CN116287169A - 一种适用于lamp检测基因或基因突变的新型检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明“一种适用于LAMP检测基因或基因突变的新型检测方法”属于分子生物学技术领域，公开了一种适用于LAMP检测基因或基因突变的新型检测方法，其原理是利用改良后的新型Beacon探针，通过修改传统Beacon探针配对区的设计方式、退火核苷酸的LNA替换、3’端的MGB修饰，以及结合于LAMP反应哑铃形结构的“柄”的位置，实现了对LAMP扩增的实时检测，该方法不但可用于特定基因的检测，还可以用于基因突变或SNP的检测。不仅保留了LAMP法耗时短的优点，还解决了LAMP非特异扩增的问题。同时，本方法可采用经典的LAMP反应体系，无需对反应体系进行大量调整，降低了试剂盒的研发难度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适用于 LAMP 检测基因或基因突变的新型检测方法。
背景技术
环介导等温扩增（Loop Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一种在等温条件下，对目的基因进行快速扩增的方法，与传统PCR法相比，该方法具有快速（最快可10分钟完成检测）、高灵敏度和对设备要求较低的优点，是传统PCR扩增最有力的替代方法。
目前以LAMP法为基础开发的检测产品集中在微生物的检测应用中，主要的原因是因为此方法特异性较差，很容易出现假阳性结果，即使在各个引物的5’或3’端引入突变也无法避免假阳性的产生，因此，市面上几乎没有以LAMP检测基因突变或者特异基因的成熟产品。
现有的LAMP检测技术有肉眼判读法、荧光染料法、浊度法和熔解曲线法。肉眼判读法主要通过在LAMP反应体系内加入染料或指示剂（如HNB），LAMP反应后由于体系里离子强度发生变化，最终引起指示剂颜色变化，从而判定是否存在检测模板，这种方法虽然判读简单，但是无法排除非特异反应，同时还指示剂的变色还容易受到周围环境温度的影响，导致一些弱阳性的样本颜色变化十分不明显，造成判读错误。荧光染料法和浊度法是通过检测设备来判定体系中是否发生扩增，前者常使用SYBR、Evagreen等嵌合型染料，其原理类似于染料法荧光PCR，染料与DNA的小沟发生非特异性结合，以此来判定体系中是否发生LAMP反应；后者是通过检测LAMP副产物焦磷酸镁沉淀来判定体系中是否有LAMP反应发生。两者均在一定程度上提高了LAMP的灵敏度，但均无法排除非特异扩增，例如高浓度的引物很容易产生引物二聚体，这些检测手段均无法排除引物二聚体的干扰。熔解曲线法检测是在LAMP反应体系中加入一条特异性的荧光探针，在LAMP反应结束后进行熔解曲线分析，通过探针的不同Tm来判定待测模板的基因型或特异基因，这种方法解决了LAMP反应的非特异性，同时还可以保证一定的灵敏度，但是该方法对反应体系的优化要求非常高，常规的LAMP反应体系无法满足需求，必须大量摸索合适的反应条件，这就为试剂的研究和开发带来了极大的挑战，同时，本方法因反应体系与“正常”LAMP不同，其反应时间往往较长，通常需要1h的扩增时间，再加上熔解曲线分析的时间，其总体检测时间可达1.5h，这就失去了LAMP检测法耗时短的最大优势，因此，虽然本方法可以解决LAMP的非特异扩增问题，但是依旧很难在市面上找到相应的产品。
本发明阐述了一种适用于 LAMP 检测基因或基因突变的新型检测方法，其原理是利用改良后的Beacon探针，对LAMP扩增进行实时检测，不仅保留了LAMP法耗时短的优点，还解决了LAMP非特异扩增的问题。同时，本方法可采用经典的LAMP反应体系，无需对反应体系进行大量调整，降低了试剂盒的研发难度。
发明内容
Beacon探针是一种原用于PCR扩增中的非水解探针，如图1所示。其5’端带有荧光标记，3’端带有淬灭基团，同时，Beacon探针的5’端和3’端有3-7nt的互补核苷酸序列，在较低的温度下，探针的两端以双链的形式存在，这使得5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团相互靠近，表现为不发光，当探针与扩增产物特异结合后，5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团分开，此时荧光基团的发射光就会被设备检测到，从而达到实时显示扩增的目的。
在LAMP反应中，我们发现，传统的Beacon探针并不能正常工作，因此，我们对Beacon进行了改造，为区别于传统的Beacon，我们将其成为L-beacon。具体技术路线如下：
为防止Taq酶将Beacon探针水解，传统Beacon探针的两个互相配对的“柄”不与靶标序列匹配，尤其是探针的5’端。而LAMP反应所采用的Bst酶不具备Taq酶的5’→3’核酸外切酶活性，因此，L-beacon的5’端与靶标序列是互补的。这种修改可以缩短探针的长度，从而提高它的特异性。
经过上述修改后的L-beacon探针虽然特异性增加，但是其Tm值较难达到理想状态，导致其扩则过信号变化较弱，无法在实际检测中应用。为此，我们在L-beacon中以锁核酸（LNA）代替普通核苷酸以提高它的Tm。
对于单纯的检测靶序列而言，在L-beacon的环形位置添加3～5个LNA即可；对于检测基因突变或SNP的应用而言，除了要将突变点或SNP位点替换成LNA外，还需要额外在其相邻的两个位点替换成LNA。
L-beacon的设计位置应位于LAMP哑铃形结构的“柄”的位置。如图2所示。
L-beacon的5’荧光基团可以选择FAM、VIC、ROX、CY5、CY3以及CY5.5等常用的荧光标记物，3’端可以是TAMRA和BHQ1等常见的淬灭基团，对于高AT含量的靶标序列，也可将L-beacon的3’做MGB修饰，进一步提高其Tm和特异性。
经过上述的改造，我们发明了一种新型的适用于LAMP的L-beacon探针，该探针可以使得LAMP实现了实时荧光探针检测，不仅增加了灵敏度，还大大提高了特异性，可以在短至数分钟内完成基因或基因突变的检测。
附图说明
图1为Beacon探针的工作示意图。
图2为L-Beacon探针的工作示意图。
图3为A1样本检测结果。
图4为A2样本检测结果。
图5为A3样本检测结果。
图6为A4样本检测结果。
图7为A5样本检测结果。
图8为A1样本Sanger测序结果。
图9为A2样本Sanger测序结果。
图10为A3样本Sanger测序结。
图11为A4样本Sanger测序结果。
图12为A5样本Sanger测序结果。
图13为样本1的检测结果。
图14为样本2的检测结果。
图15为样本3的检测结果。
图16为样本4的检测结果。
具体实施方式
以下具体实施方式进一步阐明本发明“一种适用于 LAMP 检测基因或基因突变的新型检测方法”的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、条件、步骤及应用所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
所述示例中，采用的物料和设备如表1所示。
表1 物料和设备一览表
【注】“+”后面的碱基表示LNA修饰。
实施例1：人类ALDH2*2基因检测。
人类ALDH2*2或rs671是中国人乃至亚洲人中较为常见的SNP，该位点的野生型为G，它的另一个等位基因为A。在亚洲人中，约有30%～40%的人群携带这种SNP。携带A等位基因的人群对酒精的耐受度大大下降，同时应用硝酸甘油的效果也比携带G等位基因的人群差。本示例中，应用LAMP与L-beacon探针结合的方法对其进行检测，同时以Sanger测序为对比，验证其检测准确性。实验样本为5例EDTA抗凝管保存的人外周全血。
检测方法包括如下步骤。
步骤一。
准备工作。
1、引物和探针的溶解。
按照引物和探针管上的标注加入相应体积的TE缓冲液，制成浓度为100μM的引物或探针储存液。
2、外周全血。
将样本分别标记为1～5，然后各取5μl的外周全血分别与245μl的样本释放剂充分混匀，制成待测样本A1～A5。
步骤二。
反应体系配制。
LAMP反应体系如表2所示。
PCR反应体系如表3所示。
表2 单个LAMP反应的反应体系
表3 单个PCR反应的反应体系
步骤三。
反应条件。
LAMP反应条件如表4所示。
PCR反应条件如表5所示。
表4 LAMP的反应条件
| 温度 | 时间 | 备注 |
| 65℃ | 45min | 每隔1min收集一次FAM和VIC通道的荧光信号 |
表5 PCR的反应条件
图8
步骤四。
按上述反应条件操作。
实验结果。
本发明方法检测结果如图3～7所示，Sanger检测结果如图8～12所示，结果统计如表6所示。
表6 两种检测方法结果统计和对比一览表
实验结论。
两种方法的一致性达到100%，说明本发明的方法可以准确的检测出基因的SNP。
实施例2：粪肠球菌的LAMP检测。
本示例将从检测的准确性和抗干扰性对本发明进行验证试验。
检测方法包括如下步骤。
步骤一。
准备工作。
1、引物和探针的溶解。
按照引物和探针管上的标注加入相应体积的TE缓冲液，制成浓度为100μM的引物或探针储存液。
2、细菌处理。
(1)将实验室中从人粪便中分离培养的粪肠球菌、屎肠球菌和大肠杆菌培养基中挑取单菌落，然后分别用样本释放剂处理，制备成500μl的待测样本，分别记为样本1、样本2和样本3。
(2)将样本1、样本2和样本3各取100μl混匀，制成干扰样本，记为样本4。
步骤二。
反应体系配制。
LAMP反应体系如表6所示。
PCR反应体系如表7所示。
表7 单个LAMP反应的反应体系
表8 单个PCR反应的反应体系
步骤三。
反应条件。
LAMP反应条件如表8所示。
PCR反应条件如表9所示。
表9 LAMP的反应条件
| 温度 | 时间 | 备注 |
| 60℃ | 45min | 每隔1min收集一次FAM通道的荧光信号 |
表5 PCR的反应条件
步骤四。
按上述反应条件操作。
实验结果。
如图13～图16所示。
实验结论。
本发明的检测方法可以在有干扰菌的情况下特异得检测出靶点基因，且检测时间均小于30分钟。
综上所述，本发明的目的在于提供一种适用于 LAMP 检测基因或基因突变的新型检测方法。该方法利用改良后的Beacon探针，对LAMP扩增进行实时检测，不仅保留了LAMP法耗时短的优点，还解决了LAMP非特异扩增的问题。同时，本方法可采用经典的LAMP反应体系，无需对反应体系进行大量调整，降低了用该方法开发试剂盒的研发难度，极具市场推广价值。
对于本领域的技术人员来说，可以根据本发明的技术方案和构思，上述处理时间、样本、温度可根据具体需要进行调整，而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍应属于本发明创造的保护范围内。
Claims (6)
1.一种适用于LAMP检测基因或基因突变的新型beacon探针，其特征在于，该新型beacon探针包含了对配对区的设计方式、退火核苷酸的LNA替换、3’端的MGB修饰，以及结合于LAMP反应哑铃形结构的“柄”的位置的修改。
2.根据权利要求书1所述的新型beacon探针，其特征在于对5’端配对区的修改，应使5’端与靶标序列互补。
3.根据权利要求书1所述的新型beacon探针，其特征在于对3’端淬灭基团的修改，3’端可以是TAMRA和BHQ1等常见的淬灭基团，对于高AT含量的靶标序列，将3’端做MGB修饰。
4.根据权利要求书1所述的新型beacon探针，其特征在于探针应结合在LAMP反应所产生的哑铃形结构的“柄”的位置。
5.根据权利要求书2所述的新型beacon探针，5’端荧光基团的修改，其特征在于5’端荧光基团可以选择FAM、VIC、ROX、CY5、CY3以及CY5.5等常用的荧光标记物。
6.根据权利要求书3所述的新型beacon探针，在探针的环形位置添加3～5个锁核酸；对于检测基因突变或SNP的应用而言，除了要将突变点或SNP位点替换成相应的锁核酸外，还需要额外将其相邻的两个位点替换成锁核酸。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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