CN107937615B

CN107937615B - 用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的引物和探针

Info

Publication number: CN107937615B
Application number: CN201711402234.9A
Authority: CN
Inventors: 刘志成; 张春红; 沈海燕; 孙俊颖; 张建峰
Original assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2017-12-20
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2037-12-20
Also published as: CN107937615A

Abstract

本发明公开了用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的方法以及相应的引物和探针。本发明首次建立了一种可快速区分五种不同基因型JEV野毒株(I、II、III、IV、V)与疫苗株SA14‑14‑2的荧光PCR检测方法，该检测方法操作简单，全部操作过程不需3小时，不需要病毒的细胞培养，显著缩短了病毒五种不同基因型野毒株与疫苗株鉴别与检测所需时间，并且准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。

Description

用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的引物和探针

技术领域

本发明涉及鉴别猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株技术领域，尤其是用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的引物和探针、试剂盒以及方法。

背景技术

猪乙型脑炎是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)经媒介蚊虫传播的一种人兽共患病，本病在猪群中的自然感染率高，且病毒血症持续时间长，所以猪是JEV主要的扩散和增殖宿主。JEV感染在临床上多以母猪发生流产、死胎、木乃伊胎，公猪发生睾丸炎、不育为特征，给养猪业造成巨大损失。由于目前尚无有效的治疗方案，接种疫苗仍然是预防该疾病流行的最有效方式。

根据JEV结构基因的进化分析，JEV包含5个基因型(I、II、III、IV和V)^【1】，各基因型的分布有一定的区域性。包括中国在内的亚洲目前主要流行I型和III型，II型主要从泰国、马来西亚、澳大利亚、印度尼西亚分离得到，IV和V分布较少，主要来源于印度尼西亚和马来西亚。对JEV进行基因型分析是了解JEV遗传变异、开展分子流行病学研究的基础，为分析JEV流行株的遗传变异、基因型以及与现行使用的疫苗株之间的差异等提供了科学依据。目前对JEV进行基因型分析主要依靠测序后的序列进化分析，其过程复杂且费用较高，因此需要一种快速、简便的方法用于基因型鉴定。而活疫苗SA14-14-2株的使用也给临床JEV感染的检测带来干扰，因此，建立一种疫苗株与野毒株的鉴别检测方法具有重要意义。

关于区分JEV不同基因型的快速检测方法，目前已经报道的有基于逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)^【2、3】、多重RT-PCR技术^【4、5】、基因芯片分型技术^【6】和限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术(RT-PCR-RFLP)^【7】等检测方法，但这些方法都是只针对JEV基因I型和III型的检测方法。而基因II型、IV型和V型在周边国家也有流行，有必要建立长期的监测手段跟踪分析JEV流行进化规律。目前还未检索到针对JEV 5个基因型及疫苗株SA14-14-2的快速检测方法。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能快速区分猪乙型脑炎病毒野毒株与疫苗株的检测方法，该方法操作简易、快速、检测结果可靠，有利于在临床实践中推广应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：

作为本发明的第一个方面，本发明提供一种用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下所示：

引物F：5'-TGGAGAAACAGAGARMTC-3'(SEQ ID NO：1)；

引物R：5'-CCAGTTTGTCCATTTTYA-3'(SEQ ID NO：2)；

探针P：5'-CTCAGTGAAGTTAACATCAGGCCAC-3'(SEQ ID NO：3)，其中，所述探针P的5’端结合荧光报告基团，所述探针P的3’端结合荧光淬灭基团，引物F中R为A或G，M为A或C，引物R中Y为C或T。

优选地，所述荧光报告基团为FAM、HEX、VIC、CY5或TET，所述荧光淬灭基团为TAMRA、MGB或BHQ。

作为本发明的第二个方面，本发明提供用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的试剂盒，所述试剂盒含有上述的引物和探针。

作为本发明的第三个方面，本发明提供用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的方法，包括以下步骤：

1)从样品中提取病毒RNA；

2)以提取的RNA为模板，利用权利要求1或2所述的引物对F、R和探针P进行荧光PCR扩增反应获得扩增产物；

3)对扩增产物进行熔解曲线分析，确定样品中病毒的基因型。其中，熔解曲线分析技术是一种基于PCR结合靶序列与探针杂交后熔点发生变化而对基因SNP位点进行快速检测的方法，该法具有操作省时、高通量、避免污染、结果分析直观、易于判断、应用范围较广等优点。

优选地，所述步骤2)中的荧光PCR扩增反应体系为：

优选地，所述步骤2)中的荧光PCR扩增反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性20s，48℃退火20s，72℃延伸20s；循环55次。

优选地，所述步骤3)中的熔解曲线分析程序为：95℃变性10sec；37℃退火60sec；37℃到75℃以0.2℃/s的速率，5次/℃连续采集探针P荧光信号，进行熔解曲线分析。

优选地，所述步骤3)中所述熔解曲线分析的具体分析过程为：在引物F、R和探针P的荧光检测结果中，

1)若样品熔解温度与阳性对照JEV-I熔解温度的ΔTm值的绝对值小于0.5℃，则判定样品中含有I型猪乙型脑炎病毒；

2)若样品熔解温度与阳性对照JEV-II熔解温度的ΔTm值的绝对值小于0.5℃，则判定样品中含有II型猪乙型脑炎病毒；

3)若样品熔解温度与阳性对照JEV-III熔解温度的ΔTm值的绝对值小于0.5℃，则判定样品中含有III型猪乙型脑炎病毒；

4)若样品熔解温度与阳性对照JEV-IV熔解温度的ΔTm值的绝对值小于0.5℃，则判定样品中含有IV型猪乙型脑炎病毒；

5)若样品熔解温度与阳性对照JEV-V熔解温度的ΔTm值的绝对值小于0.5℃，则判定样品中含有V型猪乙型脑炎病毒；

6)若样品熔解温度与阳性对照JEV-Va熔解温度的ΔTm值的绝对值小于0.5℃，则判定样品中含有猪乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2。

综上所述，本发明的有益效果为：

(1)本发明首次建立了一种可快速区分不同基因型猪乙型脑炎病毒野毒株与疫苗株的荧光PCR检测方法以及相应的引物和探针，该检测方法操作简单，只需一个反应即可实现五种不同基因型JEV野毒株(I、II、III、IV、V)与疫苗株SA14-14-2的鉴别检测；检测速度快且高通量，全部操作过程不需3小时，不需要病毒的细胞培养，显著缩短了病毒五种不同基因型野毒株与疫苗株鉴别与检测所需时间，并且准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用；

(2)本发明的荧光PCR引物对F/R，对JEV可特异性扩增，有助于提高PCR的效率，减少病毒鉴别分型的时间；探针P可特异性与五种不同基因型JEV野毒株(I、II、III、IV、V)与疫苗株SA14-14-2的鉴别位点杂交，特异性较好；引物对F/R和探针P，均不与其他常见猪繁殖障碍性病毒核酸结合，有利于提高本发明对结果分析的正确性；

(3)本发明的用于区分不同基因型猪乙型脑炎病毒野毒株与疫苗株的荧光PCR检测方法的最低检测限可达到每个反应100拷贝，灵敏度较高。

附图说明

图1为JEV标准化样品的熔解曲线图；

图2为JEV荧光检测方法特异性试验熔解曲线图；

图3为JEV-III核酸的灵敏度试验熔解曲线图；

图4为JEV-Va核酸的灵敏度试验熔解曲线图；

图5为JEV-IV核酸的灵敏度试验熔解曲线图；

图6为JEV-V核酸的灵敏度试验熔解曲线图；

图7为JEV-I核酸的灵敏度试验熔解曲线图；

图8为JEV-II核酸的灵敏度试验熔解曲线图；

图9为JEV临床样品的熔解曲线图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1引物及探针

本申请的发明人对所设计的大量引物和探针进行试验筛选后，发现引物F/R，及探针P对熔解曲线分析法区分不同基因型猪乙型脑炎病毒野毒株与疫苗株的效果最好，其碱基序列如下所示。

引物F：5'-TGGAGAAACAGAGARMTC-3'(SEQ ID NO：1)，

引物R：5'-CCAGTTTGTCCATTTTYA-3'(SEQ ID NO：2)，

探针P：5'-CTCAGTGAAGTTAACATCAGGCCAC-3'(SEQ ID NO：3)；其中，探针P的5’端结合荧光报告基团，探针P的3’端结合荧光淬灭基团，引物F中R为A或G，M为A或C，引物R中Y为C或T。

实施例2标准样品的制备、荧光PCR扩增及熔解曲线分析

1)猪乙型脑炎病毒RNA的提取

分别取JEV疫苗SA14-14-2株，加入3mL PBS盐酸缓冲溶液进行溶解，分别取JEV I型野毒株GD2-F5和III型野毒株GD5-F5细胞培养液各200μL按TAKARA公司的MiniBESTViral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0的说明书进行核酸提取。

2)标准样品的制备

为了验证本发明方法可行性与可靠性，同时构建标准阳性样品(经序列测定正确)，为之后的临床样品检测提供阳性对照，本实施例中优先制备JEV 5个不同基因型(I、II、III、IV、V)的野毒株与疫苗株SA14-14-2的阳性标准样品JEV-I、JEV-II、JEV-III、JEV-IV、JEV-V、JEV-Va。

标准样品JEV-I、JEV-III、JEV-Va的制备步骤如下：取经过测序确定基因型为JEVI型和III型的野毒株，购买湖南中岸生物药业有限公司的猪乙型脑炎病毒活疫苗(SA14-14-2株)；分别提取上述野毒株GD2-F5和GD5-F5，疫苗株SA14-14-2的核酸，并进行RT-PCR扩增，扩增引物均为：JEVW1-F:5’-GGAGAACAATCCARCCAGAR-3’(SEQ ID NO：4)，JEVW1-R:5’-GCTCGCVACKGARRMRAT-3’(SEQ ID NO：5)，其中，引物JEVW1-F中碱基R可以是A或G；引物JEVW1-R中碱基R可以是A或G；V可以是G或A或C；K可以是T或G；M可以是A或C。分别回收纯化扩增的产物，克隆至PMD18T-Vector中作为JEV基因I型、III型和疫苗株SA14-14-2的阳性对照样品，依次命名为JEV-I、JEV-III、JEV-Va。

标准样品JEV-II、JEV-IV、JEV-V的制备步骤如下：分别针对NCBI GENEBANK数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)中JEV基因II型毒株JKT654(GenBank:HQ223287.1)，IV型毒株JKT6468(GenBank:AY184212.1)，V型毒株Muar(GenBank:HM596272.1)，合成对应上述区段序列，并分别克隆至PMD18T-Vector中作为JEV基因II型、IV型和V型的阳性对照样品，依次命名为JEV-II、JEV-IV、JEV-V。

3)阳性标准样品的荧光PCR

分别以上述获得的六种阳性标准样品为模板，分别进行荧光PCR扩增反应和熔解曲线分析；

按以下组成配制RT-PCR反应液，对照

One Step RT-PCR Kit产品说明书进行操作实验。

PCR扩增反应程序如下：

50℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性20s，48℃退火20s，72℃延伸20s；循环55次。

熔解曲线分析程序如下：

95℃变性10sec；37℃退火60sec；37℃到75℃以0.2℃/s的速率，5次/℃连续采集探针P荧光信号，进行熔解曲线分析。

4)阳性标准样品熔解曲线分析的结果分析：

PCR扩增产物用LightCycler 96分析仪进行分析。JEV 5个不同基因型(I、II、III、IV、V)的野毒株与疫苗株SA14-14-2的阳性标准样品JEV-I、JEV-II、JEV-III、JEV-IV、JEV-V、JEV-Va熔解曲线分析结果如图1所示。

结合图1的结果，可获知：

1)JEV III型野毒株，相应的熔解温度为65.04±0.18℃；

2)JEV疫苗株SA14-14-2，相应的熔解温度为59.81±0.26℃；

3)JEV IV型野毒株，相应的熔解温度为56.27±0.46℃；

4)JEV V型野毒株，相应的熔解温度为55.15±0.15℃；

5)JEV I型野毒株，相应的熔解温度为52.90±0.30℃；

6)JEV II型野毒株，相应的熔解温度为47.39±0.57℃。

上述结论均已通过测序方法得到证实。由此，通过熔解曲线Tm值差异可以完全区分开JEV 5个基因型及疫苗株SA14-14-2。

实施例3用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株与疫苗株的方法

本发明的用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株与疫苗株的方法的一种实施例，包括如下步骤：

1)从样本中提取病毒核酸：方法同上述实施例2中核酸提取方法。

2)以提取的病毒核酸为模板，分别进行荧光PCR扩增反应和熔解曲线分析；同时以实施例2中的阳性标准品JEV-I、JEV-II、JEV-III、JEV-IV、JEV-V、JEV-Va作为阳性对照。

其中，PCR反应体系如下：

PCR扩增反应程序如下：

熔解曲线分析程序如下：

4)阳性标准样品熔解曲线分析结果与分析

PCR扩增产物用LightCycler 96分析仪进行分析：在引物F、R和探针P的荧光检测结果中，

1)若样品熔解温度与阳性对照JEV-I熔解温度的ΔTm值的绝对值小于0.5℃，则判定样品中含有JEV I型野毒株；

2)若样品熔解温度与阳性对照JEV-II熔解温度的ΔTm值的绝对值小于0.5℃，则判定样品中含有JEV II型野毒株；

3)若样品熔解温度与阳性对照JEV-III熔解温度的ΔTm值的绝对值小于0.5℃，则判定样品中含有JEV III型野毒株；

4)若样品熔解温度与阳性对照JEV-IV熔解温度的ΔTm值的绝对值小于0.5℃，则判定样品中含有JEV IV型野毒株；

5)若样品熔解温度与阳性对照JEV-V熔解温度的ΔTm值的绝对值小于0.5℃，则判定样品中含有JEV V型野毒株；

6)若样品熔解温度与阳性对照JEV-Va熔解温度的ΔTm值的绝对值小于0.5℃，则判定样品中含有JEV疫苗株SA14-14-2。

实施例4特异性实验

为了检测本申请的用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的引物和探针、以及方法的特异性，发明人进行了如下试验：

分别提取其他常见猪繁殖障碍性病毒核酸，如提取猪瘟病毒(classical swinefever virus,CSFV)、猪圆环2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、猪蓝耳病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，将上述病毒的核酸和水分别作为PCR模板，以上述实施例2中的PCR扩增反应和熔解曲线分析方法进行分析，并与JEV 5个不同基因型(I、II、III、IV、V)的野毒株与疫苗株SA14-14-2的阳性标准样品JEV-I、JEV-II、JEV-III、JEV-IV、JEV-V、JEV-Va进行对比分析，熔解曲线峰型化图如图2所示。

从图2可以看出，本发明的检测方法只能特异性扩增并形成JEV 5个不同基因型(I、II、III、IV、V)的野毒株与疫苗株SA14-14-2的熔解峰，而对其它常见猪繁殖障碍性病毒，如CSFV、PCV2和PRRSV都没有扩增并形成特异熔解峰，表明实施例1的引物对F/R及探针P具有很好的特异性，可以用于JEV疫苗株及野毒株的荧光检测。

实施例5灵敏度实验

为了检测本申请的用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的引物和探针、以及方法的灵敏度，发明人进行了如下试验：

将实施例2中标准质粒样品JEV-I、JEV-II、JEV-III、JEV-IV、JEV-V、JEV-Va做核酸检测，换算质粒数，做10倍梯度稀释，形成1.0x10⁸、1.0x10⁷、1.0x10⁶、1.0x10⁵、1.0x10⁴、1.0x10³、1.0x10²copies/μl共7个梯度，按上述实施例2中的荧光PCR扩增反应和熔解曲线分析方法进行分析，扩增曲线图和熔解曲线峰型化图如图3～图8所示。

从图3～图8可以看出，本发明检测方法针对JEV每种基因型随着核酸浓度的降低呈现明显的下降的荧光信号，当质粒浓度降低至1.0x10²copies/reaction，还可以检测到相应明显的荧光信号，说明本发明的方法可用于区分JEV 5种野毒株及疫苗株的基因型，该方法的灵敏度较高。

实施例6临床样品荧光PCR扩增及熔解曲线分析

1)从临床采集的肺胀样本中提取病毒核酸：方法同上述实施例2中核酸提取方法。

2)以提取的病毒核酸为模板，方法同上述实施例2中荧光PCR扩增反应和熔解曲线分析；同时以实施例2中所述的阳性标准品JEV-I、JEV-II、JEV-III、JEV-IV、JEV-V、JEV-Va作为阳性对照。

3)临床样品熔解曲线分析结果与分析：

荧光PCR扩增产物用LightCycler 96分析仪进行分析。本实施例检测了肺胀临床样本10个，编号分别为GD1-10，熔解曲线分析结果如图9所示，其中JEV-I、JEV-II、JEV-III、JEV-IV、JEV-V、JEV-Va为阳性对照，NTC为阴性对照。

从图9所示的JEV临床样品检测峰型化熔解曲线图上可以看出，GD2和GD8与阳性对照JEV-I的ΔTm值的绝对值均小于0.5℃，为基因I型；GD4、GD5、GD9与阳性对照JEV-III的ΔTm值的绝对值均小于0.5℃，为基因III型，GD1、GD3、GD6、GD7、GD10未形成明显的熔解峰，为JEV阴性；未检测到基因II型、IV型、V型及疫苗株SA14-14-2。

参考文献：

1、Duong V,Choeung R,Gorman C,Laurent D,Crabol Y,Mey C,et al.Isolationand full-genome sequences of Japanese encephalitis virus genotype I strainsfrom Cambodian human patients,mosquitoes and pigs.J Gen Virol.2017；98:2287-96；

2、Zhang L,Cao S,Wu R,Zhu S,Liu H,Yuan L,et al.Detection anddifferentiation of Japanese encephalitis virus genotype I and genotype III byreverse transcription loop-mediated isothermal amplification combined withrestriction fragment length polymorphism.Virus Genes.2015,50:231-7；

3、周玉鹏,张亮,伍锐,文心田,刘瀚扬,袁磊,田耕,黄小波,文翼平,曹三杰.基因Ⅰ型和基因Ⅲ型日本脑炎病毒RT-LAMP鉴别检测方法的建立[J].中国兽医科学,2016,46(02):135-141；

4、Chen YY,Lin JW,Fan YC,Chiou SS.Detection and differentiation ofgenotype I and III Japanese encephalitis virus in mosquitoes by multiplexreverse transcriptase-polymerase chain reaction.Transbound Emerg Dis.2014,61:37-43；

5、张亮,刘澣扬,石双艳,袁磊,伍锐,黄小波,文翼平,文心田,曹三杰.日本脑炎病毒基因Ⅰ型与Ⅲ型复合RT-PCR鉴别方法的建立[J].中国兽医科学,2014,44(04):419-424；

6、郭欢欢,凡敏,鲁会军,刘振江,齐延新,秦艳青,岳云强,袁森,崔鹤馨,田宇飞,刘昊,田明尧,金宁一.乙型脑炎病毒分型基因芯片的制备[J].中国病原生物学杂志,2011,6(11):801-805；

7、张亮,田耕,石双艳,袁磊,刘澣扬,黄小波,伍锐,文心田,文翼平,曹三杰.RT-PCR-RFLP方法鉴别基因Ⅰ型和基因Ⅲ型日本脑炎病毒[J].畜牧兽医学报,2014,45(09):1555-1560。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的引物和探针

<130> 2017

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tggagaaaca gagarmtc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccagtttgtc cattttya 18

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctcagtgaag ttaacatcag gccac 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggagaacaat ccarccagar 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctcgcvack garrmrat 18

Claims

1.用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的核苷酸序列如下所示：

引物F：5'-TGGAGAAACAGAGARMTC-3'(SEQ ID NO：1)；

引物R：5'-CCAGTTTGTCCATTTTYA-3'(SEQ ID NO：2)；

2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、HEX、VIC、CY5或TET，所述荧光淬灭基团为TAMRA、MGB或BHQ。

3.用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1或2所述的引物和探针。