CN114350853A

CN114350853A - 一种检测病毒及其突变体的试剂盒和方法

Info

Publication number: CN114350853A
Application number: CN202111675548.2A
Authority: CN
Inventors: 李为民; 薛婷; 刘彤; 王誉熹; 邓锐杰
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114350853B

Abstract

本发明公开了一种无标记和等温检测病毒及其突变体的试剂盒，其特征在于，包括如下部分：(1)含切割识别序列的预引物；(2)从5’端至3’端由适配体互补序列(L‑broccoli)、T7启动子互补序列(L‑T7启动子)、间隔序列和引物前锚序列依次连接构成的转录模板。(3)crRNA或其DNA模板；(4)Cas13蛋白(5)体外转录试剂；(6)病毒和/或其突变体的ssRNA体外扩增用引物；(7)去磷酸化试剂。本发明的试剂盒对新冠病毒及变体检测的灵敏度、特异性高、检测限为0.216fM，操作步骤简单，有望用于临床相关RNA病毒检测，应用前景良好。

Description

一种检测病毒及其突变体的试剂盒和方法

技术领域

本发明属于病毒检测领域。具体涉及一种检测病毒及其突变体的试剂盒和方法。

背景技术

全球流行病学数据表明，随着新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的病原体新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的传播，毒株的变异也随之产生，并导致更高的传播率和更强的免疫逃逸反应。例如新冠病毒刺突蛋白(S蛋白)中的错义突变(N501Y)能使SARS-CoV-2病毒的传播速度增加70％。突变毒株的出现给新型冠状病毒的检测提出了新的要求。快速开发高效，准确的突变检测方法，势必成为应对病毒突变，有效控制传播的关键。然而，现有的新型冠状病毒检测方法，包括核酸分子识别和血清免疫检测都无法准确检出突变。因此，亟需构建快速、低成本和高通量变异新冠病毒检测和筛查试剂盒。

CRISPR-Cas(聚簇的规则间隔的短回文重复序列)是一类特殊的核酸蛋白复合体，一般具有RNA降解酶(RNase)或DNA降解酶(DNase)的活性，使得 CRISPR/Cas系统成为下一代诊断平台的完美候选物。其中，CRISPR/Cas13a 是唯一以RNA为靶点的CRISPR效应体，具有超强的信号放大能力。 CRISPR-Cas13a系统由一个Cas13a蛋白和一个crRNA组成。靶RNA被crRNA 特异性识别并激活Cas13a的RNA酶活性，对所处环境中的其它RNA分子进行非特异性的切割，被称作“旁切割”(collateral cleavage)。CRISPR-Cas13a系统在SARS-CoV-2病毒诊断中具有广阔的应用前景。取消昂贵的探针(如淬灭剂和荧光基团修饰的RNA探针)和昂贵的仪器(如热循环仪)，预计将促进其在资源有限地区的SARS-CoV-2病毒常规检测中的使用。

目前，利用CRISPR/Cas系统进行病毒检测的试剂、方法的报道较少，进一步开发高效、准确的基于CRISPR/Cas系统的病毒检测试剂，丰富病毒核酸检测和筛查的手段，仍具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种无标记和等温检测新冠病毒和/或其突变体的试剂盒。

本发明提供了一种病毒和/或其突变体的试剂盒，包括如下部分：

(1)预引物；

(2)转录模板；

(3)靶向病毒和/或其突变体的crRNA或其DNA模板；

(4)Cas13蛋白；

(5)体外转录试剂；

(6)病毒和/或其突变体的ssRNA体外扩增用引物；

(7)去磷酸化试剂；

所述预引物、转录模板的序列满足如下条件：

所述转录模板序列为一段DNA，由从5’端至3’端依次连接的适配体互补序列、T7启动子互补序列、间隔序列和引物前锚序列构成；

所述预引物序列由从5’端至3’端依次连接的成熟引物序列、切割识别序列和末端序列构成；

所述成熟引物序列为至少有15个碱基的DNA序列，且与所述引物前锚序列反向互补；

所述切割识别序列为UU与AU或AA与UA；所述间隔序列的最后一位碱基与切割识别序列的第一位碱基互补，间隔序列的倒数第二位碱基与切割识别序列的第二位碱基不互补；

所述末端序列为随机DNA碱基序列，且不与转录模板序列互补；

所述crRNA为一段RNA，序列包括2部分：1)向导序列：负责与病毒和/或其突变体的ssRNA体外扩增产物进行互补配对，形成双链；2)锚定序列：位于向导序列的5’端，依赖其二级结构，可结合Cas13蛋白；

所述Cas13蛋白为Lwacas13a或Lbucas13a；

所述ssRNA体外扩增用引物分为正向引物和反向引物，正向引物的5’端添加有T7启动子序列。

进一步地，上述crRNA与Cas 13a结合后形成Cas 13a-crRNA复合物， Cas 13a-crRNA复合物中，crRNA的向导序列与病毒和/或其突变体的ssRNA 体外扩增产物形成双链，构成Cas13a-crRNA/ssRNA复合物的情况下激活 Cas13蛋白的反式酶切活性；

所述预引物经Cas13a-crRNA/ssRNA复合物在切割识别序列处切割后，经去磷酸化试剂去磷酸化从而释放出成熟引物，成熟引物与转录模板的引物前锚序列杂交，形成转录扩增起始复合物；

所述转录扩增起始复合物经体外转录试剂生成发光RNA适配体。

进一步地，上述切割识别序列为UU，Cas13蛋白为Lwacas13a。

更进一步地，上述体外转录试剂包括T7 RNA聚合酶；所述去磷酸化试剂包括T4多聚核苷酸激酶。

更进一步地，上述试剂盒还包括无外切酶活性的Klenow片段。

更进一步地，上述病毒为新冠病毒；所述病毒的突变体是新冠病毒S基因发生N501Y突变形成的突变体。

更进一步地，上述试剂盒中，

所述预引物序列如SEQ ID NO.1所示；

所述转录模板序列如SEQ ID NO.2所示；

所述靶向病毒的crRNA的序列如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示；

所述病毒的ssRNA体外扩增用引物序列的正向引物序列如SEQ ID NO.5 所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示，或，正向引物序列如SEQ ID NO.7 所示，反向引物序列如SEQ ID NO.8所示；

所述靶向病毒突变体的crRNA的序列如SEQ ID NO.9所示；

所述病毒突变体的体外扩增用引物的正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物序列如SEQ ID NO.8所示。

进一步地，上述生成的发光RNA适配体可以特异性结合核酸染料，并使染料荧光增强。

更进一步地，上述RNA适配体为下列适配体中的至少一种：Broccoli、 Spinach、Spinach2；

所述核酸染料为如下核酸染料中的至少一种： 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone、 (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1Hi midazol-5(4H)-one。

本发明还提供了一种非疾病诊断目的的检测病毒和/或其突变体的方法，它是使用上述的试剂盒对病毒和/或其突变体的核酸进行检测的方法。

术语“新冠病毒”，指SARS-CoV-2。“LwaCas 13a”是Cas13蛋白的一种，其来源于微生物Leptotrichia wade，Lwa是其缩写。在本发明中，使用其他物种来源的Cas13蛋白同样可以达到相同的检测目的。

本发明的检测新冠及新冠变体原理是：

本发明设计了一个预引物，其带有两个“rU”(即具有切割识别序列UU)，能够作为Cas13a/crRNA的底物。同时，设计了一个转录模板，其从5’端至3’端依次由发光适配体的互补序列(L-broccoli)、T7启动子的互补序列(L-T7启动子)、间隔序列(长度5nt)和引物前锚序列连接构成。然后，对新冠假病毒的ssRNA采用等温体外扩增NASBA方法进行扩增，得到体外扩增产物(为 RNA)，可被crRNA与Cas13a形成的复合物Cas13a-crRNA识别，激活复合物中Cas13a的反式酶切活性，继而从两个“rU”位点处旁切预引物，然后，互补配对锚定在转录模板3’-末端，经过T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)的3’-端去磷酸化后，释放出成熟引物，并进一步启动无外切酶活性的klenow(exo-)介导的链延伸。接下来，转录扩增由T7 RNA聚合酶启动，产生大量发光的RNA 适配体(例如broccoli适配体)。与核酸染料(例如DFHBI 1T(即(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1Hi midazol-5(4H)-one))形成适配体复合物在激发波长468nm处激发发出荧光而输出信号，从而实现病毒的检测(示意图如图1所示)。

本发明的试剂盒和方法具有如下有益效果：

(1)不使用标记的RNA探针，而是将包含一个适配体序列的转录模板引入系统，以生成一个多功能的报告适配体探针，能够监控CRISPR-Cas13a 的激活。

(2)由于双重扩增步骤包括NASBA(基于核酸序列的扩增)、转录和 Cas13a-crRNA的直接错配识别，提议的检测方法具有高灵敏度(亚femtomolar 浓度)和单核苷酸分辨率的高特异性。

(3)以本发明的试剂盒和方法检测新冠病毒，几乎不会对同家族具有高度同源性的MERS、SARS等冠状病毒产生阳性响应；

(4)可检测新冠病毒变体。本发明的试剂盒和方法可针对新冠及新冠变体分别设计相对应的检测序列，可分别检测出新冠及变体。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是采用本发明提供的检测新冠及变体方法的原理示意图。

图2是实施例3绘制的标准曲线。

图3是实施例4中对其他冠状病毒的选择性测试结果。

图4是实施例5中检测咽拭子中新冠病毒的结果。

图5是实施例6中检测新冠病毒变体的结果。

具体实施方式

以下实施例中涉及到的序列如表1所示，各核苷酸序列委托合成公司——上海生工生物科技有限公司合成。

表1相关序列

注：Wild和Mutated分别指S基因的野生型和N501Y突变型。

实施例1 crRNA的制备

本实施例中，制备crRNA溶液，步骤如下：

将4μL浓度为10μM的crRNA的DNA模板链溶液，4μL浓度为10μM的启动子母液和4μL的phi29 DNA聚合酶缓冲液加入到19.5μL无酶水中，涡旋混匀； 90℃退火3min，室温25℃放置15min；然后加入0.5μL浓度为10U/μL的phi29 DNA聚合酶和1μL浓度为10mM dNTPs混合物，涡旋混匀；30℃孵育30min 后，在75℃加热10分钟灭活Phi29 DNA聚合酶。最后，加入1μL浓度为20U/μL 的T7 RNA聚合酶，8μL的T7 RNA聚合酶缓冲液和2μL的rNTPs混合物，混匀，在37℃下孵育9h，获得crRNA溶液。各crRNA的核苷酸(RNA)序列为：

新冠病毒N基因对应crRNA：

其中，下划线部分为锚定序列，斜体部分为向导序列。

S基因野生型对应crRNA：

其中，下划线部分为锚定序列，斜体部分为向导序列。

S基因突变型对应crRNA：

其中，下划线部分为锚定序列，斜体部分为向导序列。

实施例2目标ssRNA的制备

本实施例中，制备目标ssRNA溶液，步骤如下：

我们应用慢病毒载体系统生成了表达关键基因N基因、S基因的假病毒。关键基因N基因、S基因被合成，并克隆到pCMV3载体的PacI和NheI位点。构建的重组质粒经DNA测序验证。用Lipofectamine 3000转染试剂将6个重组质粒共转染5×10⁶HEK293T细胞。12小时后，将细胞转移到新鲜的DMEM培养基中，转染48-72小时后收集含假病毒的上清液，用0.45μm过滤器过滤。

将1μL假病毒RNA提取液，0.5μL正向引物(500nM)，0.5μL反向引物 (500nM)，5μL含有二甲基亚砜(DMSO)的缓冲液(120mM Tris-HCl pH值8.0， 39.6mM氯化镁，225mM氯化钾，30mM DTT和45％DMSO)，1.5μL rNTPs 混合物，0.5μL dNTPs混合物，和6μL H₂O混合后在65℃孵育5分钟，41℃孵育10min；然后加入5μL酶混合物(3.75U/mL RNase H,2500U/mLProtoScript RT，6,250U/mL T7聚合酶和0.12mg/mL BSA加入到不含DMSO的缓冲液中)，41℃孵育120min，获得目标ssRNA溶液。

各目标ssRNA的核苷酸(RNA)序列为： GUUGACCUACACAGGUGCCAUCAAAUUGGAUGACAAAGAUCCAAAU UUCAAAGAUCAAGUCAUUUUGCUGAAUAAGCAUAUUGACGCAUACA AAACAUUCCCACCAACAGAGCCUAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGC UGAUGAAACUCAAGCCUUACCGCAGAGACA(N基因，SEQ IDNO.10)，

UAUCAGGCCGGUAGCACACCUUGUAAUGGUGUUAAAGGUUUUA AUUGUUACUUUCCUUUACAAUCAUAUGGUUUCCAACCCACUAAUGG UGUUGGUUACCAACCAUACAGAGUAGUAGU(S基因野生型，SEQ IDNO.11)，

UAUCAGGCCGGUAGCACACCUUGUAAUGGUGUUAAAGGUUUUA AUUGUUACUUUCCUUUACAAUCAUAUGGUUUCCAACCCACUUAUGG UGUUGGUUACCAACCAUACAGAGUAGUAGU(S基因突变型，SEQ IDNO.12)。

实施例3本发明试剂的检测限

本实施例中，绘制标准溶液曲线，步骤如下：

(1)配制新冠假病毒标准溶液

配制4μL新冠假病毒RNA浓度分别为0.0、0.006、0.01、0.02、0.05、0.39、 0.78、1.56、3.12、6.25、12.50、25.00和50.00fM的新冠假病毒RNA标准溶液。

(2)按实施例2制备(1)中对应的目标ssRNA。

(3)绘制标准曲线

①取实施例1制备的N基因的crRNA溶液及(2)中制备的目标ssRNA溶液各4μL，混匀，向其中加入8μL反应缓冲液,4μL浓度为2.4μM预引物,4μL 转录模板(3μM),0.5μL dNTPs混合物(10mM),2μL rNTPs混合物(25mM), 1μL Klenow exo^-(10U/μL),1μL T4磷酸激酶(10U/μL),0.4μL Lwacas13a 蛋白(10μM),4μL DFHBI-1T(100μM)和5.1μL RNase-free H₂O混匀，然后在反应管盖上加入2μL T7 RNA聚合酶(20U/μL)，37℃金属浴孵育30min，得到含有T7启动子的双链DNA模板。然后在65℃金属浴中加热3分钟使 Lwacas13a蛋白灭活。然后将T7 RNA聚合酶短暂离心至反应液中，混匀，37℃金属浴孵育2h。用Synergy H1酶标仪分别在468nm和498～650nm的激发和发射波长下检测反应混合液的荧光强度，记录该新冠假病毒标准溶液对应的荧光强度峰值；以新冠假病毒标准溶液的新冠假病毒RNA浓度为横坐标，新冠假病毒标准溶液的荧光强度峰值为纵坐标绘制标准曲线，拟合出的标准曲线的回归方程为y＝773.12x+3512.90，R²＝0.9981，其中，y代表荧光强度，x 代表新冠假病毒RNA浓度(单位fM)，标准曲线如图2所示。

根据标准曲线，本次实验对新冠病毒的检测限是0.216fM。

实施例4本发明试剂的特异性

本实施例中，考察本发明提供的检测方法对同家族其他冠状病毒的是否有响应，步骤如下：

(1)用无核酸酶的ddH₂O分别配制浓度为50fM左右的新冠假病毒RNA、中东呼吸综合征(MERS-CoV)冠状假病毒RNA及非典型肺炎(SARS-CoV)假病毒RNA各4μL；

(2)按实施例2制备(1)中对应的目标ssRNA。

(3)取实施例1制备的N基因的crRNA溶液及(2)中制备的目标ssRNA 溶液各4μL，混匀，向其中加入8μL反应缓冲液,4μL浓度为2.4μM预引物, 4μL转录模板(3μM),0.5μL dNTP混合物(10mM),2μL rNTP混合物(25 mM),1μL Klenow exo-(10U/μL),1μL T4磷酸激酶(10U/μL),0.4μL Lwacas13a蛋白(10μM),4μL DFHBI-1T(100μM)和5.1μL RNase-free H₂O混匀，然后在反应管盖上加入2μL T7 RNA聚合酶(20U/μL)，37℃金属浴孵育30min，得到含有T7启动子的双链DNA模板。然后在65℃金属浴中加热3 分钟使Lwacas13a蛋白灭活。然后将T7 RNA聚合酶短暂离心至反应液中，混匀，37℃金属浴孵育2h。用Synergy H1酶标仪分别在468nm和498～650nm的激发和发射波长下检测反应混合液的荧光强度，记录各溶液对应的荧光强度峰值；

由图3可知，虽然SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的N基因序列高度相似(图3)，但只有SARS-CoV-2RNA产生高荧光。相比之下，对SARS-CoV、 MERS-CoV、H7N9、H1N1和H9N2的反应接近背景(没有添加病毒)。这一结果表明，本发明提供的方法可以高度特异性识别SARS-CoV-2。

实施例5检测咽拭子中的新冠病毒

本实施例中，在健康志愿者咽拭子和临床样本咽拭子中检测新冠病毒，步骤如下：

(1)取健康志愿者和患者咽拭子若干份，使用病毒RNA提取试剂盒提取 RNA，用无核酸酶水量化至4μL，依次记作N1#～N6#,P1#～P6#样品溶液。

(2)按实施例2制备(1)中对应的目标ssRNA。

(3)新冠病毒样品检测

取实施例1制备的N基因的crRNA溶液及(2)中制备的目标ssRNA溶液各 4μL，混匀，向其中加入8μL反应缓冲液,4μL浓度为2.4μM预引物,4μL转录模板(3μM),0.5μL dNTP混合物(10mM),2μL rNTP混合物(25mM),1μL Klenow exo-(10U/μL),1μL T4磷酸激酶(10U/μL),0.4μL Lwacas13a蛋白 (10μM),4μL DFHBI-1T(100μM)和5.1μL RNase-free H₂O混匀，然后在反应管盖上加入2μL T7 RNA聚合酶(20U/μL)，37℃金属浴孵育30min，得到含有T7启动子的双链DNA模板。然后在65℃金属浴中加热3分钟使Lwacas13a 蛋白灭活。然后将T7 RNA聚合酶短暂离心至反应液中，混匀，37℃金属浴孵育2h。用Synergy H1酶标仪分别在468nm和498～650nm的激发和发射波长下检测反应混合液的荧光强度，记录该新冠病毒样品溶液对应的荧光强度峰值；

结果如图4所示，咽拭子样品中病毒含量越高，其对应的荧光强度峰值越高，呈现出新冠病毒量的依赖性。

本实施例的结果表明，本发明的试剂可以用于检测咽拭子中的新冠病毒。

实施例6检测新冠病毒突变体

考察本发明提供的检测方法对新冠病毒突变体的检测能力。突变体相对于野生型病毒发生刺突蛋白N501Y突变(第501个氨基酸由N突变为Y，密码子由GAU突变为GGU)，标记为Mutated。步骤如下：

(1)取野生型新冠假病毒和含N501Y的突变型，使用病毒RNA提取试剂盒分别提取RNA，用无核酸酶水分别量化至4μL，分别标记为WT和Mutated；

(2)按实施例2制备本实施例(1)中对应的目标ssRNA。

(3)新冠病毒突变体样品检测

取实施例1制备的突变型crRNA溶液及(2)中制备的突变体目标ssRNA 溶液各4μL，混匀，向其中加入8μL反应缓冲液,4μL浓度为2.4μM预引物, 4μL转录模板(3μM),0.5μLdNTP混合物(10mM),2μL rNTP混合物(25 mM),1μL Klenow exo-(10U/μL),1μL T4磷酸激酶(10U/μL),0.4μL Lwacas13a蛋白(10μM),4μL DFHBI-1T(100μM)和5.1μL RNase-free H₂O混匀，然后在反应管盖上加入2μL T7 RNA聚合酶(20U/μL)，37℃金属浴孵育30min，得到含有T7启动子的双链DNA模板。然后在65℃金属浴中加热3 分钟使Lwacas13a蛋白灭活。然后将T7 RNA聚合酶短暂离心至反应液中，混匀，37℃金属浴孵育2h。用Synergy H1酶标仪分别在468nm和498～650nm的激发和发射波长下检测反应混合液的荧光强度，记录该新冠病毒样品溶液对应的荧光强度峰值；

(4)将(3)中的突变型crRNA溶液和突变体目标ssRNA溶液替换为等量的野生型crRNA溶液和野生型目标ssRNA溶液，重复步骤(3)的操作，记录荧光强度峰值。

结果如图5所示。左侧的曲线代表用突变型检测新冠假病毒的探针 (Probes forMutated SARS-CoV-2)分别检测新冠假病毒和新冠假病毒变体的荧光值，右侧的曲线代表用野生型检测新冠假病毒的探针(Probes for wild SARS-CoV-2)分别检测新冠假病毒和新冠假病毒变体的荧光值，浅灰色曲线代表各探针的背景荧光值，灰色曲线代表各探针检测新冠假病毒时的荧光值，黑色代表各探针检测新冠假病毒变体时的荧光值。可见，检测新冠假病毒变体的探针可以特异性识别新冠病毒突变体(N501Y)，而检测野生型新冠假病毒的探针可特异性识别野生型新冠病毒。

本实施例的结果表明，本发明的方法可用于特异性地检测新冠病毒及其突变体，可精确识别单碱基变异。

综上，本发明的新冠及变体检测方法的灵敏度、特异性高、可用于检测新冠变体，且有望用于临床相关其他病毒检测，应用前景良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学华西医院

<120> 一种检测病毒及其突变体的试剂盒和方法

<130> GYKH1818-2021P0114584CCR4

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 预引物

<400> 1

gcctgccagt ttcgaatgca uugtgtg 27

<210> 2

<211> 93

<212> DNA

<213> 转录模板

<400> 2

gagcccacac tctactcgac agatacgaat atctggaccc gaccgtctcc ctatagtgag 60

tcgtattatc cgatgcattc gaaactggca ggc 93

<210> 3

<211> 66

<212> RNA

<213> N基因crRNA

<400> 3

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacugag uuucaucagc cuucuucuuu 60

uugucc 66

<210> 4

<211> 64

<212> RNA

<213> S基因野生型crRNA

<400> 4

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacguaa ccaacaccau uaguggguug 60

gaaa 64

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> N基因正向引物

<400> 5

taatacgact cactataggg gttgacctac acaggtgcca 40

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> N基因反向引物

<400> 6

tgtctctgcg gtaaggcttg 20

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> S基因正向引物

<400> 7

taatacgact cactataggg tatcaggccg gtagcaca 38

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> S基因反向引物

<400> 8

actactactc tgtatggttg 20

<210> 9

<211> 64

<212> RNA

<213> S基因突变型crRNA

<400> 9

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacguaa ccaacaccau aaguggguug 60

gaaa 64

<210> 10

<211> 168

<212> RNA

<213> N基因ssRNA

<400> 10

guugaccuac acaggugcca ucaaauugga ugacaaagau ccaaauuuca aagaucaagu 60

cauuuugcug aauaagcaua uugacgcaua caaaacauuc ccaccaacag agccuaaaaa 120

ggacaaaaag aagaaggcug augaaacuca agccuuaccg cagagaca 168

<210> 11

<211> 119

<212> RNA

<213> S基因野生型ssRNA

<400> 11

uaucaggccg guagcacacc uuguaauggu guuaaagguu uuaauuguua cuuuccuuua 60

caaucauaug guuuccaacc cacuaauggu guugguuacc aaccauacag aguaguagu 119

<210> 12

<211> 119

<212> RNA

<213> S基因突变型ssRNA

<400> 12

uaucaggccg guagcacacc uuguaauggu guuaaagguu uuaauuguua cuuuccuuua 60

caaucauaug guuuccaacc cacuuauggu guugguuacc aaccauacag aguaguagu 119

Claims

1.一种病毒和/或其突变体的试剂盒，其特征在于，包括如下部分：

(1)预引物；

(2)转录模板；

(3)靶向病毒和/或其突变体的crRNA或其DNA模板；

(4)Cas13蛋白；

(5)体外转录试剂；

(6)病毒和/或其突变体的ssRNA体外扩增用引物；

(7)去磷酸化试剂；

所述预引物、转录模板的序列满足如下条件：

所述Cas13蛋白为Lwacas13a或Lbucas13a；

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述crRNA与Cas 13a结合后形成Cas 13a-crRNA复合物，Cas 13a-crRNA复合物中，crRNA的向导序列与病毒和/或其突变体的ssRNA体外扩增产物形成双链，构成Cas13a-crRNA/ssRNA复合物的情况下激活Cas13蛋白的反式酶切活性；

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述切割识别序列为UU，Cas13蛋白为Lwacas13a。

4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述体外转录试剂包括T7 RNA聚合酶，所述去磷酸化试剂包括T4多聚核苷酸激酶。

5.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括无外切酶活性的Klenow片段。

6.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述病毒为新冠病毒；所述病毒的突变体是新冠病毒S基因发生N501Y突变形成的突变体。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，

所述预引物序列如SEQ ID NO.1所示；

所述转录模板序列如SEQ ID NO.2所示；

所述靶向病毒的crRNA的序列如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示；

所述病毒的ssRNA体外扩增用引物序列的正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示，或，正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物序列如SEQ IDNO.8所示；

所述靶向病毒突变体的crRNA的序列如SEQ ID NO.9所示；

8.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，

所述生成的发光RNA适配体可以特异性结合核酸染料，并使染料荧光增强。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA适配体为下列适配体中的至少一种：Broccoli、Spinach、Spinach2；

所述核酸染料为如下核酸染料中的至少一种：3,5-difluoro-4-hydroxybenzylideneimidazolinone、(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1Hi midazol-5(4H)-one。

10.一种非疾病诊断目的的检测病毒和/或其突变体的方法，其特征在于：它是使用权利要求1～7任一所述的试剂盒对病毒和/或其突变体的核酸进行检测的方法。