CN114592042A - 一种微rna检测方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微RNA检测方法及试剂盒，用于生物样品和环境样品中微RNA核酸的快速检测，包括适用于快速检测的微RNA加尾和Cpf1检测体系。本发明系首次采用微RNA加尾和Cpf1检测联合作用检测微RNA，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量、肉眼可直接判读和不依赖大型实验设备等优势。这些优势使得本发明开发的检测方法方便用于临床一线对生物样品和环境样品中的微RNA进行快速检测和鉴定诊断。

Description

一种微RNA检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种微RNA检测方法及试剂盒。
背景技术
微RNA（MicroRNA，miRNA)是由约22个核苷酸组成的小型非编码RNA，在调控蛋白编码基因表达和肿瘤发病机制中具有重要作用。 最近的研究表明，miRNA的异常表达可以作为人类疾病诊断、进展和监测的有效生物标志物。血清、血浆、唾液、尿液和其他体液中细胞外循环miRNA水平的改变可以用作新型的非侵入性疾病生物标志物。用于检测miRNA的传统技术包括Northern Blot、定量逆转录PCR (RT-qPCR)、二代测序、原位杂交和基于微阵列的杂交。然而，这些技术耗时而且成本高昂，因此这些技术的缺点限制了这些技术的使用可及性。因此，有必要开发一种快速、经济、稳定、灵敏、特异的miRNA检测技术。
CRISPR-Cas系统最初来源于细菌的RNA引导的适应性免疫系统，用于抵御入侵细菌和古菌的核酸成分。各种新出现的CRISPR-Cas系统为基因调控和基因组工程提供了强大的工具。特别是Cpf1的平行切割活性，可以开发成高特异性检测核酸的诊断工具，甚至可以区分单核苷酸多态性(SNP)。miRNA序列长度短、家族成员间序列相似性高、序列长度变异是miRNA定量检测的主要挑战。由于miRNA序列较短，miRNA序列中的PAM较少，难以直接用CRISPR检测。因此，对于miRNA的检测存在测试时间长、效率低、特异性和灵敏高不够高、测试成本高等问题。
术语解释
术语crRNA是指CRISPR RNA，是短的引导Cpf1（Cpf1）到结合到靶标DNA序列的RNA。
术语CRISPR是指成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)，该序列是许多原核生物的免疫系统。
术语Cas蛋白是指CRISPR-associated蛋白，它是CRISPR系统中的相关蛋白。
术语Cpf1（又称Cpf1）是指crRNA依赖的内切酶，它是CRISPR系统分类中V型（typeV）的酶。
术语PAM是指前间区序列邻近基序(protospacer-adjacent motif)，是Cpf1切割所必须，FnCpf1的PAM为 TTN序列，LbCpf1的PAM为TTTN序列。
术语RT-RPA（reverse transcription-recombinase polymeraseamplification）为反转录等温扩增，又称逆转录重组酶聚合酶扩增。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中检测miRNA核酸时成本过高、检测试剂较长、检测效率低、特异性和灵敏性不够高等缺陷，提供了一种多聚腺嘌呤（PolyA）聚合酶和Cpf1联合使用的检测方法及试剂盒，解决了miRNA扩增困难和序列相似程度高不容易准确检测的问题。
本发明提供了一种微RNA检测方法，包括以下步骤：
S1：多聚腺嘌呤（PolyA）加尾，在样品的微RNA加入不少于两个腺嘌呤的多聚腺嘌呤（PolyA）的序列；
S2：cDNA合成，根据加尾的微RNA合成cDNA；
S3：DNA扩增，将合成的cDNA扩增；
S4：Cpf1检测，Cpf1识别cDNA，Cpf1被激活切割探针进行检测。
本发明还提供了一种微RNA检测试剂盒，包括PolyA加尾和Cpf1检测体系。
作为优选，所述的多聚腺嘌呤（PolyA）加尾包括多聚腺嘌呤（PolyA）聚合酶，所述多聚腺嘌呤（PolyA）聚合酶为经过密码子优化的蛋白，以及包含聚合酶的功能域的突变蛋白。
作为优选，所述Cpf1检测体系包括Cpf1蛋白和/或核酸探针。
作为优选，所述Cpf1蛋白为经过密码子优化的Cpf1蛋白，针对多种不同来源的cpf1蛋白核酸序列进行原核密码子优化获得序列，构建到pET28a表达载体，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得目的蛋白。
作为优选，所述核酸探针为单链DNA，可用于荧光检测。
作为优选，所述核酸探针为荧光标记的单链DNA，一端具有荧光基团，一端具有荧光淬灭基团。
作为优选，所述核酸探针为5’端具有荧光基团和3’端具有荧光淬灭基团的单链DNA。
作为优选，所述荧光基团为6-FAM、TET、CY3、CY5或ROX，所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3，所述单链DNA的序列为TTTATTT。
Cpf1可以在RNA的引导下识别DNA核酸序列，但是miRNA的序列是RNA，无法直接识别，而且RNA的序列比较短，只有20多个碱基的长度，而且大多没有Cpf1可以识别的PAM识别序列。本发明创造性的结合polyA聚合酶，解决了Cpf1检测miRNA的三个难点，第一，通过polyA序列，转录成DNA后增加了TTT的可以识别序列，不需要使用miRNA内部的PAM序列，任意的miRNA都可以使用，通用型更好；第二，转录成为DNA，可以被Cpf1高特异性识别；第三，转录成DNA后，可以比RNA更加稳定，不容易降解。因此该方法可以提高Cpf1检测的信号强度，从而可用于增强Cpf1介导的体外检测的信号以减少检测时间、提高检测效率。
本发明中，一旦靶标核酸、crRNA和Cpf1蛋白形成三元复合体时，该复合物会切割体系中其他的单链DNA分子。通过设计crRNA靶向靶标核酸；向检测体系中加入crRNA和Cpf1蛋白；当靶标DNA存在时，Cpf1与crRNA以及靶标DNA形成三元复合体，同时该复合物行使其平行切割的活性并切割带荧光信号标记的单链DNA(两头分别连有发光基团和淬灭基团，被切断后发光基团可以发光)，从而发出荧光。因此，通过检测荧光即可得知待检测体系中是否含有靶标DNA分子。
本发明中，通常可以对临床样品进行灭活处理，释放待检样品中核酸。在等温条件下，对样本的miRNA进行反转录（RT）获得DNA，并进行重组酶聚合酶扩增（RPA）。Cpf1-crRNA复合物结合并切割靶标dsDNA，其激活ssDNA的反式切割。与ssDNA偶联的荧光报告分子在切割时产生荧光信号。
本发明中，所述的核酸探针一般也可称为荧光-淬灭单链DNA报告系统，其一般含有荧光基团和淬灭基团，在完整状态荧光被淬灭基团淬灭，在反应过程中被切割之后，从而发出荧光。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的有益效果在于：
多聚腺嘌呤（PolyA）加尾可以解决miRNA长度短，不容易扩增的难题，可用于扩展miRNA序列并促进扩增；同时针对Cpf1受到PAM限制可以检测的核酸序列较少的问题，多聚腺嘌呤（PolyA）可以为miRNA加入通用的PAM序列，可以使得该方法覆盖所有的微RNA。整合CRISPR-Cpf1系统，可以利用Cpf1的特异性，解决miRNA家族成员序列之间序列相似的问题，因此可以识别从miRNA扩增出的目标核酸序列。该系统提高了miRNA样品的稳定性，减少了测试时间和成本，并提高了重现性。正如本发明中所证明的，polyA-CRISPR/Cpf1可以开发便携式、准确且成本效益高的即时诊断系统。
利用本发明所述的polyA-Cpf1试剂盒检测miRNA核酸时，可以显著提高检测时的信号强度从而减少检测时间、提高检测效率，且灵敏度高、特异性高、准确性高、检测可视化（可在荧光灯下肉眼直接可视检测）、成本低、无需复杂大型实验设备、操作简便。这些优势使得本发明的试剂盒和检测方法更加适用于基层实验和临床一线的快速检测和鉴定诊断。在本发明某一较佳实施例中，检测病毒的DNA样品时的检测灵敏度为1E-15 M的浓度的miRNA。
附图说明
图1为polyA-Cpf1快速检测miRNA的方法示意图；
图2为polyA-Cpf1检测的miRNA的覆盖比例示意图；
图3为polyA-Cpf1检测miRNA的crRNA设计原理图一；
图4为polyA-Cpf1检测miRNA的crRNA设计原理图二；
图5为polyA-Cpf1检测miRNA的实验验证图；
图6为miR-299的crRNA验证；
图7为miR-335的crRNA验证；
图8为等温扩增引物验证；
图9为polyA-Cpf1检测灵敏度分析；
图10为polyA-Cpf1 检测不同细胞中的miR-21的实验验证图；
图11为polyA-Cpf1 检测不同细胞来源的不同miRNA的实验验证；
图12为polyA-Cpf1检测的特异性，可以区分具有单碱基差异的let7a的miRNA。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明中，RPA扩增试剂盒TwistAmp® Basic kit购自TwistAmp公司；crRNA体外转录盒子MEGAshortscript T7 Transcription Kit 和纯化盒子MEGAclear Kit 购自Ambion公司；常规试剂如Tris-Base, BSA, NaCl, Tris-HCl，MgSO4，BSA和甘油等购自Thermo Fisher；检测用核酸片段、ssDNA探针和RNA合成由南京金斯瑞公司完成；本发明使用购自诺唯赞公司的快速核酸释放剂获得预处理的核酸。
本发明的总体技术示意图如图1所示，包括以下4大部分：
S1：多聚腺嘌呤加尾，在样品的微RNA加入不少于两个腺嘌呤的多聚腺嘌呤的序列；
S2：cDNA合成，根据加尾的微RNA合成cDNA；
S3：DNA扩增，将合成的cDNA扩增；
S4：Cpf1检测，Cpf1识别cDNA，Cpf1被激活切割探针进行检测。
一种微RNA检测试剂盒，包括多聚腺嘌呤加尾和Cpf1检测体系，所述的多聚腺嘌呤加尾包括多聚腺嘌呤聚合酶，所述多聚腺嘌呤聚合酶为经过密码子优化的蛋白，以及包含聚合酶的功能域的突变蛋白，所述Cpf1检测体系包括Cpf1蛋白和/或核酸探针，所述Cpf1蛋白为经过密码子优化的Cpf1蛋白，所述核酸探针为单链DNA，所述核酸探针为荧光标记的单链DNA，一端具有荧光基团，一端具有荧光淬灭基团，所述核酸探针为5’端具有荧光基团和3’端具有荧光淬灭基团的单链DNA，所述荧光基团为6-FAM、TET、CY3、CY5或ROX，所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3，所述单链DNA的序列为TTTATTT。
实施例1：polyA-Cpf1检测miRNA
1. polyA-Cpf1检测miRNA的方法验证
本实施例中的LbCpf1基因经过密码子优化后，将其克隆到pet28a质粒中（由南京金斯瑞公司完成该步骤），在大肠杆菌中表达，经过纯化后用于检测实验。
PolyA加尾的实验体系为，20ul 体系，加入15 µL RNA（总量约为1-10µg），加入2 µL 10x的Poly(A) Polymerase Reaction Buffer 溶液，加入2 µL ATP（10mM），1 µL Poly(A) Polymerase 。
核酸的准备。crRNAs和miRNAs由GenScript（中国南京）合成，本研究中使用的核心序列列于表1和表2 (支持信息)。对于miRNA逆转录，使用一步miRNA cDNA合成试剂盒（HaiGene）合成cDNA，并根据制造商的方案进行微小修改。对miRNA的反转录进行优化: 5 μL反转录反应(包含1.25 μL 反转录buffer，0.5 μL 反转录引物和miRNA) 在37℃恒温反应60 min，然后在95℃恒温进行5 min终止反应。
等温扩增。miRNA cDNA的等温扩增是按照制造商的说明使用商业RPA试剂盒(GenDx)进行的。25μL等温扩增反应包含5μL (反转录产品，10μL反应溶液，0.5μM正向引物，0.5μM反向引物, 最后加1μL活化剂，37°C恒温反应 20分钟。在这项研究中使用的引物序列表3中列出。
CRISPR / Cas12a-Based荧光检测。crRNA由一个与Cas12a相互作用的21 nt区域和一个用于目标DNA识别的23 nt可编程引导区域(称为间隔)组成。由GenScript(Nanjing, China)合成了一个以FAM和BHQ1标记的单链DNA报告基因(ssDNA-FQ)。检测用200 ng纯化Cas12a，25 pM ssDNA-FQ，1 μM crRNA，2 μL样品，最终体积为20 μL。反应在37℃下孵育反应。在检测系统中，一旦Cas12a被目标序列激活，ssDNA-FQ就会被裂解。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，激发波长为485 nm，发射波长为520 nm。每1分钟记录一次信号，持续1小时。用手机相机在485nm的激发光照射下拍摄。
如图2所示，分析已知的所有miRNA中含有的PAM序列，polyA加尾可以覆盖所有的miRNA检测。
如图3所示，polyA加尾后可以选择的crRNA设计方式1；
如图4所示，polyA加尾后可以选择的crRNA设计方式2。
实施例2：细胞样品中的核酸片段检测
2.1 核酸制备
细胞培养和miRNA提取。SNU-449、PC-9、U87MG、U251、Jurkat和16HBE均来自中国科学院(上海)。除Jurkat和16HBE细胞外，所有细胞均在含10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle’s培养基(DMEM)中培养。Jurkat和16HBE在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养。当细胞密度达到80 - 90%时，收集细胞，使用商业化的MiPure cell /Tissue miRNA试剂盒(Vazyme)提取miRNA。用Nanodrop 2000仪器测量纯化后的总miRNA浓度。提取液置于−80℃保存。
核酸的准备。crRNAs由GenScript(中国南京)合成，本研究中使用的核心序列列于表1和表2。
对于miRNA逆转录，使用一步miRNA cDNA合成试剂盒(HaiGene)合成cDNA，并根据制造商的方法进行微小修改。对miRNA的反转录进行优化：5μL反转录反应（包含1.25 μL RT溶液、0.5 μL RT引物和miRNA数量）在37℃恒温箱中进行60 min，然后在95℃恒温箱中进行5 min。
等温扩增。miRNA cDNA的等温扩增是按照制造商的说明使用商业RPA试剂盒(GenDx)进行的。25μL等温扩增反应包含5μL (反转录的,10μL反应溶液，0.5μM底漆,0.5μM反向引物，最后加1μL活化剂溶液，进行恒温扩增，37°C 扩增20分钟。
如图5所示，针对miR-299，使用polyA、扩增和Cas12a检测，证实该方案可行。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表2：微RNA序列
Figure DEST_PATH_IMAGE002
实施例3：crRNA的优化
本实施例中，为检测crRNA是否可以介导高效的识别作用，设计了crRNA1,2,3,4,5，具体序列列于表1. 根据实施例1中的反应条件进行反应。进行PolyA加尾，cDNA合成，DNA扩增之后，利用cpf1进行反应。结果如图6和图7所示。
结论：如图6和图7所示，利用polyA衍生出的PAM构建的crRNA均可以高效识别待测的微RNA，证实可以用polyA结尾的方法设计crRNA。
实施例4：检测的优化
DNA扩增是检测的关键一步，需要优化扩增的引物，实现高效的检测。对于每个待测的微RNA需要设计多对的正向引物和反向引物，比较扩增的有效性和检测的效率。扩增引物的序列如表3所列。
表3：扩增引物
Figure DEST_PATH_IMAGE004
结论：如图8所示，F2R3和F3R3针对miR299的扩增效率最高。
实施例5：检测的灵敏度
为了测定这一体系的检测灵敏度，我们将miR-299 RNA进行系列梯度稀释，然后根据实施例1的步骤进行的反应条件进行反应。进行PolyA加尾，cDNA合成，DNA扩增之后，利用cpf1进行反应。结果如图9 。
结论：如图9所示，可以检测到最低50fM的miR-299 RNA。
实施例6：检测的可拓展性
为了测定这一体系的检测的可拓展性，我们针对miRNA-21和miRNA299，以及SNU-449，PC-9，U251，U87MG，16HBE，Jurkat和培养基空白对照（NC）的细胞裂解液进行检测。提取核酸后根据实施例1的步骤进行的反应条件进行反应，使用的核心序列列于表1和表2。PolyA加尾，cDNA合成，DNA扩增之后，利用cpf1进行反应检测。结果如图10和图11所示 。
结论：
如图10所示，该方法可以检测不同细胞中miRNA-21的含量。
如图11所示，该方法可以改成阵列模式，检测多种细胞中的不同miRNA的含量。
实施例7：检测的特异性
为了测定这一体系的检测的特异性，我们将序列相近的let7a，7b和7e的微RNA，最小只有1个碱基的差异，然后根据实施例1的步骤进行的反应条件进行反应。进行PolyA加尾，cDNA合成，DNA扩增之后，利用cpf1进行反应。
结论：如图12所示，该方法可以精准区分1个碱基差异的微RNA，具有极高的特异性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种微RNA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：多聚腺嘌呤加尾，在样品的微RNA加入不少于两个腺嘌呤的多聚腺嘌呤的序列；
S2：cDNA合成，根据加尾的微RNA合成cDNA；
S3：DNA扩增，将合成的cDNA扩增；
S4：Cpf1检测，Cpf1识别cDNA，Cpf1被激活切割探针进行检测。
2.一种微RNA检测试剂盒，其特征在于：包括多聚腺嘌呤加尾和Cpf1检测体系。
3.根据权利要求2所述的一种微RNA检测试剂盒，其特征在于：所述的多聚腺嘌呤加尾包括多聚腺嘌呤聚合酶，所述多聚腺嘌呤聚合酶为经过密码子优化的蛋白，以及包含聚合酶的功能域的突变蛋白。
4.根据权利要求2所述的一种微RNA检测试剂盒，其特征在于：所述Cpf1检测体系包括Cpf1蛋白和/或核酸探针。
5.根据权利要求4所述的一种微RNA检测试剂盒，其特征在于：所述Cpf1蛋白为经过密码子优化的Cpf1蛋白。
6.根据权利要求4所述的一种微RNA检测试剂盒，其特征在于：所述核酸探针为单链DNA。
7.根据权利要求6所述的一种微RNA检测试剂盒，其特征在于：所述核酸探针为荧光标记的单链DNA，一端具有荧光基团，一端具有荧光淬灭基团。
8.根据权利要求7所述的一种微RNA检测试剂盒，其特征在于：所述核酸探针为5’端具有荧光基团和3’端具有荧光淬灭基团的单链DNA。
9.根据权利要求8所述的一种微RNA检测试剂盒，其特征在于：所述荧光基团为6-FAM、TET、CY3、CY5或ROX，所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3，所述单链DNA的序列为TTTATTT。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023202303A1 (zh) * 2022-04-21 2023-10-26 之江实验室 一种微rna检测方法及试剂盒

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1736780A1 (en) * 2005-06-24 2006-12-27 Eppendorf Array Technologies S.A. Method and means for detecting and/or quantifying hierarchical molecular change of a cell in response to an external stimulus
US20080182239A1 (en) * 2007-01-26 2008-07-31 Mullinax Rebecca L Methods, Compositions, and Kits for Detection of microRNA
CN110029150A (zh) * 2019-03-28 2019-07-19 天津大学 用于检测微小rna的小分子金属螯合剂标记寡核苷酸探针的制备方法
CA3093580A1 (en) * 2018-03-14 2019-09-19 Arbor Biotechnologies, Inc. Novel crispr dna and rna targeting enzymes and systems
CN112626179A (zh) * 2020-12-21 2021-04-09 重庆医科大学 一种CTSDR与CRISPR/Cas联用检测miRNA的荧光传感器及其制备与应用
KR20220018410A (ko) * 2020-08-06 2022-02-15 김성천 세포질에서 자가전사가 가능하고 유전체 편집을 제공하는 rna/dna 시스템
CN114395636A (zh) * 2022-02-11 2022-04-26 南方医科大学 一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110551846B (zh) * 2019-08-19 2021-10-08 上海科技大学 一种用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法
CN110878343B (zh) * 2019-12-03 2023-04-07 国家卫生健康委科学技术研究所 一种用于遗传性耳聋致病基因SLC26A4突变快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法
CN111187856B (zh) * 2020-02-13 2020-11-13 上海科技大学 一种用于新冠病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒及其制备方法与应用
CN111534641B (zh) * 2020-04-01 2021-06-04 上海科技大学 一种核酸检测试剂盒、检测方法及应用
CN114592042B (zh) * 2022-04-21 2022-11-11 之江实验室 一种微rna检测方法及试剂盒

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1736780A1 (en) * 2005-06-24 2006-12-27 Eppendorf Array Technologies S.A. Method and means for detecting and/or quantifying hierarchical molecular change of a cell in response to an external stimulus
US20080182239A1 (en) * 2007-01-26 2008-07-31 Mullinax Rebecca L Methods, Compositions, and Kits for Detection of microRNA
CA3093580A1 (en) * 2018-03-14 2019-09-19 Arbor Biotechnologies, Inc. Novel crispr dna and rna targeting enzymes and systems
CN110029150A (zh) * 2019-03-28 2019-07-19 天津大学 用于检测微小rna的小分子金属螯合剂标记寡核苷酸探针的制备方法
KR20220018410A (ko) * 2020-08-06 2022-02-15 김성천 세포질에서 자가전사가 가능하고 유전체 편집을 제공하는 rna/dna 시스템
CN112626179A (zh) * 2020-12-21 2021-04-09 重庆医科大学 一种CTSDR与CRISPR/Cas联用检测miRNA的荧光传感器及其制备与应用
CN114395636A (zh) * 2022-02-11 2022-04-26 南方医科大学 一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MINGTIAN ZHONG等: "PCDetection: PolyA-CRISPR/Cas12a-based miRNA detection without PAM restriction", 《BIOSENS BIOELECTRON》 *
SHAOHUA GONG等: "Duplex-Specific Nuclease-Assisted CRISPR-Cas12a Strategy for MicroRNA Detection Using a Personal Glucose Meter", 《ANAL CHEM》 *
VLADIMIR BENES等: "Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available", 《METHODS》 *
WEI LU等: "Precise Characterization of Bombyx mori Fibroin Heavy Chain Gene Using Cpf1-Based Enrichment and Oxford Nanopore Technologies", 《INSECTS》 *
左晨: "以microRNA为靶标的CRISPR-Cas12a体外诊断技术及肿瘤诊疗一体化纳米探针的构建", 《中国博士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023202303A1 (zh) * 2022-04-21 2023-10-26 之江实验室 一种微rna检测方法及试剂盒

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