CN111893217A - 一种新型冠状病毒组合物及其试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型冠状病毒组合物，为基于Taqman‑LNA荧光PCR检测新冠病毒用组合物，所述组合物包括有：如SEQ ID NO:1‑2所示的第一引物对；如SEQIDNO.3所示的第一探针；如SEQIDNO.4‑5所示的第二引物对；如SEQIDNO.6所示的第二探针。本法还公开了试剂盒和检测方法。本发明通过在TaqMan探针的基础上使用LNA修饰的碱基，减少了探针分子长度，增加了探针分子的亲和力，提高了检测灵敏度、特异性，且同时检测ORF1ab和N基因时大大提高了其准确性，改善了SARS‑CoV‑2的核酸阳性检出率低的问题，对于疫情的诊疗有积极的意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，具体涉及一种新型冠状病毒组合物及其试剂盒及其检测方法。
背景技术
新型冠状病毒(2019-nCoV，SARS-CoV-2)，为新发现的第7种可以感染人类的冠状病毒，该病毒在分类学上属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)中的β类型冠状病毒，具有囊膜和刺突细胞学特征基因组为线性单股正链的RNA((+)ssRNA)病毒。SARS-CoV-2从2019年末发现至今，在全世界爆发，在全球累积造成超过1900万人感染，累积造成超过70多万人死亡，为国际公共卫生事件。
在目前《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中，SARS-CoV-2的核酸的检出仍是唯一确诊依据，在诊疗方案中了明确核酸检测的方式有两种：(1)实时荧光定量PCR(qPCR)检测核酸阳性；(2)病毒基因测序，测序结果与已知SARS-CoV-2高度同源。病毒基因测序法虽然结果更为准确，但是其检测周期长、成本高、对实验室要求高，很难大规模运用临床。
由于基因测序法存在上述限制，所以临床大规模采取qPCR方法来进行检测。相对基因测序而言，qPCR方法具有快速、成本低等优势。
据报道，自从qPCR检测试剂大面积用于临床诊断以来，初期核酸阳性检出率只有30-50％；此外，更有医疗机构报道，个别病例在不同时间3次以上结果由阴性转为阳性；且在国内外网上爆出多个报道，WHO提供的引物探针存在特异性问题，美国CDC提供的检测试剂存在检测效果差的问题。以上这些情况的发生为临床诊断和疾病控制带来极大困扰。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒组合物及其试剂盒及其检测方法。
为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：
一种新型冠状病毒组合物，为基于Taqman-LNA荧光PCR检测新冠病毒用组合物，其中，所述组合物包括有：
如SEQ ID NO:1-2所示的第一引物对，所述第一引物对用于特异性地扩增SARS-CoV-2的ORF1ab基因；
如SEQIDNO.3所示的第一探针，所述第一探针为用于检测所述第一引物对的扩增产物,所述第一探针的第4、8、12、15、17个碱基进行LNA修饰；
如SEQIDNO.4-5所示的第二引物对，所述第二引物对用于特异性地扩增N基因；
如SEQIDNO.6所示的第二探针，所述第二探针用于检测所述第二引物对的扩增产物，所述第二探针的第3、6、9、12、15个碱基进行LNA修饰。
一种基于Taqman-LNA荧光PCR检测新冠病毒用试剂盒，其中，所述试剂盒包括有所述组合物。
在本发明的一个优选实施例中，所述试剂盒中还包括PCR反应液或RT-酶混合液或阳性质控品中的任意一种或多种。
在本发明的一个优选实施例中，所述PCR反应液包括MgCl2或dUTP反应液中的任意一种或多种。
在本发明的一个优选实施例中，所述RT-酶混合液包括RT-酶或Taq酶或UNG酶中的任意一种或多种。
在本发明的一个优选实施例中，所述阳性质控品包括新冠病毒ORF1ab或N基因片段人工质粒中的任意一种或多种。
一种基于Taqman-LNA荧光PCR检测新冠病毒的方法，具体为利用所述试剂盒，以待测样本的核酸为模板，进行荧光定量PCR检测。
本发明的有益效果在于：
在TaqMan探针的基础上使用LNA修饰的碱基，减少了探针分子长度，增加了探针分子的亲和力，提高了检测灵敏度、特异性，且同时检测ORF1ab和N基因时大大提高了其准确性，改善了SARS-CoV-2的核酸阳性检出率低的问题，对于疫情的诊疗有积极的意义。
附图说明
图1为本发明组合物检测下限测试FAM通道检测结果示意图(200拷贝/ml SARS-Cov-2假病毒检测结果示意图，图中曲线为ORF1ab基因检测结果)。
图2为本发明组合物检测下限测试VIC通道检测结果示意图(200拷贝/ml SARS-Cov-2假病毒检测结果示意图，图中曲线为N基因检测结果)。
图3为本发明组合物与现有疾控中心通行引物探针对比测试FAM通道检测结果示意图(在上曲线为本发明组合物测试结果)。
图4为本发明组合物与现有疾控中心通行引物探针对比测试VIC通道检测结果示意图(在上曲线为本发明组合物测试结果)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，可以参考《分子克隆实验指南》(第四版)。
在本发明中，表述“第一”、“第二”等仅用于描述目的，用以区分所限定的物质，而不以任何方式限定次序或主次。
本发明的主要原理在于：
本发明的发明人在Taqman探针的基础上，有目的地将探针的部分碱基修饰成LNA碱基(如第一探针和第二探针)，通过提供探针的Tm值，缩短探针长度来增加探针的稳定性、特异性，并进行了大量测试，能够有效地提高核酸阳性检出率，据此完成本发明。
实施例1：设计新冠病毒检测用引物及探针
本发明所使用的引物及探针如下所示：
第一引物对：
ORF1ab-F：GTGGTGCATCGTGTTGTC(SEQIDNO:1)；
ORF1ab-R：GGTCATTAGCACAAGTTGTAGG(SEQIDNO:2)；
第一探针：ORF1ab-P:CTGCCGTTGCCACATAGA(SEQIDNO:3)，第4、8、12、15、17个碱基进行LNA修饰；
第二引物对：
N-F：CGTAGTCGCAACAGTTCAAG(SEQIDNO:4)；
N-R：GCAGCAGCAAAGCAAGAG(SEQIDNO:5)；
第二探针：
N-P：CCATTGCCAGCCATTCT(SEQIDNO:6)；
第3、6、9、12、15个碱基进行LNA修饰；
其中，第一探针的荧光报告基团为FAM；第二探针的荧光报告基团为VIC。探针的3’末端还具有猝灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
实施例2：新冠病毒检测试剂盒
本发明的新冠病毒检测试剂盒包括引物探针混合液、PCR反应液、RT-酶混合溶液、阳性质控品和阴性质控品
引物探针混合液为发明实例1组合物
PCR反应液包括20mM Tris-HCl，100mM KCl，8mM MgSO4，dATPs、dGTP、dCTP、dUTP各0.2mM
RT-酶混合溶液包括RT-酶80U/ul，Taq酶1U/μL，UNG酶0.2U/μL
阳性质控品为人工合成的ORF1ab和N基因质粒混合溶液
阴性质控品为DEPC处理的ddH2O
实施例3：新冠病毒检测方法
本发明检测样本为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液。进行如下操作
(1)使用凯杰QIAamp Viral RNA Mini Kit提取样本核酸；
(2)按下表1比例配制检测混合液，以每反应25μL的体积分装至各反应管。
表1
(3)分别向各反应管中提取的核酸5μL以及阴、阳性质控品5μL，然后盖上PCR管盖，瞬时离心后放置于实时荧光PCR仪器中；
(4)按下表2循环条件进行反应和检测(荧光采集选取FAM通道、VIC通道)：
表2
调节Baseline Start值在3～15、End值在5～20，设置Threshold值高于阴性质控品荧光值的最高点，点击Analyze进行分析，使各项参数符合下述“质量控制”中的要求，记录定性结果；
(4)质量控制
阴性质控品：FAM、VIC通道均无Ct值、Ct值大于40或扩增曲线为非指数型曲线；阳性质控品：FAM、VIC通道均Ct≤34；以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
实施例4：本试剂盒的检测下限测试
使用本发明的新冠病毒检测试剂盒检测外购新冠病毒假病毒，稀释至200拷贝/mL浓度，20个平行重复检测，检测结果如图1、图2所示，20个平行重复检测结果均为阳性，说明本试剂盒的检测下限可达到200拷贝/mL，与现有的平均1拷贝每微升的检测下限比，本发明的检测下限大幅降低，将更不容易出现假阴性的干扰。
实施例5：本发明组合物的特异性验证
使用本发明的新冠病毒检测试剂盒检测检测冠状病毒NL63、冠状病毒HKU1、冠状病毒229E、冠状病毒OC43、、甲型流感病毒、甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、呼吸道合胞病毒A、B型、副流感病毒1、2、3型、新生隐球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎衣原体、白色念球菌等阳性样本，检测结果如下表3所示，表明均无交叉反应；检测SARS冠状病毒核酸、MERS冠状病毒核酸，检测结果如下表3所示，表明均无交叉反应。
表3
实施例6：本发明组合物与现有疾控中心的通行引物探针序列对比测试
下面是现有疾控中心发布的通行引物探针序列：
Orf1ab-F：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA(SEQ ID No.7)
Orf1ab-R：ACGATTGTGCATCAGCTGA(SEQ ID No.8)
Orf1ab-Probe：CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG(SEQ ID No.9)
n-F：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT(SEQ ID No.10)
n-R：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG(SEQ ID No.11)
n-Probe：TTGCTGCTGCTTGACAGATT(SEQ ID No.12)
使用本发明实施例1中所述的组合物中(SEQ ID NO:1～6)与现有疾控中心发布的通行引物探针序列比较，按照实施例3所述的方法对新型冠状病毒假病毒1000拷贝/ml进行对比测试，重复检测5次，FAM通道(ORF1ab基因)、VIC通道(N基因)检测结果如图3、图4所示，从图中可以看出，对于同样浓度的样本，本发明的组合物现有疾控中心发布的通行引物探针序列Ct值显著前移，说明需要更少的扩增循环数就可以检测出阳性结果，检测灵敏度更高。
与CN111334615A相比，本发明未采用新冠病毒特异性低E基因检测，采用优化的ORF1ab和N基因检测联检，提高了检测特异性，简化了分析步骤。
本发明检测时间更短，可于1h内完成荧光检测。
表4为本发明所涉及的序列：
| 引物序号 | 引物名称 | 引物序列 |
| SEQIDNO.1 | ORF1ab-R | GTGGTGCATCGTGTTGTC |
| SEQIDNO.2 | ORF1ab-R | GGTCATTAGCACAAGTTGTAGG |
| SEQIDNO.3 | ORF1ab-P | CTGCCGTTGCCACATAGA |
| SEQIDNO.4 | N-F | CGTAGTCGCAACAGTTCAAG |
| SEQIDNO.5 | N-R | GCAGCAGCAAAGCAAGAG |
| SEQIDNO.6 | N-P | CCATTGCCAGCCATTCT |
| SEQIDNO.7 | Orf1ab-R | CCCTGTGGGTTTTACACTTAA |
| SEQIDNO.8 | Orf1ab-R | ACGATTGTGCATCAGCTGA |
| SEQIDNO.9 | Orf1ab-P | CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG |
| SEQIDNO.10 | n-F | GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT |
| SEQIDNO.11 | n-R | CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG |
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序列表
<110> 上海派森诺生物科技股份有限公司
<120> 一种新型冠状病毒组合物及其试剂盒及其检测方法
<130> 20200817
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 1
gtggtgcatc gtgttgtc 18
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> homo spaiens
<400> 2
ggtcattagc acaagttgta gg 22
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> homo sapiens
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ctgccgttgc cacataga 18
<210> 4
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<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 4
cgtagtcgca acagttcaag 20
<210> 5
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<213> homo sapiens
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gcagcagcaa agcaagag 18
<210> 6
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<212> DNA
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ccattgccag ccattct 17
<210> 7
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<212> DNA
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ccctgtgggt tttacactta a 21
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acgattgtgc atcagctga 19
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<212> DNA
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ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28
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ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 11
<211> 22
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<213> homo sapiens
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cagacatttt gctctcaagc tg 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 12
ttgctgctgc ttgacagatt 20
Claims (7)
1.一种新型冠状病毒组合物，为基于Taqman-LNA荧光PCR检测新冠病毒用组合物，其特征在于，所述组合物包括有：
如SEQ ID NO:1-2所示的第一引物对，所述第一引物对用于特异性地扩增SARS-CoV-2的ORF1ab基因；
如SEQ ID NO.3所示的第一探针，所述第一探针为用于检测所述第一引物对的扩增产物,所述第一探针的第4、8、12、15、17个碱基进行LNA修饰；
如SEQ ID NO.4-5所示的第二引物对，所述第二引物对用于特异性地扩增N基因；
如SEQ ID NO.6所示的第二探针，所述第二探针用于检测所述第二引物对的扩增产物，所述第二探针的第3、6、9、12、15个碱基进行LNA修饰。
2.一种基于Taqman-LNA荧光PCR检测新冠病毒用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括有如权利要求1所述的组合物。
3.如权利要求2所述的一种基于Taqman-LNA荧光PCR检测新冠病毒用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括PCR反应液或RT-酶混合液或阳性质控品中的任意一种或多种。
4.如权利要求3所述的一种基于Taqman-LNA荧光PCR检测新冠病毒用试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括MgCl2或dUTP反应液中的任意一种或多种。
5.如权利要求3所述的一种基于Taqman-LNA荧光PCR检测新冠病毒用试剂盒，其特征在于，所述RT-酶混合液包括RT-酶或Taq酶或UNG酶中的任意一种或多种。
6.如权利要求3所述的一种基于Taqman-LNA荧光PCR检测新冠病毒用试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品包括新冠病毒ORF1ab或N基因片段人工质粒中的任意一种或多种。
7.一种基于Taqman-LNA荧光PCR检测新冠病毒的方法，其特征在于，具体为利用如权利要求2-7当中任意一项所述试剂盒，以待测样本的核酸为模板，进行荧光定量PCR检测。
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