関する対数期での1つの増殖サイクルのPCR効率の値であり、
Cqは、指示したcDNAに関するPCR定量化サイクルの値である)
を使用して実行される。
- 第1のcDNA逆転写物を得るための(逆転写酵素を使用した)上記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写、及び第1のアンプリコン(第1のcDNA又はDNA核酸)を得るための(ポリメラーゼを使用した、及び)第1のプライマー対を使用した上記第1のcDNA逆転写物由来の第1のcDNA標的のPCR増幅、並びに
- 第2のcDNA逆転写物を得るための(逆転写酵素を使用した)上記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写、及び第2のアンプリコン(第2のcDNA又はDNA核酸)を得るための(ポリメラーゼを使用した、及び)第2のプライマー対を使用した上記第2のcDNA逆転写物由来の第2のcDNA標的のPCR増幅
を含み、
上記方法は、上記第1のアンプリコン(の数又は濃度)及び上記第2のアンプリコン(の数又は濃度)の定量化を更に含み、
上記第1のアンプリコン(の、例えば数又は濃度)の定量化の値は、上記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物(の、例えば数又は濃度)の定量化の値であり、上記第2のアンプリコン(の、例えば数又は濃度)の定量化の値は、上記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物(の、例えば数又は濃度)の定量化の値である。
- 配列番号30の配列、若しくは
- 配列番号30と同じ長さであり、配列番号30に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるcDNA配列
を含むか、又はその配列である。
- 配列番号15若しくは配列番号20若しくは配列番号25の配列、又は
- それぞれ、配列番号15若しくは配列番号20若しくは配列番号25と同じ長さであり、配列番号15若しくは配列番号20若しくは配列番号25に対して少なくとも95%同一であるcDNA配列
を含むか、或いはその配列である。
- 配列番号10の配列、若しくは
- 配列番号10と同じ長さであり、配列番号10に対して少なくとも95%同一であるcDNA配列
を含むか、又はその配列である。
- 配列番号15若しくは配列番号20若しくは配列番号25の配列、又は
- それぞれ、配列番号15若しくは配列番号20若しくは配列番号25と同じ長さであり、配列番号15若しくは配列番号20若しくは配列番号25に対して少なくとも95%同一であるcDNA配列
を含むか、或いはその配列である。
- 第1のcDNA逆転写物を得るための(逆転写酵素を使用した、及び)第1のプライマー対を使用した上記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物に含有される第1のRNA標的のcDNA逆転写、及び第1のアンプリコンを得るための(ポリメラーゼを使用した、及び)同じ第1のプライマー対を使用した上記第1のcDNA逆転写物のPCR増幅と、
- 第2のcDNA逆転写物を得るための(逆転写酵素を使用した、及び)第2のプライマー対を使用した上記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物由来の第2のRNA標的のcDNA逆転写、及び第2のアンプリコンを得るための(ポリメラーゼを使用した、及び)同じ第2のプライマー対を使用した上記第2のcDNA逆転写物のPCR増幅と
を含み、
上記方法は、上記第1のアンプリコン(の数又は濃度)及び上記第2のアンプリコン(の数又は濃度)の定量化を更に含み、
上記第1のアンプリコン(の、例えば数又は濃度)の定量化の値は、上記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物(の、例えば数又は濃度)の定量化の値であり、上記第2のアンプリコン(の、例えば数又は濃度)の定量化の値は、上記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物(の、例えば数又は濃度)の定量化の値である。
- 配列番号29の配列、若しくは
- 配列番号29と同じ長さであり、配列番号29に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるRNA配列
を含むか、又はその配列である。
- 配列番号14若しくは配列番号19若しくは配列番号24の配列、又は
- それぞれ、配列番号14若しくは配列番号19若しくは配列番号24と同じ長さであり、配列番号14若しくは配列番号19若しくは配列番号24に対して少なくとも95%同一であるRNA配列
を含むか、或いはその配列である。
- 配列番号9の配列、若しくは
- 配列番号9と同じ長さであり、配列番号9に対して少なくとも95%同一であるRNA配列
を含むか、又はその配列である。
- 配列番号14若しくは配列番号19若しくは配列番号24の配列、又は
- それぞれ、配列番号14若しくは配列番号19若しくは配列番号24と同じ長さであり、配列番号14若しくは配列番号19若しくは配列番号24に対して少なくとも95%同一であるRNA配列
を含むか、或いはその配列である。
- 配列番号30の配列、若しくは
- 配列番号30と同じ長さであり、配列番号30に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるcDNA配列
を含むか、又はその配列である、(cDNA又はDNA)アンプリコンを産生するための(又は、cDNA逆転写物並びにそれらの(cDNA又はDNA)アンプリコンを産生するための)、それぞれ、上記第1又は第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物に(又は、上記第1若しくは第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物に、並びにそれらのcDNA逆転写物に)アニーリングするプライマー対である。
- 配列番号10の配列、若しくは
- 配列番号10と同じ長さであり、配列番号10に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるcDNA配列
を含むか、又はその配列である。
- 配列番号9の配列、若しくは
- 配列番号9と同じ長さであり、配列番号9に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるRNA配列
を含むか、又はその配列である。
- 配列番号10の配列、若しくは
- 配列番号10と同じ長さであり、配列番号10に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるcDNA配列
を含むか、又はその配列である、(cDNA又はDNA)アンプリコンを産生するための(又は、cDNA逆転写物並びにそれらの(cDNA又はDNA)アンプリコンを産生するための)、P.イロベチイmtLSU遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物に(又は、P.イロベチイmtLSU遺伝子のRNA転写物に、並びにそれらのcDNA逆転写物に)アニーリングする(mtLSU)プライマー対であってもよい。
- 配列番号15の配列、若しくは
- 配列番号15と同じ長さであり、配列番号15に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるcDNA配列
を含むか、又はその配列である。
- 配列番号14の配列、若しくは
- 配列番号14と同じ長さであり、配列番号14に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるRNA配列
を含むか、又はその配列である。
- 配列番号15の配列、若しくは
- 配列番号15と同じ長さであり、配列番号15に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるcDNA配列
を含むか、又はその配列である、(cDNA又はDNA)アンプリコンを産生するための(又は、cDNA逆転写物並びにそれらの(cDNA又はDNA)アンプリコンを産生するための)、P.イロベチイmtSSU遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物に(又は、P.イロベチイmtSSU遺伝子のRNA転写物に、並びにそれらのcDNA逆転写物に)アニーリングする(mtSSU)プライマー対であってもよい。
- 配列番号20の配列、若しくは
- 配列番号20と同じ長さであり、配列番号20に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるcDNA配列
を含むか、又はその配列である。
- 配列番号19の配列、若しくは
- 配列番号19と同じ長さであり、配列番号19に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるRNA配列
を含むか、又はその配列である。
- 配列番号20の配列、若しくは
- 配列番号20と同じ長さであり、配列番号20に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるcDNA配列
を含むか、又はその配列である、(cDNA又はDNA)アンプリコンを産生するための(又は、cDNA逆転写物並びにそれらの(cDNA又はDNA)アンプリコンを産生するための)、P.イロベチイmtSSU遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物に(又は、P.イロベチイmtSSU遺伝子のRNA転写物に、並びにそれらのcDNA逆転写物に)アニーリングする(mtSSU)プライマー対であってもよい。
- 配列番号25の配列、若しくは
- 配列番号25と同じ長さであり、配列番号25に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるcDNA配列
を含むか、又はその配列である。
- 配列番号24の配列、若しくは
- 配列番号24と同じ長さであり、配列番号24に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるRNA配列
を含むか、又はその配列である。
- 配列番号25の配列、若しくは
- 配列番号25と同じ長さであり、配列番号25に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるcDNA配列
を含むか、又はその配列である、(cDNA又はDNA)アンプリコンを産生するための(又は、cDNA逆転写物並びにそれらの(cDNA又はDNA)アンプリコンを産生するための)、P.イロベチイmtSSU遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物に(又は、P.イロベチイmtSSU遺伝子のRNA転写物に、並びにそれらのcDNA逆転写物に)アニーリングする(mtSSU)プライマー対であってもよい。
- 95℃で2分~10分間のポリメラーゼ活性化、並びに
- 95℃で15秒~30秒間及び60℃で30秒~60秒間を45~50サイクル
を含む。
- 95℃で2分間のポリメラーゼ活性化、並びに
- 95℃で15秒間及び60℃で30秒間を45サイクル
を含む。
- 42℃~61℃、好ましくは50℃で2分~15分間の逆転写、
- 95℃で2分間のポリメラーゼ活性化、並びに
- 95℃で15秒間及び60℃で30秒間を45サイクル
を含む。
- 50℃で2分間の逆転写、
- 95℃で2分間のポリメラーゼ活性化、並びに
- 95℃で15秒間及び60℃で30秒間を45サイクル
を含む。
上記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子(CYTB)のcDNA逆転写物にハイブリダイズする少なくとも1つの第1のプローブ、及び/若しくは(より詳細には、及び)上記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子(mtLSU又はmtSSU、より詳細にはmtLSU)のcDNA逆転写物にハイブリダイズする少なくとも1つの第2のプローブを使用して、又はより詳細には、
上記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子(mtSSU)のcDNA逆転写物にハイブリダイズする少なくとも1つの第1のプローブ、及び/若しくは(より詳細には、及び)上記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子(mtLSU)のcDNA逆転写物にハイブリダイズする少なくとも1つの第2のプローブを使用して実行され得る。
- 配列番号2であるP.イロベチイmtSSU遺伝子に、若しくは配列番号2に相補的な配列に、より詳細には配列番号15(P.イロベチイmtLSU標的)の配列に、若しくは配列番号15に相補的な配列に、及び/又は
- 配列番号20(別のP.イロベチイmtLSU標的)の配列に、若しくは配列番号20に相補的な配列に、及び/又は
- 配列番号25(更に別のP.イロベチイmtLSU標的)の配列に、若しくは配列番号25に相補的な配列にハイブリダイズし得る。
- 配列番号2であるP.イロベチイmtSSU遺伝子に、若しくは配列番号2に相補的な配列に、より詳細には配列番号15(P.イロベチイmtSSU標的)の配列に、若しくは配列番号15に相補的な配列に、及び/又は
- 配列番号20(別のP.イロベチイmtSSU標的)の配列に、若しくは配列番号20に相補的な配列に、及び/又は
- 配列番号25(更に別のP.イロベチイmtSSU標的)の配列に、若しくは配列番号25に相補的な配列にハイブリダイズし得る。
- ニューモシスチス肺炎(PCP)を診断若しくは予測するための、より詳細には、ヒト患者(より詳細には、ニューモシスチス・イロベチイ保因者であるヒト患者)が、PCPを有するか若しくは発症するかどうかを診断若しくは予測するための、又は
- ヒト患者(より詳細には、ニューモシスチス・イロベチイ保因者であるヒト患者)におけるPCPに対する薬物若しくは治療の有効性を決定若しくは予測するための、又は
- PCPを有すると診断され、PCPに対する薬物若しくは治療を受けているか、若しくは受けたヒト患者において、PCPが退行するか、若しくは治療されたかどうかを決定するための
逆転写酵素(即ち、RNA依存性DNAポリメラーゼ)及びオリゴヌクレオチドのin vitroでの使用に関し、
ここで、上記オリゴヌクレオチドは、プライマー及び/又はプローブを含み、上記プライマーは、第1のプライマー対及び第2のプライマー対を含み、上記プローブは、第1のプローブ及び第2のプローブを含み、
上記第1のプライマー対及び/又は上記第1のプローブは、上記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物に特異的にハイブリダイズし(上記を参照)、
上記第2のプライマー対及び/又は上記第2のプローブは、上記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物に特異的にハイブリダイズする(上記を参照)。
- 配列番号30の配列、若しくは
- 配列番号30と同じ長さであり、配列番号30に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるcDNA配列
を含むか、又はその配列である、cDNAアンプリコンを産生するための、上記第1又は第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物に(又は、上記第1又は第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物に、並びにそれらのcDNA逆転写物に)アニーリングするプライマー対である。例えば、上記第1又は第2のプライマー対は、配列番号31及び配列番号32のプライマー対である。例えば、上記第1又は第2のプライマー対は、配列番号60及び配列番号32のプライマー対である。
- 配列番号10の配列、若しくは
- 配列番号10と同じ長さであり、配列番号10に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるcDNA配列
を含むか、又はその配列である、cDNAアンプリコンを産生するための、P.イロベチイmtLSU遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物に(又は、P.イロベチイmtLSU遺伝子のRNA転写物に、並びにそれらのcDNA逆転写物に)アニーリングする(mtLSU)プライマー対であってもよい。例えば、上記第1又は第2のプライマー対は、配列番号11及び配列番号12の(mtLSU)プライマー対である。
- 配列番号15の配列、若しくは
- 配列番号15と同じ長さであり、配列番号15に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるcDNA配列
を含むか、又はその配列である、cDNAアンプリコンを産生するための、P.イロベチイmtSSU遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物に(又は、P.イロベチイmtSSU遺伝子のRNA転写物に、並びにそれらのcDNA逆転写物に)アニーリングする(mtSSU)プライマー対であってもよい。例えば、上記第1又は第2のプライマー対は、配列番号16及び配列番号17の(mtSSU)プライマー対である。
- 配列番号20の配列、若しくは
- 配列番号20と同じ長さであり、配列番号20に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるcDNA配列
を含むか、又はその配列である、cDNAアンプリコンを産生するための、P.イロベチイmtSSU遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物に(又は、P.イロベチイmtSSU遺伝子のRNA転写物に、並びにそれらのcDNA逆転写物に)アニーリングする(mtSSU)プライマー対であってもよい。例えば、上記第1又は第2のプライマー対は、配列番号21及び配列番号22の(mtSSU)プライマー対である。
- 配列番号25の配列、若しくは
- 配列番号25と同じ長さであり、配列番号25に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であるcDNA配列
を含むか、又はその配列である、cDNAアンプリコンを産生するための、P.イロベチイmtSSU遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物に(又は、P.イロベチイmtSSU遺伝子のRNA転写物に、並びにそれらのcDNA逆転写物に)アニーリングする(mtSSU)プライマー対であってもよい。例えば、上記第1又は第2のプライマー対は、配列番号26及び配列番号27の(mtSSU)プライマー対である。
- 対の第1のプライマーが、上記(標的)cDNA又はRNA又はDNA中に含有され、上記第1のプライマーと同じ長さを有する第1の配列に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一であり、
- 同じ対の第2のプライマーが、上記(標的)cDNA又はRNA又はDNAに相補的な配列中に含有され、上記第2のプライマーと同じ長さを有する、第2の配列に対して少なくとも95%(より詳細には少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%)同一である。
- P.イロベチイCYTB遺伝子のRNA転写物由来の40個~400個のヌクレオチドの断片のcDNA逆転写物を含む、40~400bpの少なくとも1つの第1のDNA断片、及び
- P.イロベチイmtLSU又はmtSSU遺伝子のRNA転写物由来の40個~400個のヌクレオチドの断片のcDNA逆転写物を含む、40~400bpの少なくとも1つの第2のDNA断片
を含むか、又はそれらで構成され、
ここで、P.イロベチイCYTB遺伝子のRNA転写物由来の40個~400個のヌクレオチドの上記断片は、P.イロベチイmtLSU又はmtSSU遺伝子のRNA転写物由来の40個~400個のヌクレオチドの上記断片と異なる。
- P.イロベチイCYTB遺伝子のRNA転写物由来の40個~400個のヌクレオチドの上記断片は、P.イロベチイCYTB遺伝子のRNA転写物に特異的であり、
- P.イロベチイmtLSU遺伝子のRNA転写物由来の40個~400個のヌクレオチドの上記断片は、P.イロベチイmtLSU遺伝子のRNA転写物に特異的であり、
- P.イロベチイmtSSU遺伝子のRNA転写物由来の40個~400個のヌクレオチドの上記断片は、P.イロベチイmtSSU遺伝子のRNA転写物に特異的である。
- P.イロベチイmtSSUのRNA転写物由来の40個~400個のヌクレオチドの断片のcDNA逆転写物を含む、40~400bpの少なくとも1つの第1のDNA断片、及び
- P.イロベチイmtLSU遺伝子のRNA転写物由来の40個~400個のヌクレオチドの断片のcDNA逆転写物を含む、40~400bpの少なくとも1つの第2のDNA断片
を含むか、又はそれらで構成され、
ここで、P.イロベチイmtSSU遺伝子のRNA転写物由来の40個~400個のヌクレオチドの上記断片は、P.イロベチイmtLSUのRNA転写物由来の40個~400個のヌクレオチドの上記断片と異なる。
- P.イロベチイcDNA又はDNAの断片ではなく、上記cDNA逆転写物の5'末端に(共有)結合される、30~150bpの第1のDNA(例えば、第1のシーケンシングアダプターである30~150bpのDNA)、及び
- P.イロベチイcDNA又はDNAの断片ではなく、上記cDNA逆転写物の3'末端に(共有)結合される、30~150bpの第2のDNA(例えば、第2のシーケンシングアダプターであり、上記第1のシーケンシングアダプターと異なる30~150bpのDNA)
を更に含んでもよい。
- 少なくとも1つのジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤及び少なくとも1つのスルホンアミド抗生物質(の組合せ又は結合)、例えばトリメトプリム及びスルファメトキサゾール(の組合せ又は結合)(例えば、コトリモキザゾール複合薬)、又は
- エアロゾル化ペンタミジン、又は
- プリマキン及びクリンダマイシン、又は
- アトバクオン、又は
- ピリメタミン、又は
- エキノキャンディン(カスポファンギンを含む)、又は
- コルチコステロイド(プレドニゾンを含む)、又は
- 抗炎症性有効成分、又は
- ダプソン、又は
- ダプソン及びピリメタミン及びロイコボリン
であり得る。
本出願の方法を用いて、上記ヒト患者が、PCPを有するか又は発症する危険性が高いかどうかを診断又は予測する工程と、
PCPの治療及び/又は防止及び/又は寛解のための薬物又は薬物の組合せを供給する工程と、
上記薬物又は薬物の組合せを上記ヒト患者に投与する工程と
を含む。
- 少なくとも1つのジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤及び少なくとも1つのスルホンアミド抗生物質(の組合せ又は結合)、例えばトリメトプリム及びスルファメトキサゾール(の組合せ又は結合)(例えば、コトリモキザゾール複合薬)、又は
- エアロゾル化ペンタミジン、又は
- プリマキン及びクリンダマイシン、又は
- アトバクオン、又は
- ピリメタミン、又は
- エキノキャンディン(カスポファンギンを含む)、又は
- コルチコステロイド(プレドニゾンを含む)、又は
- 抗炎症性有効成分、又は
- ダプソン、又は
- ダプソン及びピリメタミン及びロイコボリン
を含み得る。
材料及び方法
試料
総計200個の連続した気管支肺胞洗浄(BAL)液(BALF)を、2013年1月1日~2013年8月31日に予め収集した。患者が、新たな診断手順を実験するためのBALFの使用に対して反対しないことを宣言した後に、光ファイバー気管支鏡検査法を実行した。BALの部位は、肺高分解能コンピューター断層撮影法による病巣のトポグラフィーによって導かれ、BALは、Alanio等、2011年の標準プロトコールに倣って、滅菌生理食塩水の4つ50mL分取量を用いて実行した。BALFを収集後、時間内に研究室に送った。到着したら、BALFを2,800gで10分間遠心分離して、ペレットを、リン酸緩衝生理食塩水4mLで再懸濁して、1mLの4つの画分に分割した。次に、4本のチューブを8,000gで5分間遠心分離して、2本のチューブのペレットを凍結させて、-80℃で保管した。2つの他のペレットは、Alanio等、2011年に記載されるように、古典的な染色、免疫蛍光手順及びDNA抽出に使用した。
192名の対応する患者は、パリ北部にある3つの病院で管理した(Hospital Saint Louis、1 avenue Claude Vellefaux 75010、パリ、フランス;Hospital Lariboisiere、2 rue Ambroise Pare 75010、パリ、フランス;及びHospital Robert Debre、48 Boulevard Serrurier 75019、パリ、フランス)。性別比は1.5であり、年齢中央値は、2歳~82歳の範囲で50歳であった。P.イロベチイの兆候(免疫蛍光、DNA又はRNA検出)を有する患者において、臨床的、放射線学的及び生物学的特色を含む医療ファイル全体が、2人の専門家(呼吸器科医1人及び感染病専門医1人)によって遡及的に分析された。特異的分析に関して、BAL時のコトリモキザゾール療法の導入日及び持続期間を記録した。最終的な追訪の結果を電子医療ファイルから記録した。基礎疾患を4つのカテゴリー(HIV陽性、血液学的悪性腫瘍、実質臓器移植、その他)に分けた。
急性肺炎エピソードの病因としてのニューモシスチス肺炎(PCP)診断は、PCPの確定、PCPの高い可能性、PCPの可能性及びPCPなしと分類した。確定、高い可能性、可能性の分類に関して使用される判断基準を以下のTable 1(表1)に概要する。他の臨床的状況は、PCPなしと分類した。
実験当日、1本のチューブのペレットを解凍して、QIAGEN(登録商標)France S.A.S.社(3 avenue du Canada; LP 809; 91974 COURTABOEUF CEDEX;フランス)からのRNeasy(登録商標)plusミニキット(カタログ番号74136)を使用して、RNAを抽出した。簡潔に述べると、溶解緩衝液RLT350μL+1%ベータメルカプトエタノールをペレットに添加して、ボルテックスした。70%エタノール350μLを添加して、穏やかに混合した。最終容量をカラム中にのせて、製造業者の推奨に倣って、更なる工程を行った。本発明者等は、最終的に、抽出RNA 50μLを得た。
ミトコンドリアラージサブユニット(mtLSU、RNLとしても公知)のRNA転写物の定量化のためのプライマー及びプローブを設計するのに使用した参照配列は、GENBANK(登録商標)において、受託番号JX499143.1 REGION: 12373..15076(配列番号1)で言及され、それは、
各試料に関して、mtLSU、CYTB、BTUB、HSP70、COX1、NAD1及びATP9遺伝子の発現を試験した(RNA転写物の定量化)。PCR反応は全て、0.3μMの各プライマー、0.1μMのプローブ及びRNAの1:2希釈液2μLを用いて、一工程qRT-PCR用のEXPRESS SuperScript(登録商標)III Mix(LIFE TECHNOLOGIES(商標)社によるINVITROGEN(商標);5791 Van Allen way; Carlsbad; CA 92008;米国)0.2μL、1X EXPRESS SuperScript(登録商標)III SuperMix Universal緩衝液(LIFE TECHNOLOGIES(商標)社によるINVITROGEN(商標);5791 Van Allen way; Carlsbad; CA 92008;米国)を含有する最終容量10μL中で、LIGHTCYCLER(登録商標)480機器(ROCHE DIAGNOSTICS社;2, Avenue du Vercors; BP 59; 38242 MEYLAN CEDEX;フランス)で実行した。反応は、50℃15分の逆転写工程、続く95℃2分のDNAポリメラーゼ活性化並びに95℃15秒及び60℃30秒の45サイクルで構成された。
MGB(登録商標)=Minor Groove Binder(登録商標)クエンチャー
種々の試料の遺伝子発現レベルの決定のために、定量化データ(Cq)全てを、BTUB発現と比較して正規化した。実験較正曲線により、各PCRに関する遺伝子発現を決定するのに必要とされるPCR効率(e)の決定が可能となった。最終的に、
CYTB/mtLSU比=E(CYTB)-Cq(CYTB)/E(mtLSU)-Cq(mtLSU)
としてPfaffl、2001年の式の変更を伴って、BTUB発現を考慮せずに、CYTBの発現をmtLSU遺伝子と比較した。
患者1人当たり試料1つのみを用いて、臨床データとの相関を行った。PRISM(登録商標)v5.0(GraphPAD Software Inc.社;7825 Fay Avenue; Suite 230; LA JOLLA; CA 92037、米国)を用いて、統計学的分析を行った。
BALF中でのRNAの検出
試料200個全てから、mtLSU RNA PCRを、日常的な試験として実行されるmtLSU DNA PCRと比較した。試料200個から、RNA及びDNA PCRを用いた場合に、34名(17%)がともに陽性であり、148名(74%)がともに陰性であった。以下のTable 2(表2)を参照されたい。
192名の患者から予め収集した200個のBALFから、陽性DNA PCRを保有する試料2個(患者2名)を、臨床データの欠如のため排除した。
PCPなしの患者は、陽性mtLSU RNA及び陰性CYTB RNA PCRを有する16個の試料において、また陰性mtLSU及びCYTB RNA PCRを有する152個の試料において記録された(以下のTable 6(表4)を参照)。
続いて、本発明者等の試験の診断性能を、試料の種々のカテゴリーに基づいて算出した。比が、1.5でのCYTB/mtLSU比の閾値(]1.27から1.66[の間の閾値)を用いて決定可能である試料(陽性CYTB及びmtLSU RNA PCR、n=25)を考慮して、感度、特異性、陽性予測値(PPV)及び陰性予測値(NPV)並びに尤度比(LR)は、0.867、0.900、0.929、0.818、8.667であった(以下のTable 7(表7)を参照)。
HSP70遺伝子は、そのmRNAが、ニューモシスチス症のラットモデルにおける劇症(fulminate)感染中のニューモシスチス・カリニのトランスクリプトーム分析で見出される最も豊富な転写物のうちの1つであったため試験した。BTUB遺伝子は、参照遺伝子として使用し、同様にmtLSUと比較して試験した。他のミトコンドリア遺伝子もまた研究した:COX1、NAD1及びATP9。
RNA抽出及び/又は精製の対照としての内部対照の添加
人工又は外因性RNAを、抽出及び/又は精製工程に先立って試料に添加することができる。かかる人工又は外因性RNAは、内部抽出対照RNA(IECR)として公知である。
- BIOLINE社(BIOLINE USA Inc.社;305 Constitution Dr.; TAUNTON; MA 027080;米国)によって、カタログ番号BIO-38040又はBIO-35040で商品化されたRNA抽出対照、
- LIFE TECHNOLOGIES S.A.S.社(route de l'orme des merisiers; Immeuble Discovery - Zone Technologique; 91190 SAINT AUBIN、フランス)によって、カタログ番号4456740で商品化されているAMBION(登録商標)ERCC RNA Spike-In Controls、及び
- QIAGEN(登録商標)社(QIAGEN(登録商標)France S.A.S.社;3, avenue du Canada; LP 809; 91974 COURTABOEUF CEDEX;フランス)によって、カタログ番号211492で商品化されているRNA内部対照
が挙げられる。
代替的なCYTBプローブ及びプライマー
上記実施例1で使用したCYTB(cDNA)プローブは、5'ではFAM(商標)フルオロフォアを、及び3'ではTAMRA(商標)クエンチャーを使用した、TAQMAN(登録商標)方式での配列番号33のプローブであった。
代替的な比(mtSSU/mtLSUの比)
18名の患者の気管支肺胞洗浄(BAL)液試料を、mtSSU及びmtLSUのRNA転写物の検出及び定量化に関して分析した[P.肺炎保因者である12名の非PCP患者、及びいかなる抗PCP治療も受けていないか、又は多くても15日間、抗PCP治療を受けた6名のPCP患者]。
mtSSU遺伝子は、それぞれ、30.00[CI95% 26.51~31.36]と比較して27.90[CI95% 24.39~28.55]の中央値で、mtLSUよりも有意に良好なサイクルの結果をもたらす(p<0.001)。図5を参照されたい。
mtSSU/mtLSU RNA比は、PCPと保因との間の識別を可能にする(最適比は、2.7である)。
Claims (18)
- ニューモシスチス・イロベチイ保因者であるヒト患者が、ニューモシスチス肺炎(PCP)を有するか若しくは発症するかどうかを決定若しくは予測するための、又はニューモシスチス・イロベチイ保因者であるヒト患者におけるPCPに対する薬物若しくは治療の有効性を決定若しくは予測するための、逆転写酵素及びオリゴヌクレオチドを含む、in vitroでの使用のためのキットであって、前記オリゴヌクレオチドが、プライマー及び/又はプローブを含み、前記プライマーが、第1のプライマー対及び第2のプライマー対を含み、前記プローブが、第1のプローブ及び第2のプローブを含み、
前記第1のプライマー対及び/又は前記第1のプローブが、第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物に特異的にハイブリダイズし、
前記第2のプライマー対及び/又は前記第2のプローブが、第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物に特異的にハイブリダイズし、
前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、その配列がCytbタンパク質をコードするP.イロベチイ遺伝子であるか、又はその配列がスモールサブユニット(mtSSU)リボソームRNAに転写されるP.イロベチイmtSSU遺伝子であり、前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、その配列がラージサブユニット(mtLSU)リボソームRNAに転写されるP.イロベチイmtLSU遺伝子である、キット。 - ニューモシスチス・イロベチイ保因者であるヒト患者においてニューモシスチス肺炎(PCP)を決定若しくは予測するのに、又はニューモシスチス・イロベチイ保因者であるヒト患者におけるPCPに対する薬物若しくは治療の有効性を決定若しくは予測するのに適したキットであって、請求項1に規定の逆転写酵素及びオリゴヌクレオチド並びにポリメラーゼを含み、前記オリゴヌクレオチドが、請求項1に規定の前記第1のプライマー対、前記第1のプローブ、前記第2のプライマー対及び前記第2のプローブを含み、前記逆転写酵素及び前記ポリメラーゼが、同じチューブ中に含有される、キット。
- RNA抽出内部対照を含む、請求項1又は2に記載のキット。
- 前記ヒト患者が、HIV陰性である、請求項1から3のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値の前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値に対する比を算出する手段を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のキット。
- 比の値を閾値と比較する手段を含む、請求項5に記載のキット。
- 前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、その配列がCytbタンパク質をコードするP.イロベチイ遺伝子であり、前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、その配列がP.イロベチイラージサブユニット(mtLSU)リボソームRNAに転写されるP.イロベチイmtLSU遺伝子である、請求項5又は6に記載のキット。
- 前記閾値が、1.27~1.66の範囲に存在し、より詳細には1.50を有する、請求項6に記載のキット。
- 前記比の算出が、方程式
R=E(CYTb) -Cq(CYTb) /E(mtrDNA) -Cq(mtrDNA)
(式中、
Rは、前記比であり、
CYTBは、その配列がCytbタンパク質をコードする前記P.イロベチイ遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物であり、
mtrDNAは、その配列がP.イロベチイリボソームRNAに転写される前記P.イロベチイ遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物であり、
Eは、指示したcDNAに関する対数期での1つの増殖サイクルのPCR効率の値であり、
Cqは、指示したcDNAに関するPCR定量化サイクルの値である)
を使用して実行される、請求項7又は8に記載のキット。 - 前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、ミトコンドリアP.イロベチイスモールサブユニット(mtSSU)遺伝子であり、前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、ミトコンドリアP.イロベチイラージサブユニット(mtLSU)遺伝子である、請求項5又は6に記載のキット。
- 前記閾値が、2.7~3.3の範囲に存在し、より詳細には3.2を有する、請求項10に記載のキット。
- 前記比の算出が、方程式
R=E(mtSSU) -Cq(mtSSU) /E(mtLSU) -Cq(mtLSU)
(式中、
Rは、前記比であり、
mtSSUは、前記ミトコンドリアP.イロベチイmtSSU遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物であり、
mtLSUは、前記ミトコンドリアP.イロベチイmtLSU遺伝子のRNA転写物のcDNA逆転写物であり、
Eは、指示したcDNAに関する対数期での1つの増殖サイクルのPCR効率の値であり、
Cqは、指示したcDNAに関するPCR定量化サイクルの値である)
を使用して実行される、請求項10又は11に記載のキット。 - 各々のRNA転写物の定量化のための手段をさらに含む、請求項1から12のいずれか一項に記載のキットであって、
前記各々のRNA転写物の定量化が、
- 第1のcDNA逆転写物を得るための第1のプライマー対を使用した前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物に含有される第1のRNA標的のcDNA逆転写、及び第1のアンプリコンを得るための同じ第1のプライマー対を使用した前記第1のcDNA逆転写物のPCR増幅、並びに
- 第2のcDNA逆転写物を得るための第2のプライマー対を使用した前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物由来の第2のRNA標的のcDNA逆転写、及び第2のアンプリコンを得るための同じ第2のプライマー対を使用した前記第2のcDNA逆転写物のPCR増幅
を可能にし、
前記キットは、前記第1のアンプリコン及び前記第2のアンプリコンの定量化のための手段を更に含み、
前記第1のアンプリコンの定量化の値が、前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値であり、前記第2のアンプリコンの定量化の値が、前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値である、キット。 - 前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、その配列がCytbタンパク質をコードするP.イロベチイ遺伝子であるとき、
前記第1のRNA標的が、100個~120個のヌクレオチドで構成され、
- 配列番号29の配列、若しくは
- 配列番号29と同じ長さであり、配列番号29に対して少なくとも95%同一であるRNA配列
を含むか、又はその配列であり、並びに、
前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、ミトコンドリアP.イロベチイスモールサブユニット(mtSSU)遺伝子であるとき、
前記第1のRNA標的が、60個~110個のヌクレオチドで構成され、
- 配列番号14若しくは配列番号19若しくは配列番号24の配列、又は
- それぞれ配列番号14若しくは配列番号19若しくは配列番号24と同じ長さであり、配列番号14若しくは配列番号19若しくは配列番号24に対して少なくとも95%同一であるRNA配列
を含むか、或いはその配列である、請求項13に記載のキット。 - 前記第2のRNA標的が、115個~125個のヌクレオチドで構成され、
- 配列番号9の配列、若しくは
- 配列番号9と同じ長さであり、配列番号9に対して少なくとも95%同一であるRNA配列
を含むか、又はその配列である、請求項13又は14に記載のキット。 - 以下の定量化:
- 前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、その配列がCytbタンパク質をコードするP.イロベチイ遺伝子であるとき、前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化が、配列番号1、配列番号1に相補的な配列、配列番号2及び配列番号2に相補的な配列のいずれにもハイブリダイズせずに、配列番号30又はその相補配列にハイブリダイズする第1のプローブを使用して実行される、
又は、
- 前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、ミトコンドリアP.イロベチイスモールサブユニット(mtSSU)遺伝子であるとき、前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化が、配列番号3、配列番号3に相補的な配列、配列番号1及び配列番号1に相補的な配列のいずれにもハイブリダイズせずに、配列番号15若しくは配列番号15に相補的な配列に、又は配列番号20若しくは配列番号20に相補的な配列に、又は配列番号25若しくは配列番号25に相補的な配列にハイブリダイズする第1のプローブを使用して実行される、
又は、
- 前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、ミトコンドリアP.イロベチイラージサブユニット(mtLSU)遺伝子であるとき、前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化が、配列番号3、配列番号3に相補的な配列、配列番号2及び配列番号2に相補的な配列のいずれにもハイブリダイズせずに、配列番号10又は配列番号10に相補的な配列にハイブリダイズする第2のプローブを使用して実行される、
を可能にする手段をさらに含む、請求項1から15のいずれか一項に記載のキット。 - 前記キットを用いるRNA転写物の定量化の工程が、リアルタイムPCRによって行われる、請求項1から16のいずれか一項に記載のキット。
- (1) ニューモシスチス・イロベチイ保因者であるヒト患者が、ニューモシスチス肺炎(PCP)を有するか又は発症するかどうかを決定又は予測するためのin vitroでの方法であって、
i.前記ヒト患者の気道から事前に得た生体液の試料のRNA材料において、2つの異なるP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物を定量化して、第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値及び第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値を得る工程であって、前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、その配列がCytbタンパク質をコードするP.イロベチイ遺伝子であるか、又はその配列がスモールサブユニット(mtSSU)リボソームRNAに転写されるP.イロベチイmtSSU遺伝子であり、前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子が、その配列がラージサブユニット(mtLSU)リボソームRNAに転写されるP.イロベチイmtLSU遺伝子である、工程と、
ii.i.の前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値のi.の前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値に対する比を算出する工程と、
iii.ii.の比の値を閾値と比較する工程
を含み、
ii.の比の値が、前記閾値に等しいか又は前記閾値よりも低い場合、前記ヒト患者は、PCPを有するか又は発症する危険性が高いと決定又は予測され、
ii.の比の値が、前記閾値よりも高い場合、前記ヒト患者は、PCPを有するか又は発症する危険性が低いと決定又は予測され、
前記ヒト患者を、それが属する可能性が最も高い参照コホートの患者に分類するために、前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値の前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値に対する比が、
PCPを有するか若しくは発症するP.イロベチイ保因者、又は
PCPを有さず発症もしていないP.イロベチイ保因者
の状態に応じて事前に確立されたP.イロベチイ保因者の参照ヒトコホートを取り入れている、値又は該値の分布を比較することによって、前記閾値が事前に決定されており、
前記工程i.の定量化が、(cDNA)逆転写及びPCR増幅によって実行される、方法、
あるいは、
(2) ニューモシスチス・イロベチイ保因者であり、ニューモシスチス肺炎(PCP)を有するか又は発症すると決定されたヒト患者におけるPCPに対する薬物又は治療の有効性を決定又は予測するin vitroでの方法であって、
- 第1の時点及び第2の時点で、前記ヒト患者の気道から事前に得た生体液の試料のRNA材料において、RNA転写物を定量化して、それぞれ前記第1の時点及び前記第2の時点での第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値並びに前記第1の時点及び前記第2の時点での第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値を得る工程であって、前記第2の時点が、前記第1の時点よりも遅く、前記第1の時点及び前記第2の時点の少なくとも1つが、前記ヒト患者が前記薬物又は治療を受けている期間に含まれ、前記RNA転写物が、2つの異なるP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物であり、前記2つの異なるP.イロベチイミトコンドリア遺伝子の第1が、その配列がCytbタンパク質をコードするP.イロベチイ遺伝子であるか、又はその配列がスモールサブユニット(mtSSU)リボソームRNAに転写されるP.イロベチイmtSSU遺伝子であり、前記2つの異なるP.イロベチイミトコンドリア遺伝子の第2が、その配列がラージサブユニット(mtLSU)リボソームRNAに転写されるP.イロベチイmtLSU遺伝子であり、RNA転写物の前記定量化が、(cDNA)逆転写及びPCR増幅によって実行される工程と、
- 前記第1のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値の前記第2のP.イロベチイミトコンドリア遺伝子のRNA転写物の定量化の値に対する比を算出して、前記第1の時点での前記比の値及び前記第2の時点でのその値を得る工程と、
- 前記第2の時点での前記比の値を前記第1の時点でのその値と比較する工程であって、前記第1の時点と比較した前記第2の時点での前記比の値の増加が、前記治療又は薬物が、前記ヒト患者においてPCPを治療又は緩和するのに効率的であるか、又は効率的と予想されることを示す、工程と
を含む方法
を実行するための説明書を含む、プロセシングユニットのメモリにおける、又は前記プロセシングユニットのリーダーとの連携のためのリムーバブルメモリ支持体上での保存のためのコンピュータープログラム製品。
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