CN111808995A - 一种呼吸道病原体核酸检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种呼吸道病原体核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括以下各组分：SARS‑CoV‑2病毒核酸检测试剂、甲型流感病毒核酸检测试剂和乙型流感病毒核酸检测试剂，所述SARS‑CoV‑2病毒核酸检测试剂是用于检测SARS‑CoV‑2病毒的ORF1a和/或S基因的试剂；所述试剂盒是多重PCR扩增试剂盒，在一次多重PCR扩增中完成上述三种病毒检测。本发明提供一种具有通量高，操作简单，灵敏度高的试剂盒，用于鉴别是否为流感病毒感染或新型冠状病毒肺炎，实现对呼吸道病原体的快速准确检测，在SARS‑CoV‑2及流感病毒感染的临床诊断、监测、防控方面具有较大应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种呼吸道病原体核酸检测试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，简称“新冠肺炎”，是指新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染导致的肺炎。新型冠状病毒属于β属的冠状病毒。目前所见传染源主要是新型冠状病毒感染的患者，无症状感染者也可能成为传染源。基于目前的流行病学调查，潜伏期1-14天，多为3-7天。以发热、干咳、乏力为主要表现。少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等
症状；重症表现为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒、出凝血功能障碍。
流行性感冒，通常称为“流感”，是由流感病毒(influenza virus)引起的急性呼吸道传染病，具有很强的传染性，主要通过咳嗽和打喷嚏传播，一般春季和冬季爆发，流感病毒分为甲型(Influenza A)、乙型(Influenza B)、丙型(Influenza C)三种型别，均属于正粘病毒科，引起人类疾病的主要为甲型和乙型流感病毒，为单股负链、分节段RNA病毒；甲型流感病毒为急性呼吸道传染病，有H1N1、H3N2等多个亚型，很容易发生变异。乙型流感病毒分为Yamagata和Victoria两大谱系，同样会造成人的呼吸道感染并导致流行。流感病毒可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播，感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高。
新型冠状病毒肺炎是急性呼吸道传染病，人群普遍易感。目前所见传染源主要是新型冠状病毒感染的患者，无症状感染者也可能成为传染源。为实现对该病毒的快速准确检测，有效的防控感染以及流感病毒变异性强、感染率高、流行规模大，临床症状与新型冠状病毒相似，中国是流行性感冒的高发地区，建立新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒对于临床诊断具有重要意义，可用于鉴别是否为流感病毒感染或新型冠状病毒肺炎。建立新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒对于临床诊断具有重要意义，可用于鉴别是否为流感病毒感染或新型冠状病毒肺炎，为临床诊断提供依据。
发明内容
本发明解决的技术问题是在新冠疫情的特殊时期，快速诊断区分流感和新冠感染，为疫情防控提供一个特异性好、灵敏度高的检测试剂盒，在SARS-CoV-2疾病临床诊断、监测、防控方面具有较大应用前景。
为了实现上述目的，本发明提供一种呼吸道病原体核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括以下各组分：SARS-CoV-2病毒核酸检测试剂、甲型流感病毒核酸检测试剂和乙型流感病毒核酸检测试剂，所述SARS-CoV-2病毒核酸检测试剂是用于检测SARS-CoV-2病毒的ORF1a和/或S基因的试剂；所述试剂盒是多重PCR扩增试剂盒，在一次多重PCR扩增中完成上述三种病毒检测。
在一种实施方式中，检测SARS-CoV-2病毒的ORF1ab基因核酸所用的扩增引物、探针分别是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，和检测S基因核酸SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6；
| 引物序列号 | 序列 |
| SEQ ID NO.1 | ACAACTACTATTCAAACAATTG |
| SEQ ID NO.2 | TTAATGTATACATTGTCAGTAAG |
| SEQ ID NO.3 | AGGTTCAACCTCAATTAGAGATGGA |
| SEQ ID NO.4 | GCAAAC<u>T</u>GGAAAGATTG |
| SEQ ID NO.5 | TTACCACCAACCTTAGAATCAAGA |
| SEQ ID NO.6 | TGTGCTACCGGCCTG |
。
在一种实施方式中，SEQ ID NO.4第7个碱基T修饰LNA。
在一种实施方式中，检测甲型流感病毒核酸的引物、探针分别是SEQ ID NO.7、SEQID NO.8、SEQ ID NO.9；
| 引物序列号 | 序列 |
| SEQ ID NO.7 | GACCRATCCTGTCACCTCTGAC |
| SEQ ID NO.8 | AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA |
| SEQ ID NO.9 | CCTCGCTCACTGGGCACGGTGAGCG |
在一种实施方式中，检测乙型流感病毒核酸的引物、探针序列分别是SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12；
| 引物序列号 | 序列 |
| SEQ ID NO.10 | CAGTCTTGGCTTTGATGTCTCTC |
| SEQ ID NO.11 | GGCTGARGCCATTCGATTTA |
| SEQ ID NO.12 | AATAGCCCTCTGTCTGCCATTGCTCTT |
。
在一种实施方式中，所述试剂盒还包括检测内参基因人类ACTB基因的试剂，检测所述ACTB基因的引物探针序列是SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15，
| 引物序列号 | 序列 |
| SEQ ID NO.13 | AATGAGCTGCGTGTGGCTC |
| SEQ ID NO.14 | GGCTGGGGTGTTGAAGGTC |
| SEQ ID NO.15 | TTCTCGCGGTTGGCCTTGGG |
。
在一种实施方式中，所述试剂盒组分中所述的5条荧光探针采用FAM、VIC、HEX、CY3、NED、ROX、Texas Red、CY5中的任一种荧光基团进行标记；所述荧光淬灭基团采用BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、Dabcyl任一种进行淬灭，不同病毒检测的荧光探针采用不同的荧光基团进行标记，所述新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的ORF1ab和S基因也采用不同荧光基团进行标记或者新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的ORF1ab和S基因采用相同荧光基团进行标记。
在一种实施方式中，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品为构建的待扩增靶标基因的假病毒，阴性对照品为无RNase和DNase水。
本次发明的呼吸道3项核酸检测试剂盒采用4重或5重荧光定量PCR技术，分别选择新型冠状病毒SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒保守区域设计特异性的引物、探针，实现在同一管的反应体系中同时检测新型冠状病毒SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒核酸。
本试剂盒含有dUTP/UDG酶防污染体系，可以防止扩增产物的气溶胶污染，样本检测时间为2～3hours(从样本处理开始)，操作简便；可以在一管中实现对新型冠状病毒SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒核酸的检测，提高试剂盒在不同机型上的适配性，避免检测机构增添设备，造成资源浪费。
本发明的试剂盒的灵敏度高，用于鉴别是否为流感病毒感染或新型冠状病毒肺炎，为实现对新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒的快速准确检测；在新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒疾病临床诊断、监测、防控方面具有较大应用前景。
附图说明
图1本发明中的试剂盒检测新型冠状病毒梯度样品(105、104、103、102Copies/mL)的扩增曲线图(ORF1ab基因和S基因在同一通道)。
图2本发明中的试剂盒检测新型冠状病毒梯度样品(105、104、103、102Copies/mL)的ORF1ab基因扩增曲线图(ORF1ab基因和S基因在不同通道)。
图3本发明中的试剂盒检测新型冠状病毒梯度样品(105、104、103、102Copies/mL)的S基因扩增曲线图(ORF1ab基因和S基因在不同通道)。
图4本发明中的试剂盒检测新型冠状病毒甲型流感病毒样本梯度(5×105、5×104、5×103、5×102Copies/mL)扩增曲线图。
图5本发明中的试剂盒检测新型冠状病毒乙型流感病毒样本梯度(5×105、5×104、5×103、5×102Copies/mL)扩增曲线图。
图6本发明中的试剂盒检测脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、风疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道腺病毒(3型)、呼吸道腺病毒(7型)、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒2型扩增曲线图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，实施例仅是范例，不能对本发明造成限制。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。实施例中所有的试剂为市售试剂。反应buffer、检测酶液购于专业原料公司；所用引物及探针均由上海生物工程技术服务有限公司合成。病毒RNA提取试剂盒为公司自产试剂盒。
实施例1呼吸道3项病原体(新型冠状病毒SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒)引物探针筛选。
从NCBI上下载新型冠状病毒SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒基因序列，将序列进行分析，选择突变率较低(＜5％)的区域设计检测引物探针。
1.新型冠状病毒SARS-CoV-2专用引物探针筛选
1.1.筛选引物探针序列
1.2.检测病原体
选择经ddPCR标定浓度的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染样本，采用SARS-CoV-2阴性样本稀释得到浓度为105Copies/mL、104Copies/mL、103Copies/mL、102Copies/mL的样品；和其他病原体包括人源DNA、H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、乙型流感病毒、脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、风疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道腺病毒(3型)、呼吸道腺病毒(7型)、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒2型的样品(浓度＞5×105Copies/mL)。
1.3.样本RNA提取
1.3.1.在1.5ml无核酸酶离心管中加入3.5μL蛋白酶K、0.5mL裂解液、20μL磁珠(使用前颠倒混匀，使磁珠充分混匀)，取200μL样本，加入配制好的裂解溶液中。充分震荡混匀，室温条件下裂解5min，期间不断颠倒混匀。
1.3.2.短暂离心收集管壁液体，将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后，用移液器吸尽管内液体。
1.3.3.取下离心管，加入500μL洗涤液I，颠倒混匀1min。
1.3.4.短暂离心收集管壁液体，将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后，用移液器吸尽管内液体。
1.3.5.取下离心管，加入500μL洗涤液II，颠倒混匀1min。
1.3.6.短暂离心收集管壁液体，将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后，用移液器吸尽管内液体。保持离心管在磁力架上开盖静置3～5min，吸去管底液体。
1.3.7.取下离心管，加入60μL洗脱液，震荡混匀，55℃水浴5min，期间轻轻晃动2次。短暂离心收集管内液体，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，用移液器将管内液体转移到新的无核酸酶离心管中，所得到的的液体即为待检测样品的RNA。
1.4.检测体系如下表所示
| 反应体系组分 | 加入量μL/人份(30μL反应体积) |
| 2×反应buffer | 15 |
| 引物探针Mix | 1.5 |
| 检测酶Mix | 1.5 |
| 无RNase和DNase水 | 2 |
| RNA | 10 |
1.5.扩增程序
1.6.筛选结果
设计的ORF1ab和S基因的三套引物探针与其他病原体均无交叉反应，具有较好的检测特异性；ORF1ab基因的第二套引物探针可以检测到102Copies/mL浓度，检测灵敏度高；筛选第二套检测引物探针作为SARS-CoV-2的ORF1ab检测专用引物探针。S基因的第一套引物探针可以检测到102Copies/mL，检测灵敏度较高，选择第1套的引物探针作为SARS-CoV-2的S基因专用的引物探针。
2.甲型流感病毒专用引物探针筛选
2.1.筛选引物探针序列
2.2.检测病原体
选用第二代甲型流感病毒核酸检测试剂国家参考品S1、S2、S3的梯度稀释样品(5×105、5×104、5×103、5×102Copies/mL、2.5×102Copies/mL)和人源DNA及其他病原体包括乙型流感病毒、新型冠状病毒、脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、风疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道腺病毒(3型)、呼吸道腺病毒(7型)、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒2型的样品(浓度＞5×105Copies/mL)。
2.3.样本RNA提取
2.3.1.在1.5ml无核酸酶离心管中加入3.5μL蛋白酶K、0.5mL裂解液、20μL磁珠(使用前颠倒混匀，使磁珠充分混匀)，取200μL样本，加入配制好的裂解溶液中。充分震荡混匀，室温条件下裂解5min，期间不断颠倒混匀。
2.3.2.短暂离心收集管壁液体，将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后，用移液器吸尽管内液体。
2.3.3.取下离心管，加入500μL洗涤液I，颠倒混匀1min。
2.3.4.短暂离心收集管壁液体，将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后，用移液器吸尽管内液体。
2.3.5.取下离心管，加入500μL洗涤液II，颠倒混匀1min。
2.3.6.短暂离心收集管壁液体，将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后，用移液器吸尽管内液体。保持离心管在磁力架上开盖静置3～5min，吸去管底液体。
2.3.7.取下离心管，加入60μL洗脱液，震荡混匀，55℃水浴5min，期间轻轻晃动2次。短暂离心收集管内液体，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，用移液器将管内液体转移到新的无核酸酶离心管中，所得到的的液体即为待检测样品的RNA。
2.4.检测体系如下表所示
| 反应体系组分 | 加入量μL/人份(30μL反应体积) |
| 2×反应buffer | 15 |
| 引物探针Mix | 1.5 |
| 检测酶液 | 1.5 |
| 无RNase和DNase水 | 2 |
| RNA | 10 |
2.5.扩增程序
2.6.筛选结果
设计的甲型流感病毒检测的三套引物探针与其他病原体均无交叉反应，具有较好的检测特异性；第三套引物探针检测第二代甲型流感病毒核酸检测试剂国家参考品S1、S2、S3的灵敏度均可以达到2.5×102Copies/mL检测灵敏度较高，选择第三套的引物探针作为甲型流感病毒专用的引物探针。
3.乙型流感病毒专用引物探针筛选
3.1.筛选引物探针序列
3.2.检测病原体
选用第二代乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品S1、S2的梯度稀释样品(5×105、5×104、5×103、5×102Copies/mL、2.5×102Copies/mL)和人源DNA及其他病原体包括新型冠状病毒、H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、风疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道腺病毒(3型)、呼吸道腺病毒(7型)、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒2型的样品(浓度＞5×105Copies/mL)。
3.3.样本RNA提取
3.3.1.在1.5ml无核酸酶离心管中加入3.5μL蛋白酶K、0.5mL裂解液、20μL磁珠(使用前颠倒混匀，使磁珠充分混匀)，取200μL样本，加入配制好的裂解溶液中。充分震荡混匀，室温条件下裂解5min，期间不断颠倒混匀。
3.3.2.短暂离心收集管壁液体，将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后，用移液器吸尽管内液体。
3.3.3.取下离心管，加入500μL洗涤液I，颠倒混匀1min。
3.3.4.短暂离心收集管壁液体，将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后，用移液器吸尽管内液体。
3.3.5.取下离心管，加入500μL洗涤液II，颠倒混匀1min。
3.3.6.短暂离心收集管壁液体，将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后，用移液器吸尽管内液体。保持离心管在磁力架上开盖静置3～5min，吸去管底液体。
3.3.7.取下离心管，加入60μL洗脱液，震荡混匀，55℃水浴5min，期间轻轻晃动2次。短暂离心收集管内液体，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，用移液器将管内液体转移到新的无核酸酶离心管中，所得到的的液体即为待检测样品的RNA。
3.4.检测体系如下表所示
| 反应体系组分 | 加入量μL/人份(30μL反应体积) |
| 2×反应buffer | 15 |
| 引物探针Mix | 1.5 |
| 检测酶液 | 1.5 |
| 无RNase和DNase水 | 2 |
| RNA | 10 |
3.5.扩增程序
3.6.筛选结果
设计的乙型流感病毒检测的三套引物探针与其他病原体均无交叉反应，具有较好的检测特异性；第一套引物探针检测第二代乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品S1的灵敏度为2.5×102Copies/mL，S2的灵敏度均可以达到2.5×102Copies/mL检测灵敏度较高，选择第一套引物探针作为乙型流感病毒专用的引物探针。
4.内参专用引物探针筛选
4.1.筛选引物探针序列
4.2.检测人基因
选用人源基因梯度稀释样品(5×105、5×104、5×103、5×102Copies/mL)和其他病原体包括新型冠状病毒、H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、乙型流感病毒、脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、风疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道腺病毒(3型)、呼吸道腺病毒(7型)、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒2型的样品(浓度＞5×105Copies/mL)。
4.3.样本RNA提取
4.3.1.在1.5ml无核酸酶离心管中加入3.5μL蛋白酶K、0.5mL裂解液、20μL磁珠(使用前颠倒混匀，使磁珠充分混匀)，取200μL样本，加入配制好的裂解溶液中。充分震荡混匀，室温条件下裂解5min，期间不断颠倒混匀。
4.3.2.短暂离心收集管壁液体，将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后，用移液器吸尽管内液体。
4.3.3.取下离心管，加入500μL洗涤液I，颠倒混匀1min。
4.3.4.短暂离心收集管壁液体，将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后，用移液器吸尽管内液体。
4.3.5.取下离心管，加入500μL洗涤液II，颠倒混匀1min。
4.3.6.短暂离心收集管壁液体，将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后，用移液器吸尽管内液体。保持离心管在磁力架上开盖静置3～5min，吸去管底液体。
4.3.7.取下离心管，加入60μL洗脱液，震荡混匀，55℃水浴5min，期间轻轻晃动2次。短暂离心收集管内液体，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，用移液器将管内液体转移到新的无核酸酶离心管中，所得到的的液体即为待检测样品的RNA。
4.4.检测体系如下表所示
| 反应体系组分 | 加入量μL/人份(30μL反应体积) |
| 2×反应buffer | 15 |
| 引物探针Mix | 1.5 |
| 检测酶液 | 1.5 |
| 无RNase和DNase水 | 2 |
| RNA | 10 |
4.5.扩增程序
4.6.筛选结果
设计的人内参基因检测的三套引物探针与其他病原体均无交叉反应，具有较好的检测特异性；第二套引物探针检测人内参基因的灵敏度均可以达到5×102Copies/mL检测灵敏度较高，选择第二套引物探针作为内参基因专用的引物探针。
实施例2一种呼吸道3项病原体(新型冠状病毒SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒)检测试剂盒
1.试剂盒组分
所述试剂盒包括反应buffer、引物探针Mix、检测酶液、阳性对照品、阴性对照品。
反应buffer为2×浓度，包含扩增反应的Tris-HCl缓冲液、氯化钾、氯化镁、脱氧核糖核苷酸(5种，dCTP、dGTP、dATP、dTTP、dUTP)，使用体积为15μL/人份(30μL反应体积)。
其中所述引物探针Mix包括以下组分混合配制而成：
组分1：SARS-CoV-2病毒核酸检测4条扩增引物(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5所示)的终浓度为0.1mM和2条检测探针(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6所示)的终浓度为0.05mM；
组分2：甲型流感病毒核酸检测2条扩增引物(SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示)终浓度为0.2mM和1条检测探针(SEQ ID NO.9所示)终浓度为0.1mM；
组分3：乙型流感病毒核酸检测2条扩增引物(SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示)终浓度为0.2mM和1条检测探针(SEQ ID NO.12所示)终浓度为0.1mM
组分4：人基因组保守基因作为内参检测的2条扩增引物(SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14)终浓度为0.2mM和一条检测探针(SEQ ID NO.15)终浓度为0.1mM。
2.试剂盒制备过程
引物探针Mix制备过程，将上述引物探针使用无RNase和DNase水溶解至40μM浓度，振荡混匀后，按照上述比例进行混合配制后，使用无RNase和DNase水补至3.5μL/人份(30μL反应体积)。
检测酶液包括热启动的DNA聚合酶、逆转录酶、UDG酶，使用体积为1.5μL/人份(30μL反应体积)
阳性对照品为构建的待扩增靶标基因的假病毒，阴性对照品为无RNase和DNase水。
3.本发明的试剂盒检测过程
1)样本RNA提取
按照实施例1中的样本RNA提取方法进行样本的RNA提取。
2)将反应buffer、引物探针Mix、检测酶液、RNA按照表2的体系进行混合
表2 本发明试剂盒检测体系配制表
| 反应体系组分 | 加入量μL/人份(30μL反应体积) |
| 反应buffer | 15 |
| 引物探针Mix | 3.5 |
| 检测酶液 | 1.5 |
| RNA | 10 |
3)在荧光PCR仪中按照下表3的程序进行扩增
表3 本发明试剂盒扩增程序
4)扩增结束后，根据荧光曲线进行呼吸道3项病原体的结果判定
a)3项病原体通道(FAM/ROX/CY5)检测无明显扩增曲线或检测Ct值＞40，且内参通道(VIC)检测有明显扩增曲线，检测Ct值≤38，判定呼吸道3项病原体核酸检测阴性；
b)FAM通道有明显的扩增曲线且检测Ct值≤40，且内参通道(VIC)检测有明显扩增曲线，检测Ct值≤38，判定新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸检测阳性；
c)CY5通道有明显的扩增曲线且检测Ct值≤40，内参通道(VIC)检测有明显扩增曲线，检测Ct值≤38，判定甲型流感病毒核酸检测阳性；
d)ROX通道有明显的扩增曲线且检测Ct值≤40，内参通道(VIC)检测有明显扩增曲线，检测Ct值≤38，判定乙型流感病毒核酸检测阳性；
e)FAM和CY5通道有明显的扩增曲线且检测Ct值≤40，且内参通道(VIC)检测有明显扩增曲线，检测Ct值≤38，判定新型冠状病毒SARS-CoV-2、甲型流感病毒核酸检测阳性；
f)FAM和ROX通道有明显的扩增曲线且检测Ct值≤40，且内参通道(VIC)检测有明显扩增曲线，检测Ct值≤38，判定新型冠状病毒SARS-CoV-2、乙型流感病毒核酸检测阳性；
g)CY5和ROX通道有明显的扩增曲线且检测Ct值≤40，且内参通道(VIC)检测有明显扩增曲线，检测Ct值≤38，判定甲型流感病毒、乙型流感病毒核酸检测阳性；
h)FAM、CY5和ROX通道有明显的扩增曲线且检测Ct值≤40，且内参通道(VIC)检测有明显扩增曲线，检测Ct值≤38，判定新型冠状病毒SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒核酸检测阳性；
4.本发明的试剂盒对16例临床样本的验证
表4 16例临床样本检测结果统计表
检测5例灭活的新型冠状病毒、6例甲型流感病毒和5例乙型流感病毒均检测为对应的阳性，结果准确。
上述引物探针经过优化设计，确保相互之间对扩增效率影响最小。新型冠状病毒SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒和内参基因引物在五重扩增时的扩增效率比单独扩增时没有显著下降，说明五对引物之间彼此几乎没有影响，有效地克服了多层PCR扩增中效率降低的问题；具体如下表5所示。
表5 单独扩增和五重扩增时的五组引物探针的扩增效率
试验例3本发明试剂盒的灵敏度试验
1.参考品的制备
1.1.新型冠状病毒SARS-CoV-2检测限样品的制备
选择新型冠状病毒阳性样品S1，采用数字PCR对样品的浓度进行标定，标定完成后样品进行梯度稀释至100Copies/mL浓度作为检测限样品。
1.2.甲型流感病毒阳性参考品制备
选择第二代甲型流感病毒核酸检测试剂国家参考品中的最低检测限S1、S2、S3根据说明书进行稀释至250Copies/mL浓度。
1.3.乙型流感病毒阳性参考品制备
第二代乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品中的最低检测限S1、S2根据说明书进行稀释至250Copies/mL浓度。
2.试验方案
使用本发明试剂盒按照实施例2所述方法进行检测。
3.检测结果
新型冠状病毒检测最低检测限为100Copies/mL，甲型流感病毒和乙型流感病毒检测最低检测限为250Copies/mL，结果见图1-图5本试剂盒具有较高的灵敏度。
试验例4本发明试剂盒的特异性试验
使用本发明试剂盒按照实施例2所述方法检测脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、风疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道腺病毒(3型)、呼吸道腺病毒(7型)、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒2型病原体。
检测结果表明，本发明试剂盒检测脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、风疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道腺病毒(3型)、呼吸道腺病毒(7型)、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒2型结果均为阴性，扩增结果见图6。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 江苏宏微特斯医药科技有限公司
<120> 一种呼吸道病原体核酸检测试剂盒
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acaactacta ttcaaacaat tg 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttaatgtata cattgtcagt aag 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggttcaacc tcaattagag atgga 25
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcaaactgga aagattg 17
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttaccaccaa ccttagaatc aaga 24
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgtgctaccg gcctg 15
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaccratcct gtcacctctg ac 22
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agggcattyt ggacaaakcg tcta 24
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cctcgctcac tgggcacggt gagcg 25
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagtcttggc tttgatgtct ctc 23
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggctgargcc attcgattta 20
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aatagccctc tgtctgccat tgctctt 27
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aatgagctgc gtgtggctc 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggctggggtg ttgaaggtc 19
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttctcgcggt tggccttggg 20
Claims (9)
1.一种呼吸道病原体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下各组分：SARS-CoV-2病毒核酸检测试剂、甲型流感病毒核酸检测试剂和乙型流感病毒核酸检测试剂，所述SARS-CoV-2病毒核酸检测试剂是用于检测SARS-CoV-2病毒的ORF1a和/或S基因的试剂；所述试剂盒是多重PCR扩增试剂盒，在一次多重PCR扩增中完成上述三种病毒检测。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，检测SARS-CoV-2病毒的ORF1ab基因核酸所用的扩增引物、探针分别是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，和检测S基因核酸SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6；
。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO.4第7个碱基T修饰LNA。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，检测甲型流感病毒核酸的引物、探针分别是SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9；
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，检测乙型流感病毒核酸的引物、探针序列分别是SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12；
。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测内参基因人类ACTB基因的试剂，检测所述ACTB基因的引物探针序列是SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQID NO.15，
。
7.根据权利要求1-6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒组中荧光探针采用FAM、VIC、HEX、CY3、NED、ROX、Texas Red、CY5中的任一种荧光基团进行标记；所述荧光淬灭基团采用BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、Dabcyl中任一种进行淬灭，不同病毒检测的荧光探针采用不同的荧光基团进行标记，所述新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的ORF1ab和S基因采用不同荧光基团进行标记或者新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的ORF1ab和S基因采用相同荧光基团进行标记。
8.根据权利要求1-6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括热启动的DNA聚合酶、逆转录酶、UDG酶。
9.根据权利要求1-6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品为构建的待扩增靶标基因的假病毒，阴性对照品为无RNase和DNase水。
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