KR102570655B1 - 토홀드 스위치 시스템을 이용한 생물학적 지표 검출용 키트 및 검출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 토홀드 스위치 시스템을 이용한 생물학적 지표 검출용 키트 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 토홀드 영역을 포함하는 헤어핀 구조 올리고머; 무세포 반응액; 및 기질을 포함하는 CD3ε 검출용 키트 및 SARS-CoV-2 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 검출 키트는 기존 키트에 비해 단순하고 빠른 시간 내에 정확한 표적 mRNA의 검출이 가능하여 신장 이식 급성 거부반응의 진단 지표인 CD3ε mRNA를 우수한 효율로 검출 가능함을 확인하였는바, 신장 이식 급성 거부반응을 조기에 진단할 수 있으며, 이 기술을 이용하면 확산속도 및 감염률이 높은 SARS-CoV-2의 검출에 있어 기존 방법을 대체하여 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 토홀드 스위치 시스템을 이용한 생물학적 지표 검출용 키트 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 토홀드 영역을 포함하는 헤어핀 구조 올리고머; 무세포 반응액; 및 기질을 포함하는 CD3ε 검출용 키트 또는 이를 이용한 SARS-CoV-2의 검출 방법에 관한 것이다.
신장 이식 후, 이식 수용자의 급성 거부반응을 조기에 진단하는 것은 매우 중요하다. 이를 위해 임상에서는 바늘 생검(needle biopsy)과 PCR(정량적 PCR 및 액적 디지털 PCR)이 급성 거부반응의 진단을 위해 널리 이용되고 있으나, 상기 방법들은 여전히 일부 측면에서 자체적인 단점을 가지고 있다.
한편, 2019년 12월 이후, 중국 후베이에서 처음 발견된 코로나 바이러스(SARS-CoV-2)의 대유행에 의해 전 세계적으로 엄청난 수의 사람들이 사망했고 여전히 수백만 명의 사람들이 위협받고 있다. 대규모의 사전 감염여부 진단은 대유행 확산을 방지하는 효율적인 조치 중 하나로 입증되었다. RT-PCR은 높은 정확도와 민감도를 갖는 표준 진단방법으로 간주되고 있으나, 대기 시간이 길고 고가의 장비, 시간 및 많은 노동이 필요하다는 자체적인 제약이 있다. SARS-CoV-2는 빠른 확산속도 및 높은 전염력을 가지는 바, 많은 연구 그룹에서 보다 빠르고 간단하며 정확한 검출효율을 갖는 대체 검출 방법을 개발하고 있으며, 이는 감염 유행을 억제하는데 중요한 역할을 할 수 있다.
토홀드 스위치(Toehold switch)는 루프(loop)와 돌기(bulge)에 리보솜 결합 부위(ribosome biding site; RBS) 및 개시 코돈(AUG)을 갖는 RNA 헤어핀 구조 및 이의 앞부분에 단일가닥의 토홀드 영역(Toehold region)이 연결되어 있다. 상기 토홀드 영역은 토홀드 스위치의 작동을 자극하는 트리거 RNA(trigger RNA)와 결합하며, 이에 의해 상기 헤어핀 구조가 열리면서 상기 RBS 서열이 노출되면 리보솜이 상기 인식 서열에 결합하고 헤어핀 구조의 뒷부분에 연결된 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase, LacZ)의 번역이 시작된다(Cell, 2014, 159, 925-39).
또한, 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification; NASBA)이라고 불리는 등온성 RNA 증폭 방법을 결합하여 토홀드 스위치의 검출 한계를 줄여 감도를 최적화할 수 있다. 민감한 등온 전사 기반 시스템인 NASBA는 세 가지 효소 (조류 골수아세포증 바이러스 역전사 효소(avian myeloblastosis virus reverse transcriptase), RNase H 및 T7 RNA 중합 소)가 등온 조건에서 단일 가닥 RNA를 증폭하기 위해 이용되며, 이는 진단 툴로 사용하는데 유용하다.
하버드 대학의 Wyss Institute에서 개발한 대체 리보레귤레이터(riboregulators)인 토홀드 스위치는 에볼라바이러스(Ebola virus) 및 지카바이러스(Zika virus)와 같은 다양한 병원성 바이러스의 RNA를 검출하여 감염여부를 진단한 결과를 보고한바 있다. 상기 결과는 토홀드 스위치의 높은 특이성과 민감도를 보여주어 이후 상기 시스템의 추가 적용이 가능함을 입증하였다. 토홀드 스위치의 특성은 다수의 서로 다른 RNA에 대하여 특이적인 토홀드 스위치를 제작할 수 있다는 것이다. 따라서 검출하고자 하는 RNA에 특이적인 서열을 적용하여 토홀드 스위치를 제작한다면 다양한 분야에서 활용될 수 있을 것이다.
이전 발명에서 IP-10 mRNA의 검출에서 토홀드 스위치를 적용하였다. 하지만, 단지 하나의 RNA에 기초한 진단에 대해서는 거짓 양성(false positive)이 나올 확률이 높을 수 있다. 이에, 본 발명자들은 토홀드 스위치(toehold switches) 시스템을 적용하여, 신장 이식 급성 거부반응의 진단 마커인 IP-10 mRNA 외에 CD3ε mRNA 특이적으로 검출 가능한 토홀드 스위치를 제작하였으며, 상기 토홀드 스위치 및 무세포 반응액 플랫폼을 이용하여 상기 RNAs를 높은 특이성 및 민감도로 검출 가능함을 확인하였는 바, 이로써 해당 발명을 완성하였다. 또한 더 나아가 토홀드 스위치를 이용한 SARS-CoV-2 검출 방법을 설계하였다.
이에, 본 발명은 신장 이식 거부반응 지표인 CD3ε 검출용 키트 및 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 토홀드 스위치를 이용한 SARS-CoV-2 검출 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 토홀드 영역(Toehold region), 이중가닥 핵산서열1, 루프서열1, 이중가닥 핵산서열2, 루프서열2, 링커서열 및 발현 핵산서열을 포함하는 헤어핀 구조 올리고머;
무세포(Cell-free) 반응액; 및
기질을 포함하는, CD3ε 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 토홀드 영역은 CD3ε mRNA 또는 SARS-CoV-2 mRNA에 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 발현 핵산서열은 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase; LacZ)를 암호화하는 유전자 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 CD3ε 검출용 헤어핀 구조 올리고머는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 SARS-CoV-2 검출용 헤어핀 구조 올리고머는 서열번호 9 내지 서열번호 68의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 무세포 반응액은 아미노산, rNTP, tRNA, RNA 중합효소, 번역 인자, 아미노아실-tRNA 합성효소(aminoacyl-tRNA synthetase) 및 리보솜을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 기질은 클로로페놀 레드-β-D-갈락토피라노사이드(chlorophenol red-β-D-galactopyranoside; CBRG)일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, CD3ε 또는 SARS-CoV-2의 검출방법을 제공한다:
(a) 피검자 유래 생물학적 시료를 상기 키트에 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(b) 비색반응에 의한 반응액의 색 변화를 확인하는 단계.
본 발명의 일구현예로, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 단계 (a)에서 생물학적 시료를 상기 키트와 반응시키기 전에, 상기 시료를 이용해 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification; NASBA) 반응을 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단계 (a)에서 반응은 2 내지 6시간 동안 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 반응액의 색이 노란색에서 자색으로 변화하는 경우 CD3ε mRNA 가 존재하는 것으로 판단하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 검출 키트는 기존 검출 및 진단 수단에 비해 단순하고 빠른 시간 내에 정확한 표적 mRNA의 검출이 가능하여 신장 이식 급성 거부반응의 진단 지표인 CD3ε mRNA를 우수한 효율로 검출 가능함을 확인하였는바, 신장 이식 급성 거부반응을 조기에 진단할 수 있으며, 이 기술을 이용하면 확산속도 및 감염률이 높은 SARS-CoV-2의 검출에 있어 기존 방법을 대체하여 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 CD3ε mRNA 검출용 토홀드 스위치의 8개 후보군(70, 71, 72, 109, 175, 176, 291, 297)에 대한 스크리닝 결과를 나타낸 것으로, 도 1a는 100 nM의 각 토홀드 스위치와 1 μM trigger mRNA CD3ε를 37℃에서 240분 동안 배양하면서 시간 경과에 따른 흡광도 변화를 측정하여 나타낸 결과이고, 도 1b는 240분 동안 배양한 후 각 토홀드 스위치의 LacZ 생성률을 배수 변화로 나타낸 결과이며, 도 1c는 각 토홀드 스위치의 LacZ 생성에 따라 CPRG 기질과의 상호작용을 통한 반응액의 색 변화를 나타낸 결과이다.
도 2는 토홀드 스위치의 특이성을 분석한 결과로서, 2종류의 토홀드 스위치(175 및 176) 100 nM과 트리거 RNAs로 각각 IP-10, CD3ε 및 18S RNA를 37℃에서 240분 동안 배양한 후 LacZ 생성에 따른 흡광도 배수 변화를 나타낸 결과 및 LacZ 생성에 따라 CPRG 기질과의 상호작용을 통한 반응액의 색 변화를 보여주는 결과이다.
도 3은 토홀드 스위치의 민감도를 분석한 결과로서, 토홀드 스위치(175번)와 트리거 RNA인 CD3ε mRNA를 다양한 농도(1000, 100, 10, 1, 0.1, 0 nM)로 37℃에서 240분 동안 배양한 후 LacZ 생성에 따른 흡광도 배수 변화를 나타낸 결과 및 LacZ 생성에 따라 CPRG 기질과의 상호작용을 통한 반응액의 색 변화를 보여주는 결과이다.
도 4는 핵산 서열 기반 증폭(NASBA)이 트리거 RNA에 대한 토홀드 스위치의 검출 민감도를 향상시키는지 여부를 분석한 결과로서, 각각 CD3ε 및 IP-10 트리거 mRNA를 다양한 농도(100, 10, 1, 0.1 pM)로 토홀드 스위치와 37℃에서 240분 동안 배양한 후 LacZ 생성에 따른 흡광도 배수 변화를 측정하여 NASBA와의 결합을 통해 토홀드 스위치의 검출 민감도가 향상됨을 확인한 결과이다.
도 2는 토홀드 스위치의 특이성을 분석한 결과로서, 2종류의 토홀드 스위치(175 및 176) 100 nM과 트리거 RNAs로 각각 IP-10, CD3ε 및 18S RNA를 37℃에서 240분 동안 배양한 후 LacZ 생성에 따른 흡광도 배수 변화를 나타낸 결과 및 LacZ 생성에 따라 CPRG 기질과의 상호작용을 통한 반응액의 색 변화를 보여주는 결과이다.
도 3은 토홀드 스위치의 민감도를 분석한 결과로서, 토홀드 스위치(175번)와 트리거 RNA인 CD3ε mRNA를 다양한 농도(1000, 100, 10, 1, 0.1, 0 nM)로 37℃에서 240분 동안 배양한 후 LacZ 생성에 따른 흡광도 배수 변화를 나타낸 결과 및 LacZ 생성에 따라 CPRG 기질과의 상호작용을 통한 반응액의 색 변화를 보여주는 결과이다.
도 4는 핵산 서열 기반 증폭(NASBA)이 트리거 RNA에 대한 토홀드 스위치의 검출 민감도를 향상시키는지 여부를 분석한 결과로서, 각각 CD3ε 및 IP-10 트리거 mRNA를 다양한 농도(100, 10, 1, 0.1 pM)로 토홀드 스위치와 37℃에서 240분 동안 배양한 후 LacZ 생성에 따른 흡광도 배수 변화를 측정하여 NASBA와의 결합을 통해 토홀드 스위치의 검출 민감도가 향상됨을 확인한 결과이다.
본 발명자들은 토홀드 스위치(toehold switches) 시스템을 적용하여, 신장 이식 급성 거부반응의 진단 마커인 CD3ε mRNA, 및 SARS-CoV-2 RNA를 각각 특이적으로 검출 가능한 토홀드 스위치를 제작하였으며, 높은 정확도의 검출을 통해 신장 이식 급성 거부반응 및 상기 바이러스의 감염여부의 진단용도로 이용할 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명은 토홀드 영역(Toehold region), 이중가닥 핵산서열1, 루프서열1, 이중가닥 핵산서열2, 루프서열2, 링커서열 및 발현 핵산서열을 포함하는 헤어핀 구조 올리고머;
무세포(Cell-free) 반응액; 및
기질을 포함하는, CD3ε 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 헤어핀 구조 올리고머는 토홀드 영역(Toehold region), 이중가닥 핵산서열1, 루프서열1, 이중가닥 핵산서열2, 루프서열2, 링커서열 및 베타-갈락토시다아제 유전자 서열을 포함하며, 본 발명에서 사용되는 용어 ‘토홀드 스위치’와 동일한 의미를 갖는다. 상기 올리고머 서열의 염기 개수는 최적 효율로 트리거 RNA의 검출을 위해 조절될 수 있으며, 구체적으로 60 내지 120개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 70 내지 110개, 더더욱 바람직하게는 80 내지 100개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다.
상기 “토홀드 영역”은 검출하고자 하는 표적 RNA 즉, 트리거 RNA(trigger RNA)와 결합하는 영역으로서, 상기 트리거 RNA의 일부 영역과 상보적인 서열로 구성되어 있다. 본 발명에 있어서, 상기 토홀드 영역은 CD3ε mRNA 또는 SARS-CoV-2 mRNA에 결합할 수 있으며, 바람직하게 10 내지 30개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 15 내지 25개 뉴클레오티드로 구성될 수 있다.
본 발명에서, 상기 SARS-CoV-2 mRNA는 바람직하게는 SARS-CoV-2의 E 유전자(gene ID: 43740570)의 mRNA일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “핵산서열1” 및 “핵산서열2”는 각각 이중가닥으로 구성되며, 핵산서열1은 5 내지 15개 뉴클레오티드, 바람직하게는 10 내지 15, 더욱 바람직하게는 11 내지 13개, 가장 바람직하게는 12개 뉴클레오티드로 구성될 수 있고, 핵산서열2는 1 내지 10개 뉴클레오티드, 바람직하게는 2 내지 8개, 더욱 바람직하게는 3 내지 7개, 더더욱 바람직하게는 4 내지 6개, 가장 바람직하게는 5개 뉴클레오티드로 구성될 수 있으며, 뉴클레오티드 개수는 상기 올리고머의 제조를 위해 적절히 조절될 수 있다.
상기 루프서열은 서열 내 상보적인 서열이 존재하지 않도록 디자인되어 양쪽 말단의 핵산서열이 이중가닥을 형성할 때 고리모양의 구조를 형성하는 서열을 의미한다. 본 발명에 있어서, “루프1”은 번역이 시작되는 개시코돈(AUG)을 암호화하는 염기서열을 포함하고, 상기 “루프2”는 리보솜 결합 부위(ribosome biding site; RBS)를 암호화하는 염기서열을 포함한다. 루프2는 5 내지 15개 뉴클레오티드, 바람직하게는 10 내지 15, 더욱 바람직하게는 11 내지 13개, 가장 바람직하게는 12개 뉴클레오티드로 구성될 수 있으며, 상기 루프1 및 루프2 서열의 뉴클레오티드 개수는 적절히 조절될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 링커(linker) 서열은 15 내지 30개 뉴클레오티드, 바람직하게는 17 내지 25개, 더욱 바람직하게는 19 내지 23개, 더더욱 바람직하게는 20 내지 22개, 가장 바람직하게는 21개 뉴클레오티드로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현 핵산서열은 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase; LacZ)를 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 “베타-갈락토시다아제(β-galactosidase; LacZ)”를 암호화하는 유전자는 토홀드 영역과 트리거 RNA와의 결합에 의해 단백질로 번역되는 유전자로서, 베타-갈락토시다아제 단백질과 상기 기질의 반응을 통해 RNA의 존재여부를 확인할 수 있다.
본 발명자들은 구체적인 실시예에서 각각 CD3ε mRNA 및 SARS-CoV-2의 E 유전자의 mRNA를 주형으로 하여 토홀드 영역을 포함하는 다양한 헤어핀 구조 올리고머를 합성하였고, 연속된 뉴클레오타이드 패턴 유무, 종결 코돈의 유무, 트리거 RNA 즉 CD3ε mRNA 및 SARS-CoV-2 E 유전자의 mRNA 각각에 대한 검출 특이성 및 민감성, 결함 값 등을 분석하여 유효한 올리고머를 선별하였다.
본 발명에 있어서, 상기 CD3ε 검출용 헤어핀 구조 올리고머는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 검출용 헤어핀 구조 올리고머는 서열번호 9 내지 서열번호 68의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 무세포 반응액은 헤어핀 구조 올리고머를 구성하는 LacZ 유전자의 번역을 위해 필요한 구성성분들을 포함하며, 예컨대 아미노산, rNTP, tRNA, RNA 중합효소, 번역 인자, 아미노아실-tRNA 합성효소(aminoacyl-tRNA synthetase) 및 리보솜을 포함할 수 있으나, 이것으로 제한되지 않고 필요한 모든 성분을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기질은 본 발명에 따른 헤어핀 구조 올리고머에 암호화된 LacZ 유전자로부터 번역된 단백질과의 상호작용을 통해 생성된 산물에 의해 반응액의 색을 보라색(자색) 계열로 변화를 유도하기 위한 것으로, 바람직하게는 클로로페놀 레드-β-D-갈락토피라노사이드(chlorophenol red-β-D-galactopyranoside; CBRG)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 CD3ε mRNA 검출방법을 제공한다.
(a) 피검자 유래 생물학적 시료를 상기 키트에 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(b) 비색반응에 의한 반응액의 색 변화를 확인하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 체외로 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 단계 (a)에서, 생물학적 시료를 상기 키트와 반응시키기 전에, 상기 시료를 이용해 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification; NASBA) 반응을 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 신장 이식 거부반응의 지표인 CD3ε 및 IP-10 mRNA를 이용해 NASBA를 수행한 수, 반응물을 이용해 토홀드 스위치 시스템과 반응시킨 결과, 상기 시스템의 검출 민감도가 nM 단위에서 pM 단위 농도의 트리거 RNA를 검출할 수 있어 매우 민감도가 향상된 것을 확인하였다(실시예 5 참조).
상기 단계 (a)에서 반응은 2시간 내지 6시간, 바람직하게는 3 내지 5시간, 더욱 바람직하게는 4시간일 수 있으며, 이는 발현된 베타-갈락토시다아제와 상기 기질간의 반응에 의한 기질의 생성물 생산속도가 안정기에 도달하기까지의 시간을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 반응액의 색 변화는 육안으로 관찰하거나, 반응액 내 기질의 생성물인 클로로페놀 레드의 흡광도를 측정함으로써 판별할 수 있다. 육안으로 색 변화를 관찰할 때 노란색에서 자색(보라색) 계열로 변화하는 경우 CD3ε mRNA가 존재하는 것으로 판단하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험재료 및 실험방법
1-1. In silico 토홀드 스위치(Toehold Switch) 설계
본 발명에서 CD3ε 및 SARS-CoV-2 검출을 위해 제작한 토홀드 스위치는 종래 공지된 선행문헌에 개시된 디자인 체계를 기반으로 하여 설계하였다(Cell, 165, 1255-1266). 간략하게, 스위치의 토홀드 영역은 주형 RNA(CD3ε, 바이러스 E 유전자)의 연속적인 30-nt 영역에 결합하도록 설계되었다. 토홀드 부분에 대한 라이브러리는 전체 길이의 주형 RNA 서열에 걸쳐 1-nt 증분으로 생성되었다. 스위치의 다른 부분은 상기 선행문헌에 개시된 보존된 영역을 적용하였다. 최적화된 보존된 영역은 21nt 링커 영역과 함께 최상위 스템(top-stem) (5bp) 및 루프 영역 (12nt)이다.
주형 sRNA에서 생성된 후보 토홀드 영역은 BLAST를 이용해 특이성 확인을 위한 스크리닝을 수행하였다. 다음으로 설계된 토홀드 스위치가 프레임 내 정지 코돈을 회피하는지 확인하였다. 선별된 스위치는 NUPACK 분석 및 유틸리티 모듈을 계산하여 트리거 RNA와의 상호작용을 평가하였다. 동시적 결함 값과 토홀드 스위치의 2차구조 및 스위치/트리거 RNA 복합체 구조의 최소 자유 에너지(MFE)를 계산하였다.
1-2. 토홀드 스위치의 구조
토홀드 스위치의 DNA 주형은 베타-갈락토시다제(β-galactosidase) 암호화 유전자(LacZ) 및 벡터와의 후자 결찰을 위해 2개의 오버행(overhangs)을 추가하여 마크로젠(Macrogen)사에서 합성하였다. 주형은 PCR로 증폭시키고 겔 추출법으로 정제하였다. DNA 조각은 Gibson Assembly를 사용하여 LacZ 유전자와 연결하였다. PCR로 증폭시킨 산물은 총 30bp 중첩 영역이 있는 Gibson Assembly를 사용하여 LacI 및 가나마이신(Kanamycin) 내성 유전자를 포함하는 T7 기반 발현 플라스미드(pET28)에 삽입하였고, 이후 증폭 및 추가적인 추출을 위해 DH5α E. coli 균주에 상기 플라스미드를 도입하였다.
최적화된 전사를 위해, 두 트리거 RNA의 선형 DNA 주형은 PCR 산물의 5’ 말단에 T7 프로모터 서열을 추가하기 위해 지정된 프라이머 쌍을 사용하여 PCR로 제작하였다. 토홀드 스위치의 선형 DNA 서열은 다음과 같은 프라이머쌍을 이용해 PCR로 제작하였다. FWD_T7 프로모터 (5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’, 서열번호 69) 및 REV_T7 종결인자 (5’-CAAAAAACCCCTCAAGAC-3’, 서열번호 70).
다음으로, T7 RNAP 기반 전사 키트(MEGAscript® Kit, Thermo Fisher)를 사용하여 해당 DNA 주형에서 트리거 RNA 및 RNA 형태의 토홀드 스위치를 합성했다. 이어서 제조사의 프로토콜에 따라 MEGAclear™ 키트(Thermo Fisher)를 이용해 RNA를 정제하였다. RNA의 농도는 NanoDrop One 분광 광도계(Thermo Fisher)를 사용하여 확인하였고, -20℃에서 보관하였다.
1-3. 무세포 플랫폼 반응물의 제조
PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit(NEB, E6800S)를 이용해 무세포 반응물 용액을 제조하였다. 구체적으로, 용액 A에는 아미노산과 rNTP를 포함한 작은 분자와 tRNA가 포함되어 있으며, 반면에 용액 B에는 T7 RNA 중합 효소, 번역 인자, 아미노아실-tRNA 합성효소 및 에너지 재생 효소와 같은 단백질 성분 및 리보솜이 포함되어 있다. 나머지는 RNA 억제제 (20 U/30 μL 반응, NEB, Murine), 비색반응의 기질인 클로로페놀 레드-β-D-갈락토피라노사이드(chlorophenol red-β-D-galactopyranoside; CBRG, 0.6 mg/L), 토홀드 스위치의 RNA (100 nM) 및 트리거 RNA CD3ε (1 μM)을 포함하였다. 37℃에서 배양하는 동안 무세포 반응액에서 LacZ 반응으로부터 생성된 클로로페놀 레드 생성물의 최대 흡광도인 570 nm 파장에서 측정하여 흡광도가 안정기에 도달할 때까지 15분마다 비색 변화를 평가했다.
1-4. 토홀드 스위치 스크리닝
반응 동력학을 이용하여 설계된 토홀드 스위치를 스크리닝하였다. 15분 간격으로 측정한 시간 경과에 따른 무세포 반응액의 흡광도 측정 데이터는 570 nm 파장에서 NanoDrop One 분광 광도계(Thermo Fisher)로 측정하여 도출되었다. 토홀드 스위치의 스크리닝은 흡광도의 배수 변화 결과에 기반하여 수행하였다. 상대적으로 배수 변화가 크고 짧은 배양 시간에 최대 흡광도에 도달하는 스위치를 선별하였다.
1-5. 토홀드 스위치의 특이성 및 민감도 분석
토홀드 스위치의 특이성과 민감도를 확인하기 위해, 상기 실시예 1-3의 방법에 따라 무세포 반응액을 제조하고 570 nm 파장에서 240분 동안 배양한 후 반응액의 흡광도를 측정하였다.
토홀드 스위치의 특이성은 다른 RNA, 즉 IP-10 mRNA 및 18S rRNA와 같이 비-동족성 트리거 RNA를 이용하여 평가하였다. 상기 소변 내에 포함된 RNA는 RNA 합성 프로토콜에 따라 DNA 주형으로부터 합성하였으며 토홀드 스위치의 특이성을 평가하기 위해 100 nM 농도로 무세포 반응액에 추가하였다. 토홀드 스위치의 특이성은 트리거 mRNA CD3ε를 사용한 반응액의 흡광도와 IP-10 mRNA 및 18S rRNA를 각각 사용한 반응액의 흡광도를 비교하여 평가하였다.
토홀드 스위치의 민감도는 트리거 RNA CD3ε의 농도를 1000 nM에서 0.1 nM 범위로 사용하여 분석하였다. 반응액의 흡광도는 토홀드 스위치만 포함된 반응액의 흡광도와 비교하였다.
1-6. 민감도의 최적화를 위한 NASBA
NASBA 반응은 IP-10 및 CD3ε 토홀드 스위치 모두를 최적화하는데 사용하였다. NASBA 반응을 위해, 토홀드-상보성 영역 (IP-10의 경우 136-nt 영역, CD3ε의 경우 137-nt 영역)을 포함하는 RNA 앰플리콘을 NASBA 프라이머 설계를 위한 주형으로 사용하였다. 반응 버퍼(Life Sciences Advanced Technologies, NECB-24), 뉴클레오티드 믹스(Life Sciences Advanced Technologies, NECN-24), RNase 억제제(Roche), nuclease free water 및 트리거 mRNA (IP-10 또는 CD3ε)를 제조사의 프로토콜하에 4℃에서 혼합하고 65℃에서 2분 동안 배양한 다음 41℃에서 10분 동안 배양하였다. 다음으로, 효소 믹스(Life Sciences Advanced Technologies, NEC-1-24)를 반응물에 첨가하고(최종 부피 5 mL) 혼합물을 41℃에서 2시간 동안 배양하였다. NASBA 반응은 무세포 반응에 사용하기 위해 물에서 1:5의 비율로 희석하였다. IP-10 및 CD3ε는 NASBA의 효율을 평가하기 위해 100 pM, 10 pM, 1 pM 및 0.1 pM의 농도로 사용하였다.
1-7. 흡광도의 배수 변화 측정
흡광도의 배수 변화 값은 유도된 반응에서 LacZ의 생산 속도를 의미하는 색상 변화 속도의 차이를 나타낸다. 무세포 시스템 및 기질 클로로페놀 레드-β-D-갈락토피라노사이드가 흡광도에 미치는 영향을 배제하기 위해 토홀드 스위치 및 트리거 RNA를 포함하지 않는 대조군 반응액을 블랭크(blank)로 사용하였다. 배수 변화는 각 시점에서 반응액의 흡광도를 토홀드 스위치만 포함하는 대조군 반응액의 흡광도로 나누어 계산하였다. 측정 오류는 3회 반복실험의 표준 편차로부터 계산하였다.
실시예 2. 소변 내 CD3ε mRNA의 검출을 위한 토홀드 스위치 설계
도 1에 그림으로 도시된 바와 같이 토홀드 스위치는 헤어핀 구조 및 토홀드 영역을 포함하는 합성 리보스위치(riboswitch)로, 트리거 RNA와의 상보적 결합에 의해 헤어핀 구조가 열리면 리보솜이 리보솜 결합 영역에 결합하여 변역이 개시된다. 소변 RNA CD3ε의 DNA 주형에 기반하여 총 302개의 후보 토홀드 스위치를 설계 및 제작하였다. 이후 4개 이상의 연속된 동일한 뉴클레오티드 서열 패턴(AAAA, TTTT, CCCC, GGGG)이 포함된 스위치를 제거하여 145개의 토홀드 스위치 선별하였고, 다른 인간 유전자 서열과의 높은 상동성을 갖는 토홀드 스위치 및 프레임 내 정지 코돈을 갖는 토홀드 스위치를 제거하여 47개의 스위치를 선별하였다. 마지막으로 낮은 결합 값을 갖는 총 8개의 토홀드 스위치(70, 71, 72, 109, 175, 176, 291 및 297)를 선택하여 합성 및 효율성 검증을 진행하였다.
실시예 3. 토홀드 스위치의
in vitro
스크리닝
상기 실시예 2에서 선별된 8개의 토홀드 스위치를 이용하여 트리거 mRNA CD3ε의 검출능력을 비교하였다. 실험결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이 대부분의 토홀드 스위치의 시간에 대한 흡광도 변화는 240분 동안의 배양 후 LacZ 생성 속도가 느려지며 완화되는 것으로 나타났다. 또한 8개의 토홀드 스위치 중 2개의 스위치(175 및 176)만이 대조군 반응과 비교하여 도 1b에서 볼 수 있는 비색 변화의 현저한 차이를 통해 높은 LacZ 생산율을 보여주었다(각각 36배 및 10배). 또한 도 1c의 결과에서 볼 수 있는 바와 같이 두 스위치의 비색 변화를 육안으로도 구별이 가능하였다.
실시예 4. 토홀드 스위치의 특이성 및 민감도 확인
도 3은 상기 선별된 두 종류의 토홀드 스위치에 대한 특이성 분석 결과를 보여준다. 트리거 mRNA와 비-트리거 RNA 각각을 이용해 240분 동안의 배양 후 무세포 반응액의 흡광도를 측정한 결과, 175번 토홀드 스위치는 상기 두 RNA 간에 LacZ 흡광도의 배수 변화가 유의한 차이를 나타내었다(IP-10 mRNA의 경우 10배, CD3ε mRNA의 경우 36배, 및 18S rRNA의 경우 4배). 176번 토홀드 스위치도 다른 두 RNA에 비해 CD3ε mRNA에 대하여 상대적으로 높은 특이성을 보였지만 흡광도 차이는 175번에 비해 훨씬 낮게 나타났다. 따라서 175번 토홀드 스위치가 트리거 CD3ε mRNA의 검출에 가장 효과적임을 알 수 있었다.
나아가 CD3ε mRNA를 1000 nM 내지 0.1 nM 농도 범위로 이용하여 175번 토홀드 스위치의 검출 민감도를 확인해보고자 하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 각각 CD3ε mRNA를 1000 및 100 nM 농도로 이용한 경우 흡광도 값의 배수 변화가 각각 36배 및 42배로 가장 높게 나타났다. 10 nM ~ 0.1 nM 범위의 농도에서 흡광도 배수 변화는 10 미만이었지만 대조군 반응보다는 훨씬 높게 나타났다. 가시적 비색 변화 측면에서는 1000 nM 및 100 nM 농도에서 반응의 비색 변화가 육안으로 인식될 수 있는 선명한 보라색을 나타내었다. 농도 범위가 10 ~ 0.1 nM 인 경우에는 1000 nM 및 100 nM에서의 결과에 비해 비색 변화가 뚜렷하지 않은 오렌지색 계열로 나타났다.
실시예 5. 민감도 최적화를 위한 등온 증폭 NASBA
NASBA는 토홀드 스위치 1과 175 각각의 mRNA 영역에 해당하는 IP-10 및 CD3ε의 트리거 mRNA 영역에서 수행되었다. NASBA 반응은 2시간 동안 실시하였으며 산물은 무세포 플랫폼 기반 토홀드 스위치 시스템에 이용되었다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 CD3ε의 경우, NASBA로 증폭된 트리거 RNA를 이용한 반응액의 배수 변화가 비-NASBA 트리거 RNA를 이용한 경우 보다 높은 것으로 나타났으며, 검출 민감도가 10 pM까지 낮아지는 것을 확인하였다. 이것은 상기 실시예 4에서 확인한 민감도에 비해 민감도가 향상되었음을 보여준다. 또한 IP-10의 경우 NASBA 증폭 트리거 mRNA IP-10의 검출 한계가 10 pM 수준까지 감소하는 것을 확인하였다. 1 및 0.1 pM의 트리거 mRNA IP-10을 사용한 NASBA 증폭은 비-NASBA 트리거 mRNA를 이용한 것과 비교하여 LacZ 흡광도의 배수 변화에서 뚜렷한 차이를 나타내었다. 이 실험의 결과는 NASBA가 저농도의 트리거 RNA 검출을 위한 시스템의 감도를 최적화하기 위해 무세포 플랫폼 기반 토홀드 스위치 시스템에 결합하여 수행될 수 있는 가능성을 보여주었다.
실시예 6. SARS-CoV-2 검출용 토홀드 스위치 설계를 위한 토홀드 스위치 설계 접근법의 적용
본 발명자들은 토홀드 스위치 설계를 통해 다양한 RNA의 검출에 광범위하게 적용 가능함을 확인하였다. 구체적으로, 상기 설계 방법을 이용해 SARS-CoV-2 검출용 토홀드 스위치를 제작하고자 하였다, 상기 바이러스의 검출을 위해 SARS-CoV-2 게놈 (NC_045512.2)에서 바이러스 E 유전자의 서열을 토홀드 스위치 디자인의 주형으로 이용하였다. 결과적으로 바이러스 E 유전자를 기반으로 하여 총 199개의 후보 토홀드 도메인을 설계하였다. 상기 후보군에서 4개 이상의 연속적인 동일한 뉴클레오티드, 예컨대 AAAA, TTTT, CCCC, GGGG의 서열 패턴을 포함하는 토홀드 도메인을 제거하여 112개의 토홀드 도메인을 선별하였고, 이어서 BLAST를 사용하여 특이성을 테스트하였는데, 이때에는 제거되는 토홀드 도메인이 없었다. 토홀드 스위치 디자인은 상기 실시예 1-2에 기재한 보존된 영역을 추가하여 완료한 다음 프레임 내 정지 코돈을 포함하지 않는 토홀드 스위치를 선별하였으며, 결과적으로 100개의 스위치가 선별되었다. 이어서 상기 선별된 토홀드 스위치에 대하여 바이러스 E 유전자를 갖는 복합체 구조에 대한 결함 값을 계산했다. 결과적으로, 결함 값이 낮은 (< 20 %) 60개의 토홀드 스위치를 도출하였다. 상기 도출된 토홀드 스위치에 대하여 높은 역학, 특이도 및 민감도를 분석하여 효율적인 스위치를 추가로 선별할 수 있다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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<120> Kit for detecting biomarker using toehold switch system and
detection method thereof
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<213> Artificial Sequence
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aggtacgtta aacctggcgg cagcgcaaaa g 91
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<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Toehold switches_SARS-CoV-2_27
<400> 30
agaagtacgc tattaactat taacgtacct ggactttaga acagaggaga taaagatgag 60
gtacgttaat aacctggcgg cagcgcaaaa g 91
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<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Toehold switches_SARS-CoV-2_28
<400> 31
aagaagtacg ctattaacta ttaacgtacc ggactttaga acagaggaga taaagatggg 60
tacgttaata aacctggcgg cagcgcaaaa g 91
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<213> Artificial Sequence
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tggtattctt aacctggcgg cagcgcaaaa g 91
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<213> Artificial Sequence
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gatggctagt gtaactagca agaataccac ggactttaga acagaggaga taaagatggt 60
ggtattcttg aacctggcgg cagcgcaaaa g 91
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<223> Toehold switches_SARS-CoV-2_76
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cttgctagtt aacctggcgg cagcgcaaaa g 91
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<223> Toehold switches_SARS-CoV-2_120
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cgtactgctg aacctggcgg cagcgcaaaa g 91
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<220>
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<400> 55
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<220>
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<400> 57
aagactcacg ttaacaatat tgcagcagta ggactttaga acagaggaga taaagatgta 60
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<400> 58
caagactcac gttaacaata ttgcagcagt ggactttaga acagaggaga taaagatgac 60
tgctgcaata aacctggcgg cagcgcaaaa g 91
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<400> 59
acaagactca cgttaacaat attgcagcag ggactttaga acagaggaga taaagatgct 60
gctgcaatat aacctggcgg cagcgcaaaa g 91
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tacaagactc acgttaacaa tattgcagca ggactttaga acagaggaga taaagatgtg 60
ctgcaatatt aacctggcgg cagcgcaaaa g 91
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<220>
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<400> 61
agatcaggaa ctctagaaga attcagattt ggactttaga acagaggaga taaagatgaa 60
atctgaattc aacctggcgg cagcgcaaaa g 91
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<220>
<223> Toehold switches_SARS-CoV-2_190
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aagatcagga actctagaag aattcagatt ggactttaga acagaggaga taaagatgaa 60
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<223> Toehold switches_SARS-CoV-2_191
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gaagatcagg aactctagaa gaattcagat ggactttaga acagaggaga taaagatgat 60
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Toehold switches_SARS-CoV-2_192
<400> 64
agaagatcag gaactctaga agaattcaga ggactttaga acagaggaga taaagatgtc 60
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<212> DNA
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<223> Toehold switches_SARS-CoV-2_193
<400> 65
cagaagatca ggaactctag aagaattcag ggactttaga acagaggaga taaagatgct 60
gaattcttct aacctggcgg cagcgcaaaa g 91
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<211> 91
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Toehold switches_SARS-CoV-2_196
<400> 66
gaccagaaga tcaggaactc tagaagaatt ggactttaga acagaggaga taaagatgaa 60
ttcttctaga aacctggcgg cagcgcaaaa g 91
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<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Toehold switches_SARS-CoV-2_197
<400> 67
agaccagaag atcaggaact ctagaagaat ggactttaga acagaggaga taaagatgat 60
tcttctagag aacctggcgg cagcgcaaaa g 91
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<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Toehold switches_SARS-CoV-2_199
<400> 68
ttagaccaga agatcaggaa ctctagaaga ggactttaga acagaggaga taaagatgtc 60
ttctagagtt aacctggcgg cagcgcaaaa g 91
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FWD_T7_promoter
<400> 69
taatacgact cactataggg 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> REV_T7_terminator
<400> 70
caaaaaaccc ctcaagac 18
Claims (12)
- 토홀드 영역(Toehold region), 이중가닥 핵산서열1, 루프서열1, 이중가닥 핵산서열2, 루프서열2, 링커서열 및 발현 핵산서열을 포함하는 헤어핀 구조 올리고머;
무세포(Cell-free) 반응액; 및
기질을 포함하는, CD3ε 검출용 키트로서,
상기 헤어핀 구조 올리고머는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 것이며,
상기 발현 핵산서열은 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase; LacZ)를 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 검출용 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 토홀드 영역은 CD3ε mRNA에 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 무세포 반응액은 아미노산, rNTP, tRNA, RNA 중합효소, 번역 인자, 아미노아실-tRNA 합성효소(aminoacyl-tRNA synthetase) 및 리보솜을 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 기질은 클로로페놀 레드-β-D-갈락토피라노사이드(chlorophenol red-β-D-galactopyranoside; CPRG)인 것을 특징으로 하는, 키트.
- 하기의 단계를 포함하는, CD3ε의 검출방법:
(a) 피검자 유래 생물학적 시료를 제1항의 키트에 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(b) 비색반응에 의한 반응액의 색 변화를 확인하는 단계.
- 제8항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 검출방법.
- 제8항에 있어서,
상기 단계 (a)에서 생물학적 시료를 상기 키트와 반응시키기 전에, 상기 시료를 이용해 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification; NASBA) 반응을 수행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 검출방법.
- 제8항에 있어서,
상기 단계 (a)에서 반응은 2 내지 6시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는, 검출방법.
- 제8항에 있어서,
상기 단계 (b)에서, 반응액의 색이 노란색에서 자색으로 변화하는 경우 CD3ε가 존재하는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 검출방법.
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020200110561A KR102570655B1 (ko) | 2020-08-31 | 2020-08-31 | 토홀드 스위치 시스템을 이용한 생물학적 지표 검출용 키트 및 검출방법 |
Publications (2)
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| KR102570655B1 true KR102570655B1 (ko) | 2023-08-23 |
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|---|---|
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2015085209A1 (en) | 2013-12-06 | 2015-06-11 | President And Fellows Of Harvard College | Paper-based synthetic gene networks |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102277068B1 (ko) * | 2019-05-31 | 2021-07-14 | 경희대학교 산학협력단 | 급성 신장 이식 거부 반응 진단용 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트 |
-
2020
- 2020-08-31 KR KR1020200110561A patent/KR102570655B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015085209A1 (en) | 2013-12-06 | 2015-06-11 | President And Fellows Of Harvard College | Paper-based synthetic gene networks |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Clin Chim Acta,510:619-624. (2020.08.27.) |
| Immunol Rev,258(1):218-40. (2014.02.11.)* |
| MEDRXIV PREPRINT DOI: HTTPS://DOI.ORG/10.1101/2020.07.28.20164004* |
| Nat Commun,9(1):3347. (2018.12.31.)* |
Also Published As
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