CN111647683B - 一种新冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种新冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，提供一种新冠状病毒2019‑nCoV核酸检测试剂盒及其应用，该试剂盒可用于诊断人2019‑nCoV感染。本发明所述检测试剂盒基于Taqman RT‑qPCR实验技术，利用设计的2条引物和一条探针对受试者的临床样本核酸进行检测，以有无特异性扩增曲线作为判定受试者是否已被2019‑nCoV感染，可以以100copies/μL以上的灵敏度和发热呼吸道症候群临床样本零交叉反应的高度特异性诊断2019‑nCoV感染。

Description

一种新冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可用于检测2019-nCoV感染的检测试剂盒及其应用。
技术背景
冠状病毒(Coronavirus，CoV)属于套式病毒目(Order:Nidovirales)、冠状病毒科(Family:Coronaviridae)，是具外套膜(envelope)的单股正链RNA病毒，直径约80-120nm，是一类主要引起呼吸道、肠道疾病的病原体。这类病毒颗粒的表面有许多规则排列的突起，整个病毒颗粒就像一顶帝王的皇冠，因此得名“冠状病毒”。冠状病毒除感染人类以外，还可感染猪、牛、猫、犬、骆驼、蝙蝠、禽类等多种脊椎动物。
感染2019-nCoV的主要临床特征表现包括发热、乏力、干咳，肺部影像表现为散在的斑片状毛玻璃阴影等。由于这些临床特征与其他引起肺部感染的病毒，如流感病毒、腺病毒、合胞体病毒等，具有较高的相似之处，仅靠临床特征无法准确的区分该病毒。此外，现有技术中的冠状病毒检测方法主要针对已知的SARS、MERS等冠状病毒，2019-nCov是一种全新病毒，基因序列与已知冠状病毒差别大，现有的诊断方法无法识别和区分新病毒和其他冠状病毒，故无法应对本次疫情，因此急需一种简便可靠的方法来对疑似感染2019-nCoV的患者标本进行快速诊断，从而对该病毒的流行病学进行监测，并指导临床对症治疗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种用于检测新型冠状病毒(2019-nCoV)的检测试剂盒，用于从不明原因肺炎病人标本中快速、特异和高灵敏度地检测2019-nCoV，为不明原因肺炎的临床诊断和治疗以及疫情防控提供依据。
为解决上述技术问题，本发明提供一种2019-nCoV病毒核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括特异性引物和荧光探针，所述特异性引物和荧光探针序列如下：
上游引物WHCV-F:TGATGATACTCTCTGACGATGCTGT；
下游引物WHCV-R:CTCAGTCCAACATTTTGCTTCAGA；
荧光探针WHCV-P:荧光报告基团-ATGCATCTCAAGGTCTAGTG-荧光淬灭基团。
优选的，上述试剂盒荧光探针中所使用的荧光报告基团为FAM、ROX、CY3、CY5、HEX、JOE、TET、VIC、TAMRA；荧光淬灭基团为MGB、BHQ1、BHQ2、TAMRA、BHQ-X。
优选的，该试剂盒还包括RT-qPCR(Quantitative real time polymerase chainreaction简称 RT-qPCR)缓冲液、DNA聚合酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂的混合制剂。
优选的，试剂盒所述上、下游引物在反应体系中的终浓度为8pmol，荧光探针在反应体系中的终浓度为：4pmol。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：我们根据前期在感染2019-nCoV的临床标本中获得的病毒全基因组序列(GenBank Accession No.MN908947.2)设计了一种基于orf1b基因序列的特异性荧光定量PCR引物，根据该引物制备的2019-nCoV核酸检测试剂盒检测耗时少(2-3小时)，操作简单，灵敏度高的特点。通过特异性和灵敏度实验，我们可以看出建立的Taqman RT-qPCR方法，能稳定检测出2019-nCoV的基因片段。最高灵敏度能检测出102数量级拷贝每微升的核酸模板。该方法同时具有较高的特异性，从包括甲型流感病毒、乙型型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞体病毒、细小RNA病毒、偏肺病毒、冠状病毒OC43 型、冠状病毒NL63、冠状病毒HK01等在内的呼吸道常见病毒临床标本中，能特异性地检测出2019-nCoV，未观察到假阳性结果。
总之，我们建立了一种基因Taqman RT-qPCR检测2019-nCoV的快速检测方法，该方法可以应用于2019-nCoV的快速临床筛查诊断和定量分析，同时也可以应用于2019-nCoV的流行病学监测。
附图说明
图1为本发明所述试剂盒的引物和探针序列与国内外流行的冠状病毒基因型序列比对；图1A为上游引物WHCV-F和14株来自于国内外流行的人冠状病毒229E、KHU1、NL63、OC43、MERS、SARS和新冠状病毒(2019-nCoV)，以及蝙蝠类SARS冠状病毒序列比对结果；图1B为探针WHCV-P和14株来自于国内外流行的人冠状病毒229E、KHU1、NL63、 OC43、MERS、SARS冠状病毒和2019-nCoV，以及蝙蝠类SARS冠状病毒序列比对结果；图 1C下游引物WHCV-R和14株来自于国内外流行的人冠状病毒229E、KHU1、NL63、OC43、 MERS、SARS冠状病毒和2019-nCoV，以及蝙蝠类SARS冠状病毒序列比对结果。
图2为本发明所述试剂盒灵敏度分析中RT-qPCR标准曲线建立及临床样本定量检测图图2A为标准质粒按照10倍梯度稀释后，模板拷贝数依次为108copies/μl、107copies/μl、 106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、10copies/μl时进行 RT-qPCR对应线性扩增曲线。图2B为标准质粒按照10倍梯度稀释后，模板拷贝数依次为 108copies/μl、107copies/μl～10copies/μl时进行RT-qPCR对应标准曲线。图2C为对一份临床患者灌洗液样本RNA进行RT-qPCR对应线性扩增曲线，结果显示为阳性。
图3为使用本发明所述试剂盒对新冠状病毒(2019-nCoV)及16种常见呼吸道病原体阳性临床样本的检测结果。
具体实施方式
实施例1引物设计
从Genbank数据库中，选取了13条冠状病毒的全基因组核酸序列，包括与2019-nCoV 同源性较高的一株蝙蝠SARS-like冠状病毒(Genebank No.MG772933.1)以及六种可感染人的冠状病毒，分别是冠状病毒229E型、冠状病毒OC43型、冠状病毒NL63型、冠状病毒HKU1型、中东呼吸综合征冠状病毒MERS以及SARS冠状病毒，以及2019-nCoV新型冠状病毒，针对orf1b基因序列使用Primer Express 3.0软件设计合成 2019-nCoV特异性RT-qPCR的引物和探针。并且使用Bioedit软件中ClustalW程序将上述冠状病毒核酸序列进行alignment分析，通过查找标注引物位置，结果显示，针对2019-nCoV 所设计的上下游引物以及探针序列与其它相关冠状病毒有很好的区分度(见图1)。由图1 可知，新合成的引物序列相对于其它冠状病毒株系区分度较高，序列特异性较高。引物序列见表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中荧光报告基团可选择FAM、ROX、 CY3、CY5、HEX、JOE、TET、VIC、TAMRA等，本实验选择ROX，荧光淬灭基团可选择 MGB、BHQ1、BHQ2、TAMRA、BHQ-X等,本实验选择MGB。
表1引物和探针序列
引物/探针 序列(5’-3’) 位置*
WHCV-F TGATGATACTCTCTGACGATGCTGT 15720-15744
WHCV-R CTCAGTCCAACATTTTGCTTCAGA 15839-15862
WHCV-P 荧光报告基团-ATGCATCTCAAGGTCTAGTG-荧光淬灭基团 15765-15784
*参考的2019-nCoV病毒株为(Genbank No.MN908947.2)
实施例2 2019-nCoV核酸检测方法
使用实施例1中设计的引物序列，通过荧光定量核酸检测方法，对收集到的17份2019-nCoV感染的临床标本进行检测，具体方法如下：
1核酸提取：使用PureLinkTMViral RNA/DNA Mini Kit(Invitrogen货号：12280050)提取待测标本病毒基因组核酸。在200μL样本中加入25μL蛋白酶K，随即加入200μL Lysis Buffer(含5.6μg carrier RNA)，震荡混匀15 s后56℃裂解15 min。再加入250μL无水乙醇，震荡15 s后，室温静置5 min。转移上述裂解液至吸附柱中，离心后随即用Washbuffer洗2次，最后用50μL RNase-free water洗脱核酸。
2核酸检测：采用一步法荧光定量检测试剂盒(Takara RR064A)进行核酸检测，25μL反应体系中包含2×Buffer Mix 12.5μL，TaKaRa Ex Taq HS(5 U/μL)0.5μL，PrimeScriptRT Enzyme MixⅡ 0.5μL，上游引物WHCV-F 8pmol，下游引物WHCV-R 8pmol，探针WHCV-P4pmol，RNA模板2.5μL。设置阳性对照和阴性对照。PCR反应条件：42℃反转录，10min； 95℃,1min；95℃变性，15s，60℃ 1min，运行40个循环，并在60℃进行荧光采集。反应在实时荧光定量PCR仪(ABI 7500,Real-Time PCR Software v2.4)上进行。上述临床标本均能特异性地检测出2019-nCoV，未观察到假阳性结果。
实施例3本发明所述试剂盒灵敏度分析
1标准品的制备
1.1T-A克隆：
根据新冠状病毒(2019-nCoV)orf1b序列，设计一对特异性引物，其中上游引物为WHCV-15F(5’-TCAATAGCCGCCACTAGAGGAG-3’),下游引物为WHCV-15R(5’-TCACCAGCATTTGTCCAGTCAC-3’)。采用RT-qPCR试剂盒(Takara RR064A)进行核酸扩增；PCR反应条件：42℃反转录，10min,95℃ 1min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min运行40 个循环，72℃延伸5分钟。
取上述扩增的阳性产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，采用割胶纯化试剂盒(QiagenCat No.28704)回收1421 bp大小的PCR产物。通过一步法快速克隆试剂盒(全式金生物科技有限公司Cat No.CT501-01)将PCR产物克隆进pEASY-T5载体，获得重组质粒pEASY-T5-nCoV-orf1b，通过PCR鉴定获得阳性克隆。通过M13引物测序获得克隆片段序列，然后使用BLAST 工具对克隆片段进行比对，确认插入目的片段的正确性，该重组质粒亦可用作本发明试剂盒中阳性对照的制备。
1.2制备RT-qPCR定量分析标准品
采用上述T-A克隆质粒制作标准品，建立2019-nCoV核酸定量标准曲线，首先微量紫外分光光度计(Thermo，NanoDrop one)对克隆质粒进行核酸定量，然后进行10倍模板稀释，制作108～101copies/μl的标准品。
2灵敏度分析
对本发明所述2019-nCoV病毒核酸检测试剂盒的灵敏度进行评估，我们以上述制备的标准品为模板，使用本发明所述试剂盒进行RT-qPCR检测，获得了标准曲线(见图2)。图2 显示各个标准品之间能保持一致的水平间距，说明该PCR方法能稳定有效的扩增新冠状病毒(2019-nCoV)orf1b基因片段。该PCR方法最高能检测到100copies/μL，能有力的说明该PCR方法的灵敏度。
实施例4本发明所述试剂盒特异性分析
使用BLAST工具在Genbank数据库中进行了比对分析，未发现上下游引物以及探针和数据库中其他物种有PCR扩增的模板匹配可能性。其次，我们使用16种非2019年新冠状病毒(2019-nCoV)的其他呼吸道相关病原体阳性样本(包括甲型流感病毒09H1N1型，甲型流感病毒H3N2型,乙型流感病毒，腺病毒，呼吸道合胞病毒，小RNA病毒，副流感病毒 1型，副流感病毒2型，副流感病毒3型，副流感病毒4型，博卡病毒，偏肺病毒，冠状病毒OC43型，冠状病毒NL63型，冠状病毒HKU1型以及冠状病毒229E型)进行特异性测试，扩增结果均为阴性(见图3)，说明此套引物与其他病毒存在交叉反应的可能性较小。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种新冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括特异性引物和荧光探针，所述特异性引物和荧光探针序列如下：
上游引物WHCV-F: TGATGATACTCTCTGACGATGCTGT;
下游引物WHCV-R: CTCAGTCCAACATTTTGCTTCAGA;
荧光探针WHCV-P: 荧光报告基团-ATGCATCTCAAGGTCTAGTG-荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述一种新冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒荧光探针中所使用的荧光报告基团为FAM、ROX、CY3、CY5、HEX、JOE、TET、VIC、TAMRA；荧光淬灭基团为MGB、BHQ1、BHQ2、TAMRA、BHQ-X。
3.根据权利要求1所述一种新冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括RT-PCR 缓冲液、DNA 聚合酶、逆转录酶和RNA 酶抑制剂的混合制剂。
4.根据权利要求1所述一种新冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒所述上、下游引物在反应体系中的终浓度为8pmol，荧光探针在反应体系中的终浓度为：4 pmol。
5.根据权利要求1所述一种新冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包含阳性对照，该阳性对照是由重组质粒 pEASY-T5-nCoV- orf1b制备获得。
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