CN114875116B

CN114875116B - 一种自淬灭荧光的引物及其设计方法及应用

Info

Publication number: CN114875116B
Application number: CN202210452429.9A
Authority: CN
Inventors: 周玲玲; 麻昕雨; 温清娜
Original assignee: Guangzhou Boyirei Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Boyirei Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-04-27
Filing date: 2022-04-27
Publication date: 2023-08-29
Anticipated expiration: 2042-04-27
Also published as: CN114875116A

Abstract

本发明公开了一种自淬灭荧光的引物及其设计方法及应用。所述引物的序列含有“TG”碱基、“GT”碱基、“CG”碱基或“GC”碱基，“TG”碱基、“GT”碱基、“CG”碱基或“GC”碱基的T碱基或C碱基标记有荧光染料；所述引物的序列不含有“TG”碱基、“GT”碱基、“CG”碱基或“GC”碱基的引物序列，引物的5’端额外设置有含“TG”碱基或“GT”碱基的接头序列，所述接头序列中“TG”碱基或“GT”碱基的T碱基标记有荧光染料，或者引物的5’端额外设置有含“CG”碱基或“GC”碱基的接头序列，所述接头序列中“CG”碱基或“GC”碱基的C碱基标记有荧光染料；所述引物可自淬灭；可满足多重检测的需求。

Description

一种自淬灭荧光的引物及其设计方法及应用

技术领域

本发明涉及荧光PCR技术领域，更具体地，涉及一种自淬灭荧光的引物及其设计方法及应用。

背景技术

实时荧光PCR检测技术同时具备灵敏度高、特异性强、简便快速、成本低等多种优点，是病原微生物检测最常用的方法。目前多重荧光PCR方法基于上是荧光探针技术或荧光染料法进行检测。基于荧光探针法的多重PCR技术，是指在多重PCR扩增时，在加入多对引物的同时加入不同荧光标记的特异性的探针，探针的两端分别标记不同的荧光基团和淬灭基团，在PCR扩增过程中依赖DNA聚合酶的5’→3’外切酶活性将探针酶切水解，使荧光基团和淬灭基团分开，从而产生不同的荧光信号，最后根据荧光信号的差别来区分所检测物质；缺点是，相同荧光通道不能区分不同的检测物质、检测突变的能力不足、不能进行溶解曲线分析。基于荧光染料的多重PCR检测方法，是指在多重PCR扩增时加入荧光染料，然后进行熔解曲线分析，根据不同检测物质TM值的不同来区分相应的检测物质，缺点是，只能进行单通道检测，容易产生非特异性。

查阅国内外相关的基于自淬灭荧光引物检测技术的专利及文献，目前有基于自淬灭荧光引物或探针的专利和文献，现有技术淋球奈瑟菌荧光定量PCR检测试剂盒介绍了一种自淬灭引物，该自淬灭引物是一种颈环结构的引物，引物3’端的5个碱基会5’端的碱基自身配对，其中3’端的第二个碱基(T碱基)标记有FAM荧光素；但是该自淬灭引物中颈环结构中的G碱基与C碱基对结合，会大大降低G碱基的淬灭性能，使自淬灭引物的本身背景信号增强，增加了检测时的难度；且该自淬灭引物进行PCR检测时，不能用于溶解曲线分析，因为其引物自身存在双链结构，会释放荧光信号，从而造成非特异性的溶解曲线峰图；同时该自淬灭引物有明显的二级结构，会影响PCR的扩增效率。现有技术(Zhang Y,Wei Y,Yang S,etal.Rapid and accurate identification of SARS-CoV-2 variants containing E484mutation.2021.)公开了利用鸟嘌呤自淬灭的原理，但其是利用该原理制备自淬灭的TaqMan荧光探针，是一种自淬灭探针荧光PCR技术，该方法需额外设计TaqMan探针，增加设计的难度；同时该方法不能进行溶解曲线分析，Taq酶会把探针水解掉，不会形成有荧光信号的双链产物。

因此，十分有必有研究一种能利用相同荧光通道区分不同检测物质、能进行溶解曲线分析、单通道检测也具有特异性、检测难度低、扩增效率更高的PCR检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有荧光PCR技术的不足，提供一种自淬灭荧光的引物及其设计方法及应用。

本发明的第一个目的是提供一种自淬灭荧光的引物。

本发明的第二个目的是提供一种自淬灭荧光的引物的设计方法。

本发明的第三个目的是提供所述引物在作为荧光PCR检测引物中的应用。

本发明的第四个目的是提供非诊断目的PCR方法。

鸟嘌呤可通过电子转移的方式淬灭和其相邻荧光基团的荧光，因此在设计引物时，只需在鸟嘌呤的相应碱基上标记相应的荧光基团，既可以被鸟嘌呤淬灭，引物在未与模板结合时就不会产品荧光信号。但当引物与模板结合时，鸟嘌呤与胞嘧啶配对结合后，其淬灭荧光能力会显著下降，此时标记在引物上的荧光基团不能够被淬灭，从而产生荧光信号。本发明基于自淬灭荧光的引物的非诊断目的PCR方法可以实现不依赖于荧光探针或荧光染料即可实现荧光PCR检测的目的，可以实现相同荧光通道对不同产物的检测，可以在单个反应管中实现多重PCR扩增，还可以将扩增曲线与融合曲线结合分析，实现了真正意义上的一管多重检测，可用于核酸水平分子生物学检测。

本发明的“自淬灭荧光的引物”是指一条寡核苷酸，在鸟嘌呤(G碱基)的相邻位置上标记荧光染料，G碱基能够吸收或淬灭荧光染料的信号，从而淬灭荧光染料发出的信号，但当自淬灭荧光的引物与其互补序列相结合时，G碱基淬灭能力大大下降，不能吸收或淬灭荧光染料发出的信号，在这种情况下会产生相应的荧光信号。

本发明所述自淬灭荧光的引物，引物中不需标记淬灭基团，且荧光染料可以在一个碱基上标记，也可以在两个或以上碱基上标记，同一引物上标记多个荧光染料，会提升相应反应的荧光信号，理论上会提升检测的灵敏度。

本发明人通过广泛而深入的研究，发现了基于自淬灭荧光的引物的非诊断目的PCR方法，该方法具有较高的应用价值。

本发明的方法同以往的荧光PCR方法相比：

(1)在技术原理上完全不同，本发明不需要添加荧光探针或荧光染料既可以实现荧光PCR检测，可以减少探针或荧光染料对反应的抑制率，提升反应的灵敏度；

(2)本发明设计简单只需要设计普通的引物，然后在鸟嘌呤的相邻碱基上标记荧光基团(荧光染料)即可；无需增加引物的二级结构；背景信号低，淬灭效果良好；无需设计TaqMan探针，只需在引物上标记荧光信号即可进行荧光PCR检测；

(3)本发明的检测方法可以同时对不同荧光通道进行扩增曲线和熔解曲线分析；

(4)本发明在一个反应中可以同时检测多种物质，实现真正意义上多重荧光PCR检测；

(5)本发明的引物为单荧光标记，同Taqman探针相比具有合成成本低廉等优点，同荧光染料法相比具有更高的特异性；

(6)本发明每一个荧光通道均可以检测多种物质，相同通道可以通过熔解曲线来区分不同的检测物质。

本发明的上述目的通过以下技术手段实现：

本发明提供了一种自淬灭荧光的引物，所述引物的序列为16～30个碱基；所述引物的序列含有“TG”碱基、“GT”碱基、“CG”碱基或“GC”碱基，“TG”碱基、“GT”碱基、“CG”碱基或“GC”碱基的T碱基或C碱基标记有荧光染料；

所述引物的序列不含有“TG”碱基、“GT”碱基、“CG”碱基或“GC”碱基的引物序列，引物的5’端额外设置有含“TG”碱基或“GT”碱基的接头序列，所述接头序列中“TG”碱基或“GT”碱基的T碱基标记有荧光染料，或者引物的5’端额外设置有含“CG”碱基或“GC”碱基的接头序列，所述接头序列中“CG”碱基或“GC”碱基的C碱基标记有荧光染料。

优选地，所述引物的3’端无荧光染料标记。

优选地，所述引物长度为18～23个碱基。

优选地，所述引物的3’端无封闭修饰，可以进行延伸反应。

优选地，所述引物的序列含有“TG”碱基，“TG”碱基的T碱基标记有荧光染料；所述引物的序列不含有“TG”碱基的引物序列，引物的5’端额外设置有含“TG”碱基的接头序列，所述接头序列中“TG”碱基的T碱基标记有荧光染料。

优选地，所述接头序列的长度为2～10个碱基。

进一步优选地，所述荧光染料为FAM、VIC、HEX、Tamara、磺酰罗丹明101(TexasRed)、ROX或CY5中的任一种。

优选地，所述荧光染料为FAM。

优选地，所述引物为上游引物(正义引物)或/和下游引物(反义引物)。

一种自淬灭荧光的引物的设计方法，在含有“TG”碱基、“GT”碱基、“CG”碱基或“GC碱基”的引物序列中，选择“TG”碱基、“GT”碱基、“CG”碱基或“GC碱基”的T碱基或C碱基标记荧光染料；在不含有“TG”碱基、“GT”碱基、“CG”碱基或“GC碱基”的引物序列中，在引物的5’端额外设置含“TG”碱基或“GT”碱基的接头序列，所述接头序列中“TG”碱基或“GT”碱基的T碱基标记荧光染料，或者在引物的5’端额外设置含“CG”碱基或“GC”碱基的接头序列，所述接头序列中“CG”碱基或“GC”碱基的C碱基标记荧光染料。

优选地，所述引物的3’端不标记荧光染料。

优选地，所述引物的3’端不进行封闭修饰，可以进行延伸反应。

优选地，在含有“TG”碱基的引物序列中，选择“TG”碱基的T碱基标记荧光染料；在不含有“TG”碱基的引物序列中，在引物的5’端额外设置含“TG”碱基的接头序列，所述接头序列中“TG”碱基的T碱基标记荧光染料。

优选地，所述接头序列的长度为2～10个碱基。

进一步优选地，所述荧光染料为FAM、VIC、HEX、Tamara、磺酰罗丹明101(TexasRed)ROX或CY5中的任何一种。

优选地，所述荧光染料为FAM。

所述引物在作为荧光PCR检测引物中的应用也在本发明的保护范围之内。

一种非诊断目的PCR方法，进行荧光PCR反应，其中至少一条引物为所述引物。

所述非诊断目的PCR方法，以自淬灭荧光的引物作为反应引物进行荧光PCR反应，反应体系中无需加入荧光探针或荧光染料，即可完成荧光PCR反应，同时产物为含有荧光标记的DNA或RNA。

所述非诊断目的PCR方法可以同时检测多种物质，可用于DNA或RNA的检测。

优选地，所述检测物质为ACTB基因、NOP56基因、BCR基因、ABL基因、EB病毒(EBV)或巨细胞病毒(CMV)中的一种或多种。

非诊断目的PCR方法，包括以下步骤：

S1.对所检测的物质进行核酸提取；可采用商业的核酸提取试剂盒；

S2.以提取后核酸为模板，使用所述的自淬灭荧光的引物结合相应的下游或上游引物进行荧光PCR反应。

优选地，步骤S2所述核酸为DNA，荧光PCR的反应体系为：10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)，2.5μL；dNTPs(10mM each，含dUTP)，1μL；自淬灭荧光的引物(10pmol/μL)，0.3μL～1μL；下游/上游引物(10pmol/μL)，0.3μL～1μL；DNA聚合酶(5U/μL)，0.5μL；核酸模板，5μL；无核酸酶水补足至25μL。

进一步优选地，步骤S2所述核酸为DNA，荧光PCR的反应体系为：10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)，2.5μL；dNTPs(10mM each，含dUTP)，1μL；自淬灭荧光的引物(10pmol/μL)，0.3μL～1μL；下游/上游引物(10pmol/μL)，0.3μL～1μL；DNA聚合酶(5U/μL)，0.5μL；UDG酶(1U/μl)，1μL；核酸模板，5μL；无核酸酶水补足至25μL。

优选地，步骤S2所述核酸为RNA，荧光PCR的体系为：5×RT-PCR Buffer(Mg²⁺plus)，5μL；dNTPs(10mM each，含dUTP)，1μL；自淬灭荧光的引物(10pmol/μL)，0.3μL～1μL；下游/上游引物(10pmol/μL)，0.3μL～1μL；MMLV逆转录酶(5U/μL)，0.5μL；DNA聚合酶(5U/μL)，0.5μL；RNA酶抑制剂(40U/μL)，0.5μL；核酸模板，5μL；无核酸酶水补足至25μL。

进一步优选地，步骤S2所述核酸为RNA，荧光PCR的体系为：5×RT-PCR Buffer(Mg²⁺plus)，5μL；dNTPs(10mM each，含dUTP)，1μL；自淬灭荧光的引物(10pmol/μL)，0.3μL～1μL；下游/上游引物(10pmol/μL)，0.3μL～1μL；MMLV逆转录酶(5U/μL)，0.5μL；DNA聚合酶(5U/μL)，0.5μL；RNA酶抑制剂(40U/μL)，0.5μL；UDG酶(1U/μL)，1μL；核酸模板，5μL；无核酸酶水补足至25μL。

PCR体系中加入了UDG酶，能有效防止产物污染，增加检测的准确性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供了一种自淬灭荧光的引物，所述引物只在引物的鸟嘌呤(G碱基)的相邻碱基上标记荧光染料，其3’端没有进行封闭修饰，所以仍可以进行PCR扩增，最后的扩增产物是带有荧光标记的DNA；因为每一轮PCR扩增产物都有荧光信号，所以自淬灭荧光的引物也可以用于实时荧光检测；自淬灭荧光的引物只需标记荧光染料，无需标记淬灭基团，可以降低合成成本和难度；

(2)本发明建立了一种基于自淬灭荧光的引物的非诊断目的PCR方法，实现了无需荧光探针或荧光染料即可进行荧光PCR检测；由于无需探针，可以降低设计难度，同时也可以减少探针与引物之间的抑制作用，提升反应的灵敏度和准确性；可以实现相同荧光通道对不同物质的检测；也可以实现同时对多通道的荧光扩增曲线和熔解曲线进行分析，具有比较广的应用场景；同时PCR体系中加入了UDG酶，能有效防止产物污染，增加检测的准确性；

(3)本发明提供的非诊断目的PCR方法是一种新型的荧光PCR方法，不依赖荧光探针和荧光染料即可以进行荧光PCR检测，同时还可以对产物进行熔解曲线分析，可以对样本中的DNA/RNA准确地进行荧光PCR检测，为核酸水平的分子生物学提供操作更为简便的、成本相对低廉的准确、灵敏的检测方法；可以用于检测病原微生物、SNP、染色体非整倍体、微缺失微重复等，具有非常广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明自淬灭荧光的引物的设计原理和步骤示意图。

图2为本发明实施例3利用不同引物对检测的背景信号图。

图3为本发明实施例5的NOP56基因荧光PCR检测的扩增曲线图。

图4为本发明实施例5的NOP56基因荧光PCR检测的熔解曲线图。

图5为本发明自淬灭荧光引物法和荧光染料法荧光PCR检测的结果；其中a为自淬灭荧光引物法的扩增曲线图，b为自淬灭荧光引物法的熔解曲线图，c为荧光染料法(SBRYGreen1)的扩增曲线图，d为荧光染料法(SBRY Green1)的熔解曲线图。

图6为本发明NOP56基因、BCR基因和ABL基因的PCR产物的TM值图。

图7为本发明NOP56基因、BCR基因和ABL基因同一通道荧光PCR检测的结果；a为扩增曲线图，b为熔解曲线图。

图8为本发明EBV和CMV的PCR产物的TM值图。

图9为本发明EBV和CMV不同荧光多重PCR检测结果；a为扩增曲线图，b为熔解曲线图。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1自淬灭荧光的引物的设计

1.自淬灭荧光的引物的设计方法

(1)针对待测物质的基因序列，设计相应的上游引物和下游引物；

(2)在上游或下游引物的序列中寻找“TG”碱基或“GT”碱基或“CG”碱基或“GC”碱基；

(3)在“TG”碱基或“GT”碱基或“CG”碱基或“GC”碱基中的T或C碱基上标记荧光染料。

2.自淬灭荧光的引物设计具体方法

选择针对待测物质基因已设计好的引物，引物序列为16～30个碱基，寻找上游引物或下游引物序列中的“TG”碱基或“GT”碱基或“CG”碱基，然后在T碱基或C碱基上标记相应的荧光染料，即得一条自淬灭荧光的引物。所述荧光染料为FAM、HEX/VIC、Texas-Red、ROX或CY5等荧光染料标记；所述自淬灭荧光的引物的3’端无封闭修饰，可以继续延伸。另一条引物可以标记荧光染料，也可以不标记荧光染料。

自淬灭荧光的引物的设计原理和步骤示意图如图1所示。

实施例2一种基于自淬灭荧光的引物的PCR检测方法

1.提取样本的核酸

使用核酸提取试剂盒对样本的核酸进行提取和纯化。

2.PCR体系配制

(1)DNA荧光PCR的反应体系

10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)，2.5μL；dNTPs(10mM each，含dUTP)，1μL；自淬灭荧光的引物(10pmol/μl)，0.3μL～1μL；下游/上游引物(10pmol/μl)，0.3μL～1μL；DNA聚合酶(5U/μl)，0.5μL；UDG酶(1U/μl)，1μL；核酸模板，5μL；无核酸酶水补足至25μL。

(2)RNA荧光PCR的反应体系

5×RT-PCR Buffer(Mg²⁺plus)，5μL；dNTPs(10mM each，含dUTP)，1μL；自淬灭荧光的引物(10pmol/μl)，0.3μL～1μL；下游/上游引物(10pmol/μl)，0.3μL～1μL；MMLV逆转录酶(5U/μl)，0.5μL；DNA聚合酶(5U/μl)，0.5μL；RNA酶抑制剂(40U/μl)，0.5μL，UDG酶(1U/μl)，1μL；核酸模板，5μL；无核酸酶水补足至25μL。

3.荧光PCR检测

将PCR反应管置于荧光定量PCR仪中，设置反应程序。DNA荧光PCR反应程序如表1所示，RNA荧光PCR反应程序如表2所示。

表1 DNA荧光PCR反应程序

表2 RNA荧光PCR反应程序

注：a表示在退火过程中收集荧光信号，b表示在60℃到90℃的升温过程中收集荧光信号。

4.检测结果分析

(1)扩增曲线分析

反应结束后保存检测数据文件。在Results下选择Amplification Plot选项。选择分析的目的样品所在位置。根据背景信号手动调整Baseline的数值，参考数值为start：3，stop：10，设定Threshold高于背景信号。在Graph type栏选择Linear，点击Analyze自动分析结果。

(2)熔解曲线分析

反应结束后保存检测数据文件。在Results下选择Melt Curve Plot选项。选择分析的目的样品所在位置，再选择所要分析的Target，根据熔解曲线峰图来区别相应的检测物质。

实施例3比较不同标记方法的背景信号

1.引物设计

针对人的ACTB基因(NCBI登录号：NG_007992.1)以实施例1的引物设计相应的自淬灭荧光的引物及普通引物。

首先根据ACTB基因序列，应用NCBI的Pick Primers设计相应的上、下游引物。为了比较“TG、GT、CG、GC”碱基淬灭效果，从中选取没有“TG、GT、CG、GC”碱基的上游引物序列为：CCCCTTCCCTCCTCAGATCAT，然后在引物的5’端人工设置相应的接头序列，接头序列分别为：“GCAATG”、“GCAAGT”、“GCAACG”、“GCAAGC”，接头序列中“TG”碱基、“GT”碱基、“CG”碱基、“GC”碱基的T或C碱基上标记FAM荧光染料。引物序列和标记如表3所示。ACTBF1和ACTBR为组合1；ACTBF2和ACTBR为组合2；ACTBF3和ACTBR为组合3；ACTBF4和ACTBR为组合4。

表3引物序列及标记

注：dT-FAM表示在T碱基上标记FAM荧光染料，dC-FAM表示在C碱基上标记FAM荧光染料。

2.比较不同引物对的自淬灭效果

(1)仪器

荧光定量PCR仪，ABI7500。

(2)试剂

10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)；dNTPs(10mM each，含dUTP)；DNA聚合酶(5U/μL)；UDG酶(1U/μL)；无核酸酶水、洗脱液。

(3)荧光PCR检测

将反应物按照表4的荧光PCR反应体系配制好后置于在PCR管中，然后将PCR管置于ABI7500荧光定量PCR仪中，按照实施例2中表1的反应程序进行PCR反应。

表4荧光PCR反应体系

3、检测结果

反应结束后保存检测数据文件。在Results下选择Amplification Plot选项。选择分析的目的样品所在位置。根据背景信号手动调整Baseline的数值，参考数值为start：3，stop：10，设定Threshold高于背景信号。在Graph type栏选择Linear，data栏选择Rn vsCycle，点击Analyze自动分析结果。

以洗脱液为样本进行荧光定量PCR扩增，检测四种组合在无阳性样本时的真实背景信号，可以真实反应各组合的背景噪音的强弱，从而可以辅助挑选合适的淬灭引物组合。

利用不同引物对检测的背景信号图如图2所示，从图2中可以看出组合1和组合2的Rn值在6.4×10⁴～7.5×10⁴，组合3和组合4的Rn值在9.4×10⁴～1.2×10⁵。组合1的Rn值最小，说明组合1引物对的背景信号最低，是最优的引物组合，也即ACTBF1和ACTBR引物对值最优的引物对，因此，在设计自淬灭荧光引物时，应首选“TG”碱基标记荧光染料，然后依次是“GT”碱基、“CG”碱基和“GC”碱基。

实施例4 NOP56基因的自淬灭荧光的引物的设计

以实施例1的引物设计方法对NOP56基因(NCBI登录号：NG_032136.1)进行相应的自淬灭荧光的引物及普通引物的设计。

首先根据NOP56基因序列，应用Primer5.0软件设计相应的上、下游引物，从中选取评分最高的引物组合，选取的上游引物序列(SEQ ID NO：6)为：TAAATAGCTGGCCTCTTGCAT，下游引物序列(SEQ ID NO：7)为：AGATAAAGACACCACACGACT。上游引物序列中有2处TG碱基和3处GC碱基，下游引物序列中有1处CG碱基，这些位置的T或C碱基均可以标记荧光染料。本实施例选取NOP56基因上游引物TG碱基设计自淬灭荧光的引物，序列为(SEQ ID NO：8)：TAAATAGC/dT-FAM/GGCCTCTTGCAT，下游引物不做标记，为普通引物；引物序列及标记如表5所示。

表5引物序列及标记

注：dT-FAM表示在T碱基上标记FAM荧光染料。

实施例5基于自淬灭荧光的引物的NOP56基因的检测

1.选取NOP56基因作为研究对象，采用自淬灭荧光引物法进行检测。

(1)仪器

荧光定量PCR仪，ABI7500。

(2)试剂

5×RT-PCR Buffer(Mg²⁺plus)；dNTPs(10mM each，含dUTP)；MMLV逆转录酶(5U/μL)；DNA聚合酶(5U/μL)；RNA酶抑制剂(40U/μL)；UDG酶(1U/μL)；无核酸酶水。

(3)引物

以实施例4表5中核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的自淬灭荧光的引物(上游，NOP56QF1)和核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的下游引物(NOP56R1)作为引物；按照实施例2的方法检测对NOP56基因进行检测。

(4)RNA提取

采用QIAamp RNA Blood Mini Ki(QIAGEN公司，52304)对所收集的健康人血液样本进行总RNA提纯，通过紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度(OD₂₆₀/OD₂₈₀)，然后用于后续的检测。

(5)荧光PCR检测

将反应物按照表6的荧光PCR反应体系配制好后置于在PCR管中，然后将PCR管置于ABI7500荧光定量PCR仪中，按照实施例2中表2的反应程序进行PCR反应。

表6荧光PCR反应体系

组分	加入量(μL)
		无核酸酶水	9.5
5×RT-PCR Buffer(Mg²⁺plus)	5
		dNTPs(含dUTP，10mM each)	1
自淬灭荧光的引物NOP56QF1(10μM)(SEQ ID NO：8)	1
		下游引物NOP56R1(10μM)(SEQ ID NO：7)	1
RNA酶抑制剂(40U/μL)	0.5
		M-MLV(200U/μL)	0.5
DNA聚合酶(5U/μL)	0.5
		UDG酶(1U/μL)	1
待测物RNA	5
		总体积	25

2.检测结果

荧光PCR检测的扩增曲线图如图3所示，熔解曲线图如图4所示。

图3和图4显示，血液样本的扩增曲线为典型的S型曲线；熔解曲线为单峰、无杂峰，说明针对NOP56基因设计的自淬灭荧光的引物及普通引物可靠，无非特异性和二聚体产生；且检测方法可以进行荧光PCR检测，同时也可以进行熔解曲线分析。

实施例6自淬灭荧光引物法与荧光染料法PCR的比较

1.选取NOP56基因作为研究对象，分别采用自淬灭荧光引物法和荧光染料法进行检测。

(1)仪器

荧光定量PCR仪，ABI7500。

(2)试剂

5×RT-PCR Buffer(Mg²⁺plus)；dNTPs(10mM each，含dUTP)；MMLV逆转录酶(5U/μL)；DNA聚合酶(5U/μL)；RNA酶抑制剂(40U/μL)；UDG酶(1U/μL)；SYBR Green1(50×)；无核酸酶水。

(3)引物

以实施例4表5中核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的自淬灭荧光的引物(上游，NOP56QF1)和核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的下游引物(NOP56R1)作为引物；按照实施例2的方法检测对NOP56基因进行自淬灭荧光引物法检测；

以实施例4表5中核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的上游引物(NOP56F1)和核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的下游引物(NOP56R1)作为引物；按照实施例2的方法检测对NOP56基因进行荧光染料法检测。

(4)RNA提取

采用实施例5所示RNA核酸提取试剂盒对所收集的人血液样本进行总RNA提纯，然后用于无核酸酶水10倍稀释成3个梯度，分别以原液、10^-1、10^-2、10^-3浓度的样本RNA作为待检测物用于后续的检测。

(5)荧光PCR检测

将反应物按照表7的荧光PCR反应体系配制好后置于在PCR管中，然后将PCR管置于ABI7500荧光定量PCR仪中，按照实施例2中表2的反应程序进行PCR反应。

表7荧光PCR反应体系

2.检测结果

自淬灭荧光引物法和荧光染料法荧光PCR检测的结果如图5所示；其中a为自淬灭荧光引物法的扩增曲线图，b为自淬灭荧光引物法的熔解曲线图，c为荧光染料法(SBRYGreen1)的扩增曲线图，d为荧光染料法(SBRY Green1)的熔解曲线图。

自淬灭荧光引物法和荧光染料法的检测Ct值如表8所示。

表8自淬灭荧光引物法和荧光染料法的检测Ct值

根据图5中的a图和c图可知，自淬灭荧光引物法和荧光染料法对4个浓度样本进行检测，均有明显的扩增曲线，且自淬灭荧光引物法的荧光信号要强于SBRY Green1染料法；由图5中的b图和d图可知，自淬灭荧光引物法的熔解曲线峰均为单峰，且TM都一样，SBRYGreen1染料法的TM值不在一条线上，个别样本的有0.5℃的差距。

由表8结果可知，自淬灭荧光引物法和荧光染料法的检测Ct值基本一致，说明二者的扩增效率一致。

综上可知，自淬灭荧光引物法的性能与SBRY Green1荧光染料法相当，在熔解曲线的稳定性上要优于荧光染料法，证明本发明的自淬灭荧光的引物可以用于扩增曲线和熔解曲线分析。

实施例7自淬灭荧光的引物在同一通道进行多重PCR检测

1.选取NOP56基因、BCR基因和ABL基因作为研究对象，分别采用自淬灭荧光引物法在同一通道进行多重PCR检测。

(1)仪器

荧光定量PCR仪，ABI7500。

(2)试剂

(3)引物

针对BCR基因(NCBI登录号X02596)和ABL基因(NCBI登录号X16416)分别设计相应的自淬灭荧光的引物和对应的下游或上游引物，NOP56基因选择实施例4中的引物，要求PCR产物的TM值相差1度以上(TM值如图6所示)，NOP56基因、BCR基因和ABL基因的引物序列如表9所示。

表9 NOP56基因、BCR基因和ABL基因的引物序列

名称	序列(5’→3’)及修饰	备注
			NOP56QF1	TAAATAGC/dT-FAM/GGCCTCTTGCAT(SEQ ID NO：8)	自淬灭荧光的引物(上游)
NOP56R1	AGATAAAGACACCACACGACT(SEQ ID NO：7)	普通下游
			BCR-F1	TTTCTGAATGTCATCGTCCACT(SEQ ID NO：9)	普通上游
BCR-QR1	AGCTCTATCTCAAATTCCTCG/dT-FAM/T(SEQ ID NO：10)	自淬灭荧光的引物(下游)
			ABL-QF1	GG/dC-FAM/CCTAGCTTTACGCTCA(SEQ ID NO：11)	自淬灭荧光的引物(上游)
ABL-R1	AGAACCGCATAAAACGATCCAG(SEQ ID NO：12)	普通下游

注：dT-FAM表示在T碱基上标记FAM荧光染料；dC-FAM表示在C碱基上标记FAM荧光染料。

(4)RNA提取

收集健康人的全血样本3例，然后用实施例4的RNA核酸提取试剂盒，对样本中的总RNA进行提取。

(5)荧光PCR检测

将反应物按照表10的荧光PCR反应体系配制好后置于在PCR管中，然后将PCR管置于ABI7500荧光定量PCR仪中，按照实施例2中表2的反应程序进行PCR反应。

表10荧光PCR反应体系

2.检测结果

NOP56基因、BCR基因和ABL基因同一通道荧光PCR检测的结果如图7所示，其中a为扩增曲线图，b为熔解曲线图。

因为NOP56基因、BCR基因和ABL基因三个基因的自淬灭荧光的引物只标记了FAM荧光染料，所以每个样本检测只会有一条扩增曲线(图7中a)，通过扩增曲线无法识别相应的基因，但由于3个基因的PCR产物的TM值不同(图7中b)，可以根据熔解曲线的TM值来识别相应的检测基因。

从图7中b熔解曲线峰图可知，NOP56、BCR和ABL基因的TM值均不同，NOP56基因的TM值为83.93、BCR基因的TM值为77.15，ABL基因的TM值为80.74；因此，可以根据熔解曲线峰TM值的大小来识别相应的基因。

综上可知，本发明设计的引物可以实现在同一荧光通道中鉴别不同的基因。

实施例8自淬灭荧光引物法不同通道的检测

1.选取EB病毒(EBV)和巨细胞病毒(CMV)的序列作为研究对象，分别采用自淬灭荧光引物法在不同通道进行多重PCR检测。

(1)仪器

荧光定量PCR仪，QuantStudio^TM7。

(2)试剂

10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)；dNTPs(10mM each，含dUTP)；DNA聚合酶(5U/μL)；UDG酶(1U/μL)；无核酸酶水。

(3)引物

根据GenBank中登录的EB病毒(EBV、NC_007605.1)和巨细胞病毒(CMV、NC_055235)序列，应用DNAMAN软件进行同源性分析，并找出各个病毒的保守区。应用Primer 5.0软件根据2种病毒基因的保守区基因分别设计相应的自淬灭荧光的引物和对应的下游/上游引物，PCR产物的TM值相差1℃以上(如图8所示)，EBV和CMV的引物序列如表11所示。

表11 EBV和CMV的引物序列

注：dT-FAM表示在T碱基上标记FAM荧光染料；dT-CY5表示在T碱基上标记CY5荧光染料。

(4)DNA提取

采用QIAamp DNA Kits(QIAGEN公司，56304)提取EBV和CMV的标准物(浓度为1×10⁵IU/mL)的DNA，然后用无核酸酶水10倍梯度稀释成3个梯度(1×10⁴IU/mL、1×10³IU/mL、1×10²IU/mL)进行多重PCR检测。

(5)荧光PCR检测

将反应物按照表12的荧光PCR反应体系配制好后置于在PCR管中，然后将PCR管置于ABI7500荧光定量PCR仪中，按照实施例2中表1的反应程序进行PCR反应。

表12荧光PCR反应体系

组分	加入量(μL)
		无核酸酶水	13.6
10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)	2.5
		dNTPs(含dUTP，10mM each)	1
EBQF1(10μM)SEQ ID NO：13	0.3
		EBR1(10μM)SEQ ID NO：14	0.3
CMQR1(10μM)SEQ ID NO：15	0.4
		CMF1(10μM)SEQ ID NO：16	0.4
DNA聚合酶(5U/μL)	0.5
		UDG酶(1U/μL)	1
待测物DNA	5
		总体积	25

2.检测结果

EBV和CMV不同荧光多重PCR检测结果如图9所示，其中a为扩增曲线图，b为熔解曲线图。

由图9中a可知，EBV和CMV分别在FAM和CY5通道均有明显的扩增曲线，通过不同通道的扩增曲线可以区分相应的病原体；由图9中b可知，EBV和CMV均有相应的熔解曲线，且二者的熔解曲线温度不同，所以可以通过熔解曲线的温度或不同通道的熔解曲线来区分相应的病原体。

综上所述，本发明的方法能够实现单管检测不同荧光信号，且同时可以对其熔解曲线进行分析，能够对不同基因进行检测，具有较高的应用价值。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 广州博懿瑞生物科技有限公司

<120> 一种自淬灭荧光的引物及其设计方法及应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcaatgcccc ttccctcctc agatcat 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcaagtcccc ttccctcctc agatcat 27

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcaacgcccc ttccctcctc agatcat 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcaagccccc ttccctcctc agatcat 27

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcgtcatac tcctgcttgc t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taaatagctg gcctcttgca t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agataaagac accacacgac t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taaatagctg gcctcttgca t 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tttctgaatg tcatcgtcca ct 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agctctatct caaattcctc gtt 23

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggccctagct ttacgctca 19

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agaaccgcat aaaacgatcc ag 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggttcacctt caggggtaag ta 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

caggttcctg tgaaaagcaa ga 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gttctgtaag agcagcgagc ta 22

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gccgccgtga gcatct 16

Claims

1.一种自淬灭荧光的引物，其特征在于，用于检测ACTB基因的上游引物核苷酸序列为GCAA/dT-FAM/GCCCCTTCCCTCCTCAGATCAT，

下游引物核苷酸序列为CTCGTCATACTCCTGCTTGCT，

dT-FAM表示在T碱基上标记FAM荧光染料。

2.权利要求1所述引物在制备荧光PCR检测试剂盒中的应用。

3.一种非诊断目的PCR方法，其特征在于，用权利要求1所述的引物进行荧光PCR反应。