CN105755134A - 一种内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增技术及应用 - Google Patents

一种内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增技术及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增技术及应用，所述方法提供在5`端含有限制性内切酶特异性识别序列，并标记有荧光基团和猝灭基团的一对交叉引物、一对置换引物，以及3～6条扩增引物恒温扩增目的基因片段并进行可视化检测、电泳检测、实时浊度检测及实时荧光检测。本方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于各种核苷酸片段检测。

Description

一种内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增技术及应用
技术领域
本发明公开了一种核酸扩增技术，属于分子生物学领域。
背景技术
在现代医学和生物学领域，核酸扩增是一种不可缺少的技术，广泛运用于临床检测、基础研究、考古研究、流行病研究、转基因研究等领域。在已开发设计的核酸扩增技术中，PCR扩增技术是第一个被建立的体外核酸扩增技术，具有划时代意义，该技术已经被广泛运用于医学、生物及化学相关领域。
运用PCR技术进行核酸扩增时，依靠复杂昂贵的热循环设备，扩增产物的检测比较复杂，需要一套复杂的流程及设备。因此，PCR技术的应用受到实验室条件的限制，这些劣势阻碍了PCR技术的广泛应用，尤其在经济落后的地区，快速检测及现场诊断领域。对于生物及医学相关研究领域而言，非常有必要发展一个操作简单、检测快速、经济有效的核酸扩增方法。
近十年来，为了克服PCR扩增技术及衍生技术(如实时PCR)的劣势，应运而生了许多恒温核酸扩增技术。相比较PCR及衍生技术而言，恒温扩增技术不依赖于热循环扩增设备，整个扩增过程恒定在固定的温度，反应速度快，敏感性强，特异性高。有利于实现快速扩增，便捷检测及现场诊断。
到目前为止，已研发的恒温扩增技术有10余种，应用较为广泛的有SDA(链置换扩增)、HDA(解旋酶依赖的恒温扩增)、RCA(滚环扩增)、LAMP(环介导恒温扩增)、CPA(交叉扩增)等。然而，SDA、HDA技术实现核酸扩增需要多种酶同时工作，依赖于昂贵的试剂和复杂的操作步骤。RCA技术仅能扩增环状核酸序列，且反应时间长。LAMP及CPA技术实现核酸的扩增仅依靠一种置换酶，已经被广泛的运用于检测领域。然而，LAMP和CPA技术很难对一些含量极低的靶标进行检测(如感染早期的临床样本，血液样本)。因此这些扩增技术的实用性，便捷性，可操作性有待于提高，尤其是在快速诊断领域以及欠发达地区。
为了克服现有恒温扩增技术及PCR相关技术的劣势，实现快速、简单、敏感及特异的核酸序列扩增，有必要建立一种操作简单、经济实用、反应快速、特异性强的核酸扩增技术。为了实现这一目标，本发明人近期已经建立了一种新的核酸扩增技术，命名为多交叉置换扩增(MultipleCrossDisplacementAmplification，MCDA)，相关内容公开于CN104946744A，该专利文件作为现有技术文件构成本申请说明书的一个部分。MCDA在恒温条件下实现核酸扩增，仅使用一种恒温置换酶、扩增速度快、反应灵敏、特异性高。在本发明中，为了使该技术在生物、医药及卫生领域应用更广泛、更经济。发明人以MCDA为基础，开发了能够同时检测多个靶标的多重实时MCDA技术，该技术被命名为内切酶介导的实时多交叉置换扩增(EndonucleaseRestriction-MediatedReal-timeMultipleCrossDisplacementAmplification,ET-MCDA)，ET-MCDA作为一种新的多重实时恒温核酸检测技术，能够广泛地用于生物、临床及相关领域，实现核酸的实时、快速及多重检测分析。
志贺菌(Shigellaspp.)和沙门菌(Salmonellaspp.)是两种重要的食源性疾病病原体，广泛存在于环境中的革兰氏阴性菌。志贺菌和沙门菌常分离自食品样本及临床标本，引起食源性的肠热症，临床症状表现为发热、腹泻。据WHO数据统计，全球每年有180万病人死于腹泻，而绝大多数病例是由志贺菌和沙门菌导致，从而受到全球卫生部门的高度关注，成为各国的重大公共卫生问题。在发展中国家，志贺菌是引起菌痢的最主要的病原体，然而，无论是在发展中国家还是发达国家，沙门菌是导致食源性疾病最重要的病原体。因此，为了给予临床病人快速准确的治疗，食源性病原体监测以及志贺菌和沙门菌的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的诊断方法，能够同时检测和鉴定志贺菌和沙门菌成为必要。
目前对于志贺菌和沙门菌的检测主要依赖于传统的增菌培养和生化鉴定，该方法耗时大约5到7天，包括增菌、选择培养及后续的生化鉴定，其劣势耗时耗力，生化结果的判读依赖于人的主观判断，导致结果重复性差，易错判。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于志贺菌和沙门菌的快速检测，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，昂贵的探针合成，以及熟练的操作人员。对于一些落后的实验室无法进行，从而限制了这些技术的运用。目前运用这些检测技术检测志贺菌和沙门菌的PCR方法和real-timePCR方法，诊断灵敏度差，检测过程耗时较长，不利于快速检测和应急检测。
本发明针对志贺菌的特异基因ipaH和沙门菌的特异基因invA基因分别设计两套ET-MCDA扩增引物，旨在验证、评价ET-MCDA扩增技术及建立针对志贺菌和沙门菌病原体的快速、敏感和特异的ET-MCDA检测体系。
发明内容
基于上述目的，本发明首先提供了一种内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)自所述目的基因片段的3’端起，设定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目的基因片段的5’端起，设定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端设定第五任意序列C1，和/或在所述第四任意序列P2的3’端设定第六任意序列C2s；
(2)提供置换引物F1，所述引物F1含有与序列F1s互补的序列，提供交叉引物E-CP1，所述引物E-CP1自5’端依次含有一种荧光基团、一种限制性内切酶序列、序列C1和与序列P1s互补的序列P1，在所述引物E-CP1的中间标记有荧光猝灭基团，提供置换引物F2，所述引物含有序列F2，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有序列C2s互补的序列C2和序列P2；
(3)提供扩增引物，所述扩增引物包括含有序列C1的扩增引物C1，和/或含有与序列C2s互补的扩增引物C2；
(4)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用目的基因片段作为模板恒温扩增DNA；
(5)检测步骤(4)的扩增结果。
在一个优选的技术方案中，在步骤(1)中所述序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1，步骤(3)所述的扩增引物还包括含有序列D1的扩增引物D1和含有序列R1的扩增引物R1；或者
在步骤(1)中序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s，步骤(3)所述的扩增引物还包括含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2。
在另一个优选的技术方案中，在步骤(1)序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1,在序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s，步骤(3)所述的扩增引物还包括含有序列D1的扩增引物D1、含有序列R1的扩增引物R1、含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2。
在另一个优选的技术方案中，所述引物CP2自5’端还依次含有一种荧光基团、一种限制性内切酶序列，在所述引物CP2的中间标记有荧光猝灭基团，在实际应用中，为了节省成本，CP2可不标记，当CP1与CP2同时标记的时候，达到的效果与只标记CP1或CP2是相同的，该技术方案也在本发明的保护范围之中。
在又一个优选的技术方案中，其特征在于，步骤(4)中所述扩增是在61-65℃中进行的。
优选地，步骤(4)中所述扩增是在63℃中进行的。
在一个优选的技术方案中，步骤(4)中所述链移位型聚合酶为BstDNA聚合酶，所述解链温度调节剂为甜菜碱。
在另一个优选的技术方案中，步骤(5)所述的检测为可视染料检测、电泳检测、实时浊度检测或实时荧光检测。
其次，本发明还提供了上述内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增方法在检测志贺菌和/或沙门菌中的应用，其特征在于，步骤(2)提供的引物选自下列序列组合：
(1)如SEQIDNO:1所示的引物Sal-F1，SEQIDNO:2所示的引物Sal-F2，SEQIDNO:3所示的引物Sal-CP1，SEQIDNO:4所示的引物Sal-E-CP1，SEQIDNO:5所示的引物Sal-CP2，SEQIDNO:6所示的引物Sal-C1，SEQIDNO:7所示的引物Sal-C2，SEQIDNO:8所示的引物Sal-D1，SEQIDNO:9所示的引物Sal-D2，SEQIDNO:10所示的引物Sal-R1，SEQIDNO:11所示的引物Sal-R2，和/或
SEQIDNO:12所示的引物Shi-F1，SEQIDNO:13所示的引物Shi-F2，SEQIDNO:14所示的引物Shi-CP1，SEQIDNO:15所示的引物Shi-E-CP1，SEQIDNO:16所示的引物Shi-CP2，SEQIDNO:17所示的引物Shi-C1，SEQIDNO:18所示的引物Shi-C2，SEQIDNO:19所示的引物Shi-D1，SEQIDNO:20所示的引物Shi-D2，SEQIDNO:21所示的引物Shi-R1，SEQIDNO:22所示的引物Shi-R2；
其中，所述引物Sal-E-CP1与所述引物Shi-E-CP1分别含有限制性内切酶序列，能够被一种限制性内切酶特异性识别，两种引物分别标记不同的荧光基团和荧光猝灭基团。
在一个优选的技术方案中，所述引物Sal-E-CP1含有的限制性内切酶序列能够被限制性内切酶Nb.BsrDI特异性识别，所标记的荧光基团为Cy5，所述荧光猝灭基团为BHQ2；所述引物Shi-E-CP1含有的限制性内切酶序列能够被限制性内切酶Nb.BsrDI特异性识别，所标记的荧光基团为Hex，所述荧光猝灭基团为BHQ1。
本发明提供的内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增方法(ET-MCDA)用于沙门菌和志贺菌检测时，其独立检测沙门菌的检测限为6.25fg/反应管(见图6A，6C)，独立检测志贺菌的检测限为3.125fg/反应管(见图6B,6D)，其灵敏度与MCDA技术相同(见图8)，比普通qPCR及普通PCR优越。
ET-MCDA多重检测体系在检测沙门菌的检测下限为6.25fgDNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为15分钟(见图7A)，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约30分钟；ET-MCDA检测沙门菌的灵敏度比普通qPCR及普通PCR优越。ET-MCDA多重检测体系在检测志贺菌的检测下限为3.125fgDNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为15分钟(见图7B)，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约31分钟；ET-MCDA检测志贺菌的灵敏度比普通qPCR及普通PCR优越。
在对常见的致病菌及条件致病菌DNA(沙门菌、志贺菌、单增李斯特菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、蜡样芽胞杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌等)的检测中，ET-MCDA技术能准确地鉴别沙门菌和志贺菌，显示了良好的特异性(见图9)。
附图说明
图1ET-MCDA扩增原理示意图；
图2ET-MCDA引物标记示意图；
图3针对沙门菌和志贺菌检测的ET-MCDA引物设计示意图；
图4ET-MCDA可行性验证结果图；
图5针对沙门菌和志贺菌检测的ET-MCDA引物的最佳温度测定图；
图6ET-MCDA检测单一靶序列结果图；
图7ET-MCDA同时检测多序列结果图；
图8针对沙门菌和志贺菌检测的MCDA方法的敏感度评价结果图；
图9ET-MCDA特异性评价结果图
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增(ET-MCDA)原理
本发明在原有MCDA引物的基础上(具体参见CN104946744A)，对MCDA的交叉引物CP1和CP2进行改进，在CP1和CP2的5`端添加一段酶切序列(命名为Es)，该序列能够被限制性内切酶(Nb.BsrDI)特异性的识别，改进后的引物称为E-CP1和E-CP2。合成针对不同靶序列的E-CP1和E-CP2引物时，在E-CP1和E-CP2的5`端标记不同的荧光基团，引物的中间标记猝灭基团，该猝灭基团能够特异性的猝灭5`端荧光基团。
在ET-MCDA的扩增反应体系中，运用E-CP1和E-CP2替换了原来MCDA体系中的CP1和CP2引物，该反应在恒温条件下进行(61-65℃)。ET-MCDA反应过程与MCDA扩增过程相似(见图1)。随着ET-MCDA扩增反应的进行，反应混合物中合成了以Es为模板的互补链CEs(扩增步骤3，4，11，12，循环过程1，2)。该双链能够被反应体系中的限制性内切酶特异性的识别、切割，该过程将荧光基团和猝灭基团分开，导致荧光信号释放。释放的荧光信号可以通过荧光检测器检测，不同的荧光信号代表了不同的靶序列。同时，E-CP1和E-CP2的Es序列被剪切后，该引物变成了MCDA反应的交叉引物CP1和CP2，使得ET-MCDA扩增反应继续进行(见图1)。引物E-CP1和E-CP2上标记的荧光基团和荧光猝灭基团的标记位置参见图2和图3。
在ET-MCDA扩增之后，两种主流的检测方法被用于ET-MCDA扩增判别，首先，在反应混合物中加入可视染料(如FD试剂，朗普荧光可视试剂)，阳性反应管的颜色从浅灰色变为绿色，阴性反应管则保持原来的浅灰色(图4A，4B)。其次，ET-MCDA产物可以通过琼脂糖凝胶电泳后检测扩增子，由于产物中包含了不同大小的扩增片段，因此阳性扩增产物的电泳图呈特异性阶梯状，阴性反应不出现任何条带(4C，4D)。此外，ET-MCDA技术的优势在于能够进行实时荧光及多重检测，因此实时荧光检测被用于判别ET-MCDA扩增。
实施例所需要的引物设计和实验材料
1.引物设计根据志贺菌属(Shigellaspp.)的特异性基因ipaH(Genbankaccessionno.M32063)和沙门菌属(Salmonellaspp.)的特异基因invA(Genbankaccessionno.NC.003197)设计ET-MCDA扩增引物，ipaH基因存在于所有的志贺菌中，其特异性好，可以将志贺菌与其他密切相近的菌种和菌属区分开。invA基因存在于所有的沙门菌中，其特异性好，可以将沙门菌与其他密切相近的菌种和菌属区分开。依据ET-MCDA技术的扩增原理(参见图1)，利用PrimerExplorerV4(EikenChemical)(http:// primerexplorer.jp/e/)和PrimerPremier5.0引物设计软件设计ET-MCDA引物，并将获得的特异性引物在NCBI数据库中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的两套ET-MCDA扩增引物。引物设计的位置和方向见图3。(图3A针对沙门菌的特异基因invA设计ET-MCDA引物，图3B针对志贺菌特异基因ipaH设计ET-MCDA引物。划线部分表示引物的设计区域，箭头代表引物设计的方向)，序列见表1。
表1.引物序列及修饰
注1.Sal:salmonella.
注2.引物Sal-E-CP1的限制性酶切序列、荧光基团与猝灭基团的标记位置为：5'-Cy5-TGCAATG-ATGATAT(BHQ2)TCCGCCCCATATTATCCGGATTAGTGCCGGTTTTATCGTG-3'
注3.Shi:shigella.
注4.引物Shi-E-CP1的限制性酶切序列、荧光基团与猝灭基团的标记位置为：5'-Hex-TGCAATG-CGACCT(BHQ1)GTTCACGGAATCCGGCTTGACCGCCTTTCCGATAC-3'
2.本发明中使用的试剂LoopampKit(EikenChemicalCo.Ltd.,Tokyo,Japan)购于日本荣研公司。DNA提取试剂盒(QIAampDNAminikits；Qiagen,Hilden,Germany)购于德国Qiagen公司。qPCR反应体系混合物Premix(TakaraBio,Inc.,Otsu,Japan，dNTP和缓冲液)购于北京Takara生物科技有限公司。PCR反应体系混合物MIX(TaqDNA聚合酶，dNTP和缓冲液)购于北京康为世纪生物科技有限公司。DL50DNAMarker和DL50DNAMarker购于宝生物工程(大连)有限公司。其余试剂均为市售分型纯产品。
3.本发明实验中使用和涉及的主要仪器：Loopamp实时浊度仪LA-320C(EikenChemicalCo.,Ltd,Japan)购于日本荣研公司。实时荧光检测仪为Rotor-GeneQReal-TimeSystem(Qiagen),德国Qiagen产品；电泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品；PCR仪为SensoquestLabcycler,德国Sensoquest产品；凝胶成像系统为Bio-RadGelDoxXR,美国Bio-Rad产品。
4.本发明中细菌基因组的提取，志贺菌菌、沙门菌及其他种类菌的基因组DNA的提取。
基因组提取：细菌基因组的提取使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒(QIAampDNAminikits；Qiagen,Hilden,Germany)，按照说明书进行操作。利用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度，志贺菌和沙门菌基因组DNA用GE缓冲液连续稀释(从25ng、2.5ng、250pg、25pg、2.5pg、250fg、25fg、12.5fg、6.25fg、3.125fg、1.56fg到0.78fg/微升)。各种基因组DNA均少量分装，-20℃保存备用。连续稀释的志贺菌和沙门菌的DNA用于ET-MCDA方法最佳温度的探索及方法灵敏度的建立。以常见的致病菌及条件致病菌DNA(单增李斯特菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、蜡样芽胞杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌等)为模板评价ET-MCDA检测反应体系的特异性。菌株信息见表2。
表2.菌株信息
注1.未鉴定的血清型；
注2.ICDC,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所；
注3.ATCC，美国模式培养物集存库。
实施例1.标准ET-MCDA检测
1.1建立标准ET-MCDA反应体系：交叉引物E-CP1和CP1的浓度为30pmol，交叉引物CP2的浓度为60pmol，置换引物F1和F2的浓度为10pmol，扩增引物R1，R2，D1和D2的浓度为30pmol，扩增引物C1和C2的浓度为20pmol，12.5μL2×Mix缓冲反应液，10U的链置换DNA聚合酶(Bst)，15U的限制性内切酶(Nb.BsrDI)，1μL的模板，补加去离子水至25μl。整个反应恒温在63℃1小时，80℃5min终止反应。
1.2证明设计的MCDA扩增反应的可行性
可视颜色变化法：在标准的ET-MCDA反应条件下，ET-MCDA在扩增DNA时产生大量的焦磷酸根离子，该离子能够夺取与钙黄绿素结合的锰离子，使钙黄绿素恢复游离状态而发荧光。该发光混合物能够与反应中产生的镁离子结合，使荧光得到增强。可以通过荧光目视检测颜色变化判读结果，阳性反应管从浅灰色变为绿色，阴性反应保持浅灰色不变，见图4A和4B。
电泳检测法：由于ET-MCDA的扩增产物包含了许多大小不一的短片段及一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯式图谱，见图4C和4D。
通过可视荧光目视法和电泳检测法判读MCDA扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应管未出现任何的反应产物，说明本研究所设计的ET-MCDA方法可行，以及针对靶序列设计的两套ET-MCDA可用，能够用于靶序列扩增检测。
1.3测定ET-MCDA技术的最佳反应温度
在标准反应体系条件下，加入目的病原菌DNA模板及所对应的ET-MCDA引物，其模板浓度为250pg/ul。反应在恒温条件下进行(60-67℃)，结果运用实时荧光仪进行检测，在不同的温度下得到不同的动态曲线图，见图5A和5B。61-65℃被推荐作为ET-MCDA技术的最佳反应温度。本发明中的后续验证选择63℃作为恒温条件进行ET-MCDA扩增。
1.4ET-MCDA检测单一样本的灵敏度
在标准体系条件下，倍比稀释模板DAN从25ng、2.5ng、250pg、25pg、2.5pg、250fg、25fg、12.5fg、6.25fg、3.125fg、1.56fg到0.78fg/微升)，1微升各浓度模板加入反应体系中，通过实时荧光检测，得到稳定的荧光检测图形，见图6。ET-MCDA独立检测沙门菌的检测下限为6.25fgDNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为12分钟(见图6A和6C)，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约35分钟；当反应体系中沙门菌的基因组模板量降低至6.25fg以下时，ET-MCDA反应不出现阳性扩增。参见图8，8A，8C，8E为沙门菌的MCDA敏感性评价，8A为实时浊度检测，8C为可视荧光检测，8E为琼脂糖凝胶电泳检测。根据判读的结果，ET-MCDA技术独立检测沙门菌的检测限为3.125fg/反应管，ET-MCDA检测沙门菌的灵敏度与MCDA技术相同，比普通qPCR及普通PCR优越(见表3)。ET-MCDA独立检测志贺菌的检测下限为3.125fgDNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为13分钟(见图6B和6D)，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约28分钟；当反应体系中志贺菌的基因组模板量降低至3.125fg以下时，ET-MCDA反应不出现阳性扩增。参见图8，8B，8D，8F为志贺菌的MCDA敏感性评价，8B为实时浊度检测，8D为可视荧光检测，8F为琼脂糖凝胶电泳检测。根据判读的结果，ET-MCDA技术独立检测志贺菌的检测限为3.125fg/反应管，ET-MCDA检测志贺菌的灵敏度与MCDA技术相同，比普通qPCR及普通PCR优越(见表3)。
实施例2.多重ET-MCDA检测
为了得到稳定的多重荧光检测图形，对标准ET-MCDA体系进行优化适应多重检测，建立多重检测体系。在多重检测体系下，我们在多重反应混合物中同时加入两套引物及对应的模板，通过荧光检测器检测，得到稳定的多重荧光检测图，见图7(A组信号和B组信号同时产生，来自同一反应管。A组信号来自于Cy5信号通道，代表沙门菌的检测，信号1到12代表检测样本的量为25ng、2.5ng、250pg、25pg、2.5pg、250fg、25fg、12.5fg、6.25fg、3.125fg、1.56fg到0.78fg/反应管，信号13代表阴性对照；B组信号来自于HEX通道，代表志贺菌的检测，信号1到12代表检测样本的量为25ng、2.5ng、250pg、25pg、2.5pg、250fg、25fg、12.5fg、6.25fg、3.125fg、1.56fg到0.78fg/反应管，信号13代表阴性对照)。ET-MCDA反应体系能够同时进行两个靶序列的检测，证明了ET-MCDA技术的多重检测能力，能够将ET-MCDA技术推广到多靶序列的检测。应用ET-MCDA同时检测沙门菌和志贺菌时，其检测时间和检测灵敏度与单序列检测没有质的变化。
2.1建立多重ET-MCDA反应体系：交叉引物Sal-E-CP1和Sal-CP1的浓度为30pmol，交叉引物Sal-CP2的浓度为60pmol，置换引物Sal-F1和Sal-F2的浓度为10pmol，扩增引物Sal-R1，Sal-R2，Sal-D1和Sal-D2的浓度为30pmol，扩增引物Sal-C1和Sal-C2的浓度为5pmol，交叉引物Shi-E-CP1和Shi-CP1的浓度为10pmol，交叉引物Shi-CP2的浓度为20pmol，置换引物Shi-F1和Shi-F2的浓度为10pmol,扩增引物Shi-R1，Shi-R2，Shi-D1和Shi-D2的浓度为10pmol，扩增引物Shi-C1和Shi-C2的浓度为5pmol，12.5μL2×Mix缓冲反应液，10U的链置换DNA聚合酶(Bst)，15U的限制性内切酶(Nb.BsrDI)，1μL的模板，补加去离子水至25μl。整个反应恒温在63℃1小时，80℃5min终止反应。
2.2验证ET-MCDA的多重检测能力及灵敏度
ET-MCDA多重检测体系在检测沙门菌的检测下限为6.25fgDNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为15分钟(见图7A)，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约30分钟；当反应多重检测体系中沙门菌的基因组模板量降低至6.25fg以下时，ET-MCDA反应不出现阳性扩增。根据判读的结果，ET-MCDA多重检测体系在检测沙门菌时的检测限为6.25fg/反应管，ET-MCDA检测沙门菌的灵敏度比普通qPCR及普通PCR优越(见表3)。ET-MCDA多重检测体系在检测志贺菌的检测下限为3.125fgDNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为15分钟(见图7B)，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约31分钟；当反应体系中志贺菌的基因组模板量降低至3.125fg以下时，ET-MCDA反应不出现阳性扩增。根据判读的结果，ET-MCDA多重检测体系在检测志贺菌时的检测限为3.125fg/反应管，ET-MCDA检测志贺菌的灵敏度比普通qPCR及普通PCR优越(见表3)。
2.3ET-MCDA检测特异性评价：
以常见的致病菌及条件致病菌DNA(沙门菌、志贺菌、单增李斯特菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、蜡样芽胞杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌等)为模板评价ET-MCDA技术的特异性，(菌株信息详见表2)。ET-MCDA技术能准确地鉴别沙门菌和志贺菌，说明ET-MCDA方法的特异性良好，见图9：图9A，信号1-10来自于志贺菌基因组模板扩增(Hex荧光通道)；图9B,信号11-17信号来自于沙门菌基因组模板扩增(Cy5通道)。反应18-35为非沙门菌，非志贺菌；反应36为阴性控制。结果表明，ET-MCDA能够正确的检测靶序列，通过荧光信号并将不同靶序列鉴别开。
对照实施例1.MCDA检测
MCDA反应体系：交叉引物CP1的浓度为60pmol，交叉引物CP2的浓度为60pmol，置换引物F1和F2的浓度为10pmol，扩增引物R1，R2，D1和D2的浓度为30pmol，扩增引物C1和C2的浓度为20pmol，12.5μL2×Mix缓冲反应液，10U的链置换DNA聚合酶(Bst)，1μL的模板，补加去离子水至25μl。整个反应恒温在63℃1小时，80℃5min终止反应。
检测结果及与ET-MCDA的对照见表3。
对照实施例2
Real-timeRCR方法反应体系：
在实时荧光定量PCR仪上扩增并测定结果：
在荧光检测仪(Rotor-GeneQRealTimeSystem,Qiagen)中进行Real-time反应，扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同一阈值分析数据，确定该反应的Ct(cyclethreshold)值。
检测结果及与ET-MCDA的对照见表3
对照实施例3.普通RCR检测：
普通RCR反应体系
PCR反应条件：
反应结束后，取10μlPCR产物在2.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，并在凝胶成像系统上观察分析结果。
检测结果及与ET-MCDA的对照见表3。
表3.ET-MCDA，MCDA，qPCR及PCR方法的灵敏度比较
注1.ET-MCDA,内切酶介导的实时多交叉置换扩增；
MCDA,多交叉置换扩增；
qPCR，荧光定量PCR。

Claims (10)

1.一种扩增目的基因片段并对扩增结果进行检测的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)自所述目的基因片段的3’端起，设定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目的基因片段的5’端起，设定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端设定第五任意序列C1，和/或在所述第四任意序列P2的3’端设定第六任意序列C2s；
(2)提供置换引物F1，所述引物F1含有与序列F1s互补的序列，提供交叉引物E-CP1，所述引物E-CP1自5’端依次含有一种荧光基团、一种限制性内切酶序列、序列C1和与序列P1s互补的序列P1，在所述引物E-CP1的中间标记有荧光猝灭基团，提供置换引物F2，所述引物含有序列F2，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有序列C2s互补的序列C2和序列P2；
(3)提供扩增引物，所述扩增引物包括含有序列C1的扩增引物C1，和/或含有与序列C2s互补的扩增引物C2；
(4)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用目的基因片段作为模板恒温扩增DNA；
(5)检测步骤(4)的扩增结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中所述序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1，步骤(3)所述的扩增引物还包括含有序列D1的扩增引物D1和含有序列R1的扩增引物R1；或者
在步骤(1)中序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s，步骤(3)所述的扩增引物还包括含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1,在序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s，步骤(3)所述的扩增引物还包括含有序列D1的扩增引物D1、含有序列R1的扩增引物R1、含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物CP2自5’端还依次含有一种荧光基团、一种限制性内切酶序列，在所述引物CP2的中间标记有荧光猝灭基团。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述扩增是在61-65℃中进行的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述扩增是在63℃中进行的。
7.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述链移位型聚合酶为BstDNA聚合酶，所述解链温度调节剂为甜菜碱。
8.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述的检测为可视染料检测、电泳检测、实时浊度检测或实时荧光检测。
9.权利要求1-4任一所述的方法在检测志贺菌和/或沙门菌中的应用，其特征在于，步骤(2)提供的引物选自下列序列组合：
(1)如SEQIDNO:1所示的引物Sal-F1，SEQIDNO:2所示的引物Sal-F2，SEQIDNO:3所示的引物Sal-CP1，SEQIDNO:4所示的引物Sal-E-CP1，SEQIDNO:5所示的引物Sal-CP2，SEQIDNO:6所示的引物Sal-C1，SEQIDNO:7所示的引物Sal-C2，SEQIDNO:8所示的引物Sal-D1，SEQIDNO:9所示的引物Sal-D2，SEQIDNO:10所示的引物Sal-R1，SEQIDNO:11所示的引物Sal-R2，和/或
SEQIDNO:12所示的引物Shi-F1，SEQIDNO:13所示的引物Shi-F2，SEQIDNO:14所示的引物Shi-CP1，SEQIDNO:15所示的引物Shi-E-CP1，SEQIDNO:16所示的引物Shi-CP2，SEQIDNO:17所示的引物Shi-C1，SEQIDNO:18所示的引物Shi-C2，SEQIDNO:19所示的引物Shi-D1，SEQIDNO:20所示的引物Shi-D2，SEQIDNO:21所示的引物Shi-R1，SEQIDNO:22所示的引物Shi-R2；
其中，所述引物Sal-E-CP1与所述引物Shi-E-CP1分别含有限制性内切酶序列，能够被一种限制性内切酶特异性识别，两种引物分别标记不同的荧光基团和荧光猝灭基团。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述引物Sal-E-CP1含有的限制性内切酶序列能够被限制性内切酶Nb.BsrDI特异性识别，所标记的荧光基团为Cy5，所述荧光猝灭基团为BHQ2；所述引物Shi-E-CP1含有的限制性内切酶序列能够被限制性内切酶Nb.BsrDI特异性识别，所标记的荧光基团为Hex，所述荧光猝灭基团为BHQ1。
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