CN105950778A - 依赖mert-lamp技术检测粪肠球菌和金黄色葡萄球菌的核苷酸序列 - Google Patents

依赖mert-lamp技术检测粪肠球菌和金黄色葡萄球菌的核苷酸序列 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组用于MERT‑LAMP扩增的引物序列，其中包括分别针对粪肠球菌和金黄色葡萄球菌的引物F3、B3、EFIP、BIP、LF和LB，在每个EFIP引物的5’端各标记有一个彼此不同的荧光基团，并在所述引物的其它位置标记有一荧光猝灭基团。本发明还公开了上述引物在粪肠球菌和金黄色葡萄球菌检测中的应用。该应用实现了一步法多重恒温检测，操作简便、特异性强、灵敏度高、检测速度快。

Description

依赖MERT-LAMP技术检测粪肠球菌和金黄色葡萄球菌的核苷 酸序列
技术领域
本发明涉及MERT-LAMP技术(Multiple Endonuclease Restriction Real-TimeLoop-Mediated Isothermal Amplification)在细菌检测中的应用，特别是在粪肠球菌和金黄色葡萄球菌鉴别检测中的应用，属于分子生物学和微生物学领域。
背景技术
粪肠球菌(Enterococcus faecalis；E.faecalis)是革兰氏阳性，过氧化氢阴性球菌，是人和动物肠道内主要菌群之一。该菌是内源性和外源性医院感染的第二大病原菌，检出率仅次于大肠杆菌。在引起尿路感染的致病菌中，粪肠球菌感染居第2位；腹腔、盆腔感染，粪肠球菌居第3位；败血症，粪肠球菌居第3位，病死率12.6％～57％。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus；S.aureus)是人类的一种重要病原体，隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus aureus；S.aureus)。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因此，该菌极易造成食品污染。此外，根据世界卫生组织的报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。该菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。此外，这两种病原体也是重症加强护理病房最常见的病原菌，从而受到全球卫生部门的高度关注，成为各国的重大公共卫生问题。因此，为了给予临床病人准确快速的治疗，医院感染的控制以及两种病原体的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的检测方法，能够同时检测和鉴定两种病原体成为必要。
目前对于粪肠球菌和金黄色葡萄球菌的检测主要依赖于传统的分离培养和生化鉴定，该方法耗时大约5到7天，包括增菌，选择培养及后 续的生化鉴定，该检测过程耗时耗力。此外，生化结果的判读依赖于操作者的主观判断，从而导致结果重复差，易错判。随着核酸检测技术的快速发展，一些以PCR为基础的检测技术(如普通PCR技术，实时荧光PCR技术)被用于粪肠球菌和金黄色葡萄球菌的快速检测，然而这些方法依赖于昂贵的热循环仪器，需要后续的电泳操作，昂贵的探针合成，以及熟练的操作人员。因此，以PCR为基础的技术对于一些落后的实验室无法进行，限制了这些技术的广泛运用。此外，已经建立的用于检测粪肠球菌和金黄色葡萄球菌的PCR方法和实时荧光定量PCR方法，其检测灵敏度差，检测过程耗时较长，不利于快速检测和应急检测。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由日本科学家Notomi等建立的一种新的核酸特异性扩增技术，具有特异性强、灵敏高、操作简单、产物易检测等优点。该技术已被广泛用于分子检测领域。LAMP针对靶序列的6个特异部位设计4条核心引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件(60～65℃)下催化新链合成，从而使靶序列高效扩增。4条核心引物之中2条为内引物，即FIP(Forward innerprimer，FIP)和BIP(Backward inner primer，BIP)。FIP包含Flc和F2(F2c区域的互补序列)，即5′-Flc-F2；BIP包含B1c(B1区域的互补序列)和B2，即5′-Blc-B2。其余两条核心引物为外引物F3和B3。另外的两条环引物(Loop primes,LF和LB)被增加到反应体系中加速LAMP反应。LAMP反应可以特异、高效、快速的扩增目的DNA，在1小时之内使产物的量达到109个拷贝。
LAMP扩增之后，其产物的检测可以通过琼脂糖电泳后染色观察。较为简便的方法是直接在产物中加入SYBR Green染色，呈现绿色为阳性反应，橙红色为阴性反应。也可以通过扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断，液体浑浊，离心后有白色沉淀的为阳性反应，无此现象的则为阴性反应。现在更为简单的方法是在反应混合物中加入可视染料，阳性反应管的颜色从浅灰色变为绿色，阴性反应管则保持原来的浅灰色。然而，这些方法都只能检测LAMP反应是否进行，不能识别针对某一靶序列的特异性扩增，导致LAMP技术只能检测单一目的序列，限制了LAMP技术的运用。
为了克服传统LAMP方法技术瓶颈，本发明人设计一种新的MERT-LAMP(MultipleEndonuclease Restriction Real-Time Loop-Mediated Isothermal Amplification)扩增技术。MERT-LAMP扩增技术以LAMP反应为基础，结合限制性内切酶酶切原理和荧光检测，从而实现一步法多重恒温检测。该方法操作简便、特异性强、灵敏性高、检测速度快，因此在微生物检测领域有广泛的应用前景。
本发明针对粪肠球菌的特异基因Ef0027基因和金黄色葡萄球菌的特异基因nuc分别设计两套MERT-LAMP扩增引物，旨在建立针对粪肠球菌和金黄色葡萄球菌病原体的快速、敏感和特异的核酸检测体系。
发明内容
基于上述目的，本发明首先提供了一组用于MERT-LAMP扩增的引物序列，其特征在于，所述序列包括：SEQ ID NO：1所示的引物Ef-F3，SEQ ID NO：2所示的引物Ef-B3，SEQ IDNO：4所示的引物Ef-EFIP，SEQ ID NO：5所示的引物Ef-BIP，SEQ ID NO：6所示的引物Ef-LF，SEQ ID NO：7所示的引物Ef-LB；和/或
SEQ ID NO：8所示的引物Sau-F3，SEQ ID NO：9所示的引物Sau-B3，SEQ ID NO：11所示的引物Sau-EFIP，SEQ ID NO：12所示的引物Sau-BIP，SEQ ID NO：13所示的引物Sau-LF，SEQ ID NO：14所示的引物Sau-LB，
其中，在引物Ef-EFIP和引物Sau-EFIP的5’端各标记有一个彼此不同的荧光基团，并在所述引物的其它位置标记有一荧光猝灭基团。
优选地，所述序列还包括SEQ ID NO：3所示的引物Ef-FIP，和/或SEQ ID NO：10所示的引物Sau-FIP，FIP的使用为了提供更多的EFIP结合位点，从而形成更多的酶切末端。
在一个优选的技术方案中，引物Ef-EFIP标记的荧光基团为HEX，所述Sau-EFIP标记的荧光基团为Cy5。
更为优选地，所述引物Ef-EFIP标记的荧光猝灭基团为BHQ-1，所述Sau-EFIP标记的荧光猝灭基团为BHQ-2。
最为优选地，所述引物Ef-EFIP的荧光猝灭基团标记位置位于5’端第13位碱基，所述引物Sau-EFIP的荧光猝灭基团标记位置位于5’端第11位碱基。
本发明还提供了上述的序列在粪肠球菌和/或金黄色葡萄球菌检测中的应用，所述检测采用MERT-LAMP扩增技术。
优选地，所述MERT-LAMP扩增的反应温度为61～63℃。
在一个优选的技术方案中，所述应用采用单一样本检测模式，所使用的引物为：
SEQ ID NO：1所示的引物Ef-F3，SEQ ID NO：2所示的引物Ef-B3，SEQ ID NO：4所示的引物Ef-EFIP，SEQ ID NO：5所示的引物Ef-BIP，SEQ ID NO：6所示的引物Ef-LF，SEQ IDNO：7所示的引物Ef-LB；或
SEQ ID NO：8所示的引物Sau-F3，SEQ ID NO：9所示的引物Sau-B3，SEQ ID NO：11所示的引物Sau-EFIP，SEQ ID NO：12所示的引物Sau-BIP，SEQ ID NO：13所示的引物Sau-LF，SEQ ID NO：14所示的引物Sau-LB。
优选地，所述序列还包括SEQ ID NO：3所示的引物Ef-FIP，或SEQ ID NO：10所示的引物Sau-FIP。
在另一个优选的技术方案中，所述应用采用多重样本检测模式，所使用的引物为：
SEQ ID NO：1所示的引物Ef-F3，SEQ ID NO：2所示的引物Ef-B3，SEQ ID NO：4所示的引物Ef-EFIP，SEQ ID NO：5所示的引物Ef-BIP，SEQ ID NO：6所示的引物Ef-LF，SEQ IDNO：7所示的引物Ef-LB；和
SEQ ID NO：8所示的引物Sau-F3，SEQ ID NO：9所示的引物Sau-B3，SEQ ID NO：11所示的引物Sau-EFIP，SEQ ID NO：12所示的引物Sau-BIP，SEQ ID NO：13所示的引物Sau-LF，SEQ ID NO：14所示的引物Sau-LB。
优选地，所述序列还包括SEQ ID NO：3所示的引物Ef-FIP，和SEQ ID NO：10所示的引物Sau-FIP。
本发明应用上述引物通过MERT-LAMP能单独分别检测粪肠球菌和 金黄色葡萄球菌，而且也能一步同时准确的检测和鉴别粪肠球菌和金黄色葡萄球菌，具有操作简便、特异性强、灵敏度高、检测速度快的优点。检测粪肠球菌的检测下限为250fg DNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为15分钟，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约35分钟。检测金黄色葡萄球菌的检测下限为250fg DNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为15分钟，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约35分钟。应用MERT-LAMP检测多个靶序列时，其检测时间和检测灵敏度与单序列检测没有质的变化，最短的检测时间为15分钟左右。本发明应用上述引物通过MERT-LAMP能同时准确地检测和鉴别粪肠球菌和金黄色葡萄球菌，对27株粪肠球菌和12株金黄色葡萄球菌的检测均为阳性，73株非粪肠球菌、非金黄色葡萄球菌不出现阳性结果，显示了良好的特异性。
附图说明
图1 MERT-LAMP引物设计示意图；
图2 MERT-LAMP引物的可行性验证结果图谱；
图3 MERT-LAMP引物的最佳温度测定图谱；
图4 MERT-LAMP单一检测敏感度测定图谱；
图5普通LAMP单一检测敏感度测定图谱；
图6多重MERT-LAMP多重检测敏感度测定图谱；
图7 MERT-LAMP方法的特异性评价图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
本发明的目的在于提供一种能够应用细菌检测，特别是恒温技术的检测序列，更进一步提供MERT-LAMP扩增技术检测粪肠球菌和金黄色葡萄球菌方法，以及应用于该方法的试剂盒。
根据粪肠球菌(E.faecalis)的特异基因Ef0027(GenBank accession1198935)和金黄色葡萄球(S.aureus)的特异性基因nuc(GenBank accession EF529597)设计两套分别针对粪肠球菌和金黄色葡萄球菌的MERT-LAMP扩增引物。Ef0027基因存在于所有的粪肠球菌中，其特异性好，可以将粪肠球菌与其他密切相近的菌种和菌属区分开。nuc基因存在于所有的金黄色葡萄球菌中，其特异性好，可以将金黄色葡萄球菌与其他密切相近的菌种和菌属区分开。利用多序列比对软件ClustalX 1.83和引物设计软件Primer Premier 5.0设计MERT-LAMP扩增引物，并将获得的特异性引物在NCBI数据库中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的两套MERT-LAMP扩增引物。引物设计的位置和方向见图1，图1A为针对粪肠球菌特异基因Ef0027设计MERT-LAMP引物。图1B为针对金黄色葡萄球菌特异基因nuc基因设计MERT-LAMP引物。序列见表1。
表1. MERT-LAMP引物设计及修饰
Ef,粪肠球菌(E.faecalis)；
Sau,金黄色葡萄球菌(S.aureus)；
mer,寡聚体单元；
nt,核苷酸.
其中，Ef-EFIP(SEQ ID NO.4)标记有荧光基团HEX(六氯-6-甲基荧光素)和淬灭基团BHQ-1(Blackhole quencher 1，荧光淬灭剂1)，具体标记位置为：
HEX-TGCAATG-TGGCTT(BHQ-1)CATCCATTTGTTGAAAACTTTTCAAGCTATTACGCAACAGT
Sau-EFIP(SEQ ID NO.11)标记有荧光基团Cy5(Cy5荧光素)和淬灭基团BHQ-2(Blackhole quencher 2，荧光淬灭剂2)，具体标记位置为：Cy5-TGCAATG-CGTT(BHQ2)TACCATTTTTCCATCAGCATAGTTTGACAAAGGTCAAAGAACT
本发明中所使用和涉及的试剂：
Loopamp Kit(Eiken Chemical Co.Ltd.,Tokyo,Japan)购于日本荣研公司。DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)购于德国Qiagen公司。qPCR反应体系混合物(SYBR○R Premix Ex TaqTMII,Takara Bio,Inc.,Otsu,Japan，dNTP和缓冲液)购于北京Takara生物科技有限公司。PCR反应体系混合物Mix(Taq DNA聚合酶，dNTP和缓冲液)购于北京康为世纪生物科技有限公司。DL50DNA Marker和DL50DNA Marker购于宝生物工程(大连)有限公司。其余试剂均为市售分型纯产品。
本发明实验中使用和涉及的主要仪器：Loopamp实时浊度仪LA-320C(EikenChemical Co.,Ltd,Japan)购于日本荣研公司。实时荧光检测仪为Rotor-Gene Q Real-Time System(Qiagen),德国Qiagen产品；电 泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品；PCR仪为Sensoquest Labcycler,德国Sensoquest产品；凝胶成像系统为Bio-Rad GelDox XR,美国Bio-Rad产品。
实验过程，粪肠球菌和金黄色葡萄球菌及其他种类菌(菌株见表2)的基因组DNA的提取如下步骤操作：
细菌基因组的提取使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)，按照说明书进行操作。利用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度，粪肠球菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA用GE缓冲液连续稀释(从2.5ng，250pg,25pg,2.5pg,250fg,25fg到2.5fg)。各种基因组DNA均少量分装，-20℃保存备用。
表2.细菌菌株信息
a U,未鉴定的血清型.
b ATCC,美国菌种保藏中心；ICDC,中国疾病预防控制中心传染病所.
实施例1. MERT-LAMP反应
1. MERT-LAMP标准反应体系：引物EFIP和FIP的浓度各为20pmol，引物BIP的浓度为40pmol或引物BIP、EBIP的浓度各为20pmol，引物F3和B3的浓度为5pmol，引物LF和BF的浓度为20pmol，10mM的Betain，6mM的MgSO4，1mM的dNTP，2.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，8U的链置换DNA聚合酶，15U的DNA限制性内切酶，1μL的模板，补加去离子水至25μl。整个反应在荧光检测仪(Rotor-Gene Q Real Time System,Qiagen)中进行，等温扩增63～65℃1h，80℃5min终止反应。
2.该技术的可行性验证
标准体系用于验证MERT-LAMP引物的可行性，在标准体系条件下，加入一套MERT-LAMP引物和对应的DNA模板，通过可视颜色变化法、电泳检测法和荧光检测方法证实MERT-LAMP技术可行。
可视颜色变化法：MERT-LAMP在合成DNA的同时还产生大量的焦磷酸根离子，该离子能够夺取与钙黄绿素结合的锰离子，使钙黄绿素恢复游离状态而发荧光。该发光混合物能够与反应中产生的镁离子结合，使荧光得到增强。可以通过荧光目视检测颜色变化判读结果，阳性反应管从浅灰色变为绿色，阴性反应保持浅灰色不变，见图2A和图2B。
图2A和图2B为可视荧光染料法分析MERT-LAMP产物。阳性结果呈现绿色，阴性结果保持颜色不变，呈现浅灰色。图2A为针对粪肠球菌的检测，图2B为针对金黄色葡萄球菌的检测。
电泳检测法：由于MERT-LAMP反应与LAMP反应相似，其产物也是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯式图谱，可以根据片段大小进行判定，见图2C和2D。
图2C和图2D为电泳检测分析MERT-LAMP产物。阳性结果呈现特异的阶梯条带，阴性结果不出现任何的电泳条带。图2C为针对粪肠球菌的检测，图2D为针对金黄色葡萄球菌的检测。
实时荧光检测法：标准体系条件下，在反应管中加入一套引物和对应的模板，酶切后产生的荧光通过荧光检测器接收，得到稳定的荧光曲线，结果参见图4。
3. MERT-LAMP技术的最佳反应温度测定
在标准体系条件下，加入粪肠球菌，金黄色葡萄球菌MERT-LAMP引物和粪肠球菌及金黄色葡萄球菌的DNA模板，其模板浓度为250pg/μl。反应在恒温条件下进行(60～67℃)，结果运用实时浊度仪进行检测，在不同的温度下得到两组不同的动态曲线图，见图3A和图3B。图3A和图3B中，应用实时浊度法测定两套引物的最佳扩增温度。图3A： 针对粪肠球菌特异基因Ef0027设计MERT-LAMP引物的温度检测，A1-A8代表该套引物在60～67℃条件下的实时浊度扩增。图3B：针对金黄色葡萄球菌特异基因nuc设计MERT-LAMP引物的温度检测，B1-B8代表该套引物在60～67℃条件下的实时浊度扩增。61～63℃被推荐作为MERT-LAMP技术的最佳反应温度。
4. MERT-LAMP检测单一样本的灵敏度
在标准体系条件下，倍比稀释基因组模板DAN(2.5ng,250pg,25pg,2.5pg,250fg,25fg到2.5fg/微升)，1微升各浓度模板加入反应体系中，通过实时荧光检测，得到稳定的荧光检测图形，见图4。其中，图4A：MERT-LAMP技术单独对粪肠球菌的敏感度检测，结果通过实时荧光分析。图4B：MERT-LAMP技术单独对金黄色葡萄球菌的敏感度检测，结果通过实时荧光分析。
MERT-LAMP检测单一靶序列，对粪肠球菌的检测下限为250fg DNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为15分钟，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约35分钟。当反应体系中基因组模板量降低至250fg以下时，MERT-LAMP反应不出现阳性扩增,见图4A。
MERT-LAMP检测单一靶序列，对金黄色葡萄球菌的检测下限为250fg DNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为15分钟，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约35分钟。当反应体系中基因组模板量降低至250fg以下时，MERT-LAMP反应不出现阳性扩增，见图4B。
5. MERT-LAMP检测特异性评价：
以常见的致病菌及条件致病菌DNA(粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、志贺菌、沙门菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、单增李斯特菌、伊氏李斯特菌、蜡样芽胞杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌等)为模板评价MERT-LAMP反应体系的特异性，菌株信息见表2。MERT-LAMP扩增技术能同时准确的检测和鉴别粪肠球菌和金黄色葡萄菌，非粪肠球菌，非金黄色葡萄球菌不出现阳性结果，说明MERT-LAMP方法的特异性良好，见图7。图7A，检测信号1-4来自于粪肠球菌基因组模板扩增(Hex通道)。图7B，信号5-9来自于金黄色葡萄球菌基因组模板扩增(Cy5通道)。反应10-35为非金黄色葡萄球菌、 非粪肠球菌，反应36为阴性控制。结果表明，MERT-LAMP能够正确的检测靶序列，并通过荧光信号将不同靶序列鉴别开。
实施例2. MERT-LAMP多重反应
1. MERT-LAMP的反应体系如下：
引物Ef-EFIP和FIP的浓度各为12.5pmol，引物Ef-BIP的浓度为25pmol,引物Ef-LF和Ef-LB的浓度为12.5pmol，引物Ef-F3和Ef-B3的浓度为10pmol；引物Sau-EFIP、Sau-FIP的浓度各为20pmol，引物Sau-BIP的浓度为40pmol，引物Sau-LF和Sau-LB的浓度为20pmol，引物Sau-F3和Sau-B3的浓度为10pmol；10mM的Betain，6mM的MgSO4，1mM的dNTP，12.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，8U的链置换DNA聚合酶，15U的DNA限制性内切酶，1μL的模板，补加去离子水至25μl。整个反应在荧光检测仪(Rotor-Gene Q Real Time System,Qiagen)中进行，等温扩增63～65℃1h，80℃5min终止反应。
2. MERT-LAMP的多重检测能力验证
为了得到稳定的多重荧光检测图形，对标准体系进行优化适应多重检测，建立多重检测体系。在多重反应混合物中同时加入两套引物及对应的模板(倍比稀释模板DAN2.5ng,250pg,25pg,2.5pg,250fg,25fg和2.5fg/微升，1微升各浓度模板加入多重MERT-LAMP反应体系中)。通过荧光检测器检测，得到稳定的多重荧光检测图，见图6。其中，图6A检测信号来自于粪肠球菌基因组模板扩增(Hex通道)。图6B信号来自于金黄色葡萄球菌基因组模板扩增(Cy5通道)。MERT-LAMP反应体系能够同时进行粪肠球菌和金黄色葡萄球菌的检测，证明了MERT-LAMP技术的多重检测能力，应用MERT-LAMP检测多个靶序列时，其检测时间和检测灵敏度与单序列检测没有质的变化，最短的检测时间为15分钟左右。
3. MERT-LAMP灵敏度验证
多重MERT-LAMP同时检测多个靶序列时，粪肠球菌的检测下限为250fg DNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为15分钟，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约35分钟。当反应体系中基因组模板量降低至250fg以下时，MERT-LAMP反应不出现阳性扩增,见图6A。金 黄色葡萄球菌的检测下限为250fg DNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为15分钟，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约35分钟。当反应体系中基因组模板量降低至250fg以下时，MERT-LAMP反应不出现阳性扩增,见图6B。
对照实施例1. LAMP标准反应体系，
LAMP的反应体系如下：引物FIP的浓度各为40pmol，引物BIP的浓度为40pmol，引物F3和B3的浓度为5pmol，引物LF和BF的浓度为20pmol，10mM的Betain，6mM的MgSO4，1mM的dNTP，2.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，8U的链置换DNA聚合酶，15U的DNA限制性内切酶，1μL的模板，补加去离子水至25μl。整个反应在荧光检测仪(Rotor-Gene Q Real TimeSystem,Qiagen)中进行，等温扩增61～63℃1h，80℃5min终止反应。
在标准LAMP体系条件下，倍比稀释模板DAN(2.5ng,250pg,25pg,2.5pg,250fg,25fg和2.5fg/微升)，1微升各浓度模板加入反应体系中，通过实时浊度检测，得到稳定的实时浊度检测图形，见图5。其中，图5A为LAMP技术单独对粪肠球菌的敏感度检测，结果通过实时浊度分析。图5B为LAMP技术单独对金黄色葡萄球菌的敏感度检测，结果通过实时浊度分析。
LAMP检测单一靶序列，粪肠球菌的检测下限为250fg DNA/反应管，消耗的最短检测时间大约为15分钟，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约30分钟。当反应体系中基因组模板量降低至250fg以下时，LAMP反应不出现阳性扩增,见图5A。
LAMP检测单一靶序列，金黄色葡萄球菌的检测下限为250fg DNA/反应管，消耗的最短检测时间大约为15分钟，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约30分钟。当反应体系中基因组模板量降低至250fg以下时，LAMP反应不出现阳性扩增，见图5B。
对照实施例2. Real-time RCR方法反应体系
其中，上游引物序列为SEQ ID No.1/SEQ ID No.8(Ef-F3/SauF3)，下游引物序列为SEQ ID NO:2/SEQ ID No.9(Ef-B3/SauB3)。
在实时荧光定量PCR仪上扩增并测定结果：
在荧光检测仪(Rotor-Gene Q Real Time System,Qiagen)中进行Real-time反应，扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同一阈值分析数据，确定该反应的Ct(cyclethreshold)值。
在标准的qPCR反应条件下，倍比稀释模板DAN(2.5ng,250pg,25pg,2.5pg,250fg,25fg和2.5fg/微升)，1微升各浓度模板加入qPCR反应体系中，通过实时荧光检测，得到稳定的实时荧光检测图形，见表3。qPCR检测单一靶序列，粪肠球菌的检测下限为2.5pg DNA/反应管，当反应体系中基因组模板量降低至2.5pg以下时，qPCR反应不出现阳性扩增,见表3。qPCR检测单一靶序列，金黄色葡萄球菌的检测下限为2.5pg DNA/反应管，当反应体系中基因组模板量降低至2.5pg以下时，qPCR反应不出现阳性扩增,见表3。
普通RCR反应体系：
PCR反应条件：
反应结束后，去10μl PCR产物在2.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，并在凝胶成像系统上观察分析结果。
在标准的PCR反应条件下，倍比稀释模板DAN(2.5ng,250pg,25pg,2.5pg,250fg,25fg和2.5fg/微升)，1微升各浓度模板加入PCR反应体系中，PCR检测单一靶序列，粪肠球菌的检测下限为25pg DNA/反应管，当反应体系中基因组模板量降低至25pg以下时，PCR反应不出现阳性扩增,见表3。PCR检测单一靶序列，金黄色葡萄球菌的检测下限为25pg DNA/反应管，当反应体系中基因组模板量降低至25pg以下时，PCR反应不出现阳性扩增,见表3。
表3.几种方法的敏感度比较
a MERT-LAMP,multiple endonuclease restriction real-time loop-mediatedisothermal amplification(实时多重环介导恒温扩增)；LAMP,loop-mediatedisothermal amplification(环介导恒温扩增)；qPCR,quantitative real-time PCR(定量PCR方法).
b检出限：LoD(limit of detection)。

Claims (11)

1.一组用于MERT-LAMP扩增的引物序列，其特征在于，所述序列包括：SEQ ID NO：1所示的引物Ef-F3，SEQ ID NO：2所示的引物Ef-B3，SEQ ID NO：4所示的引物Ef-EFIP，SEQ IDNO：5所示的引物Ef-BIP，SEQ ID NO：6所示的引物Ef-LF，SEQ ID NO：7所示的引物Ef-LB；和/或
SEQ ID NO：8所示的引物Sau-F3，SEQ ID NO：9所示的引物Sau-B3，SEQ ID NO：11所示的引物Sau-EFIP，SEQ ID NO：12所示的引物Sau-BIP，SEQ ID NO：13所示的引物Sau-LF，SEQID NO：14所示的引物Sau-LB，
其中，在引物Ef-EFIP和引物Sau-EFIP的5’端各标记有一个彼此不同的荧光基团，并在所述引物的其它位置标记有一荧光猝灭基团。
2.根据权利要求1所述的序列，其特征在于，所述序列还包括SEQ ID NO：3所示的引物Ef-FIP，和/或SEQ ID NO：10所示的引物Sau-FIP。
3.根据权利要求1所述的序列，其特征在于，引物Ef-EFIP标记的荧光基团为HEX，所述Sau-EFIP标记的荧光基团为Cy5。
4.根据权利要求3所述的序列，其特征在于，所述引物Ef-EFIP标记的荧光猝灭基团为BHQ-1，所述Sau-EFIP标记的荧光猝灭基团为BHQ-2。
5.根据权利要求4所述的序列，其特征在于，所述引物Ef-EFIP的荧光猝灭基团标记位置位于5’端第13位碱基，所述引物Sau-EFIP的荧光猝灭基团标记位置位于5’端第11位碱基。
6.根据权利要求1-5中任一所述的序列在粪肠球菌和/或金黄色葡萄球菌检测中的应用，所述检测采用MERT-LAMP扩增技术。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述MERT-LAMP扩增的反应温度为61～63℃。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用采用单一样本检测模式，所使用的引物为：
SEQ ID NO：1所示的引物Ef-F3，SEQ ID NO：2所示的引物Ef-B3，SEQ ID NO：4所示的引物Ef-EFIP，SEQ ID NO：5所示的引物Ef-BIP，SEQ ID NO：6所示的引物Ef-LF，SEQ ID NO：7所示的引物Ef-LB；或
SEQ ID NO：8所示的引物Sau-F3，SEQ ID NO：9所示的引物Sau-B3，SEQ ID NO：11所示的引物Sau-EFIP，SEQ ID NO：12所示的引物Sau-BIP，SEQ ID NO：13所示的引物Sau-LF，SEQID NO：14所示的引物Sau-LB。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述序列还包括SEQ ID NO：3所示的引物Ef-FIP，或SEQ ID NO：10所示的引物Sau-FIP。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用采用多重样本检测模式，所使用的引物为：
SEQ ID NO：1所示的引物Ef-F3，SEQ ID NO：2所示的引物Ef-B3，SEQ ID NO：4所示的引物Ef-EFIP，SEQ ID NO：5所示的引物Ef-BIP，SEQ ID NO：6所示的引物Ef-LF，SEQ ID NO：7所示的引物Ef-LB；和
SEQ ID NO：8所示的引物Sau-F3，SEQ ID NO：9所示的引物Sau-B3，SEQ ID NO：11所示的引物Sau-EFIP，SEQ ID NO：12所示的引物Sau-BIP，SEQ ID NO：13所示的引物Sau-LF，SEQID NO：14所示的引物Sau-LB。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述序列还包括SEQ ID NO：3所示的引物Ef-FIP，和SEQ ID NO：10所示的引物Sau-FIP。
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