CN107523618A - 包含产碳青霉烯酶基因的耐药菌的pcr检测试剂盒及其应用 - Google Patents

包含产碳青霉烯酶基因的耐药菌的pcr检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了包含blaKPC基因的耐药菌的PCR检测试剂盒及其应用，属于生物检测技术领域。本发明的检测用引物及探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑3所示；PCR检测试剂盒，包括荧光PCR检测混合液，所述检测混合液中含有前述的引物和探针。利用本发明的试剂盒和引物探针能快速检测出包括blaKPC‑1到blaKPC‑19共19种blaKPC高耐药基因的微生物，具有操作简便、灵敏度高、特异性好、准确度高等优点，能够及时发现和确诊可疑病例，提高对各类感染疾病的监测水平。

Description

包含产碳青霉烯酶基因的耐药菌的PCR检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及包含blaKPC基因的耐药菌的PCR检测试剂盒及其应用，具体涉及一种能够同 时快速检测目前所有已知blaKPC基因型，包括blaKPC-1到blaKPC-19的PCR引物、探针及试剂 盒，属于生物检测技术领域。
背景技术
碳青霉烯类抗生素对大多数革兰氏阳性及革兰氏阴性病菌感染均有强大的抗菌效果，是 临床上抵御严重细菌感染的重要屏障。然而，随着临床的广泛使用应用，特别是滥用，产碳 青霉烯酶(KPC)的肺炎克雷白菌已经陆续出现，现已经有十多种KPC耐药基因，包括blaKPC-1到blaKPC-19(blaKPC-1和blaKPC-2是相同的)，含有这些耐药基因的微生物将对KPC类抗生素失 去敏感性。
到目前为止，临床对产blaKPC基因耐药菌的检测仍然主要是通过对标本进行选择性培养计 数菌落数后，再通过传统药敏试验和PCR扩增并与标准文库对比。随着分子生物学的发展以 及分子生物学技术在微生物的应用，特别是荧光PCR技术出现，由于其具有省时省力、敏感 性高、特异性强、操作简单快速等特点，且不受试验时间限制，而被广泛应用于临床诊断、 疾病研究和病原体检测等方面。然而，迄今使用PCR鉴别诊断KPC耐药菌的方法仍然非常复 杂，不仅耗时、费力，而且准确度并不比传统的药敏试验更佳，特别是，由于blaKPC耐药基因 种类繁多，迄今已经有19种blaKPC基因型被发现，现有的KPC耐药菌检测试剂盒都是只能够检 测单一或者部分的耐药基因，例如只能够检测blaKPC-1耐药基因，导致确切一一鉴别这些不同 KPC基因型具有效率低、成本高的缺陷。
因此，寻找一种能有效鉴别产各种KPC的“超级细菌”的方法已经迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴别并诊断各种产blaKPC基因耐药菌的引物、探针、荧光PCR 检测试剂盒及其制备方法、检测方法，可用于检测并诊断产blaKPC基因耐药菌的感染，用于临 床对可疑感染患者进行病原学鉴别诊断。本发明的PCR引物、探针及试剂盒能够方便地检测 目前已知的所有的19种已知的blaKPC耐药基因，不仅简便、快速、准确、灵敏，而且目前国内 外尚未见类似的技术报道。
本发明的第一个目的是提供一种针对各种产blaKPC基因耐药菌的检测引物，所述引物包括 序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的两条核苷酸序列。
在一种实施方式中，所述针对产blaKPC基因耐药菌的检测引物的组成如下：
上游引物：5’-CGCGGAACCATTCGCTAA-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物：5’-CGCGTACACACCGATGGA-3’(SEQ ID NO：2)。
本发明的第二个目的是提供一种包含blaKPC基因耐药菌的检测试剂盒，所述检测试剂盒中 包括本发明的检测引物。
在一种实施方式中，所述检测试剂盒中，还包括序列如SEQ ID NO：3所示探针。
在一种实施方式中，所述探针的一端标记有荧光报告基团，探针另一端标记有荧光淬灭 基团。
在一种实施方式中，所述探针的5’端包括荧光报告基团，3’端包括荧光淬灭基团。
在一种实施方式中，所述探针为5’-荧光报告基团-CTCGAACAGGACTTTGG-荧光淬灭基团-3’(SEQ ID NO：3)。
在一种实施方式中，所述荧光报告基团为FAM、VIC、ROX、Cy5、JOE或者Quasar705荧光基团中的任意一种。
在一种实施方式中，所述荧光淬灭基团为BHQ或者ECLIPSE系列。
在一种实施方式中，所述检测试剂盒中还包括普通PCR或者荧光PCR扩增用的PCRbuffer 和H2O。
在一种实施方式中，所述PCR buffer中含有优化的双阳离子缓冲液、dNTPS、PCR增强剂、 PCR稳定剂。
在一种实施方式中，所述检测试剂盒中还包括PCR酶、阴性对照品及阳性对照品中的至 少一种。
在一种实施方式中，所述酶为DNA聚合酶，比如taq DNA聚合酶。
在一种实施方式中，所述阳性对照品为灭活或减毒阳性菌株的DNA或相应的对照质粒。
在一种实施方式中，所述阴性对照品为DEPC-H2O。
在一种实施方式中，所述检测试剂盒为荧光检测试剂盒，包括本发明的引物、探针、qPCR buffer、taq DNA聚合酶。优选地，还包括水或TE。
本发明的第三个目的是提供所述的检测引物在制备包含blaKPC基因的耐药菌检测试剂中 的应用。
本发明的第四个目的是包含blaKPC基因耐药菌的检测方法，是利用本发明的所述引物或者 检测试剂盒进行检测。
在一种实施方式中，所述耐药菌为以下任意一种或多种：鲍氏不动杆菌Acinetobacterbaumannii(n＝17)，弗罗因德(氏)枸橼酸杆菌Citrobacterfreundii(n＝1)，产气肠杆 菌Enterobacteraerogenes(n＝2)，阴沟肠杆菌Enterobactercloacae(n＝12)，大肠杆菌Escherichiacoli(n＝165)，催产克雷白(氏)杆菌KlebsiellaOxytoca(n＝1)，臭鼻克雷白氏杆菌 Klebsiellaozaenae(n＝2)，肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae(n＝55)，摩根(氏)菌 Morganellamorganii(n＝1)，奇异变形杆菌Proteusmirabilis(n＝1)，雷氏普罗威登斯菌 Providenciarettgeri(n＝1)，绿浓杆菌Pseudomonasaeruginosa(n＝21)，灵杆菌 Serratiamarcescens(n＝4)和念珠菌Candidaspecies(n＝5)。
在一种实施方式中，所述检测方法，是采用荧光PCR进行检测。
在一种实施方式中，荧光PCR扩增体系包括(20μl体系)：8～12μl的qPCR buffer(2X)、 一定浓度的引物和探针、0.1～1μl的taqDNA聚合酶、一定浓度的待测品、其余为水。
在一种实施方式中，荧光PCR扩增体系为：10μl的qPCR buffer(2X)，1μl的引物探针混 合液，0.3μl的taqDNA聚合酶，待检DNA模板5μl，加灭菌去离子水补足体积到20μl。
在一种实施方式中，荧光PCR扩增体系制备方法如下：取10μl的qPCR buffer(2X)，与1μl 的KPC引物探针混合液和3.7μl的H2O混合，再加入0.3μl的taqDNA聚合酶，取15μl上述混合液 加入5μl待测DNA样本，获得反应总体系为20μl的PCR反应液。
在一种实施方式中，所述PCR酶由0.3μl Taq酶(5U/μl)，无尿嘧啶-N-糖基化酶制成。
在一种实施方式中，所述的KPC引物探针混合液由等体积的10pmol/μl的KPC上游引物、 10pmol/μl的KPC下游引物和5pmol/μl探针组成。
在一种实施方式中，所述待测品为样本的DNA模板溶液、阳性对照品或阴性对照品(DEPC-H2O)。
在一种实施方式中，所述阳性对照品中，对照质粒可以单独包装也可以混合包装。
本发明针对鉴别并诊断产blaKPC基因耐药菌的荧光PCR检测的试剂盒所用的方法，采用的 是Taqman荧光定量PCR原理，分别针对blaKPC耐药基因设计特异性引物，扩增特异性核酸序 列，同时分别设计Taqman探针，并标记不同的荧光报告基团，并位于上下游引物之间。探针 5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团。当探针完整的时候，报告基团所发射的 荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到 与模板结合的探针，其5’→3’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其 能量不能被吸收，即产生荧光信号。因此，本发明采用的荧光定量PCR技术具有实时检测、 定量和高通量检测等特点，且操作简便、灵敏度高、特异性好等优点。
使用本发明针对产blaKPC基因耐药菌的荧光PCR检测试剂盒检测时，其使用方法如下：
1)提取待测样本的DNA，获得DNA模板溶液；
2)加入本发明制备的检测混合溶液，制备反应体系；
3)PCR扩增并检测。
本发明PCR检测的待测样本来自ATCC、疾控中心(CDC)、本公司实验室从获得的患者 标本，包括，但不限于粪便、尿液、痰、血液、组织液、分泌物等获取的菌株。样本的核酸提取按核酸提取说明书操作进行。
检测加样的方法为：每个反应取10μl的PCR buffer(2X)与0.3μlTaqPCR酶(Taq酶5U/μl)， 混合，再加入1μl的KPC引物探针混合液和3.7μlddH2O，振荡混匀数秒，3000rpm离心5秒，获 得混合液。取前述混合液15μl置于PCR管中，然后将5μl的DNA模板溶液、阳性对照品、或者 阴性对照品加入PCR反应管中，盖好PCR反应管盖，立即进行PCR扩增反应。
本发明推荐的PCR反应条件：
ABI7500fastdx仪器：95℃2min，(95℃15s，60℃30s)40个循环
博日9600plus仪器：94℃2min，(94℃10s，60℃40s)40个循环。
PCR反应阈值设定：阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品检测荧光曲线的最高点。
本发明荧光PCR质量控制：阴性对照品检测结果在Ct栏显示Undetermined(ABI7500)或 N/A(CFX96)或No Ct(SLAN)；阳性对照品检测结果应为：FAM通道Ct值均≤35(其他荧 光标记结果判断依据同FAM)，并且有明显的S扩增曲线，否则实验视为无效。具体见表1。
表1试验结果的判断标准
序列 通道 结果判断
1 Undetermined/No Ct/(N/A) 阴性
2 Ct≤35 阳性
3 38≤Ct≤40 待定，复测
本发明最后公开了前述针对产blaKPC基因耐药菌的荧光PCR检测用引物及探针、前述产 blaKPC基因耐药菌的荧光PCR检测试剂盒在制备和/或检测试剂中的应用。
本发明的有益效果：
本发明的试剂盒及其应用大大缩短检测时间，操作简便。特异性引物和和探针的设计保 证了引物和探针的高度保守和特异性，避免了两对引物和探针之间无互补配对或交叉扩增的 情况。
附图说明
图1实施例8第一天的检测灵敏度的扩增曲线图；
图2实施例8第二天检测灵敏度的扩增曲线图；
图3实施例8第三天检测灵敏度的扩增曲线图；
图4实施例10的批内重复性的扩增曲线图；
图5实施例10的批间重复性第一天的扩增曲线图；
图6实施例10的批间重复性第二天的扩增曲线图；
图7实施例10的批间重复性第三天的扩增曲线图；
图8实施例11的线性度的扩增曲线图；
图9实施例11的检测革兰氏阴性菌株中blaKPC基因的线性度的标准曲线；
图10实施例12的特异性的扩增曲线图；
图11实施例13的VIC、JOE两种荧光标记对PCR的影响。
具体实施方案
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的保护范围。
实施例1
核酸测定试剂盒引物探针的设计和合成1
在探针的5’标记FAM荧光基团，探针的3’标记BHQ1荧光基团。
合成针对产各种KPC耐药菌的PCR检测的引物、探针：
上游引物：5’-CGCGGAACCATTCGCTAA-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物：5’-CGCGTACACACCGATGGA-3’(SEQ ID NO：2)
探针：5’-FAM-CTCGAACAGGACTTTGG-BHQ1-3’(SEQ ID NO：3)
实施例2
核酸测定试剂盒引物探针的设计和合成2
在探针的5’标记VIC荧光基团，探针的3’标记BHQ1荧光基团。
合成针对产各种KPC耐药菌的PCR检测的引物、探针：
上游引物：5’-CGCGGAACCATTCGCTAA-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物：5’-CGCGTACACACCGATGGA-3’(SEQ ID NO：2)
探针：5’-VIC-CTCGAACAGGACTTTGG-BHQ1-3’(SEQ ID NO：3)
实施例3
核酸测定试剂盒引物探针的设计和合成3
在探针的5’标记ROX荧光基团，探针的3’标记BHQ2荧光基团。
合成针对产各种KPC耐药菌的PCR检测的引物、探针：
上游引物：5’-CGCGGAACCATTCGCTAA-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物：5’-CGCGTACACACCGATGGA-3’(SEQ ID NO：2)
探针：5’-ROX-CTCGAACAGGACTTTGG–BHQ2-3’(SEQ ID NO：3)
实施例4
核酸测定试剂盒引物探针的设计和合成4
在探针的5’标记Cy5荧光基团，探针的3’标记BHQ2荧光基团。
合成针对产各种KPC耐药菌的PCR检测的引物、探针：
上游引物：5’-CGCGGAACCATTCGCTAA-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物：5’-CGCGTACACACCGATGGA-3’(SEQ ID NO：2)
探针：5’-Cy5-CTCGAACAGGACTTTGG–BHQ2-3’(SEQ ID NO：3)
实施例5
核酸测定试剂盒引物探针的设计和合成5
在探针的5’标记Quasar705荧光基团，探针的3’标记BHQ3荧光基团。
合成针对产各种KPC耐药菌的PCR检测的引物、探针：
上游引物：5’-CGCGGAACCATTCGCTAA-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物：5’-CGCGTACACACCGATGGA-3’(SEQ ID NO：2)
探针：5’-Quasar705-CTCGAACAGGACTTTGG–BHQ3-3’(SEQ ID NO：3)
实施例6
核酸测定试剂盒引物探针的设计和合成6
在探针的5’标记JOE荧光基团，探针的3’标记DAB荧光基团。
合成针对产各种KPC耐药菌的PCR检测的引物、探针：
上游引物：5’-CGCGGAACCATTCGCTAA-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物：5’-CGCGTACACACCGATGGA-3’(SEQ ID NO：2)
探针：5’-JOE-CTCGAACAGGACTTTGG–DAB-3’(SEQ ID NO：3)
实施例7
核酸测定试剂盒的制备及使用
1、核酸荧光PCR检测混合液的制备：
制备方法如下：配制10pmol/μl的上游引物、下游引物以及5pmol/μl的探针，再取等体积 的上述引物探针混匀制成一管引物探针混合液。取qPCR buffer(2X)10μl，与1μl的引物探针 混合液、0.3μl的taq DNA聚合酶、工艺用水3.7μl混合，获得体积为15μl的核酸荧光PCR检测混 合液。制备n×15μl核酸荧光PCR检测混合液(n为反应管数)。
2、加样
每支PCR管中取上述混合液15μl，然后向每支PCR管中再分别加入待测样品DNA制备液 5μl，盖好PCR管盖，立即进行PCR扩增反应。
3、PCR扩增
反应管置于定量荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：
ABI7500fastdx仪器：95℃2min，(95℃15s，60℃30s)40个循环
博日9600plus仪器：94℃2min，(94℃10s，60℃40s)40个循环。
实施例8
核酸测定试剂盒的灵敏度分析
根据美国临床实验室标准化研究所的规程确定了本PCR检测灵敏度实验方案。
(1)制备一管106cfu/ml浓度的菌悬液：blaKPC基因采用菌株ATCC BAA-17052。
(2)将上述菌悬液逐级稀释成8个浓度梯度的稀释液，各稀释浓度分别见下表2。将稀 释浓度约100CFU/ml浓度的菌混合液液按照标准微生物学方法进行细菌计数。
(3)提取上述8个浓度梯度稀释液的菌混合液DNA，备用。
(4)实时PCR分析本实时PCR检测的灵敏度。每个稀释度三个重复，重复三天，故每个稀释度一共得到9个数据，利用SPSS统计软件版本22.0(95％阳性率水平)统计本实时PCR检测blaKPC基因的灵敏度。结果见下表2，三天检测灵敏度的扩增曲线见附图1，2和3。 通过SPSS软件分析，95％阳性率水平上本实时荧光定量PCR检测blaKPC基因的灵敏度为567CFU/mL。
目前国内有两家生产KPC检测试剂盒的公司，上海之江生物科技和深圳普瑞康生物技 术，两家生产的KPC检测试剂盒的检测限为1000copies/ml，并且国内临床并没有同时检测所 有1-19种blaKPC基因耐药的试剂盒或检查方法。
表2 PCR对blaKPC灵敏度分析结果
实施例9
核酸测定试剂盒的精确度分析
根据美国临床实验室标准化研究所的规程确定了本发明的PCR检测灵敏度实验方案。通 过检测以下类型的样本，对本发明的实时PCR检测的准确性进行了评估，菌株的来源：
参考菌株从ATCC、CDC(n＝88)或者本实验室收集的患者样本(n＝200)，以及单个或多个 外添加目标基因的标本((n＝13)，共301株样本，其中包括283株革兰氏阴性菌株和5种念珠 菌，如下：
鲍氏不动杆菌Acinetobacterbaumannii(n＝17)，弗罗因德(氏)枸橼酸杆菌Citrobacterfreundii(n＝1)，产气肠杆菌Enterobacteraerogenes(n＝2)，阴沟肠杆菌Enterobactercloacae(n＝12)，大肠杆菌Escherichiacoli(n＝165)，催产克雷白(氏)杆菌KlebsiellaOxytoca(n＝1)，臭鼻克雷白氏杆菌Klebsiellaozaenae(n＝2)，肺炎克雷伯氏菌 Klebsiellapneumoniae(n＝55)，摩根(氏)菌Morganellamorganii(n＝1)，奇异变形杆菌 Proteusmirabilis(n＝1)，雷氏普罗威登斯菌Providenciarettgeri(n＝1)，绿浓杆菌Pseudomonasaeruginosa(n＝21)，灵杆菌Serratiamarcescens(n＝4)和念珠菌Candidaspecies(n＝5)。
从ATCC或CDC获得的菌株是否含有blaKPC基因，在菌株说明书中都有详细的说明；而 对于临床菌株，采用Illumina MiSeq或HiSeq对菌株全基因组测序，再在全基因组序列的基 础上，采用基因从头组装技术来确定临床菌株中是否含有blaKPC基因，301份样本中，其中 确定的blaKPC阳性样本共45份。
提取这301份样本的DNA，采用本实时荧光定量PCR检测这301份样本blaKPC基因。结果见表3，其中45份阳性，与已知的阳性样本数一致，精确度100％。PCR对各型blaKPC基因的敏感性为100％，特异性为100％，总体精度为100％。
表3本PCR对blaKPC基因精确度的检测结果
实施例10
核酸测定试剂盒的重复性分析
1、批内重复性
以美国临床和实验室标准协会(CLSI)的定性分析方法为指南检测本PCR实验的批内重 复性。准备含blaKPC基因浓度为108cfu/ml菌悬液，制备高中低三个稀释度(稀释度分别为 107、105、103cfu/ml)的菌悬液提取DNA备用。实时PCR分析本实时PCR检测的批内重复性，每个稀释度每次三个重复，计算得到的三个Ct值的平均值和标准差(SD)，结果见表4，扩增曲线见附图4。结果表明，PCR检测blaKPC基因批内重复性达到了100％。
表4本PCR检测blaKPC基因批内重复性结果
2、批间重复性
以美国临床和实验室标准协会(CLSI)的定性分析方法为指南检测本PCR实验的批间重 复性。准备含blaKPC基因的菌悬液，制备4个浓度的菌悬液提取DNA备用。每个浓度每次两个重复，连续做三天，则每个浓度得到6个数据。计算得到的6个Ct值的平均值和标准差(SD)。结果见表5，扩增曲线见附图5，图6和图7。结果表明，PCR检测blaKPC基因批 间重复性为95.8％(23/24)。
表5本PCR检测blaKPC基因批间重复性结果
实施例11
核酸测定试剂盒的线性分析
制备含blaKPC靶基因10cfu/ml到108cfu/ml的8个浓度的稀释液，提取各稀释液DNA备 用。运用本PCR检测对耐药基因blaKPC的线性度，线性度的扩增曲线见附图8，线性度的标准曲线见附图9。
如图8、9所示，本PCR对blaKPC基因的线性度检测结果跨度超过七个对数单位。
实施例12
本核酸测定试剂盒的特异性分析
为了研究本PCR的分析特异性，本实验分析了88株参考菌株的耐药性，其中包括了常 见的多重耐药革兰氏阴性菌，如鲍氏不动杆菌Acinetobacterbaumannii(n＝14)，产气肠杆菌 Enterobacteraerogenes(n＝2)，阴沟肠杆菌Enterobactercloacae(n＝9)，大肠杆菌 Escherichiacoli(n＝15)，奥克西托克雷白杆菌KlebsiellaOxytoca(n＝1)，臭鼻克雷白氏杆菌 Klebsiellaozaenae(n＝2)，肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae(n＝23)，摩根(氏)菌 Morganellamorganii(n＝1)，奇异变形杆菌Proteusmirabilis(n＝1)，雷氏普罗威登斯菌 Providenciarettgeri(n＝1)，铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa(n＝12)，粘质沙雷氏菌 Serratiamarcescens(n＝2)，念珠菌Candidaspecies(n＝5)。
这88株菌株中，blaKPC阳性株为11株，其余为耐药基因阴性菌株。
提取这88份样本的DNA，研究本实时PCR的特异性，结果扩增曲线如附图10所示，阳性结果为11株，与已知的一致，其余为耐药基因阴性菌株，本PCR正确检测所有的blaKPC靶基因，无交叉反应。
对于干扰物质的研究中，本实验采用了高水平的人类血红蛋白和粪便标本进行了分析， 均不会干扰本PCR检测。
实施例13
不同的荧光标记对荧光定量PCR的影响
将blaKPC的探针由FAM标记改为VIC、JOE标记，制备含blaKPC浓度梯度为103，104，105，106，107，108cfu/ml的菌悬液，提取DNA备用，比较不同的荧光标记对荧光定量PCR 的影响。扩增曲线如附图11所示。
从图中可以看出，两种荧光标记的PCR结果的敏感性和特异性都很好，本试剂盒的探针 适合不同的荧光标记，均能得到较好的结果。
结论
本发明的PCR引物可以同时检测包括blaKPC-1到blaKPC-19共19种blaKPC高耐药基因，具 有良好的灵敏度、精确度和可重复性，这是目前其他的同类PCR试剂盒无法做到的。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京紫萌医药科技有限公司
<120> 包含blaKPC基因的耐药菌的PCR检测试剂盒及其应用
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgcggaacca ttcgctaa 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgcgtacaca ccgatgga 18
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctcgaacagg actttgg 17

Claims (10)

1.一种检测引物，其特征在于，所述引物包括序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的两条核苷酸序列。
2.一种包含blaKPC基因耐药菌的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包括权利要求1所述的检测引物。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括序列如SEQ ID NO：3所示的探针。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针的一端标记有荧光报告基团，探针另一端标记有荧光淬灭基团。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、VIC、ROX、Cy5、JOE或者Quasar705荧光基团中的任意一种；所述荧光淬灭基团为BHQ或者ECLIPSE系列。
6.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还含有qPCRbuffer和H2O。
7.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括PCR酶、阴性对照品及阳性对照品中的至少一种。
8.权利要求1所述的检测引物在制备包含blaKPC基因的耐药菌检测试剂中的应用。
9.一种包含blaKPC基因耐药菌的检测方法，其特征在于，是利用权利要求1所述的引物、权利要求2-7任一所述的检测试剂盒或者权利要求8所述的检测试剂进行检测。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述耐药菌为以下任意一种或多种：鲍氏不动杆菌Acinetobacterbaumannii，弗罗因德(氏)枸橼酸杆菌Citrobacterfreundii，产气肠杆菌Enterobacteraerogenes，阴沟肠杆菌Enterobactercloacae，大肠杆菌Escherichiacoli，催产克雷白(氏)杆菌KlebsiellaOxytoca，臭鼻克雷白氏杆菌Klebsiellaozaenae，肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae，摩根(氏)菌Morganellamorganii，奇异变形杆菌Proteusmirabilis，雷氏普罗威登斯菌Providenciarettgeri，绿浓杆菌Pseudomonasaeruginosa，灵杆菌Serratiamarcescens和念珠菌Candidaspecies。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN105349685A (zh) * 2007-04-06 2016-02-24 贝克顿·迪金森公司 用于鉴定碳青霉烯酶基因的组合物和方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105349685A (zh) * 2007-04-06 2016-02-24 贝克顿·迪金森公司 用于鉴定碳青霉烯酶基因的组合物和方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110904199A (zh) * 2019-11-22 2020-03-24 南方医科大学南方医院 检测碳青霉烯酶blaKPC基因的引物、方法及试剂盒

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