CN113355399A - 一种基于crispr系统及胶体金检测条的冠状病毒核酸快速检测方法及其应用 - Google Patents

一种基于crispr系统及胶体金检测条的冠状病毒核酸快速检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR的冠状病毒核酸检测方法及其应用；该方法针对病毒的全基因组设计特异性引物对，能够进行多位点逆转录扩增，然后利用CRISPR系统进行剪切反应，最后透过胶体金检测条判读结果。将CRISPR系统与胶体金快速诊断试纸条技术结合的意义在于兼顾免疫胶体金试纸条直观、快速、方便、成熟、廉价等优点，以及CRISPR技术检测的高灵敏度、高特异性等特点，两种技术的结合利于快速且精准的检测；除此之外，独特的全基因组检测适用于潜伏期、发病期和恢复期的传染性监控，为病毒检测提供最佳检测法。并根据此方法设计开发相应的检测试剂盒。

Description

一种基于CRISPR系统及胶体金检测条的冠状病毒核酸快速检 测方法及其应用
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种基于CRISPR蛋白和胶体金检测条的冠状病毒核酸检测方法及应用。
背景技术
新冠状病毒(SARS-CoV-2)导致以呼吸系统为主、累及全身多个系统损害的综合性疾病(CoVID-19)近期引发空前社会震荡，已成为当前我国甚至全人类公共卫生的主要威胁和负担，新冠状病毒感染后部分病人迅速引起的炎症因子风暴和急性呼吸窘迫综合症是其致死的主要机制，严重威胁人类生命健康。因此，对SARS-CoV-2及其所致疾病的早期检测与诊断、病理机理和靶向防治策略与技术、病情转归与预后、公共卫生预防方针与政策等各个方面的研究研发已刻不容缓。关于新冠状病毒的流行病学和临床症状的资讯可以参考以下文献，这些文献皆引入本文作为参考：
Lu R,Zhao X,Li J,Niu P,Yang B,Wu H,et al.Genomic characterisation andepidemiology of 2019novel coronavirus:implications for virus origins andreceptor binding.Lancet.2020.
Chen N,Zhou M,Dong X,Qu J,Gong F,Han Y,et al.Epidemiological andclinical characteristics of 99cases of 2019novel coronavirus pneumonia inWuhan,China:a descriptive study.Lancet.2020.
Chang,Lin M,Wei L,Xie L,Zhu G,Dela Cruz CS,et al.Epidemiologic andClinical Characteristics of Novel Coronavirus Infections Involving 13PatientsOutside Wuhan,China.JAMA.2020.
Zhu N,Zhang D,Wang W,Li X,Yang B,Song J,et al.A Novel Coronavirusfrom Patients with Pneumonia in China,2019.N Engl J Med.2020.
Huang C,Wang Y,Li X,Ren L,Zhao J,Hu Y,et al.Clinical features ofpatients infected with 2019novel coronavirus in Wuhan,China.Lancet.2020.
Chan JF,Yuan S,Kok KH,To KK,Chu H,Yang J,et al.A familial cluster ofpneumonia associated with the 2019novel coronavirus indicating person-to-person transmission:a study of a family cluster.Lancet.2020.
Li Q,Guan X,Wu P,Wang X,Zhou L,Tong Y,et al.Early TransmissionDynamics in Wuhan,China,of Novel Coronavirus-Infected Pneumonia.N Engl JMed.2020.
Phan LT,Nguyen TV,Luong QC,Nguyen TV,Nguyen HT,Le HQ,etal.Importation and Human-to-Human Transmission of a Novel Coronavirus inVietnam.N Engl J Med.2020.
Munster VJ,Koopmans M,van Doremalen N,van Riel D,and de Wit E.A NovelCoronavirus Emerging in China-Key Questions for Impact Assessment.N Engl JMed.2020.
Giovanetti M,Benvenuto D,Angeletti S,and Ciccozzi M.The first twocases of 2019-nCoV in Italy:where they come from？J Med Virol.2020.
与SARS病毒相似，SARS-CoV-2为正链、单链RNA病毒，通过其表面的棘蛋白(Spike)与人体细胞的血管紧张素转化酶2(Angiotensin converting enzyme 2,ACE2)进入宿主细胞，在宿主的细胞胞浆内，依靠RNA依赖性RNA酶(RdRp)，以其正链、单链RNA为模版并充当信使RNA的功能，从而进行病毒组蛋白的转译。肺脏，尤其是肺泡细胞表达大量ACE2，所以肺炎特别是重症肺炎是SARS-CoV-2感染的突出症状。关于新冠状病毒的病理机制可以参考以下文献，这些文献皆引入本文作为参考：
Wu F,Zhao S,Yu B,Chen YM,Wang W,Song ZG,et al.A new coronavirusassociated with human respiratory disease in China.Nature.2020.
Zhou P,Yang XL,Wang XG,Hu B,Zhang L,Zhang W,et al.A pneumoniaoutbreak associated with a new coronavirus of probable batorigin.Nature.2020.
Fehr AR,and Perlman S.Coronaviruses:an overview of their replicationand pathogenesis.Methods Mol Biol.2015；1282:1-23.
Perlman S.Another Decade,Another Coronavirus.N Engl J Med.2020.
在新冠状病毒肺炎疫情发生后，中国和世界的科学家迅速完成了病毒的测序掌握了病毒的基因组信息，为开发新型、敏感的诊治技术提供了依据和基础。SARS-CoV-2的核苷酸序列大约30kb，为大型RNA病毒，拥有315个蛋白(图1)，其中编码病毒复制的RNA聚合酶和入侵细胞的表面棘蛋白序列被认为是其中最为关键的序列。关于新冠状病毒的基因组信息可以参考以下文献，这些文献皆引入本文作为参考：
Holshue ML,DeBolt C,Lindquist S,Lofy KH,Wiesman J,Bruce H,et al.FirstCase of 2019Novel Coronavirus in the United States.N Engl J Med.2020.
Ceraolo C,and Giorgi FM.Genomic variance of the 2019-nCoVcoronavirus.J Med Virol.2020.
Chu DKW,Pan Y,Cheng SMS,Hui KPY,Krishnan P,Liu Y,et al.MolecularDiagnosis of a Novel Coronavirus(2019-nCoV)Causing an Outbreak ofPneumonia.Clin Chem.2020.
从公共数据库GSAID可下载到88个SARS-CoV-2病毒完整序列，对这些序列进行比对，构建进化树，进化树相似扁平状，显示这些样本高度相似，系同一来源的病毒(图2)。
SARS-CoV-2病毒及其引发的CoVID-19肺炎是全新的，属于典型烈性，高传染性传染病，会在超短时间内产生大量病人，早期诊断和发现和隔离是最有效的控制手段，所以对快速，简便，仪器设备依赖性小的病原学诊断方法尤其重要。最近有多家单位推出的SARS-CoV-2病毒IgM快速检测试剂盒，并被国家批准进入临床诊断，但是抗体出现相对滞后，且有部分人免疫反应低下，筛选不到处于窗口期的病人，有其局限性。
目前主要依靠逆转录PCR进行SARS-CoV-2的核酸检测与诊断，该方法针对病毒基因组的单个位点进行信号捕捉和放大，在临床实践中频繁出现了大量的病毒核酸假阴性的病人，说明目前的核酸检测方法敏感性不够，出现大量的假阴性，导致2020年2月12日武汉正式开始应用CT作为临床诊断。但归根结底病原学的检测依然十分必要，因而还需开发更敏感的检测技术与方法。
核酸检测出现假阴性的一个重要的因素是病毒RNA在体外不稳定，容易分解，使得本来相对低的病毒核酸信号无法捕捉。因此，从病毒基因组多个位点甚至全基因组进行高效逆转录放大和测定，有望显著提高其敏感性。
重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)为一种可于恒温下反应之核酸扩增技术，由Piepenburg等人(2006)发表于国际期刊PLoS Biology，并在英国TwistDx Inc公司完成配套技术开发。相较于PCR动辄需120分钟以上的反应时间，RPA在37～42℃下，反应30分钟即完成核酸扩增，并且通过将多种引物同时添加到同一反应管中，单次RPA测试即可扩增和检测多种不同的靶标，再配合使用側層流分析法(lateralflow assay，LFA)之分析试纸，即可直接目测判读，且其灵敏度与qPCR相差无几，相当适合用于进行疾病快速筛检。
成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspacedshortpalindromic repeats，CRISPR)及其关联蛋白9(CRISPR-associated proteins 9，Cas9)构成一种适应性分子免疫系统，最早是细菌用来抵抗病毒感染的机制，现在由CRISPR/Cas9系统改造而成的CRISPR/Cas9技术已成为一种强大的基因编辑工具，由位点特异性DNA核酸内切酶(site-specific DNA endonuclease)Cas9和引导RNA(guide RNA，gRNA)组成，gRNA能够以序列依赖性的方式特异性地引导Cas9内切核酸酶，因此被广泛应用于基因功能研究，基因修饰与治疗；除了作为基因编辑工具，基于该系统的“靶向切割”特性，CRISPR/Cas9已被开发成一种快速、低成本且高灵敏的核酸检测工具，在核酸分子诊断领域具有重要的应用潜力。以往，研究人员已经使用CRISPR/Cas9系统切割双链DNA病毒的核酸，但并未有记载CRISPR/Cas9系统被用于RNA病毒核酸的切割。
胶体金快速诊断试纸条技术是20世纪90年代以来发展起来的一项新型体外诊断技术，是一种将已知抗原或抗体用胶体金进行标记再通过抗原抗体特异性结合反应使得胶体金集聚形成肉眼可见的形式，从而达到对待测物进行快速简便、迅速且准确的检测目标物的技术。该项技术是在单克隆抗体制备技术和胶体金标记技术的基础上建立的，其融合了免疫亲和技术、印记技术与层析技术等几项技术。近年来该方法发展迅速，由于该技术有方便快捷、特异敏感、稳定性强、保存时间长、除商品试剂外不需要任何仪器设备或其他试剂、结果判断直观可用肉眼观察等优点在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用。
将CRISPR/Cas9系统与胶体金快速诊断试纸条技术结合，以特异性引物扩增适当长度的目的片段，然后进行CRISPR/Cas9切割反应，最后试纸条可视化判读结果。此结合意义在于具有免疫胶体金试纸条直观、快速、方便、成熟、廉价等优点，又具备CRISPR/Cas9技术检测的高灵敏度、高特异性等特点。两种技术的结合为现场检测提供最佳检测法，具有简便、快速、特异、敏感、稳定等特点，利于及时诊断。因此，该检测方法具有广阔应用前景。
发明内容
本发明的目的在于克服现有RNA病毒核酸检测技术存在的缺陷和不足，提供一种基于CRISPR系统和胶体金测试条的检测方法和相应的检测试剂盒。该方法针对病毒的全基因组设计特异性引物对，能够对病毒核酸进行多位点逆转录扩增，具有简便、快速、特异、敏感、稳定等特点。
由于新冠肺炎病毒的受体及其表达具有较严格的种属特异性和组织倾向性，目前还缺少合适的细胞和动物模型，制约着对其所致疾病的病理机理的阐释，也限制了药物或其他治疗诊断技术乃至疫苗的研发进程。同时，由于该病毒是全新和致命性病毒，过早地直接研究活病毒会构成生物安全性潜在隐患，亟需一种能够不直接接触病毒又有效的研究策略、平台与方法。
为了实现上述目的，本发明提出充分发挥SARS-CoV-2病毒RNA序列公共数据和生物信息技术优势从而避免直接使用病毒病源体或病毒材料，应用前沿的CRISPR蛋白结合和切断核酸大分子的功能原理，开发出针对新冠肺炎的新型诊治技术，专注于从核酸水平早期检测、阻断和消灭病毒，并利用所建立的细胞、组织和动物疾病模型检测评价。
由于SARS-CoV-2病毒同SARS病毒等同属于冠状病毒，序列有约80％同源，使用同样或相似的受体进入人类细胞，其症状和传播方式也类似，本发明所建立的诊治平台和技术，也将对包括SRAS病毒和未来潜在的RNA冠状病毒的防治技术的开发具有重要价值。
本发明提供一种基于CRISPR系统的冠状病毒快速检测方法，该方法包括下列步骤：
步骤一：以病毒核酸为模板，利用特异性引物对扩增目标片段，得到扩增产物；
步骤二：将步骤一中所得扩增产物加入CRISPR系统，在特异性引导RNA介导下进行切割反应，得到包含核酸标记物的切割产物；
步骤三：将步骤二中所得切割产物直接用胶体金检测条进行检测；
上述特异性引物对针对冠状病毒的全基因组，能够进行多位点逆转录扩增。
优选地，上述冠状病毒为新冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)。
优选地，步骤二CRISPR系统中的CRISPR关联蛋白(Cas)可以是Cas9或Cas13。
优选地，上述特异性引物对包括SEQ ID NO.1～104。
更优选地，上述特异性引物对为SEQ ID NO.103～104。
优选地，上述特异性引导RNA包括SEQ ID NO.105～1205。
更优选地，上述特异性引导RNA为SEQ ID NO.1205。
在一些实施方案中，上述目标片段的扩增技术包括：传统聚合酶链式反应(tPCR)、定量PCR(qPCR)、数字PCR(dPCR)、核酸依赖性扩增检测技术(NASBA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、依赖解旋酶DNA恒温扩增技术(HDA)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)。
进一步地，上述目标片段的5’端标记异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基荧光素(FAM)，或生物素(Biotin)。
其次，本发明提供针前述检测方法所设计的引物对，该引物对能够通过基于PCR的技术对目标片段进行扩增。
优选地，上述引物对包括SEQ ID NO.1～104。
更优选地，上述特异性引物对为SEQ ID NO.103～104。
优选地，上述引物对可通过等温逆转录扩增技术来扩增目标片段。
更优选地，上述引物对可通过重组酶聚合酶扩增技术(RPA)来扩增目标片段。
在另一实施方案中，本发明提供针对前述检测方法所设计的引导RNA，该引导RNA能够引导Cas9/gRNA或Cas13/gRNA复合物靶向目标核酸序列。
优选地，上述引导RNA包括SEQ ID NO.105～1205。
更优选地，上述特异性引导RNA为SEQ ID NO.1205。
在另一实施方案中，本发明提供根据前述基于CRISPR/Cas9或CRISPR/Cas13的检测方法在制备病毒核酸检测试剂中的应用。
优选地，上述病毒为单链RNA病毒。
更优选地，上述单链RNA病毒为新冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)。
在另一实施方案中，本发明提供一种用于新冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)核酸检测的组合物，该组合物包括前述的引物对。
优选地，上述组合物包含前述的引导RNA。
在另一实施方案中，本发明提供一种基于试纸条的用于新冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)核酸检测的试剂盒，该试剂盒包含上述组合物。
优选地，上述试纸条为胶体金检测条。
本说明书中使用的术语“引物”表示寡核苷酸，优选为单链的脱氧核糖核苷酸，包括天然(naturally occurring)dNMP(dAMP、dGMP、dCMP和dTMP)、变形核苷酸或非天然核苷酸，此外，还可以包含核糖核苷酸。
本发明中利用的引物包含与靶核酸的目标位置互补的杂交核苷酸序列。术语“互补”的含义是指，在杂交条件下引物或探针与靶核酸序列选择性地进行杂交的充分互补，具有将实质上互补(substantially complementary)和完全互补(perfectlycomplementary)全部包括在内的含义，优选地为完全互补。本说明书中使用的术语“实质上互补的序列”不仅包括完全一致的序列，也包括能够在特定靶序列上发挥引物作用且与作为比较对象的序列有部分不一致的序列。
引物的序列不需要具有与模板的一部分序列完全互补的序列，只要在能够与模板杂交从而发挥其固有作用的范围内具有充分的互补性即可。因此，本发明中的引物不需要具有与作为模板的上述核苷酸序列完全互补的序列，只要在能够与模板杂交从而发挥其固有作用的范围内具有充分的互补性即可。引物的设计为本领域技术人员所掌握的技能，例如可以利用引物设计用程序。
本发明中目标片段的扩增的方法可以利用本领域公知的方法进行，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、核酸依赖性扩增检测技术(NASBA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、依赖解旋酶DNA恒温扩增技术(HDA)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)。
本发明的试剂盒中，除了上述引物对和引导RNA之外，还可以追加含有用于逆转录反应、试样的RNA分离和CRISPR系统的反应等本领域公知的工具和/或试剂。本发明的试剂盒可以根据需要追加含有用于各成分的混合的管、微孔板、试纸条和记载使用方法的指示资料等。
有益效果
本项目专注快速检测与诊断，基于前期工作基础，利用常温核酸快速扩增技术，用特殊修饰的核转录酶，设计并验证高效特异性引物对，在全病毒基因组水平筛选和优化gRNA的组合和特殊修饰核苷酸底物，用胶体金标记技术予以显色，制作胶体金标记SARS-CoV2检测条，可在30分钟左右得到结果；并可以开展病毒全基因组多点或全基因组的检测，大大提高检测的敏感性。胶体金层析技术快速简便、准确，结果直观、而且试剂和样品用量极少，无需仪器设备，简化了繁琐的常规操作过程，同时也减小了因操作引起的误差，特别适合CoVID-19接触的大量人群和居家隔离病人的初筛。同时，本项目基于CRISPR剪切和胶体金技术的检测，还可与荧光检测、PCR检测、乃至IgM抗体检测等相结合起来，实现复杂多场景的更为精准的早期检测与诊断。此外，本项目创新特色还体现于：
1.充分利用生物信息学及基因重组技术，研究全程无需活病毒。
2.独特的全基因组检测和应用原理，可期在未来所有潜在RNA病毒感染中推广应用。
3.超高敏感病毒核酸检测技术，适用于潜伏期、发病期和恢复期的传染性监控。
附图说明
图1：SARS-CoV-2病毒序列和蛋白编码区示意图。
图2：迄今所发现的SARS-CoV病毒序列进化聚类分析。
图3：胶体金检测组成和工作原理。
图4：SARS-CoV-2病毒全基因组胶体金快速检测原理及流程。
图5：SARS-CoV-2全基因组序列比对。(5a)5’-end MSA。(5b)Middle MSA。(5c)3’-end MSA。
图6：第一个扩增子区内5个引导RNA的分布。
图7：SARS-CoV-2病毒编码RdRp片段。
图8：Cas9-gRNA复合物体外切断病毒重组RdRp片段的RNA序列。(8a)SARS-CoV-2病毒编码RNA酶的核心序列确定和反转录引物设计。(8b)SARS-CoV-2病毒编码RNA酶的核心833bp具体序列。(8c)反转录引物序列和引导RNA序列。(8d)SARS-CoV-2病毒编码RNA酶的反转录PCR产物示意图和CRISPR蛋白可能作用位点，提示可以进行病毒全基因组检测。(8e)CRISPR/Cas9-gRNA复合物切割逆转录产物，可以在10％聚丙烯酰胺电泳显示为3个条带。(8f)CRISPR/Cas9-gRNA复合物切割逆转录产物，透过胶体金试纸显影。
具体实施方式
本发明提出在等温条件下，用优化引物高效逆转录将病毒RNA序列合成为cDNA，然后直接用以DNA为底物的CRISPR蛋白捕捉，最后以胶体金显影，省去体外转录这一步，简化步骤，提高检测的可重复性，同时缩短检测时间。其次在全病毒基因组水平，筛选和寻找高效的gRNA组合，设计高效套叠引物组合进行病毒基因组多位点高效检测，可望显著提高诊断的敏感性和特异性，本发明专注快速检测与诊断，基于前期工作基础，利用常温核酸快速扩增技术，在全病毒基因组水平筛选和优化gRNA的组合和特殊修饰核苷酸底物，用胶体金标记技术予以显色，制作胶体金标记SARS-CoV-2检测条，可快速实现检测结果，并针对病毒全基因组多点检测，提高检测的敏感性(图4)。同时这个基本技术还可以同荧光检测，PCR检测等相结合，适合于复杂场景下的更准确诊断。
具体而言，本发明提供的方案包含以下三个步骤：
步骤一：利用特异性引物对进行逆转录聚合酶扩增，捕捉并放大SARS-CoV-2病毒序列的RNA。
步骤二：将步骤一中所得的扩增产物加入CRISPR/CRISPR关联蛋白系统，在特异性引导RNA介导下，CRISPR-CRISPR关联蛋白捕捉切割目标RNA序列信号得到包含蛋白标记FAM的切割产物。
步骤三：将步骤二中所得切割产物用胶体金检测条进行检测，胶体金捕捉蛋白标记FAM信号并显影。
上述特异性引物对针对新冠状肺炎病毒的全基因组，能够进行多位点逆转录扩增。
来自病人的样品病毒RNA提取方法可使用罗氏MagNA Pure 96 system，或者美国疾病控制中心推荐的标准方法等本领域公知的分离试样中RNA的方法。
某些实施方案中，步骤一的特异性引物对选自SEQ ID NO.1～104，如引物对SEQID NO.103和104。
某些实施方案中，步骤二的特异性引导RNA选自SEQ ID NO.105～1205，如引导RNASEQ ID NO.1205。
本发明中目标片段SARS-CoV-2病毒序列的RNA的扩增的方法可以利用本领域公知的方法进行，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、核酸依赖性扩增检测技术(NASBA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、依赖解旋酶DNA恒温扩增技术(HDA)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)。
进一步地，上述目标片段SARS-CoV-2病毒序列的RNA的5’端标记异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基荧光素(FAM)，或生物素(Biotin)。
其中，步骤二所述的CRISPR关联蛋白可以是Cas9或Cas13等；相应的所述gRNA可以设计成与CRISPR关联蛋白匹配的引导RNA，如Cas9匹配的引导RNA或Cas13匹配的引导RNA。当使用非平末端双链DNA断裂的CRISPR核酸酶时，可通过末端加工如延伸补齐等，使切割产物成为平末端，以便连接；或使用与CRISPR核酸酶产生的序列已知的粘性末端匹配的接头DNA将切割产物连接起来。
另外，本发明设计了上述检测方法所适用的引物对，该引物对能够通过基于PCR的技术对目标片段进行扩增。该引物对包括SEQ ID NO.1～104。
优选地，上述引物对可通过等温逆转录扩增技术来扩增目标片段。
更优选地，上述引物对可通过重组酶聚合酶扩增技术(RPA)来扩增目标片段。
本发明还针对上述引物对设计了引导RNA，该引导RNA能够引导Cas9/gRNA或Cas13/gRNA复合物靶向所述目标核酸序列。
优选地，上述引导RNA包括SEQ ID NO.105～1205。
在另一实施方案中，本发明提供了上述检测方法在制备病毒核酸检测试剂中的应用。
优选地，上述病毒为单链RNA病毒。
更优选地，上述单链RNA病毒为新冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)。
在另一实施方案中，本发明提供一种用于新冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)核酸检测的组合物，该组合物包括前述的引物对。
优选地，上述组合物包含前述的引导RNA。
在另一实施方案中，本发明提供一种基于试纸条的用于新冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)核酸检测的试剂盒，该试剂盒包含上述组合物。上述胶体金检测系统使用一种特殊的多孔膜—硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)作为固相蛋白载体，其反应可在数分钟内完成。该膜具有很强的蛋白吸附功能，抗-目标蛋白抗体蛋白吸附于NC膜并经干燥处理后即作为固相，可与液相中的相应病毒核酸序列快速结合。而在湿润状态下，液相中含有的被CRISPR蛋白切割病毒核酸序列的样本可因毛细现象作快速定向泳动，CRISPR蛋白特异性切割后释放的FAM、生物素或任何其他可检测的标记物与固相中相应的抗体形成复合物；结合物载体上预先喷点的结合有胶体金(作为显色和指示剂)的相应第二抗体亦可与该复合物快速结合。由于毛细作用复合物沿线条向前移动，移动至检测线处，复合物被抗标记物的单克隆抗体捕获形成单克隆抗体夹心复合物，呈现出一条条带；阴性样本则不会形成夹心物，无条带(如图4所示)。
应用胶体金标记，待CRISPR/Cas9特异性切割病毒RNA后释放标记物，基于胶体金层析(Lateral Flow Immuno-Assay)原理及相关免疫诊断技术，检测对多位点RNA同时切段的信号，实现一个反应体系中完成全部反应，合成SARS-CoV2病毒快速检测试剂盒。在不需要任何仪器设备的情况下，实现大样本人群和各种场景的现场初筛，克服目前病毒基因组单点检测的短板，也可避免病人抗体检测的滞后性。
本发明所建立的诊治平台和技术，也可以用于包括SRAS病毒和未来潜在的RNA冠状病毒，只需针对相应的病毒设计对应的特定引物对和引导RNA。
下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求限定的范围内。
实施例1体外构建SARS-CoV-2全基因组RNA序列片段文库
利用生物信息学技术根据现有的已发表病毒全基因组序列(共计88个)确定一致性序列，病毒为大约30Kb核苷酸，为大RNA正链RNA病毒。按从病毒5’开始，建构大小约在1000bp的覆盖SARS-CoV2全基因组的RNA序列片段文库，建立编码该片段的T7启动子调控的gBlock DNA序列，在转录酶(Lucigen，30223-1)的作用下进行体外转录并提纯，产生约30个RNA，其序列跟病毒一致。重点区域如病毒的RNA依赖性RNA酶(RdRp)和刺蛋白(SPIKE，人病毒受体ACE-2配体)区域，在CRIPSR识别位点适当进行重叠设计，总文库含有50个RNA序列。
具体地，在美国IDT公司订购含有T7启动子的gBlock DNA序列，并按下述组装反应体系，在37℃进行体外转录1小时，生成含病毒序列的RNA，并去除DNA模版和提纯RNA(Qiagen)。
反应物 体积(微升)
DNA模版(50ng) 1
10x体外转录缓冲液 4
10mM ATP 1
10mM CTP 1
10mM GTP 1
10mM UTP 1
100mM DTT 2
10单位T7RNA聚合酶 2
无RNA酶水 7
总计 20
实施例2SARS-CoV-2全基因组RNA转录及切段
2.1等温逆转录引物设计
在所报道的88个病毒组序列中，除两端大约200bp因为序列不完整或者测序错误有较大差异，大部分位点达到99％以上的保守性(图5)，5a为5’-end MSA，5b为Middle MSA，5c为3’-end MSA。极个别单个样本的差别可能是真实的突变，也可能是测序错误造成的。
其中，一致性序列在220-29570bp进行常温逆转录扩增扩增引物的设计参数已确定：
Amplicon size:80-200,preferred 150
Primer size:28-36,preferred 32
GC:20-70％,preferred 45％
Tm:54-67℃,preferred 60℃,max diff 6
polymer<5
最终共选取20个扩增子，每个扩增子有2-5对RPA引物，总计53组引物(表一)，可以组合形成4到25种组合进行同步扩增，起到指数倍放大原始信号的作用，最大限度的缩短了反应时间。
2.2引导RNA(gRNA)设计
针对每个RPA扩增子目标去，为了获取尽可能多的引导RNA(guide RNA，gRNA)，我们采用tiling设计，即扩增子目标区的内均匀分布，每35bp选取一个19bp(cas9)或20bp(cas9)的引导RNA(见图6)，共设计1110个gRNA(SEQ ID NO.105～1205)。
2.3重组酶聚合酶扩增(RPA)
RPA试剂盒购自TwistDx公司(
Figure BDA0002400799140000161
Basic kit，TABAS03KIT)，并在赛默飞订购Cas9-gRNA复合体，按下表组装等温逆转录扩增反应体系，于42℃反应25分钟，引物对的选择参考表一的分组，可同时使用多个组别的引物对。
反应物 体积(微升)
待测样品 1
逆转录酶(100,000U/mL) 0.2
CRISPR蛋白 2
常温逆转录缓冲液 5.9
常温逆转录正链引物(10uM) 0.5
常温逆转录反链引物(10uM) 0.5
引导RNA组合 1
CRISPR蛋白切割缓冲液(400mM Tris,pH 7.4) 2
胶体金显色底物(20uM) 1
RNAase抑制剂 1
脱氧核糖核苷酸 0.8
MgCl<sub>2</sub>(120mM) 1
MgAc 2.5
ddH<sub>2</sub>O 10.6
共计 30
实施例3胶体金检测条快速检测SARS-CoV-2病毒
胶体金检测条的特异性抗体(抗-FAM单克隆抗体)以条带状固定在膜上(检测线)，胶体金标记试剂吸附在结合垫子(金垫)。当待测样品滴加到试纸条一端的样品垫上后，样本中含有被CRISPR蛋白切割的病毒核酸序列和特异切割病毒RNA后释放的FAM，由于试纸的层析作用，向吸水纸方向层析，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，移动至固定的第二抗体(抗-FAM单克隆抗体)的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，当测试线处聚集了一定量的复合物时，可通过肉眼观察到显色结果。质控线布下结合素，可以报告胶体金是否正常和层析方向的正确(图3)。
阴性结果：测试线不显色，质控线显黑色；
阳性结果：测试线和质控线均显黑色；
无效：不论测试线显色与否，质控线不显色。
实施例4用Cas9/gRNA切割RdRp基因
按图7所示选取SARS-CoV-2病毒编码的RNA依赖性RNA酶(RdRp)关键序列SEQ IDNO.1206进行试验(图8b)。
直接从IDT公司订购DNA序列，以此DNA为模版按前述条件进行体外转录成RNA，再以此RNA样本为模版按前述条件进行逆转录反应，引物对设计如图8(a)所示，使用逆转录正链引物(SEQ ID NO.105)：GGATCAAGATGCACTTTTCGCATATACAAAAC，反链引物(SEQ IDNO.104)：AACATTTTGCTTCAGACATAAAAACATTGTTTTGATAATAAA。所得的产物DNA用从赛默飞(Thermofisher)定制的Cas9-gRNA复合物处理，引导RNA识别序列为(SEQ ID NO.1205)：TGAGTGAAATGGTCATGTG(图8c)，反转录PCR产物和CRISPR蛋白可能作用位点如图8(d)所示。逆转录反应与CRISPR反应体系按实施例2的表格组装。
用SDS垂直电泳显影，结果如图8(e)所示，在逆转录DNA产物条带外出现2条条带，说明切割成功。同时在商品化胶体金检测条(Mil enia Biotec GmbH，MGHD 1)上显影，结果如图8(f)所示。
表一、新冠肺炎病毒全基因组逆转录引物一览
Figure BDA0002400799140000201
Figure BDA0002400799140000211
Figure BDA0002400799140000221
Figure BDA0002400799140000231
Figure BDA0002400799140000241
序列表
<110> 杭州赫林生物医药有限公司
<120> 一种基于CRISPR系统及胶体金检测条的冠状病毒核酸快速检测方法及其应用
<160> 1206
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttatcaaca cacttaacga tctaaatgaa ac 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttagaagaag aagtaagata accattatac gc 32
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tatcaacaca cttaacgatc taaatgaaac tc 32
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cttcaggtgt tttagaagaa gaagtaagat aa 32
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaatttcaat tttgtaatga tccatttttg gg 32
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttcttaaaca caaattccct aagatttttg aa 32
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttttgtaatg atccattttt gggtgtttat ta 32
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ataaccatca atattcttaa acacaaattc cc 32
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaagtgcctt ttacattcta ccatctatta tc 32
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cctcttgtat tttaataccc ttatatttac gc 32
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gccttttaca ttctaccatc tattatctct aa 32
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acaccctctt gtattttaat acccttatat tt 32
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
attctaccat ctattatctc taatgagaag ca 32
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cacaccctct tgtattttaa tacccttata tt 32
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
catggaaaac aagtagtgtc agatatagat ta 32
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tccagaggtt ataagtatca aattgtttgt aa 32
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tggaaaacaa gtagtgtcag atatagatta tg 32
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gaggttataa gtatcaaatt gtttgtaaac cc 32
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtgtcagata tagattatgt accactaaag tc 32
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aggttataag tatcaaattg tttgtaaacc ca 32
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgtcagatat agattatgta ccactaaagt ct 32
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggttataagt atcaaattgt ttgtaaaccc ac 32
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acgttaatag ttaatagcgt acttcttttt ct 32
<210> 24
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gatcaggaac tctagaagaa ttcagatttt ta 32
<210> 25
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cgttaatagt taatagcgta cttctttttc tt 32
<210> 26
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tcaggaactc tagaagaatt cagattttta ac 32
<210> 27
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ttaatagtta atagcgtact tctttttctt gc 32
<210> 28
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ctagaagaat tcagattttt aacacgagag ta 32
<210> 29
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
taatagttaa tagcgtactt ctttttcttg ct 32
<210> 30
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tagaagaatt cagattttta acacgagagt aa 32
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
caaattacat attttggagg aatacaaatc ca 32
<210> 32
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
actctgttgt tttctctaat tataagtcta cc 32
<210> 33
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
caattcagtt gtcttcctat tctttatttg ac 32
<210> 34
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ctctgttgtt ttctctaatt ataagtctac ct 32
<210> 35
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ttgtcttcct attctttatt tgacatgagt aa 32
<210> 36
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
acaactctgt tgttttctct aattataagt ct 32
<210> 37
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tgtcttccta ttctttattt gacatgagta aa 32
<210> 38
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ttaacaagaa catcactaga aataacaact ct 32
<210> 39
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
taaagaggaa gttaagccat ttataactga aa 32
<210> 40
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tataaagtaa caagttttct gtgaggaact ta 32
<210> 41
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
aggaagttaa gccatttata actgaaagta aa 32
<210> 42
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
caatataaag taacaagttt tctgtgagga ac 32
<210> 43
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tcatcatctg aagcattttt aattggatgt aa 32
<210> 44
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ttactcatgt caaataaaga ataggaagac aa 32
<210> 45
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tttttaattg gatgtaatta tcttggcaaa cc 32
<210> 46
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
aattcattga acggtataaa ttagaaggct at 32
<210> 47
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ttaactgtac tgtccatagg aataaaatct tc 32
<210> 48
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
acatatcgtt tatggagatt ttagtcatag tc 32
<210> 49
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gaaatagttt ttaactgtac tgtccatagg aa 32
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
catatcgttt atggagattt tagtcatagt ca 32
<210> 51
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
aaatagtttt taactgtact gtccatagga at 32
<210> 52
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ccttttctct atctttatgc tttagtctac tt 32
<210> 53
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gtatacaata gtcgtaacaa ttagtatgcc ag 32
<210> 54
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
taaactttgt aagaataata atgaggcttt gg 32
<210> 55
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tgaagtaatg acaattgaag aagttacact at 32
<210> 56
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ttatgaatgt cttgacactc gtttataaag tt 32
<210> 57
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
tattaccagt tatgaagaaa atagggcaat ac 32
<210> 58
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ttataatctc tgttacttct aactactcag gt 32
<210> 59
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
tataatctct gttacttcta actactcagg tg 32
<210> 60
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gtattaccag ttatgaagaa aatagggcaa ta 32
<210> 61
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
aaacatgact tctttaagtt tagaatagac gg 32
<210> 62
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
ttgtatgtga caagtatttc ttttaatgtg tc 32
<210> 63
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
catatatcac gtcaacgtct tactaaatac ac 32
<210> 64
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
aatatatctg ggttttctac aaaatcatac ca 32
<210> 65
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gatcaattta aacacctcat accacttatg ta 32
<210> 66
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
attttcacaa aatacttcat agatgtcaac tc 32
<210> 67
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
tataaagatt gtacaaatgt taagtgacac ac 32
<210> 68
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ttcacaaaat acttcataga tgtcaactca aa 32
<210> 69
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
agaaacattt tacccaaaat tacaatctag tc 32
<210> 70
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
taattttgaa ggtcacactt ttctaatagc at 32
<210> 71
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
gaaacatttt acccaaaatt acaatctagt ca 32
<210> 72
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
cataattttg aaggtcacac ttttctaata gc 32
<210> 73
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
aacattttac ccaaaattac aatctagtca ag 32
<210> 74
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
accataattt tgaaggtcac acttttctaa ta 32
<210> 75
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
gtattgccct attttcttca taactggtaa ta 32
<210> 76
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gtagaaacta agtaatcata aacaccaaga gt 32
<210> 77
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
acttcagtgt ataatgctag tttattgttt ct 32
<210> 78
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
taatcataaa caccaagagt cagtctaaag ta 32
<210> 79
<211> 32
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1156
cttgccatgt tgagtgagag 20
<210> 1157
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1157
gaagacctta aattccctcg 20
<210> 1158
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1158
cttgtcctcg agggaattta 20
<210> 1159
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1159
ggactgctat tggtgttaat 20
<210> 1160
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1160
agcagtccag atgaccaaat 20
<210> 1161
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1161
ctcttcggta gtagccaatt 20
<210> 1162
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1162
agagctacca gacgaattcg 20
<210> 1163
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1163
gtcaccacca cgaattcgtc 20
<210> 1164
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1164
tgaaagatct cagtccaaga 20
<210> 1165
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1165
tatttctact acctaggaac 20
<210> 1166
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1166
cagcttctgg cccagttcct 20
<210> 1167
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1167
ccagaagctg gacttcccta 20
<210> 1168
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1168
gccgtctttg ttagcaccat 20
<210> 1169
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1169
ctaacaaaga cggcatcata 20
<210> 1170
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1170
aatacaccaa aagatcacat 20
<210> 1171
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1171
cgggtgccaa tgtgatcttt 20
<210> 1172
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1172
acgattgcag cattgttagc 20
<210> 1173
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1173
atcgtgctac aacttcctca 20
<210> 1174
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1174
ccaaaaggct tctacgcaga 20
<210> 1175
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1175
ccttctgcgt agaagccttt 20
<210> 1176
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1176
actgttgcga ctacgtgatg 20
<210> 1177
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1177
agttcaagaa attcaactcc 20
<210> 1178
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1178
gaagttcccc tactgctgcc 20
<210> 1179
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1179
gggaacttct cctgctagaa 20
<210> 1180
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1180
ccattgccag ccattctagc 20
<210> 1181
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1181
cagacatttt gctctcaagc 20
<210> 1182
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1182
cagcttgaga gcaaaatgtc 20
<210> 1183
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1183
cagatttctt agtgacagtt 20
<210> 1184
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1184
cactaagaaa tctgctgctg 20
<210> 1185
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1185
tgttacattg tatgctttag 20
<210> 1186
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1186
tacaatgtaa cacaagcttt 20
<210> 1187
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1187
cgtggtccag aacaaaccca 20
<210> 1188
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1188
aaatttcctt gggtttgttc 20
<210> 1189
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1189
gaccaggaac taatcagaca 20
<210> 1190
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1190
ttccttgtct gattagttcc 20
<210> 1191
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1191
cccagcgctt cagcgttctt 20
<210> 1192
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1192
tccgaagaac gctgaagcgc 20
<210> 1193
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1193
tggcatggaa gtcacacctt 20
<210> 1194
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1194
taggtcaacc acgttcccga 20
<210> 1195
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1195
ctacacaggt gccatcaaat 20
<210> 1196
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1196
atctttgtca tccaatttga 20
<210> 1197
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1197
atgacttgat ctttgaaatt 20
<210> 1198
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1198
cccaccaaca gagcctaaaa 20
<210> 1199
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1199
ttcttctttt tgtccttttt 20
<210> 1200
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1200
tgctgtttct tctgtctctg 20
<210> 1201
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1201
tcttcttcct gctgcagatt 20
<210> 1202
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1202
aaatcatcca aatctgcagc 20
<210> 1203
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1203
agttgagtca gcactgctca 20
<210> 1204
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1204
gagcagtgct gactcaactc 20
<210> 1205
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1205
tgagtgaaat ggtcatgtg 19
<210> 1206
<211> 833
<212> DNA
<213> Betacoronavirus
<400> 1206
ggatcaagat gcacttttcg catatacaaa acgtaatgtc atccctacta taactcaaat 60
gaatcttaag tatgccatta gtgcaaagaa tagagctcgc accgtagctg gtgtctctat 120
ctgtagtact atgaccaata gacagtttca tcaaaaatta ttgaaatcaa tagccgccac 180
tagaggagct actgtagtaa ttggaacaag caaattctat ggtggttggc acaacatgtt 240
aaaaactgtt tatagtgatg tagaaaaccc tcaccttatg ggttgggatt atcctaaatg 300
tgatagagcc atgcctaaca tgcttagaat tatggcctca cttgttcttg ctcgcaaaca 360
tacaacgtgt tgtagcttgt cacaccgttt ctatagatta gctaatgagt gtgctcaagt 420
attgagtgaa atggtcatgt gtggcggttc actatatgtt aaaccaggtg gaacctcatc 480
aggagatgcc acaactgctt atgctaatag tgtttttaac atttgtcaag ctgtcacggc 540
caatgttaat gcacttttat ctactgatgg taacaaaatt gccgataagt atgtccgcaa 600
tttacaacac agactttatg agtgtctcta tagaaataga gatgttgaca cagactttgt 660
gaatgagttt tacgcatatt tgcgtaaaca tttctcaatg atgatactct ctgacgatgc 720
tgttgtgtgt ttcaatagca cttatgcatc tcaaggtcta gtggctagca taaagaactt 780
taagtcagtt ctttattatc aaaacaatgt ttttatgtct gaagcaaaat gtt 833

Claims (24)

1.一种基于CRISPR系统的冠状病毒快速检测方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
步骤一：以病毒核酸为模板，利用特异性引物对扩增目标片段,得到扩增产物；
步骤二：将步骤一中所得扩增产物加入CRISPR系统，在特异性引导RNA介导下进行切割反应，得到包含核酸标记物的切割产物；
步骤三：将步骤二中所得切割产物直接用胶体金检测条进行检测；所述特异性引物对针对冠状病毒的全基因组，能够进行多位点逆转录扩增。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述冠状病毒为新冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述CRISPR系統的CRISPR关联蛋白是Cas9或Cas13。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述特异性引物选自SEQ ID NO.1～104。
5.权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述特异性引物对为SEQ ID NO.103～104。
6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述特异性引导RNA选自SEQ IDNO.105～1205。
7.权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述特异性引导RNA为SEQ ID NO.1205。
8.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述目标片段的扩增技术包括：传统聚合酶链式反应(tPCR)、定量PCR(qPCR)、数字PCR(dPCR)、核酸依赖性扩增检测技术(NASBA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、依赖解旋酶DNA恒温扩增技术(HDA)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述目标片段的5’端标记异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基荧光素(FAM)，或生物素(Biotin)。
10.针对权利要求1-3所述的检测方法所设计的引物对，所述引物对能够通过基于PCR的技术对所述目标片段进行扩增。
11.根据权利要求10所述的引物对，其特征在于，所述引物对包括SEQ ID NO.1～104。
12.根据权利要求11所述的引物对，其特征在于，所述引物对为SEQ ID NO.103～104。
13.根据权利要求12所述的引物对，其特征在于，所述引物对可通过等温逆转录扩增技术来扩增目标片段。
14.根据权利要求13所述的引物对，其特征在于，所述引物对可通过重组酶聚合酶扩增技术(RPA)来扩增目标片段。
15.针对权利要求1-3所述的检测方法所设计的引导RNA，所述引导RNA能够引导Cas9/gRNA或Cas13/gRNA复合物靶向所述目标核酸序列。
16.根据权利要求15所述的引导RNA，其特征在于，所述引导RNA包括SEQ ID NO.105～1205。
17.根据权利要求16所述的引导RNA，其特征在于，所述引导RNA为SEQ ID NO.1205。
18.根据权利要求1-3所述基于CRISPR/Cas9或CRISPR/Cas13的检测方法在制备病毒核酸检测试剂中的应用。
19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述病毒为单链RNA病毒。
20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述单链RNA病毒为新冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)。
21.一种用于新冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)核酸检测的组合物，其特征在于，包括权利要求10所述的引物对。
22.根据权利要求16所述的组合物，其特征在于，包括权利要求15所述的引导RNA。
23.一种基于试纸条的用于新冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)核酸检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求22所述的组合物。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其特征在于，所述试纸条为胶体金检测条。
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