CN111424101A

CN111424101A - 一种用于定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法

Info

Publication number: CN111424101A
Application number: CN202010234555.8A
Authority: CN
Inventors: 邓西龙; 唐小平; 黄煌; 卓丽; 高洁; 熊漫
Original assignee: Guangzhou Haisi Medical Technology Co ltd; Guangzhou 8th People's Hospital
Current assignee: Guangzhou Haisi Medical Technology Co ltd; Guangzhou 8th People's Hospital
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2020-07-17

Abstract

本发明公开了一种用于定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法。本发明的试剂盒灵敏性高、特异性强、准确性高、稳定性好、检测时间短，不仅可以快速、选择性扩增标本中的肺孢子菌线粒体小亚基基因，还可以通过本发明工作标准品对所检样本中的肺孢子菌进行准确定量检测，为所检测样本的定植、感染状态提供参考，具有重大的临床意义。

Description

一种用于定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法。

背景技术

耶氏肺孢子菌肺炎(Pneumocystis Pneumonia，PCP)是艾滋病(Acquired ImmuneDeficiency Syndrome，AIDS)患者及其他免疫功能低下或者免疫缺陷人群最常见的机会性感染疾病，但PCP缺乏特异的临床特征，病原学检测是唯一可靠的确诊依据。目前国内临床诊断PCP主要依靠：临床症状、影像学及经验性治疗的疗效。传统的染色法检测肺孢子菌阳性率不高而且操作繁琐，制约了PCP病原学诊断率的提高。

大量研究指出，荧光定量PCR(qPCR)对微生物检测的灵敏度及阳性预测值都远远高于传统PCR，同时能通过定量方式初步评估菌体定植及感染负荷状态，对确定是否开展抗PCP治疗及制定抗PCP治疗的方案都至关重要。qPCR需要基于靶基因设计引物及探针，由于肺孢子菌存在丰富的基因多态性，可供分子诊断选择的靶基因较多，目前国内外尚无研究报道同时对肺孢子菌分子靶标在PCP诊断中的敏感性及特异性进行对比，也仍缺乏统一的分子诊断标准，因此，市场急需一种稳定、有效的肺孢子菌定量检测试剂盒。

线粒体DNA(mtDNA)存在于真核细胞的线粒体内，其组成包括编码线粒体内大小亚基rRNA的基因及一些特有酶的基因等，素有“分子钟”之称，常用于检测种内变异及分子系统发生的研究。由于大多数原核和真核生物mtDNA不含或少含内含子，以及其基因组序列的高重复性，因此以其为靶基因利用PCR扩增检测肺孢子菌的敏感性及特异性均高于其他方法。

国外研究中，最常用于临床诊断PCP的是线粒体大亚基rRNA(mt LSU rRNA)基因、二氢叶酸合成酶(DHFS)基因及主要表面糖蛋白(MSG)基因。但有研究报道，线粒体小亚基基因的拷贝数显著高于大亚基(2.5倍左右)，表明线粒体小亚基基因更易于PCR扩增；在不同生理状态下，除线粒体小亚基基因的拷贝数稳定存在外，其他线粒体基因的拷贝数均发生波动。所以，相较于线粒体大亚基基因，线粒体小亚基基因的拷贝数保守性更高，更适合作为靶标基因。根据靶标基因设计的引物及探针，定量检测耶氏肺孢子菌，借此来判断患者的定植、感染状态。

本发明致力于以线粒体小亚基基因为靶基因，建立一种定量检测肺孢子菌试剂盒和方法，。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法，提高肺孢子菌感染定量检测的稳定性、有效性和检出率，对PCP的诊断具有重大的意义。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，以耶氏肺孢子菌的线粒体小亚基基因为靶基因，提供一种用于定量检测耶氏肺孢子菌的引物组，所述引物组的核苷酸序列为：

PCP-F：5’-CGCTTGACCAGTAGTTAG-3’；

PCP-R：5’-GGCTCTTTGAAGTTGGAATTG-3’。

本发明的第二方面，提供一种用于定量检测耶氏肺孢子菌线粒体小亚基基因的探针，所述探针的核苷酸序列为：

PCP-P：5’-CTCGTCTATCATCATGAGACGGTGAATC-3’。

根据发明的实施例，所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM，探针序列3’端标记的猝灭基团为BHQ1。

本发明的第三方面，提供一种用于检测内参基因(人GAPDH基因)的引物组，所述引物组的核苷酸序列为：

GAPDH-F：5’-AAGGGCTTCGTATGACTGGG-3’；

GAPDH-R：5’-TTTATCTCCCTTGAGCTTCCCT-3’。

本发明的第四方面，提供一种用于检测内参基因(人GAPDH基因)的探针，所述探针的核苷酸序列为：

GAPDH-P：5’-CAGCCCTGGAGCCTTCAGTTGC-3’。

根据发明的实施例，所述探针序列5’端标记的荧光基团为HEX，探针序列3’端标记的猝灭基团为BHQ1。

本发明的第五方面，提供一种用于定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组和探针。

根据本发明的实施例，所述试剂盒还包括qPCR Mix、MgSO₄溶液、UDG酶、dUTPs、工作标准品1～4、阳性质控品和阴性质控品。

根据本发明的实施例，所述阳性质控品含浓度为1×10⁶～1×10⁷拷贝/mL肺孢子菌基因片段溶液；所述阴性质控品是0.9％的NaCl。

根据本发明的实施例，所述工作标准品1含1×10⁵拷贝/mL的肺孢子菌基因片段溶液；所述工作标准品2含1×10⁶拷贝/mL的肺孢子菌基因片段溶液；所述工作标准品3含1×10⁷拷贝/mL的肺孢子菌基因片段溶液；所述工作标准品4含1×10⁸拷贝/mL的肺孢子菌基因片段溶液。

本发明的第六方面，提供一种用于定量检测耶氏肺孢子菌的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的DNA；

(2)以提取的DNA为模板，用前面所述引物、前面所述探针进行荧光定量PCR，获得扩增曲线，以阳性质控品和阴性质控品为对照；

(3)对扩增曲线进行结果分析，判断样品中是否有耶氏肺孢子菌以及耶氏肺孢子菌的浓度(copies/ml)。

根据本发明的实施例，步骤(2)所述扩增体系为：18μL的PCR扩增反应液，2μL的DNA模板。

根据本发明的实施例，步骤(3)所述的荧光定量PCR扩增程序：

根据本发明的实施例，步骤(3)所述结果分析：扩增曲线平滑呈S型，且Ct≤40判定为耶氏肺孢子菌阳性(FAM通道)；扩增曲线不呈S型，且Ct值>40为阴性(FAM通道)。

本发明的有益效果是：

1)灵敏度高：可以检测低至20拷贝的样本量。

2)稳定性强：相较于大亚基、DHFS、MSG等检测基因，本试剂盒选择小亚基区域的拷贝数保守性更高。

3)特异性强：以白色加丝酵母、肺炎链球菌、金黄色葡萄菌、肺炎克雷伯、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、黑曲霉的核酸为样本，检测结果都是阴性。

4)定量：采用该试剂盒不但可以快速、选择性扩增标本中的肺孢子菌线粒体小亚基基因，还可以通过4个工作标准品对所检样本中的肺孢子菌进行准确定量检测，为所检测样本的定植、感染状态提供参考，具有重大的临床意义。

附图说明

图1为阴性质控品和阳性质控品荧光扩增曲线图。

图2为工作标准品在目的FAM通道的荧光扩增曲线图，从左至右分别为工作标准品4、工作标准品3、工作标准品2、工作标准品1，对应浓度分别为含1×10⁸拷贝/mL、1×10⁷拷贝/mL、1×10⁶拷贝/mL、1×10⁵拷贝/mL的肺孢子菌基因片段溶液。

图3为工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3、工作标准品4的标准曲线图，从左至右分别为工作标准品4、工作标准品3、工作标准品2、工作标准品1。

图4为部分临床样本的荧光扩增曲线图。

图5为灵敏度荧光扩增曲线图，“S”曲线从左到右对应的分别为1×10⁸拷贝/mL、1×10⁷拷贝/mL、1×10⁶拷贝/mL、1×10⁵拷贝/mL、1×10⁴拷贝/mL的样品，平直线为1×10³拷贝/mL的样品。

图6为试剂盒特异性检测的荧光扩增曲线图，“S”曲线为阳性质控品的扩增曲线，平直线为白色加丝酵母、肺炎链球菌、金黄色葡萄菌、肺炎克雷伯、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、黑曲霉的检测结果。

具体实施方式

为使本发明的目的和技术方案更清楚，下面结合实施例来进一步描述，但并不局限于此。

实验材料：

引物和探针由生工生物工程股份有限公司合成，

Probe qPCRMix购自东洋纺(上海)生物科技有限公司，

DNA Mini Kit核酸提取试剂盒购自QIAGEN公司。

试剂盒：

PCR扩增反应液：40％-60％的

Probe qPCR Mix、4-6mmol/L的MgSO₄溶液、0.3-0.7μmol/L的PCP-F、0.3-0.7μmol/L的PCP-R、0.1-0.3μmol/L的PCP-P、0.08-0.2μmol/L的内参基因GAPDH-F、0.08-0.2μmol/L的内参基因GAPDH-R、0.01-0.03μmol/L的GAPDH探针、0.008-0.02U/μL的UDG酶和0.04-0.06mmol/L的dUTPs混合后组成。

工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3、工作标准品4、阳性质控品、阴性质控品组成。

实施例1引物和探针的设计

根据公开的耶氏肺孢子菌线粒体小亚基基因序列，选取耶氏肺孢子菌线粒体小亚基的保守序列，设计引物组和探针，并从中选取一组特异性强和灵敏度高的引物、探针；以人的基因序列GAPDH为内参基因：

PCP-F：CGCTTGACCAGTAGTTAG(SEQ ID NO.1)；

PCP-R：GGCTCTTTGAAGTTGGAATTG(SEQ ID NO.2)；

PCP-P：FAM-CTCGTCTATCATCATGAGACGGTGAATC-BHQ1(SEQ ID NO.3)；

GAPDH-F：AAGGGCTTCGTATGACTGGG(SEQ ID NO.4)；

GAPDH-R：TTTATCTCCCTTGAGCTTCCCT(SEQ ID NO.5)；

GAPDH-P：HEX-CAGCCCTGGAGCCTTCAGTTGC-BHQ1(SEQ ID NO.6)。

实施例2阴性质控品、阳性质控品的检测

(1)标准样品的制备

阳性质控品为浓度为1×10⁷拷贝/mL的肺耶氏肺孢子菌线粒体小亚基目的检测片段的质粒和浓度为1×10⁷拷贝/mL的人基因组核酸的溶液，阴性质控品是0.9％的NaCl；

(2)

用实施例1试剂盒检测阳性质控品和阴性质控品中是否含有耶氏肺孢子菌，取4份PCR扩增反应液管，分别标记为反应管1、反应管2、反应管3、反应管4。反应管1、反应管2中分别加入2μl阴性质控品，在反应管3、反应管4中分别加入2μL阳性质控品，每管中加入18μL的PCR扩增反应液；反应体系如表1所示；采集荧光信号，得到扩增曲线。

表1荧光定量PCR反应体系

(3)结果判定：扩增曲线平滑呈S型，且Ct值≤40判定为耶氏肺孢子菌阳性(FAM通道)；扩增曲线不呈S型，且Ct值>40为阴性(FAM通道)。

结果分析：从图1可以看出，阳性质控品在FAM和HEX通道都有平滑且呈S型的扩增曲线，且Ct值<40(FAM通道)；阴性质控品则无S型的扩增曲线，因此试剂可正确区分阳性质控品、阴性质控品。

实施例3标准曲线测定

(1)取工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3、工作标准品4做标准曲线测定。其中，工作标准品1含1×10⁵拷贝/mL的肺孢子菌基因片段溶液，工作标准品2含1×10⁶拷贝/mL的肺孢子菌基因片段溶液，工作标准品3含1×10⁷拷贝/mL的肺孢子菌基因片段溶液，工作标准品4含1×10⁸拷贝/mL的肺孢子菌基因片段溶液；

(2)取8份PCR扩增反应液管，分别标记为反应管1～8，在反应管1～2中加入2μl工作标准品1，在反应管3～4中加入2μl工作标准品2，在反应管5～6中加入2μl工作标准品3，在反应管7～8中加入2μl工作标准品4，8份反应液管中都加入18μL的PCR反应液；

(3)以工作标准品为模板，用实施例1试剂盒通过荧光定量PCR检测样品中是否含有耶氏肺孢子菌，反应程序如表2所示：

表2荧光定量PCR反应体系

(4)结果判定：扩增曲线平滑呈S型，且Ct≤40(FAM通道)判定为耶氏肺孢子菌阳性；扩增曲线不呈S型，且Ct值>40为阴性(FAM通道)。

结果分析：如图2所示，4个工作标准品在FAM通道都有平滑且呈S型的扩增曲线，且Ct≤40(FAM通道)，拷贝数越低，Ct值越高，可为试剂盒检测样品提供参考；如图3所示，相关系数R2＞0.99，扩增效率为99.1％。由此可见，本试剂盒的扩增效率高、结果稳定、有效、一致性好。

实施例4临床样本的检测

(1)收集97例确诊为耶氏肺孢子菌肺炎患者的肺泡灌洗液和3例健康人的肺泡灌洗液，离心后收集沉淀；提取DNA；

(2)以提取的DNA为模板，用实施例1试剂盒通过荧光定量PCR检测样品中是否含有耶氏肺孢子菌，反应体系为：18μL的PCR扩增反应液，2μL的DNA模板；反应程序如表3所示：

表3荧光定量PCR反应体系

(4)结果判定：扩增曲线平滑呈S型，且Ct≤40判定为耶氏肺孢子菌阳性(FAM通道)；扩增曲线不呈S型，且Ct值>40为阴性(FAM通道)。

结果分析：如表4所示，从检测结果看，小亚基基因检测体系的检测结果和临床结果一致。如图4所示的4个样品结果，样品1～3的扩增曲线呈“S”型，且Ct≤40(FAM通道)；阴性样本4无Ct值。由此可见，本试剂盒的结果准确率高。

表4临床样本检测结果

样本量	样本类型	检测结果
			97例	肺泡灌洗液	阳性
3例	肺泡灌洗液	阴性

下面对本发明制备试剂盒的作进一步的效果检测。

灵敏性试验

取浓度为1×10⁹拷贝/mL、含耶氏肺孢子菌线粒体小亚基目的检测片段的质粒，用纯化水对比稀释成一系列的拷贝量(1×10⁸拷贝/mL、1×10⁷拷贝/mL、1×10⁶拷贝/mL、1×10⁵拷贝/mL、1×10⁴、1×10³拷贝/mL)溶液。以浓度分别为1×10³拷贝/mL、1×10⁴拷贝/mL、1×10⁵拷贝/mL、1×10⁶拷贝/mL、1×10⁷拷贝/mL、1×10⁸拷贝/mL的溶液为样本，同实施例2的扩增条件，在荧光定量PCR仪进行扩增检测。

结果分析：如图5所示，从结果中可以看出，1×10³拷贝/mL的样本没有扩增曲线，大于1×10⁴拷贝/mL的样本都有扩增曲线，所以本试剂盒的灵敏度为1×10⁴拷贝/mL。因此，本试剂盒灵敏度为1×10³拷贝/mL，即最低检出下限为20拷贝。

特异性试验

以白色加丝酵母、肺炎链球菌、金黄色葡萄菌、肺炎克雷伯、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、黑曲霉的核酸为样本，以阳性质控品为阳性对照，分别用本试剂盒进行检测，同实施例2的扩增条件，在荧光定量PCR仪进行扩增检测。

结果分析：如图6所示，除阳性质控品样本外，其余样本都是阴性都不“S”型的扩增曲线，可判定其它样本为阴性。由此可见，本试剂盒的特异性强。

综上所述，本发明的试剂盒灵敏性高、特异性强、准确性高、稳定性好、检测时间短。由此可见，本发明的试剂盒可用于大批量的临床样品测量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州市第八人民医院、广州海思医疗科技有限公司

<120> 一种用于定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

cgcttgacca gtagttag 18

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

ggctctttga agttggaatt g 21

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

ctcgtctatc atcatgagac ggtgaatc 28

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

aagggcttcg tatgactggg 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 5

tttatctccc ttgagcttcc ct 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 6

cagccctgga gccttcagtt gc 22

Claims

1.一种用于定量检测耶氏肺孢子菌线粒体小亚基基因的引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列为：

PCP-F：5’-CGCTTGACCAGTAGTTAG-3’；

PCP-R：5’-GGCTCTTTGAAGTTGGAATTG-3’。

2.一种用于定量检测耶氏肺孢子菌线粒体小亚基基因的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为：

PCP-P：5’-CTCGTCTATCATCATGAGACGGTGAATC-3’。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM，探针序列3’端标记的猝灭基团为BHQ1。

4.一种用于定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组、权利要求2或3所述的探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒还包括：qPCR Mix、MgSO₄溶液、UDG酶、dUTPs、工作标准品1～4、阳性质控品和阴性质控品。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述工作标准品1含1×10⁵拷贝/mL的肺孢子菌基因片段溶液；所述工作标准品2含1×10⁶拷贝/mL的肺孢子菌基因片段溶液；所述工作标准品3含1×10⁷拷贝/mL的肺孢子菌基因片段溶液；所述工作标准品4含1×10⁸拷贝/mL的肺孢子菌基因片段溶液。

7.一种用于定量检测耶氏肺孢子菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的DNA；

(2)以提取的DNA为模板，用权利要求1所述引物、权利要求2或3探针进行荧光定量PCR，获得扩增曲线，以阳性质控品和阴性质控品为对照；

(3)对扩增曲线进行结果分析，判断样品中是否有耶氏肺孢子菌以及耶氏肺孢子菌的浓度。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤(2)所述扩增体系为：18μL的PCR扩增反应液，2μL的DNA模板。

9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤(3)所述的荧光定量PCR扩增程序：

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述结果分析：扩增曲线平滑呈S型，且Ct值≤40判定为耶氏肺孢子菌阳性；扩增曲线不呈S型，且Ct值Ct值>40为阴性。