CN108179212A - 用于检测腹腔细菌感染的多重荧光pcr试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于检测腹腔细菌感染的多重荧光PCR试剂盒，所述试剂盒包括PCR缓冲液、MgCL2、dNTPs、Taq酶、引物探针混合液和阳性质控品；所述引物探针混合液包括引物组和探针组。检测方法：将核酸提取物分别加入荧光PCR反应管中，再加入PCR缓冲液、MgCL2、dNTPs和Taq酶，引物探针混合液，盖好管盖，进行荧光PCR检测；进行荧光PCR扩增循环，结果判读。本发明综合直接检测的优势，以及实时荧光定量PCR技术的特点，能快速、准确、高敏感度的检测和鉴别10种常见腹腔感染细菌。

Description

用于检测腹腔细菌感染的多重荧光PCR试剂盒及方法
【技术领域】
本发明涉及分子生物学检测的技术领域，特别是用于检测腹腔细菌感染的多重荧光PCR试剂盒的技术领域。
【背景技术】
腹腔感染是指空腔脏器的感染侵犯或超越浆膜面进入腹腔空间，可形成腹膜炎或腹腔脓肿的一种病理生理状态。其中空腔脏器包括胃肠道、胆道和胰腺。腹腔感染目前仍然是腹部外科最重要的问题之一，发生率高，死亡率高，在美国，每年仅急性阑尾炎导致的腹腔感染就可达到30万例，至今在重症监护病房，腹腔感染仍然是导致患者死亡的第二大原因。国内的情况也基本类似，华中科技大学同济医学院附属同济医院200株细菌所占科室比例普外科为27％,比例最高,ICU为15％；复旦大学附属中山医院报道病原菌来源科室的比例，普外科病房、外科ICU、内科病房和急诊室依次占39.7％、35.0％、20.4％和2.6％。
腹腔感染的病原菌常为肠道细菌，其进入腹膜腔空间的途径通常是通过空腔脏器的肠壁直接侵入，也可能存在肠粘膜屏障功能障碍导致肠道细菌易位的情况(如急性胰腺炎继发细菌感染已被许多临床和实验研究证明为该种机制)。可通过检测腹腔感染及其他部位感染的标本中的细菌基因，判断细菌的感染情况，并且在已经使用过抗菌药物的病人中，基因检测的方法较细菌培养更易得出阳性结果，从而对抗抗菌药物的使用有一定指导作用,但这些报道都是单基因或数个基因的检测，信息量小，对细菌种类的鉴定判断价值较小，对临床抗感染治疗的指导作用有限。
目前检测腹腔感染的黄金标准仍然是细菌培养，传统检测方法包括前增菌、选择性增菌、分离、鉴定等程序,一般需要3～5d才能完成,但即使是目前最高水平的细菌培养实验室，常规等待细菌培养的阳性结果要1～3天。细菌的分子生物学检测方法包括基因测序法,液相芯片,基因芯片,荧光PCR法和荧光PCR结合熔解曲线法。这几种检测方法,基因测序法操作复杂,耗时较长,成本较高,不易普及,一般应用于科研检测；液相芯片法与基因芯片法耗时较长,成本较高,且因开放式操作,易产生交叉污染也较少在临床使用。
荧光PCR通过荧光基团的淬灭结合PCR可以快速,简便的检测各种微生物的存在,是一种灵敏度高,特异性强的分子生物学检测方法,目前在临床微生物鉴定,如病毒,细菌,支原体及衣原体感染方面起着非常重要的作用,但目前腹腔常见细菌的荧光PCR检测常局限于单个细菌的鉴定；Septifast是一种荧光PCR结合熔解曲线判定常见菌血症细菌的试剂盒,但因熔解曲线法灵敏度的限制,局限于ROCHE荧光PCR仪,试剂成本极高且检测时间也很长,一般需要5小时左右。
【发明内容】
本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出用于检测腹腔细菌感染的多重荧光PCR试剂盒及方法，综合直接检测的优势，以及实时荧光定量PCR技术的特点，能快速、准确、高敏感度的检测和鉴别10种常见腹腔感染细菌。
为实现上述目的，本发明提出了用于检测腹腔细菌感染的多重荧光PCR试剂盒，所述试剂盒包括PCR缓冲液、MgCL2、dNTPs、Taq酶、引物探针混合液和阳性质控品；所述引物探针混合液包括引物组和探针组。
作为优选，所述引物组核苷酸序列选自如下序列中的2～5种:
5’-GCCTTATGGTTGTAAAGCAC-3’SEQ ID NO.1
5’-CTGCTGGCACGDAGTTAGC-3’SEQ ID NO.2
5’-GCCTTCGGGTTGTAAAGY-3’SEQ ID NO.3
5’-TCGGMTCGTAAAACTCTGTT-3’SEQ ID NO.4
5’-GGTCTTCGGATTGTAAAGC-3’SEQ ID NO.5
作为优选，所述探针组核苷酸序列如下:
5’-GGTCTTCGGATTGTAAAGC-3’SEQ ID NO.6
5’-ACCCTTGACATGGTCGGAATCCT-3’SEQ ID NO.7
5’-CCCTTTTGTTGGGAAAGAAATCCAGC-3’SEQ ID NO.8
5’-CCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAG-3’SEQ ID NO.9
5’-AACAAACGTGTAAGTAACTGTGCACGTC-3’SEQ ID NO.10
5’-CAAGGATGAGAGTAACTGTTCATCCCT-3’SEQ ID NO.11
5’-CCTTGACATACTAGAAACTTTCCAGAGAT-3’SEQ ID NO.12
5’-TACCCTTGACATCCAGAGAACTTAGC-3’SEQ ID NO.13
5’-CGTTAGTAACTGAACGTCCCCTGAC-3’SEQ ID NO.14
5’-TTGTGGTTAATAACCACAGCAATTGAC-3’SEQ ID NO.15
5’-AGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACG-3’SEQ ID NO.16
作为优选，所述引物探针混合液为针对金黄色葡萄球菌、洋葱假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、铜绿假单胞菌、凝固酶阴性葡萄球菌、屎肠球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、阴沟肠杆菌的特异引物和探针SEQ ID NO.1～16。
作为优选，所述PCR缓冲液为10X、MgCL2为25mM、dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM。
用于检测腹腔细菌感染的多重荧光PCR检测方法，其特征在于：包括具体步骤如下：
a)将核酸提取物2μL～10μL分别加入荧光PCR反应管中，并向管中加入10X的PCR缓冲液2.5μL、25mM的MgCL2 2.0μL、含dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM的dNTPs 2.0μL，和1U的Taq酶0.1μL，引物探针混合液1.5μL，分别配成25μL体系，盖好管盖，进行荧光PCR检测；
b)进行荧光PCR扩增循环，荧光PCR扩增反应的条件为：92～97℃预变性10min；92～97℃变性10s；57～62℃退火31s～60s，此时为荧光采集点；40～45个循环；
c)结果判读。
作为优选，所述结果判读：样本检测管Ct值>35，该样本结果判断为阴性；样本检测管Ct值≤35，该样本结果判断为阳性。
作为优选，所述探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核昔酸。
作为优选，所述探针标记的荧光报告基团可为FAM/ROX/HEX/CY5荧光基团中的一种。
作为优选，所述探针标记的荧光淬灭基团为BHQ1和BHQ2中的一种。
本发明的有益效果：本发明通过多重荧光PCR技术同时实现10种常见腹腔细菌的快速早期检测，无需开盖，既能减少实验操作步骤，节省时间，同时还避免了开盖操作可能带来的样本污染。多重荧光PCR通过标记不同荧光基团,在同一反应管中检测多个不同目的基因,可节约反应试剂,同时检测和鉴别多个靶标,实现精确分子诊断，具有操作简便，快速，高灵敏度，高特异性兼具高通量等诸多优势，目前已渐渐成为临床微生物感染分子诊断的重要方法，本发明利用4个反应可同时快速灵敏鉴别检测腹腔感染常见的10种细菌，对临床腹腔感染的早期诊治具有重大价值。
本发明的特征及优点将通过实施例进行详细说明。
【具体实施方式】
本发明，引物探针设计并筛选能特异性检测：根据序列比对情况，分别在10种细菌16s rDNA区段设计兼并引物，并确保每种细菌在该片段区域内的唯一性，以保证该基因扩增的特异性，引物长度一般为20碱基左右，探针长度一般为20～27碱基。
5’-GCCTTATGGTTGTAAAGCAC-3’(SEQ ID NO.1)
5’-CTGCTGGCACGDAGTTAGC-3’(SEQ ID NO.2)
5’-GCCTTCGGGTTGTAAAGY-3’(SEQ ID NO.3)
5’-TCGGMTCGTAAAACTCTGTT-3’(SEQ ID NO.4)
5’-GGTCTTCGGATTGTAAAGC-3’(SEQ ID NO.5)
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5’-ACCCTTGACATGGTCGGAATCCT-3’(SEQ ID NO.7)
5’-CCCTTTTGTTGGGAAAGAAATCCAGC-3’(SEQ ID NO.8)
5’-CCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAG-3’(SEQ ID NO.9)
5’-AACAAACGTGTAAGTAACTGTGCACGTC-3’(SEQ ID NO.10)
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5’-CCTTGACATACTAGAAACTTTCCAGAGAT-3’(SEQ ID NO.12)
5’-TACCCTTGACATCCAGAGAACTTAGC-3’(SEQ ID NO.13)
5’-CGTTAGTAACTGAACGTCCCCTGAC-3’(SEQ ID NO.14)
5’-TTGTGGTTAATAACCACAGCAATTGAC-3’(SEQ ID NO.15)
5’-AGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACG-3’(SEQ ID NO.16)
反应体系的优化：采用培养的10种常见腹腔感染细菌，提取其核酸后进行PCR。
(1)引物浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将引物浓度分别从0.1uM至1.6uM作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较定每条最佳引物浓度是0.5uM。
(2)探针浓度的优化：在反应体系中其他条件相同的情况下，将探针浓度分别从，确0.05uM至0.5uM作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定各探针最佳探针浓度是0.4uM。
(3)退火温度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，进行梯度PCR(54℃～62℃退火温度)，通过对试验结果的分析比较，确定最佳退火温度是57℃。
(4)酶的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，在反应体系中加入各种酶，通过对实验结果的分析比较，确定最佳酶是Faststart DNA聚合酶。
利用上述引物和探针进行反应体系的建立，确定采用的10种腹腔感染细菌的荧光PCR反应体系为25μL，按荧光定量PCR试剂进行反应液的配置，其中：PCR缓冲液(10X)2.5μL、MgCL2(25mM)2.0μL、dNTPs 2.0μL(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)和Taq酶0.1μL(1U)，引物探针混合液1.5μL；
检测结果分析：如果待检样本中10种腹腔感染细菌中的任意一种，用特异性引物探针组扩增时则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可以达到10copies/mL；如果待检样本中没有这10种细菌，用特异性引物探针组扩增时则显示阴性扩增曲线，即Ct值>35，提示上述引物对和探针具有良好的特异性和灵敏度。
(1)本发明提供的突变特异性引物和探针的检测灵敏度可以达到10copies/mL，说明其灵敏度良好。
(2)本发明提供的细菌特异性引物和探针组检测不到含本专利所提到的10种细菌之外的其他细菌，其扩增曲线Ct值≥38，说明其特异性强。
(3)本发明提供的检测试剂可对细菌核酸样本进行检测，方法快速、操作简单、污染少、结果判读客观。
本发明工作过程：
本发明用于检测腹腔细菌感染的多重荧光PCR试剂盒及方法在工作过程中，本发明所使用的探针为5’端FAM标记的TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核昔酸。在探针完整时，即随机状态和无PCR产物杂交状态时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收。在荧光PCR扩增过程中，当特异的PCR产物与TaqMan探针发生杂交反应时Taq酶的5’端外切酶活性同时也把探针裂解，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板RNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。
本发明，综合直接检测的优势，以及实时荧光定量PCR技术的特点，在腹腔细菌的检测方面，与微生物培养法，基因测序，基因芯片等检测技术比较，本发明具有以下优势：
特异性强：本发明的引物探针细菌的16S rDNA区域序列设计，为细菌基因测序鉴别诊断最常选用的特异基因，可特异地区分不同种属的细菌，使用Taqman探针结合特异的细菌引物可鉴别不同种类的细菌。
敏感性高：本发明能检测到10copies/mL浓度的10种最常见腹腔细菌。
操作简单快速，从标本送检到得出结果可在3个小时以内完成。
结果判读明确、客观，若需要亦可对结果进行定量分析。
上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.用于检测腹腔细菌感染的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括PCR缓冲液、MgCL2、dNTPs、Taq酶、引物探针混合液和阳性质控品；所述引物探针混合液包括引物组和探针组。
2.如权利要求1所述的用于检测腹腔细菌感染的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述引物组核苷酸序列选自如下序列中的2～5种:
5’-GCCTTATGGTTGTAAAGCAC-3’SEQ ID NO.1
5’-CTGCTGGCACGDAGTTAGC-3’SEQ ID NO.2
5’-GCCTTCGGGTTGTAAAGY-3’SEQ ID NO.3
5’-TCGGMTCGTAAAACTCTGTT-3’SEQ ID NO.4
5’-GGTCTTCGGATTGTAAAGC-3’SEQ ID NO.5。
3.如权利要求1所述的用于检测腹腔细菌感染的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述探针组核苷酸序列如下:
5’-GGTCTTCGGATTGTAAAGC-3’SEQ ID NO.6
5’-ACCCTTGACATGGTCGGAATCCT-3’SEQ ID NO.7
5’-CCCTTTTGTTGGGAAAGAAATCCAGC-3’SEQ ID NO.8
5’-CCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAG-3’SEQ ID NO.9
5’-AACAAACGTGTAAGTAACTGTGCACGTC-3’SEQ ID NO.10
5’-CAAGGATGAGAGTAACTGTTCATCCCT-3’SEQ ID NO.11
5’-CCTTGACATACTAGAAACTTTCCAGAGAT-3’SEQ ID NO.12
5’-TACCCTTGACATCCAGAGAACTTAGC-3’SEQ ID NO.13
5’-CGTTAGTAACTGAACGTCCCCTGAC-3’SEQ ID NO.14
5’-TTGTGGTTAATAACCACAGCAATTGAC-3’SEQ ID NO.15
5’-AGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACG-3’SEQ ID NO.16。
4.如权利要求2或3所述的用于检测腹腔细菌感染的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述引物探针混合液为针对金黄色葡萄球菌、洋葱假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、铜绿假单胞菌、凝固酶阴性葡萄球菌、屎肠球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、阴沟肠杆菌的特异引物和探针SEQ ID NO.1～16。
5.如权利要求1所述的用于检测腹腔细菌感染的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液为10X、MgCL2为25mM、dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM。
6.用于检测腹腔细菌感染的多重荧光PCR检测方法，其特征在于：包括具体步骤如下：
a)将核酸提取物2μL～10μL分别加入荧光PCR反应管中，并向管中加入10X的PCR缓冲液2.5μL、25mM的MgCL2 2.0μL、含dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM的dNTPs 2.0μL，和1U的Taq酶0.1μL，引物探针混合液1.5μL，分别配成25μL体系，盖好管盖，进行荧光PCR检测；
b)进行荧光PCR扩增循环，荧光PCR扩增反应的条件为：92～97℃预变性10min；92～97℃变性10s；57～62℃退火31s～60s，此时为荧光采集点；40～45个循环；
c)结果判读。
7.如权利要求6所述的用于检测腹腔细菌感染的多重荧光PCR检测方法，其特征在于：所述结果判读：样本检测管Ct值>35，该样本结果判断为阴性；样本检测管Ct值≤35，该样本结果判断为阳性。
8.如权利要求6所述的用于检测腹腔细菌感染的多重荧光PCR检测方法，其特征在于：所述探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核昔酸。
9.如权利要求8所述的用于检测腹腔细菌感染的多重荧光PCR检测方法，其特征在于：所述探针标记的荧光报告基团可为FAM/ROX/HEX/CY5荧光基团中的一种。
10.如权利要求8所述的用于检测腹腔细菌感染的多重荧光PCR检测方法，其特征在于：所述探针标记的荧光淬灭基团为BHQ1和BHQ2中的一种。
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