CN111254227B

CN111254227B - 检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组及其制备方法、用途

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Publication number: CN111254227B
Application number: CN202010341753.4A
Authority: CN
Inventors: 董长贵; 张珮琢; 王婷飞; 杜永华; 胡燕
Original assignee: Shanghai Genepharma Co Ltd
Current assignee: Shanghai Genepharma Co Ltd
Priority date: 2020-04-27
Filing date: 2020-04-27
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2040-04-27
Also published as: CN111254227A

Abstract

本发明公开了一种检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的FISH探针组，包括以S基因为靶标的第一荧光探针组、以E基因为靶标的第二荧光探针组、以M基因为靶标的第三荧光探针组、以ORF 3a基因为靶标的第四荧光探针组、以N基因为靶标的第五荧光探针组，和以ORF 1ab基因为靶标的第六荧光探针组中的至少两种荧光探针组；至少两种荧光探针组中，至少一种荧光探针组标记的荧光分子具有区别于其余的荧光探针组的荧光发射光谱。FISH探针组具有高的特异性和灵敏度，能够实现对待测样品中SARS‑CoV‑2定位检出，获得SARS‑CoV‑2的分布与相对定量情况，是对新型冠状病毒核酸检测的有效补充。

Description

检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组及其制备方法、用途

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组、体系、芯片及其制备方法、用途。

背景技术

新型冠状病毒肺炎（CoronaVirusDisease2019，COVID-19）简称新冠肺炎，指由2019新型冠状病毒感染(SARS-CoV-2)导致的肺炎。新型冠状病毒肺炎临床表现以发热、乏力、干咳为主要表现，鼻塞、流涕等上呼吸道症状少见。约半数患者多在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒征休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。部分患者起病症状轻微，可无发热，多在1周后恢复；多数患者预后良好，部分患者病情危重，甚至死亡。

SARS-CoV-2属于冠状病毒科β属，其基因特征与引起严重急性呼吸综合征(SARS)的SARS-CoV，以及引起中东呼吸综合征( MERS)的MERS-CoV都存在明显区别。目前研究显示SARS-CoV-2与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性为85%以上。体外分离培养时，SARS-CoV-2在96h左右即可在人呼吸道上皮细胞内发现。新型冠状病毒肺炎的传染性高、症状较为隐匿。目前，新型冠状病毒肺炎已在全世界爆发，对人类生命健康和社会经济的发展带来严重冲击，引起国际社会的高度重视。

检测SARS-CoV-2有多种方法，病原学检测方法（即通过体外培养分离病毒）费时较长，分离阳性率不高，而且生物安全性要求很高，不便于推广。血清学方法需等待患者出现特异性抗体，检测窗口期等待期较长，难以对病毒感染进行早期诊断。实时荧光RT-PCR检测新型冠状肺炎病毒是目前确诊阳性患者的主要标准，但基于PCR技术的检测方法存在一定的漏检率，准确率不同公司差异较大约50～80%，而且以上几种方法均无法对病毒在组织细胞中进行相对定量与定位。目前迫切需要开发新的诊断方法，以协助提高病原体检测的敏感性和特异性，特别是如何原位显示病毒分布对于疾病诊断及研究有着重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的基于PCR技术的检测方法存在一定的漏检率及无法对病毒在组织细胞中进行相对定量与定位。目前迫切需要开发新的检测与诊断方法，特别是需要一种能够原位显示新冠病毒在感染组织细胞中分布与相对定量关系，以便能够帮助及时准确了解病毒时空分布，有助于针对该病毒诊断与分子机制研究。

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）与 SARS-CoV 和 MERS-CoV 病毒类似，SARS-CoV-2（2019-nCoV）的基因组也分为非结构基因和结构基因两个部分。其中约占 SARS-CoV-2 全基因组总长度三分之二的非结构基因含有两段编码蛋白质的序列，称为 ORF1a 和 ORF1b。而紧随其后的结构基因区域则编码 S 蛋白、orf3a 蛋白、E 蛋白、M蛋白、orf6蛋白、orf7a蛋白、orf8蛋白、N蛋白等结构蛋白。

为此，本发明提供如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组，包括以S基因为靶标的第一荧光探针组、以E基因为靶标的第二荧光探针组、以M基因为靶标的第三荧光探针组、以ORF 3a基因为靶标的第四荧光探针组、以N基因为靶标的第五荧光探针组，和以ORF 1ab基因为靶标的第六荧光探针组中的至少两种荧光探针组；

所述至少两种荧光探针组中，至少一种荧光探针组标记的荧光分子具有区别于其余所述的荧光探针组的荧光发射光谱。

可选地，上述的检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组，

所述第一荧光探针组靶向结合所述SARS-CoV-2基因组的第25278位、第24173位、第25285位、第24173位和第23639位的核苷酸，所述第二荧光探针组靶向结合所述SARS-CoV-2基因组的第26329位、第26301位、第26266位和第26309位的核苷酸，所述第三荧光探针组靶向结合所述SARS-CoV-2基因组的第26971位、26619、27054和第26983位的核苷酸，所述第四荧光探针组靶向结合所述SARS-CoV-2基因组的第25508位、第26189位、第25904位和第25514位的核苷酸，所述第五荧光探针组靶向结合所述SARS-CoV-2基因组的第28311位、第28792位、第28439位、第28474位和第28822位的核苷酸，所述第六荧光探针组靶向结合所述SARS-CoV-2基因组的第1413位、第2092位、第2130位、第1452位、第822位、第1172位、第1238位和第956位的核苷酸。

可选地，上述的检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组，

所述第一荧光探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.5所示的DNA探针；所述第二荧光探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6- SEQ ID NO.9所示的DNA探针；所述第三荧光探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.10- SEQ ID NO.13所示的DNA探针；所述第四荧光探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.14- SEQ ID NO.17所示的DNA探针；所述第五荧光探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.18- SEQ ID NO.22所示的DNA探针；所述第六荧光探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.23- SEQ ID NO.30所示的DNA探针；或者，

所述第一荧光探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.33- SEQ ID NO.37所示的RNA探针；所述第二荧光探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.38- SEQ ID NO.41所示的RNA探针；所述第三荧光探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.42- SEQ ID NO.45所示的RNA探针；所述第四荧光探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.46- SEQ ID NO.49所示的RNA探针；所述第五荧光探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.50- SEQ ID NO.54所示的RNA探针；所述第六荧光探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.55- SEQ ID NO.62所示的RNA探针；

优选地，所述DNA探针为单链DNA探针。

进一步可选地，上述的检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组，所述DNA探针或所述RNA探针中的至少一个核苷酸为LNA修饰的核苷酸；

优选地，所述DNA探针中的LNA修饰的核苷酸选自LNA修饰的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸，和LNA修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸中的至少一种；

优选地，所述RNA探针中的LNA修饰的核苷酸选自LNA修饰的尿嘧啶核糖核苷酸，和LNA修饰的腺嘌呤核糖核苷酸中的至少一种。

可选地，上述的检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组，所述荧光探针组标记的荧光分子选自FAM、CY3、ROX、JOE、HEX、CY5、TET和TAMRA中的至少两种；

优选地，所述第一荧光探针组标记的荧光分子为CY3，所述第二荧光探针组、所述第三荧光探针组、所述第四荧光探针组、所述第五荧光探针组和所述第六荧光探针组标记的荧光分子为FAM。

可选地，上述的检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组，还包括：阳性探针组和阴性探针组，所述阳性探针组包括基于人18s rRNA设计的DNA探针；所述阳性探针组和所述阴性探针组标记有所述荧光探针组标记的至少一种荧光分子；

优选地，所述阳性探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示的DNA探针，所述阴性探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示的DNA探针；

优选地，所述阳性探针组和所述阴性探针组标记的荧光分子为CY3。

第二方面，本发明提供了一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH体系，所述荧光原位杂交体系包括上述的FISH探针组；

优选地，所述FISH体系中，任一单链DNA探针的浓度为0.1-10μM；

优选地，所述FISH体系中，所述FISH探针组的浓度为5μM。

第三方面，本发明提供了一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH芯片，包括上述的FISH探针组，或上述的FISH体系。

上述的FISH探针组、上述的FISH体系，或者上述的FISH芯片在制备用于检测新型冠状病毒肺炎的试剂和/或试剂盒中的用途。

可选地，上述的用途，所述试剂和/或试剂盒检测的生物样本为细胞样本和/或组织样本。

第四方面，本发明提供了一种上述的FISH探针组的制备方法，包括如下步骤：

S1，设计与S基因序列互补的第一荧光探针组的探针序列，与E基因序列互补的第二荧光探针组的探针序列，与M基因序列互补的第三荧光探针组的探针序列、与ORF 3a基因序列互补的第四荧光探针组的探针序列，与N基因序列互补的第五荧光探针组，和与ORF1ab基因序列互补的第六荧光探针组中的至少两种荧光探针组；

S2，对所述第一荧光探针组、所述第二荧光探针组、所述第三荧光探针组、所述第四荧光探针组、所述第五荧光探针组和所述第六荧光探针组的探针序列进行优化后，合成DNA探针；

S3，在所述DNA探针上标记荧光分子，并使相同荧光探针组的DNA探针标记同一荧光分子，且至少一组荧光探针组标记的荧光分子与其余所述荧光探针组具有不同的荧光发射光谱；

S4，混合标记有至少两种荧光分子的至少两组荧光探针组的DNA探针，即为所述检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组；

优选地，所述步骤S4还包括：混合标记有至少两种荧光分子的至少两组荧光探针组的DNA探针，将所述DNA探针变性，得到单链DNA探针，即为所述检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组。

本发明技术方案，具有如下优点：

作为第一方面，本发明提供的检测SARS-CoV-2的FISH探针组，是基于SARS-CoV-2的蛋白编码区基因设计，能够特异性靶向SARS-CoV-2基因组中S基因、E基因、M基因、ORF 3a基因、N基因和ORF 1ab基因中的至少两种基因，其中至少一种荧光探针组标记的荧光分子区别于其余的荧光探针组，从而实现对至少两种基因的区别显色定位。当以上述的FISH探针组检测待测样品（细胞涂片、组织切片、染色体制片等）时，荧光探针能够靶向目标基因，与目标基因的碱基序列发生互补配对，使靶标基因在杂交位置处发出特征荧光，实现对SARS-CoV-2病毒核酸的定位、定性和定量检测。FISH探针组标记有至少两种不同荧光发射光谱的荧光分子，例如，发出绿色荧光的荧光分子，和发出红色荧光的荧光分子。当靶向至少两种基因的FISH探针组与待测的细胞样品或组织样品孵育，若待测样品中含有SARS-CoV-2的完整RNA，与荧光探针杂交配对后的待测样品中同时呈现红色荧光与绿色荧光，且两中荧光出现重合，且结果判定为SARS-CoV-2阳性；若待测样品中含有SARS-CoV-2的不完整RNA，与荧光探针杂交配对后的待测样品中出现相对分离或部分重合的红色荧光与绿色荧光，也可判定为SARS-CoV-2阳性。若待测样品与FISH探针组孵育后仅呈现一种荧光，则结果判定为疑似，需重新采样进行检测。若待测样品与FISH探针组杂交孵育后，在细胞或组织样品中未检测到荧光，则判定为SARS-CoV-2阴性。

利用上述的FISH探针组能够实施对新型冠状病毒肺炎的荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）检测，在保持细胞、组织完整性的同时能够实现对SARS-CoV-2病毒核酸的定位检测，是对SARS-CoV-2病毒核酸基因检测的有效补充。以FISH探针组实施新型冠状病毒肺炎的感染检测具有灵敏度高、特异性强、检测周期短，以及定位准确的优点，能够弥补现有荧光定量PCR检测受PCR抑制因素的影响存在一定漏检率的缺陷。本发明提供的为FISH探针组SARS-CoV-2的早期诊断提供有效的诊断信息，具有一定的临床应用价值，有利于改善目前世界范围内存在的NCP检测能力不足的现状，以实现NCP感染的“早发现、早报告、早隔离、早治疗”，遏制病情的蔓延。此外，利用上述FISH探针组对NCP阳性患者标本的病毒核酸基因组进行定位研究，及时准确了解病毒时空分布，为SARS-CoV-2的病毒感染、治病机理等的研究提供重要信息，促进对SARS-CoV-2的病原体实施精准的科学防控，以及针对NCP的临床治疗药物、疫苗的研发。

进一步地，本发明提供了第一荧光探针组~第六荧光探针组中DNA探针的核苷酸序列，上述核苷酸序列分别基于SARS-CoV-2基因组的S基因、E基因、M基因、ORF 3a基因、N基因和ORF 1ab基因的特定碱基位点设计，并对探针序列中特定位置的核苷酸进行锁核酸(locked nucleic acid,LNA)修饰，以对探针序列进行优化，提高探针的稳定性和特异性，降低荧光检测信噪比。上述序列优化的FISH探针能够实现对SARS-CoV-2病毒基因组的特异性结合，避免与人基因组序列以及其他呼吸道病原体核酸的非特异性结合，以降低对SARS-CoV-2病毒检测的假阳性结果，提高病毒核酸检测的准确率。同时，FISH探针的稳定性高，检测重复性好。

进一步地，本发明还提供了阳性探针组和阴性探针组，以阳性探针组的荧光显色结果判断待测样品的核酸质量能否满足荧光原位杂交的质量要求，以阴性探针组的荧光显色结果辅助判定SARS-CoV-2病毒核酸检测是否为阴性结果。若检测前待测样品与阳性探针组杂交孵育后，呈现荧光显示，而与阴性探针组杂交孵育后无荧光活呈现弱荧光，说明待测样品核酸满足FISH的杂交要求。若待测样品经检测后，与第一荧光探针组~第六荧光探针组的杂交显色结果同与阴性探针组的显色结果保持一致，说明结果呈阴性。

作为第二方面，本发明提供的FISH体系、FISH芯片能够实现对SARS-CoV-2病毒核酸的荧光定位检测，且具有特异性强、灵敏度高、检测周期短等优势，是对新型冠状病毒肺炎诊断的有效补充，具有重要的临床应用价值，有利于遏制新型冠状病毒肺炎的传播蔓延。

进一步地，本发明对FISH体系中探针浓度进行优化，使FISH体系的多条探针能够在同一体系中实现与待测样品中核酸序列的杂交互补，使检测结果覆盖多种基因的荧光定位显色。

作为第三方面，本发明提供的FISH探针组的制备方法，为上述具有高灵敏度和特异性的FISH探针组提供了有效的实施手段。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1显示实施例1中FISH探针组对待测样品进行SARS-CoV-2检测时的结果判定过程；

图2a-图2d 显示实验例1中以FISH探针组中的第一~第六荧光探针组对SARS-CoV-2阳性细胞的核酸检测结果；

图3a-图3c显示实验例1中以FISH探针组中的阳性探针组对SARS-CoV-2阳性细胞的核酸检测结果；

图4a-图4c显示实验例1中以FISH探针组中的阴性探针组对SARS-CoV-2阳性细胞的核酸检测结果；

图5a-图5c显示以FISH探针组中第一~第六荧光探针组对未感染SARS-CoV-2的A293T阴性样品的核酸检测结果；

图6a-图6c显示以FISH探针组中第一~第六荧光探针组对未感染SARS-CoV-2的A549阴性样品的核酸检测结果。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

下述实施例中使用的实验试剂均为常规实验试剂，可由市场直接获得；下述实验例中293T细胞、A549细胞获取于上海生科院细胞库。

实施例1

选择序列相对保守的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）基因组（Genebank登记号MN988668.1）为模板。

本实施例提供一种检测SARS-CoV-2的FISH探针组，包括：

1）第一荧光探针组，以S基因为靶标，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1- SEQID NO.5所述的DNA探针；2）第二荧光探针组，以E基因为靶标，包括核苷酸序列分别如SEQID NO.6- SEQ ID NO.9所示的DNA探针；3）第三荧光探针组，以M基因为靶标，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10- SEQ ID NO.13所示的DNA探针；4）第四荧光探针组，以ORF 3a基因为靶标，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14- SEQ ID NO.17所示的DNA探针；5）第五荧光探针组，以N基因为靶标，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.18- SEQ ID NO.22所示的DNA探针；6）第六荧光探针组，以ORF 1ab基因为靶标，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.30所示的DNA探针。7）阳性探针组，基于人18s rRNA设计，其核苷酸序列如SEQID NO.31所示。8）阴性探针组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示荧光。其中，第一荧光探针组的DNA探针5’端标记红色荧光分子CY3，第二-第六荧光探针组的DNA探针5’端标记绿色荧光分子FAM。FISH探针组中DNA探针选择SARS-CoV-2病毒基因组的保守碱基位点设计，以提高探针特异性，具体对应SARS-CoV-2的基因组位置信息以及荧光标记信息如下表1所示：

表1

进一步地，对FISH探针组的每条DNA探针进行序列修饰，对DNA探针中特定位置的核苷酸进行LNA修饰，LNA修饰的核苷酸位置如表2所示，其中位于“+” 3'的核苷酸为LNA修饰的核苷酸。具体地，下述DNA探针中LNA修饰的核苷酸包括LNA修饰的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸，和LNA修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸。

表2

上述的FISH探针组中的第一~第六荧光探针组分别以SARS-CoV-2基因组中S基因、E基因、M基因、ORF 3a基因、N基因和ORF 1ab基因为靶标基因，能够实现与SARS-CoV-2基因组序列中上述序列的杂交配对。由于第一荧光探针组的DNA探针在5'端标记荧光分子CY3，第二-第六荧光探针组的DNA探针在5'端标记荧光分子FAM，FISH探针组的DNA探针与感染有SARS-CoV-2的阳性样本孵育后，第一~第六荧光探针组的DNA探针分别与上述基因位点进行识别配对，使杂交位点处显现出绿色和红色荧光，从而实现对SARS-CoV-2病毒核酸的定位、定性和定量检测。图1显示以上述FISH探针组对待测样品进行检测时的结果判定过程：若待测样品中含有SARS-CoV-2的完整RNA，两者孵育后待测样品中同时呈现红色荧光与绿色荧光，且两种荧光出现重合，结果判定为SARS-CoV-2阳性；若待测样品中含有SARS-CoV-2的不完整RNA，两者孵育后待测样品中出现相对分离或部分重合的红色荧光与绿色荧光，也可判定为SARS-CoV-2阳性。若待测样品与FISH探针组孵育后仅呈现一种荧光，则结果判定为疑似，需重新采样进行检测。若待测样品与FISH探针组杂交孵育后，在细胞或组织样品中未检测到荧光，或与阴性探针组的显色结果一致，则判定为SARS-CoV-2阴性。

利用上述的FISH探针组能够实施对新型冠状病毒肺炎的荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）检测，在保持细胞、组织完整性的同时能够实现对SARS-CoV-2病毒核酸的定位检测，是对SARS-CoV-2病毒核酸基因检测的有效补充。以FISH探针组实施新型冠状病毒肺炎的感染检测具有灵敏度高、特异性强、检测周期短，以及定位准确的优点，能够弥补现有荧光定量PCR检测受PCR抑制因素的影响存在一定漏检率的缺陷。有利于实现NCP感染的“早发现、早报告、早隔离、早治疗”，遏制病情的蔓延。同时能够为SARS-CoV-2的病原体实施精准的科学防控，以及针对NCP的临床治疗药物、疫苗的研发提供有效的病毒定位诊断信息。

作为一种替换的实施方式，FISH探针组还可以是上述的第一荧光探针组、第二荧光探针组和第六荧光探针组，或者第一荧光探针组、第二荧光探针组等等的组合，只要FISH探针组中至少包含具有两种不同荧光分子标记的能够同时靶向2种基因的荧光探针组即可。

作为一种替换的实施方式，FISH探针组的DNA探针上标记的荧光分子还可以选择ROX、JOE、HEX、CY5、TET、TAMRA等等。

作为一种替换的实施方式，第一-第六荧光探针组可以仅包含一种核苷酸序列的DNA探针。

实施例2

本实施例提供一种FISH探针组，包括：1）第一荧光探针组，以S基因为靶标，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.33- SEQ ID NO.37所述的RNA探针；2）第二荧光探针组，以E基因为靶标，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.38- SEQ ID NO.41所示的RNA探针；3）第三荧光探针组，以M基因为靶标，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.42- SEQ ID NO.45所示的RNA探针；4）第四荧光探针组，以ORF 3a基因为靶标，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.46-SEQ ID NO.49所示的RNA探针；5）第五荧光探针组，以N基因为靶标，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.50- SEQ ID NO.54所示的RNA探针；6）第六荧光探针组，以ORF 1ab基因为靶标，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.55- SEQ ID NO.62所示的RNA探针。7）阳性探针组，基于人18s rRNA设计，其核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示。8）阴性探针组，其核苷酸序列如SEQID NO.32所示荧光。其中，第一荧光探针组的RNA探针5’端标记红色荧光分子CY3，第二-第六荧光探针组的RNA探针5’端标记绿色荧光分子FAM。

进一步地，对RNA探针的探针序列进行LNA修饰，修饰位置同实施例1中的DNA探针位置。RNA探针中LNA修饰的核苷酸具体包括LNA修饰的尿嘧啶核糖核苷酸，和LNA修饰的腺嘌呤核糖核苷酸。通过LNA修饰，进一步提高FISH探针组的特异性和检测稳定性，提高对SARS-CoV-2病毒核酸检测的准确性和重复性。

上述FISH探针组以RNA探针作为荧光原位杂交的检测探针，同样能够靶向SARS-CoV-2的病毒基因组，与SARS-CoV-2的基因序列杂交配对，引入特征荧光，实现对细胞或组织样品中SARS-CoV-2的病毒核酸的特异性检测，同时能够显示SARS-CoV-2的病毒核酸分布定位情况，实现对对SARS-CoV-2病毒核酸基因检测的有效补充。

实施例3

本实施例提供实施例1中FISH探针组的制备方法，包括如下步骤：

S1，设计与S基因序列互补的第一荧光探针组的探针序列，与E基因序列互补的第二荧光探针组的探针序列，与M基因序列互补的第三荧光探针组的探针序列、与ORF 3a基因序列互补的第四荧光探针组的探针序列，与N基因序列互补的第五荧光探针组，和与ORF1ab基因序列互补的第六荧光探针组中的至少两种荧光探针组。

S2，对第一荧光探针组、第二荧光探针组、第三荧光探针组、第四荧光探针组、第五荧光探针组和第六荧光探针组的探针序列进行优化后，合成DNA探针；其中，序列优化包括选定SARS-CoV-2的S基因、E基因、N基因、ORF 1ab基因、ORF 3a基因保守性高的碱基位点设计探针序列，以提高DNA探针的特异性；并对DNA探针中特定位置处的核苷酸进行LNA修饰，以提高DNA探针的稳定性。

其中，第一荧光探针组靶向结合SARS-CoV-2基因组的第25278位、第24173位、第25285位、第24173位和第23639位的核苷酸，第二荧光探针组靶向结合SARS-CoV-2基因组的第26329位、第26301位、第26266位和第26309位的核苷酸，第三荧光探针组靶向结合SARS-CoV-2基因组的第26971位、26619、27054和第26983位的核苷酸，第四荧光探针组靶向结合SARS-CoV-2基因组的第25508位、第26189位、第25904位和第25514位的核苷酸，第五荧光探针组靶向结合SARS-CoV-2基因组的第28311位、第28792位、第28439位、第28474位和第28822位的核苷酸，第六荧光探针组靶向结合SARS-CoV-2基因组的第1413位、第2092位、第2130位、第1452位、第822位、第1172位、第1238位和第956位的核苷酸。

S3，在DNA探针上标记荧光分子，并使相同荧光探针组的DNA探针标记同一荧光分子，且至少一组荧光探针组标记的荧光分子与其余荧光探针组具有不同的荧光发射光谱。

S4，混合标记有至少两种荧光分子的至少两组荧光探针组的DNA探针，即为检测SARS-CoV-2的FISH探针组。

具体地，混合标记有至少两种荧光分子的至少两组荧光探针组的DNA探针，将DNA探针变性，得到单链DNA探针，即为检测SARS-CoV-2的FISH探针组。

实施例4

本实施例提供一种检测SARS-CoV-2的荧光原位杂交体系，包括实施例1中的任一FISH探针组。荧光原位杂交体系是将FISH探针组的DNA探针加入Buffer E得到的探针混合液，探针混合液中每条DNA探针的浓度选择0.1-10μM范围内的任一浓度，且使最终所有DNA探针的总浓度为5μM。

实施例5

本实施例提供一种检测SARS-CoV-2的FISH芯片，包括实施例1或2中的FISH探针组，或实施例4中的荧光原位杂交体系。

实施例6

本实施例提供一种检测SARS-CoV-2的产品，检测产品具体地为试剂盒，检测试剂盒中包括实施例1或3中的FISH探针组、实施例4中的FISH体系，或实施例5中的FISH芯片。

实验例1

1、实验目的：检测实施例1中FISH探针组对SARS-CoV-2核酸检测的特异性与。

2、实验步骤：

2.1体外转录产物转染细胞，获得SARS-CoV-2阳性的感染细胞

（1）293T 细胞在10cm培养皿中培养至80-90%融合时，倾去培养液，用2ml PBS洗涤细胞两次。

（2）加1mL Trypsin-EDTA solution(0.25% Trypsin +0.53 mM EDTA, Hyclone)，混匀后，小心吸去胰酶溶液，37ºC放置约1分钟。

（3）加入2 mL 含10% FBS培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液。

（4）血球计数板计数，将细胞稀释至1×10⁶细胞/ml。按2×10⁴细胞/孔的浓度接种24孔板（孔内提前放入多聚赖氨酸处理好的盖玻片），于37ºC 5% CO₂培养24h。

（5）在1.5 ml EP管中加入100μl无血清DMEM，加入体外转录产物SP、EP、MP和P3各1ug混匀；取另一1.5ml EP管，加入100μl无血清DMEM，加入2μl GP-transfect-Mate（GenePharma），混匀，室温放置5分钟后将两管混合，室温放置20分钟。

（6）吸去24孔板中的培养液，将转染混合物逐滴加入24孔板中，混匀后，在培养箱中温育5小时。

（7）吸弃转染液，加入500ul含10% FBS的DMEM培养液。37ºC 5% CO₂继续培养5小时，进行FISH检测。

2.2荧光原位杂交检测

以步骤2.1中获得的SARS-CoV-2阳性的感染细胞作为待测样品，以未感染SARS-CoV-2的293T细胞和A549细胞作为对照样品，与FISH探针组孵育，进行荧光原位杂交检测，检测步骤具体如下：

（1）吸弃24孔板培养基，PBS洗两次，每次5min。

（2）吸弃PBS，每孔加入200 μl 4%多聚甲醛，室温固定15min。

（3）吸弃4%多聚甲醛，每孔加入200 μl 0.1% Buffer A（现用现配）室温处理细胞15min。

（4）吸弃0.1% Buffer A，PBS洗两次，每次5 min。

（5）吸弃PBS，每孔加入200 μl 2×Buffer C，37ºC培养箱放置30 min。

（6）Buffer E提前在73ºC水浴锅孵育30min，至澄清透亮。

（7）探针稀释：可参看标签或报告单上所示参数：nmole/OD260，例如：nmole/OD260= 4.17，则在每OD探针干粉制品中加入41.7 μl灭菌DEPC水，混匀后即得浓度约为100 μM的储存液，建议进行分装后避光储存于-20℃，避免多次冻融操作。

（8）配制探针混合液：以 100 μl探针混合液为例，即探针5μM加入Buffer E，总体系100 μl，73 ºC变性5 min。

（9）吸弃2×Buffer C，每孔加入200μl变性后的探针混合液，采取避光措施后置于37ºC培养箱中杂交过夜。

（10）杂交次日，将样本从37ºC培养箱取出，吸弃探针混合液，每孔加入200 μl 42ºC 预热的0.1% Buffer F洗涤5 min。

（11）吸弃0.1% Buffer F，每孔加入200 μl 42ºC 预热的2×Buffer C 洗涤5min。

（12）吸弃2×Buffer C，每孔加入200 μl 42ºC 预热的1×Buffer C 洗涤5 min，吸弃洗涤液。

（13）每孔加入200 μl稀释后的DAPI工作液，避光染色20 min。

（14）吸弃DAPI工作液，PBS洗两次，每次5min。

（15）滴加甘油或抗淬灭剂于干净的载玻片，将细胞爬片细胞面朝下盖在载玻片上，封片胶封片于荧光显微镜下观察。

2.3实验结果

图2a-图2d显示以FISH探针组中的第一~第六荧光探针组对SARS-CoV-2阳性细胞的核酸检测结果，其中图2a为CY3的荧光信号检测情况，图2b为FAM的荧光信号检测情况，图2c为细胞核的DAPI染色结果，图2d为图2a-图2c的Merge图。图3a-图3c显示以FISH探针组中的阳性探针组对SARS-CoV-2阳性细胞的核酸检测结果，其中图3a为CY3的荧光信号检测情况，图3b为细胞核的DAPI染色结果，图3c为图3a-图3b的Merge图。图4a-图4c显示以FISH探针组中的阴性探针组对SARS-CoV-2阳性细胞的核酸检测结果。其中图4a为CY3的荧光信号检测情况，图4b为细胞核的DAPI染色结果，图4c为图4a-图4b的Merge图。图5a-图5c显示以FISH探针组中第一~第六荧光探针组对未感染SARS-CoV-2的A293T阴性样品的核酸检测结果，其中图5 a为CY3的荧光信号检测情况，图5b为细胞核的DAPI染色结果，图5c为图5a-图5b的Merge图。图6a-图6c显示以FISH探针组中第一~第六荧光探针组对未感染SARS-CoV-2的A549阴性样品的核酸检测结果，其中图6 a为CY3的荧光信号检测情况，图6b为细胞核的DAPI染色结果，图6c为图6a-图6b的Merge图。

由图2a-图2d、图3a-图3c和图4a-图4c检测结果可知，以FISH探针组检测SARS-CoV-2阳性细胞时，能够在细胞中同时观测到绿光荧光和红色荧光信号，且两者有效重合，说明FISH探针组具有高特异性与灵敏度，能够实现对SARS-CoV-2阳性细胞中SARS-CoV-2病毒核酸的荧光定位显色；阳性探针组孵育后的细胞显示红色荧光信号，阴性探针组孵育后的细胞未显示红色荧光信号，说明实验中检测的SARS-CoV-2阳性细胞的核酸样品满足测试需要，且以FISH探针组的检测结果准确，无假阳性和假阴性。由图5a-图5c和图6a-图6c检测结果可知，以FISH探针组检测未感染SARS-CoV-2的阴性样品时，无荧光信号检出， FISH探针组未在阴性细胞样品中未发生非特异性杂交，说明FISH探针组具有较高的特异性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 上海吉玛制药技术有限公司

<120> 检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组及其制备方法、用途

<130> SHA202000143

<160> 62

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-SP-F1)

<400> 1

aagaacaaca gcccttgaga caactac 27

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-SP-F2)

<400> 2

acccgctaac agtgcagaag tgtattgag 29

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-SP-F3)

<400> 3

caagaacaac agcccttgag acaact 26

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-SP-F4)

<400> 4

acccgctaac agtgcagaag tgtattgag 29

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-SP-F5)

<400> 5

tgcaccaagt gacatagtgt aggcaa 26

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-EP-F1)

<400> 6

cgcagtaagg atggctagtg taa 23

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-EP-F2)

<400> 7

caagaatacc acgaaagcaa gaaa 24

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-EP-F3)

<400> 8

gtacgctatt aactattaac gtacctgtct 30

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-EP-F4)

<400> 9

gtgtaactag caagaatacc acgaaa 26

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-MP-F1)

<400> 10

cacagcgtcc tagatggtgt ccagcaata 29

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-MP-F2)

<400> 11

cctgttggca taggcaaatt gtagaagac 29

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-MP-F3)

<400> 12

cgctgcgaag ctcccaattt gtaat 25

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-MP-F4)

<400> 13

ccttgatgtc acagcgtcct agatgg 26

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-P3-F1)

<400> 14

ataagccatc cgaaagggag tgag 24

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-P3-F2)

<400> 15

gcacgctagt agtcgtcgtc ggt 23

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-P3-F3)

<400> 16

gaaataggac ttgttgtgcc atcacct 27

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-P3-F4)

<400> 17

ccaacaataa gccatccgaa aggg 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-NP-F1)

<400> 18

gagggtccac caaacgtaat gcgg 24

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-NP-F2)

<400> 19

tgactgccgc ctctgctccc ttc 23

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-NP-F3)

<400> 20

gaatttaagg tcttccttgc catgttgagt ga 32

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-NP-F4)

<400> 21

ggtgttaatt ggaacgcctt gtcctcg 27

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-NP-F5)

<400> 22

tgttgcgact acgtgatgag gaacgaga 28

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-NS-F1)

<400> 23

ccagattcat tatggtattc ggcaaga 27

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-NS-F2)

<400> 24

tgccaaagat gttagttagc cactgcga 28

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-NS-F3)

<400> 25

aagccaatca aggacgggtt tgagtttt 28

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-NS-F4)

<400> 26

gcaatagtgc gaccaccctt acgaaga 27

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-NS-F5)

<400> 27

catcagggcc acagaagttg ttatcg 26

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-NS-F6)

<400> 28

cattcatttg gtgacgcaac tggataga 28

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-NS-F7)

<400> 29

cgcccgtctg ccatgaagtt tcaccacaat 30

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(2019-nCoV-NS-F8)

<400> 30

gcaatttcat gctcatgttc acggc 25

<210> 31

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(HOMO 18s)

<400> 31

ctgccttcct tggatgtggt agccgtttc 29

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(NC)

<400> 32

tgctttgcac ggtaacgcct gtttt 25

<210> 33

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-SP-F1)

<400> 33

aagaacaaca gcccuugaga caacuac 27

<210> 34

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-SP-F2)

<400> 34

acccgcuaac agugcagaag uguauugag 29

<210> 35

<211> 26

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-SP-F3)

<400> 35

caagaacaac agcccuugag acaacu 26

<210> 36

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-SP-F4)

<400> 36

acccgcuaac agugcagaag uguauugag 29

<210> 37

<211> 26

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-SP-F5)

<400> 37

ugcaccaagu gacauagugu aggcaa 26

<210> 38

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-EP-F1)

<400> 38

cgcaguaagg auggcuagug uaa 23

<210> 39

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-EP-F2)

<400> 39

caagaauacc acgaaagcaa gaaa 24

<210> 40

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-EP-F3)

<400> 40

guacgcuauu aacuauuaac guaccugucu 30

<210> 41

<211> 26

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-EP-F4)

<400> 41

guguaacuag caagaauacc acgaaa 26

<210> 42

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-MP-F1)

<400> 42

cacagcgucc uagauggugu ccagcaaua 29

<210> 43

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-MP-F2)

<400> 43

ccuguuggca uaggcaaauu guagaagac 29

<210> 44

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-MP-F3)

<400> 44

cgcugcgaag cucccaauuu guaau 25

<210> 45

<211> 26

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-MP-F4)

<400> 45

ccuugauguc acagcguccu agaugg 26

<210> 46

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-P3-F1)

<400> 46

auaagccauc cgaaagggag ugag 24

<210> 47

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-P3-F2)

<400> 47

gcacgcuagu agucgucguc ggu 23

<210> 48

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-P3-F3)

<400> 48

gaaauaggac uuguugugcc aucaccu 27

<210> 49

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-P3-F4)

<400> 49

ccaacaauaa gccauccgaa aggg 24

<210> 50

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-NP-F1)

<400> 50

gaggguccac caaacguaau gcgg 24

<210> 51

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-NP-F2)

<400> 51

ugacugccgc cucugcuccc uuc 23

<210> 52

<211> 32

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-NP-F3)

<400> 52

gaauuuaagg ucuuccuugc cauguugagu ga 32

<210> 53

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-NP-F4)

<400> 53

gguguuaauu ggaacgccuu guccucg 27

<210> 54

<211> 28

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-NP-F5)

<400> 54

uguugcgacu acgugaugag gaacgaga 28

<210> 55

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-NS-F1)

<400> 55

ccagauucau uaugguauuc ggcaaga 27

<210> 56

<211> 28

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-NS-F2)

<400> 56

ugccaaagau guuaguuagc cacugcga 28

<210> 57

<211> 28

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-NS-F3)

<400> 57

aagccaauca aggacggguu ugaguuuu 28

<210> 58

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-NS-F4)

<400> 58

gcaauagugc gaccacccuu acgaaga 27

<210> 59

<211> 26

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-NS-F5)

<400> 59

caucagggcc acagaaguug uuaucg 26

<210> 60

<211> 28

<212> RNA

<213> 人工序列(019nCov-R-NS-F6)

<400> 60

cauucauuug gugacgcaac uggauaga 28

<210> 61

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-NS-F7)

<400> 61

cgcccgucug ccaugaaguu ucaccacaau 30

<210> 62

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列(2019nCov-R-NS-F8)

<400> 62

gcaauuucau gcucauguuc acggc 25

Claims

1.一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组，其特征在于，包括以S基因为靶标的第一荧光探针组、以E基因为靶标的第二荧光探针组、以M基因为靶标的第三荧光探针组、以ORF 3a基因为靶标的第四荧光探针组、以N基因为靶标的第五荧光探针组，和以ORF 1ab基因为靶标的第六荧光探针组；

所述第一荧光探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.33- SEQ ID NO.37所示的RNA探针；所述第二荧光探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.38- SEQ ID NO.41所示的RNA探针；所述第三荧光探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.42- SEQ ID NO.45所示的RNA探针；所述第四荧光探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.46- SEQ ID NO.49所示的RNA探针；所述第五荧光探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.50- SEQ ID NO.54所示的RNA探针；所述第六荧光探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.55- SEQ ID NO.62所示的RNA探针;

所述DNA探针或所述RNA探针中的至少一个核苷酸为LNA修饰的核苷酸；

所述第一组荧光探针标记的荧光分子为CY3，所述第二-第六组荧光探针标记的荧光分子为FAM。

2.根据权利要求1所述的检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组，其特征在于，还包括：阳性探针组和阴性探针组，所述阳性探针组包括基于人18s rRNA设计的DNA探针；所述阳性探针组和所述阴性探针组标记有所述荧光探针组标记的至少一种荧光分子。

3.一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH体系，其特征在于，所述FISH体系包括权利要求1或2所述的FISH探针组。

4.一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH芯片，其特征在于，包括权利要求1或2所述的FISH探针组，或权利要求3所述的FISH体系。

5.权利要求1或2所述的FISH探针组、权利要求3所述的FISH体系，或者权利要求4所述的FISH芯片在制备用于检测新型冠状病毒肺炎的试剂和/或试剂盒中的用途。