CN104388591A - 一种鉴别日本乙型脑炎病毒基因ⅰ型和基因ⅲ型的rt-lamp方法 - Google Patents

一种鉴别日本乙型脑炎病毒基因ⅰ型和基因ⅲ型的rt-lamp方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104388591A
CN104388591A CN201410699759.3A CN201410699759A CN104388591A CN 104388591 A CN104388591 A CN 104388591A CN 201410699759 A CN201410699759 A CN 201410699759A CN 104388591 A CN104388591 A CN 104388591A
Authority
CN
China
Prior art keywords
genotype
iii type
iii
gene iii
lamp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410699759.3A
Other languages
English (en)
Inventor
曹三杰
文心田
张亮
袁磊
刘瀚扬
伍锐
黄小波
文翼平
石双艳
周玉鹏
田耕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Agricultural University
Original Assignee
Sichuan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Agricultural University filed Critical Sichuan Agricultural University
Priority to CN201410699759.3A priority Critical patent/CN104388591A/zh
Publication of CN104388591A publication Critical patent/CN104388591A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种鉴别日本乙型脑炎病毒基因Ⅰ型和基因Ⅲ型的RT-LAMP方法。通过对基因Ⅰ型和基因Ⅲ型日本乙型脑炎病毒核苷酸序列的比对分析，针对靶基因上6个区域分别设计了4条特异性引物用于特异性扩增基因Ⅰ型和基因Ⅲ型日本乙型脑炎病毒核酸，在反应体系中加入钙黄绿素荧光染料后可根据反应结束时反应管内液体的颜色变化判定反应结果，同时可根据反应结束后反应管内是否有沉淀及电泳是否出现梯状条带判定反应结果。该方法可在恒温的条件下，1h内实现反转录和核酸扩增，可在1h内快速检测并鉴别基因Ⅰ型和基因Ⅲ型日本乙型脑炎病毒。

Description

一种鉴别日本乙型脑炎病毒基因Ⅰ型和基因Ⅲ型的RT-LAMP方法
技术领域
本发明属于涉及一种鉴别日本乙型脑炎病毒基因Ⅰ型和基因Ⅲ型的RT-LAMP方法，具体说就是利用反转录-环介导等温扩增技术鉴别基因Ⅰ型和基因Ⅲ型日本乙型脑炎病毒，可以用于疾病诊断目的和非疾病诊断目的的鉴别。
背景技术
日本乙型脑炎(Japanese encephalitis B，JE)又称流行性乙型脑炎(epidemicencephalitis B)，是由日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一种蚊媒性传染病，JEV是亚洲地区病毒性脑炎的主要病原体，其是通过蚊媒传播的黄病毒属病毒。该病流行区域的人口数高达30亿，并且每年至少收到50000人感染日本乙型脑炎病毒的报告。日本乙型脑炎病毒广泛流行于亚洲到澳大利亚北部地区。随着分子生物学手段在病毒学领域中的应用，Chen等(1990)对不同地区分离到的乙脑病毒株PrM基因进行核苷酸序列分析，结果显示可将日本乙型脑炎病毒分为4个基因型，即Ⅰ～Ⅳ型，进一步分析发现了第5种基因型，目前国际上对乙脑病毒的基因分型多参照Chen的方法。研究表明，直到20世纪末期，在我国流行的日本乙型脑炎病毒主要基因型是基因Ⅲ型，在2000年后，在部分地区陆续出现基因Ⅰ型，甚至在某些地区基因Ⅰ型成了主要的基因型，并且在2009年，研究人员从病人脑内分离到了基因Ⅰ型JEV。
对JEV进行基因分型研究为分析JEV流行株的遗传变异、基因型以及与现行使用的乙脑疫苗株之间的差异等提供了科学依据，为了解JEV的分布、基因遗传规律与变异情况及疫苗研制等提供必要数据。目前对JEV进行基因分型主要是通过克隆测序后对序列进行分析，需要的时间较长、费用较高且操作复杂，因此，需要一种快速鉴定JEV基因Ⅰ型和Ⅲ型的方法。
发明内容
本发明的目的在于建立一种可以直接、快速、准确地鉴别日本脑炎病毒基因Ⅰ型和Ⅲ型的方法。
本发明实施例的鉴别日本乙型脑炎病毒基因Ⅰ型和基因Ⅲ型的RT-LAMP方法，其特征在于，该鉴别日本乙型脑炎病毒基因Ⅰ型和基因Ⅲ型的RT-LAMP方法包含基因Ⅰ型特异性RT-LAMP引物组：基因Ⅰ型-F3、基因Ⅰ型-B3、基因Ⅰ型-FIP和基因Ⅰ型-BIP；基因Ⅲ型特异性RT-LAMP引物组：基因Ⅲ型-F3、基因Ⅲ型-B3、基因Ⅲ型-FIP和基因Ⅲ型-BIP；基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特异性RT-LAMP引物组序列如下：
基因Ⅰ型-F3：5ˊ-GGACATTGCGGACGTCAT-3ˊ；
基因Ⅰ型-B3：5ˊ-ATTGTCGCACCAGCAGTC-3ˊ；
基因Ⅰ型-FIP：
5ˊ-TGCTCGGACCCAACATCTGTTTTGTGATCCCCACCTCAAAAGGT-3ˊ；
基因Ⅰ型-BIP：
5ˊ-YRAATGTCCGAAGCTTGCCGTTGTCTTCCGGATCGTTGCC-3ˊ；
基因Ⅲ型-F3：5ˊ-CTTGTGCAGGAGCCATGAA-3ˊ；
基因Ⅲ型-B3：5ˊ-TTGCCCATGGTAAGCTTAGG-3ˊ；
基因Ⅲ型-FIP：
5ˊ-ACGTCTGCAATGTCCGTGTTGTTTGTTGTCGAATTTCCAGGGG-3ˊ；
基因Ⅲ型-BIP：
5ˊ-AGAGAACAGATGCTGGTTCCGGTTTTCCTCACACATGTAGCCG-3ˊ。
进一步，JEV基因Ⅰ型RT-LAMP反应体系：10×ThermoPol buffer 2.5μL，dNTPs(10mM each)2.0μL，甜菜碱(5M)2.0μL，样品RNA2.0μL，MgSO4(100mM)1.0μL，基因Ⅰ型-FIP和基因Ⅰ型-BIP(50pmol/μL)各0.8μL，基因Ⅰ型-F3和基因Ⅰ型-B3(5pmol/μL)各1.0μL，Bst DNAploymerase8U，AMV反转录酶5U，加ddH2O至25μL。
JEV基因Ⅲ型RT-LAMP反应体系：10×ThermoPol buffer 2.5μL，dNTPs(10mM each)2.0μL，甜菜碱(5M)2.0μL，样品RNA2.0μL，MgSO4(100mM)1.0μL，基因Ⅲ型-FIP和基因Ⅲ型-BIP(50pmol/μL)各1.0μL，基因Ⅲ型-F3和基因Ⅲ型-B3(5pmol/μL)各1.0μL，Bst DNAploymerase 6U，AMV反转录酶5U，加ddH2O至25μL。
进一步，基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特异性RT-LAMP方法的反应温度为：59-65℃，最佳反应温度均为62℃，反应时间应不少于45min。
本发明提供的鉴别日本乙型脑炎病毒基因Ⅰ型和基因Ⅲ型的RT-LAMP方法，其结果可视化，易于辨认，与传统方法相比，在灵敏度、时效性等方面具有明显优势，可满足实验室及临床上简便、快速、准确进行区分鉴定的要求。
附图说明
图1图是本发明实施例提供的、加入钙黄绿素染料在紫外灯下的结果判定示意图；
图2是本发明实施例提供的加入钙黄绿素染料在自然光下的结果判定示意图；
图3是本发明实施例提供的LAMP产物的结果判定(沉淀)示意图；
图4是本发明实施例提供的LAMP产物的结果判定(电泳)示意图；
图5是本发明实施例提供的温度对G Ⅰ-LAMP反应的影响示意图；
图6是本发明实施例提供的温度对GⅢ-LAMP反应的影响示意图；
图7是本发明实施例提供的反应时间对G Ⅰ-LAMP反应的影响示意图；
图8是本发明实施例提供的反应时间对GⅢ-LAMP反应的影响示意图；
图9是本发明实施例提供的G Ⅰ-LAMP特异性试验结果示意图；
图10是本发明实施例提供的GⅢ-LAMP特异性试验结果示意图；
图11是本发明实施例提供的G Ⅰ-LAMP灵敏性试验结果示意图；
图12是本发明实施例提供的GⅢ-LAMP灵敏性试验结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
本发明的目的是通过如下方案实现的：
1、引物设计
序列比对：从GenBank中检索获得日本乙型脑炎病毒基因组序列，根据Chen等(1990)建立的方法，利用Mega 5.0对序列进行系统进化分析以确定病毒基因型，根据分析结果选择基因Ⅰ型和Ⅲ型毒株基因组序列，利用软件DNAman 6.0和DNAstar 7.1对序列进行比对分析，确定并分析其SNPs位点。
引物设计：根据序列比对分析结果，通过http://primerexplorer.jp/e/(PrimerExplorer V4)在线软件设计LAMP引物，并利用Primer premier 5.0对引物进行编辑修改，分别设计了2套特异性引物分别用于特异性扩增基因Ⅰ型和Ⅲ型JEV，每套引物包括1对外引物F3/B3和1对内引物FIP/BIP。JEV G Ⅰ特异性RT-LAMP引物组：G Ⅰ-F3、G Ⅰ-B3、G Ⅰ-FIP和G Ⅰ-BIP；JEV GⅢ特异性RT-LAMP引物组：GⅢ-F3、GⅢ-B3、GⅢ-FIP和GⅢ-BIP。引物序列如下：
G Ⅰ-F3：5ˊ-GGACATTGCGGACGTCAT-3ˊ；
G Ⅰ-B3：5ˊ-ATTGTCGCACCAGCAGTC-3ˊ；
G Ⅰ-FIP：5ˊ-TGCTCGGACCCAACATCTGTTTTGTGATCCCCACCTCAAAAGGT-3ˊ；
G Ⅰ-BIP：5ˊ-YRAATGTCCGAAGCTTGCCGTTGTCTTCCGGATCGTTGCC-3ˊ；
GⅢ-F3：5ˊ-CTTGTGCAGGAGCCATGAA-3ˊ；
GⅢ-B3：5ˊ-TTGCCCATGGTAAGCTTAGG-3ˊ；
GⅢ-FIP：5ˊ-ACGTCTGCAATGTCCGTGTTGTTTGTTGTCGAATTTCCAGGGG-3ˊ；
GⅢ-BIP：5ˊ-AGAGAACAGATGCTGGTTCCGGTTTTCCTCACACATGTAGCCG-3ˊ。
2、样品处理
对于蚊虫及猪组织样品，取适量去掉翅膀和腿的蚊虫样品(100只左右)、猪流产胎儿脑组织(50～100mg)等组织样品于预冷的研钵中，加入2％的维持液5～10ml，反复研磨至组织碎片基本消失为止，将研磨液吸入1.5ml的Eppendoff管，于4℃，3000g离心10min，取上清置于－80℃保存备用；对于接毒的细胞培养液，三冻三融后以1000g离心10min，取上清于－80℃保存备用；对于血清及脑脊液样品，直接－80℃保存备用。
3、病毒总RNA的提取
采用RNAsimple总RNA提取试剂盒对样品总RNA进行抽提，具体步骤如下：
a)取250μl处理的样品液于EP管中，加入750μl细胞裂解液RZ，轻轻摇匀，室温下静置5min；
b)4℃，12 000r/min离心5min，取上清转入新EP管中；
c)加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温下静置3min；
d)4℃，12 000r/min离心10min，样品分三层，取上层水相转移至另一新EP管中(约600μl)；
e)缓慢加入0.5倍体积(约300μl)无水乙醇，轻柔吹打混匀后一同转入吸附柱CR3中，4℃，12 000r/min离心1min，弃废液；
f)向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RD，4℃12 000r/m离心1min，弃废液；
g)向吸附柱CR3中加入700μl漂洗液RW，室温下静置2min，4℃12 000r/m离心1min，弃废液；
h)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，室温下静置2min，4℃12 000r/m离心1min，弃废液；
i)4℃，12 000r/min空离2min，弃废液；
j)将吸附柱CR3转入另一新EP管中，开盖室温下晾干5min；
k)向吸附柱CR3中加入30～70μl RNase-free ddH2O洗脱液(加入量根据样品浓度确定)，室温下静置2min，4℃12 000r/m离心2min；
l)将EP管内液体吸出，重新加入吸附柱CR3中，按照(k)步骤再洗脱一次，收集液体，立即反转录或－80℃保存，以防RNA降解。
4、RT-LAMP反应体系及条件
JEV G Ⅰ RT-LAMP反应体系及条件：10×ThermoPol buffer 2.5μl，dNTPs(10mM each)3μl，甜菜碱(5M)4μl，样品RNA 2μl，MgSO4(100mM)1.5μl，G Ⅰ-FIP和G Ⅰ-BIP(50pmol/μl)各1μl，G Ⅰ-F3和G Ⅰ-B3(5pmol/μl)各1μl，Bst DNAploymerase(8U/μl)1μl，AMV反转录酶5U，钙黄绿素荧光染料2μl，加ddH2O至25μl。62℃孵育45min。
JEV GⅢRT-LAMP反应体系及条件：10×ThermoPol buffer 2.5μl，dNTPs(10mM each)3μl，甜菜碱(5M)4μl，样品RNA 2μl，MgSO4(100mM)1.5μl，GⅢ-FIP和GⅢ-BIP(50pmol/μl)各1μl，GⅢ-F3和GⅢ-B3(5pmol/μl)各1μl，Bst DNAploymerase(8U/μl)0.8μl，AMV反转录酶5U，钙黄绿素荧光染料2μl，加ddH2O至25μl。62℃孵育45min。
5、RT-LAMP反应结果判定
通过在反应起始时在反应管内加入锰离子淬灭的钙黄绿素荧光染料(购自广州迪奥生物科技有限公司)，观察反应结束时反应管内液体颜色变化以判定结果：在紫外灯下，阳性呈紫色，阴性呈橙色；在自然光下，阳性呈黄绿色，阴性呈橙色。同时在阳性反应管的底部可见白色沉淀，而阴性管内澄清透明。RT-LAMP产物在1.5-2％的琼脂糖凝胶电泳后，阳性呈现明显的梯状条带，而阴性则无此梯状条带。
6、RT-LAMP特异性试验
本发明用JEV G Ⅰ特异性引物分别检测JEV SCYA201201(Ⅰ型)、JEVSA14-14-2(Ⅲ型)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)，结果只有JEVSCYA201201(Ⅰ型)呈阳性，其它均为阴性。同时本发明用JEV GⅢ特异性引物分别检测JEV SCYA201201(Ⅰ型)、JEV SA14-14-2(Ⅲ型)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)，结果只有JEV SA14-14-2呈阳性，其它均为阴性。两种检测方法均显示出良好的特异性，即JEV G Ⅰ和JEV GⅢ特异性RT-LAMP检测方法只能检测对应基因型的JEV。
7、RT-LAMP灵敏性试验
以JEV-F(5ˊ-GTGTGAACTTCTTGGCTTAGTATCG-3ˊ)和JEV-R(5ˊ-CCAAGTGGCTCCACTGGCTCCTTCTAT-3ˊ)为引物分别扩增JEVSCYA201201和JEV SA14-14-2核酸，回扩增片段并克隆至pGEM T-Easy Vector，利用Nde Ⅰ线性化质粒，以线性化的质粒为转录模板，利用TaKaRa in vitroTranscription T7Kit进行体外转录合成cRNA，分别命名为G Ⅰ-cRNA和GⅢ-cRNA，对转录合成的cRNA进行Dnase处理并进行酚氯仿重提，利用紫外分光光度计对cRNA进行定量。10倍系列稀释后用于试验。
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1
1.引物设计
序列比对：从GenBank中检索获得日本乙型脑炎病毒基因组序列，根据Chen等(1990)建立的方法，利用Mega 5.0对序列进行系统进化分析以确定病毒基因型，根据分析结果选择基因Ⅰ型和Ⅲ型毒株基因组序列，利用软件DNAman 6.0和DNAstar 7.1对序列进行比对分析，确定并分析其SNPs位点。
引物设计：根据序列比对分析结果，通过http://primerexplorer.jp/e/(PrimerExplorer V4)在线软件设计LAMP引物，并利用Primer premier 5.0对引物进行编辑修改，分别设计了2套特异性引物分别用于特异性扩增基因Ⅰ型(G Ⅰ)和Ⅲ型(GⅢ)JEV，每套引物包括1对外引物F3/B3和1对内引物FIP/BIP。JEV G Ⅰ特异性RT-LAMP引物组：G Ⅰ-F3、G Ⅰ-B3、G Ⅰ-FIP和G Ⅰ-BIP；JEVGⅢ特异性RT-LAMP引物组：GⅢ-F3、GⅢ-B3、GⅢ-FIP和GⅢ-BIP。根据LAMP模板区，利用Primer premier 5.0设计一套PCR引物(JEV-F和JEV-R)扩增LAMP模板区，用于标准阳性模板的制备。引物序列如下：
G Ⅰ-5ˊ-GGACATTGCGGACGTCAT-3ˊ
F3
G Ⅰ-5ˊ-ATTGTCGCACCAGCAGTC-3ˊ
B3
G Ⅰ-5ˊ-TGCTCGGACCCAACATCTGTTTTGTGATCC
FIP    CCACCTCAAAAGGT-3ˊ
G Ⅰ-5ˊ-YRAATGTCCGAAGCTTGCCGTTGTCTTCC
BIP    GGATCGTTGCC-3ˊ
GⅢ-5ˊ-CTTGTGCAGGAGCCATGAA-3ˊ
F3
GⅢ-5ˊ-TTGCCCATGGTAAGCTTAGG-3ˊ
B3
GⅢ-5ˊ-ACGTCTGCAATGTCCGTGTTGTTTGTTGTC
FIP    GAATTTCCAGGGG-3ˊ
GⅢ-5ˊ-AGAGAACAGATGCTGGTTCCGGTTTTCCT
BIP    CACACATGTAGCCG-3ˊ
JEV-5ˊ-GTGTGAACTTCTTGGCTTAGTATCG-3ˊ
F
JEV-5ˊ-CCAAGTGGCTCCACTGGCTCCTTCTAT-3ˊ
R
2.样品处理
对于蚊虫及猪脑组织样品，取适量去掉翅膀和腿的蚊虫样品(100只左右)、猪流产胎儿脑组织(50～100mg)等组织样品于预冷的研钵中，加入2％的维持液5～10ml，反复研磨至组织碎片基本消失为止，将研磨液吸入1.5ml的Eppendoff管，于4℃，3000g离心10min，取上清置于－80℃保存备用；对于接毒的细胞培养液，三冻三融后以1000g离心10min，取上清于－80℃保存备用；对于血清及脑脊液样品，直接－80℃保存备用。
3.病毒总RNA的提取
采用RNAsimple总RNA提取试剂盒对样品总RNA进行抽提，具体步骤如下：
a)取250μl处理的样品液于EP管中，加入750μl细胞裂解液RZ，轻轻摇匀，室温下静置5min；
b)4℃，12 000r/min离心5min，取上清转入新EP管中；
c)加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温下静置3min；
d)4℃，12 000r/min离心10min，样品分三层，取上层水相转移至另一新EP管中(约600μl)；
e)缓慢加入0.5倍体积(约300μl)无水乙醇，轻柔吹打混匀后一同转入吸附柱CR3中，4℃，12 000r/min离心1min，弃废液；
f)向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RD，4℃12 000r/m离心1min，弃废液；
g)向吸附柱CR3中加入700μl漂洗液RW，室温下静置2min，4℃12 000r/m离心1min，弃废液；
h)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，室温下静置2min，4℃12 000r/m离心1min，弃废液；
i)4℃，12 000r/min空离2min，弃废液；
j)将吸附柱CR3转入另一新EP管中，开盖室温下晾干5min；
k)向吸附柱CR3中加入30～70μl RNase-free ddH2O洗脱液(加入量根据样品浓度确定)，室温下静置2min，4℃12 000r/m离心2min；
l)将EP管内液体吸出，重新加入吸附柱CR3中，按照(k)步骤再洗脱一次，收集液体，立即反转录或－80℃保存，以防RNA降解。
4.RT-LAMP反应
JEV G ⅠRT-LAMP反应体系及条件：10×ThermoPol buffer 2.5μl，dNTPs(10mM each)3μl，甜菜碱(5M)4μl，样品RNA 2μl，MgSO4(100mM)1.5μl，G Ⅰ-FIP和G Ⅰ-BIP(50pmol/μl)各1μl，G Ⅰ-F3和G Ⅰ-B3(5pmol/μl)各1μl，Bst DNAploymerase(8U/μl)1μl，AMV反转录酶5U，钙黄绿素荧光染料2μl，加ddH2O至25μl。62℃孵育45min。
JEV GⅢRT-LAMP反应体系及条件：10×ThermoPol buffer 2.5μl，dNTPs(10mM each)3μl，甜菜碱(5M)4μl，样品RNA 2μl，MgSO4(100mM)1.5μl，GⅢ-FIP和GⅢ-BIP(50pmol/μl)各1μl，GⅢ-F3和GⅢ-B3(5pmol/μl)各1μl，Bst DNAploymerase(8U/μl)0.8μl，AMV反转录酶5U，钙黄绿素荧光染料2μl，加ddH2O至25μl。62℃孵育45min。
5.RT-LAMP的结果判定
通过在反应起始时在反应管内加入锰离子淬灭的钙黄绿素荧光染料，观察反应结束时反应管内液体颜色变化以判定结果：在紫外灯下，阳性呈紫色，阴性呈橙色(图1)；在自然光下，阳性呈黄绿色，阴性呈橙色(图2)。同时在阳性反应管的底部可见白色沉淀(图3)，而阴性管内澄清透明。RT-LAMP产物在1.5-2％的琼脂糖凝胶电泳后，阳性呈现明显的梯状条带，而阴性则无此梯状条带(图4)。
实施例2
1.反应温度对RT-LAMP反应的影响
本发明分别对2套引物设置了不同的温度，在其它条件均相同的情况下，2套引物分别在59.0℃、60.0℃、61.0℃、62.0℃、63.0℃、64.0℃、65.0℃进行RT-LAMP反应，通过1.5-2％的琼脂糖凝胶电泳观察各反应结果并确定反应的最佳温度。结果在59-65℃之间均能发生反应，最终确定JEV G Ⅰ和GⅢ特异性RT-LAMP反应的最佳温度均为62℃(图5、图6)。
2.反应时间对RT-LAMP反应的影响
在其他条件一致的情况下，根据优化的温度，分别调节反应时间分别为15、30、45、60和75min，探索该方法的最低反应时间。结果显示，反应30min时，JEV G Ⅰ和GⅢ特异性RT-LAMP产物电泳即可出现梯状条带，在45min时可见明显的梯状条带，故最终确定JEV G Ⅰ和GⅢ特异性RT-LAMP反应时间为45min(图7、图8)。
实施例3
1.RT-LAMP的特异性试验
本发明用JEV G Ⅰ特异性引物组分别检测JEV SCYA201201(Ⅰ型)、JEVSA14-14-2(Ⅲ型)、CSFV、PRRSV、PRV、PPV和PCV2，结果只有JEVSCYA201201呈阳性，其它均为阴性。同时本发明用JEV GⅢ特异性引物组分别检测JEV SCYA201201(Ⅰ型)、JEV SA14-14-2(Ⅲ型)、CSFV、PRRSV、PRV、PPV和PCV2，结果只有JEV SA14-14-2呈阳性，其它均为阴性。两种检测方法均显示出良好的特异性，即JEV G Ⅰ和JEV GⅢ特异性RT-LAMP检测方法只能检测对应基因型的JEV(图9、图10)。
2.RT-LAMP的灵敏性试验
cRNA定量结果：G Ⅰ-cRNAA260＝0.96，A280＝0.52，A260/A280＝1.85，RNA浓度为＝768ng/μL，拷贝数约：1.2×1012copies/μL；GⅢ-cRNAA260＝0.73，A280＝0.38，A260/A280＝1.92，RNA浓度为＝584ng/μL，拷贝数约：9.5×1011copies/μL。分别调整G Ⅰ-cRNA和GⅢ-cRNA浓度至1.2×107copies/μL，10倍系列稀释至1.2×100copies/μL后用于试验。结果显示JEV GⅢ的检出限为24copies(图11),JEV G Ⅰ的检出限为24copies(图12)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种鉴别日本乙型脑炎病毒基因Ⅰ型和基因Ⅲ型的RT-LAMP方法，其特征在于，该鉴别日本乙型脑炎病毒基因Ⅰ型和基因Ⅲ型的RT-LAMP方法包含基因Ⅰ型特异性RT-LAMP引物组：基因Ⅰ型-F3、基因Ⅰ型-B3、基因Ⅰ型-FIP和基因Ⅰ型-BIP；基因Ⅲ型特异性RT-LAMP引物组：基因Ⅲ型-F3、基因Ⅲ型-B3、基因Ⅲ型-FIP和基因Ⅲ型-BIP；基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特异性RT-LAMP引物组序列如下：
基因Ⅰ型-F3：5ˊ-GGACATTGCGGACGTCAT-3ˊ；
基因Ⅰ型-B3：5ˊ-ATTGTCGCACCAGCAGTC-3ˊ；
基因Ⅰ型-FIP：
5ˊ-TGCTCGGACCCAACATCTGTTTTGTGATCCCCACCTCAAAAGGT-3ˊ；
基因Ⅰ型-BIP：
5ˊ-YRAATGTCCGAAGCTTGCCGTTGTCTTCCGGATCGTTGCC-3ˊ；
基因Ⅲ型-F3：5ˊ-CTTGTGCAGGAGCCATGAA-3ˊ；
基因Ⅲ型-B3：5ˊ-TTGCCCATGGTAAGCTTAGG-3ˊ；
基因Ⅲ型-FIP：
5ˊ-ACGTCTGCAATGTCCGTGTTGTTTGTTGTCGAATTTCCAGGGG-3ˊ；
基因Ⅲ型-BIP：
5ˊ-AGAGAACAGATGCTGGTTCCGGTTTTCCTCACACATGTAGCCG-3ˊ。
2.根据权利要求1所述的鉴别日本乙型脑炎病毒基因Ⅰ型和基因Ⅲ型的RT-LAMP方法，其特征在于，JEV基因Ⅰ型RT-LAMP反应体系：10×ThermoPol buffer 2.5μL，dNTPs 2.0μL，甜菜碱2.0μL，样品RNA2.0μL，MgSO41.0μL，基因Ⅰ型-FIP和基因Ⅰ型-BIP各0.8μL，基因Ⅰ型-F3和基因Ⅰ型-B3各1.0μL，BstDNAploymerase 8 U，AMV反转录酶5 U，加ddH2O至25μL；
JEV基因Ⅲ型RT-LAMP反应体系：10×ThermoPol buffer 2.5μL，dNTPs 2.0μL，甜菜碱2.0μL，样品RNA2.0μL，MgSO41.0μL，基因Ⅲ型-FIP和基因Ⅲ型-BIP各1.0μL，基因Ⅲ型-F3和基因Ⅲ型-B3各1.0μL，BstDNAploymerase 6 U，AMV反转录酶5 U，加ddH2O至25μL。
3.根据权利要求1或2所述的鉴别日本乙型脑炎病毒基因Ⅰ型和基因Ⅲ型的RT-LAMP方法，其特征在于，基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特异性RT-LAMP方法的反应温度为：59-65℃，最佳反应温度均为62℃，反应时间应不少于45min。
CN201410699759.3A 2014-11-27 2014-11-27 一种鉴别日本乙型脑炎病毒基因ⅰ型和基因ⅲ型的rt-lamp方法 Pending CN104388591A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410699759.3A CN104388591A (zh) 2014-11-27 2014-11-27 一种鉴别日本乙型脑炎病毒基因ⅰ型和基因ⅲ型的rt-lamp方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410699759.3A CN104388591A (zh) 2014-11-27 2014-11-27 一种鉴别日本乙型脑炎病毒基因ⅰ型和基因ⅲ型的rt-lamp方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104388591A true CN104388591A (zh) 2015-03-04

Family

ID=52606547

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410699759.3A Pending CN104388591A (zh) 2014-11-27 2014-11-27 一种鉴别日本乙型脑炎病毒基因ⅰ型和基因ⅲ型的rt-lamp方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104388591A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101758609B1 (ko) 2015-09-08 2017-07-17 대한민국 일본뇌염바이러스 검출 및 유전자형 판별용 조성물
CN107937615A (zh) * 2017-12-20 2018-04-20 广东省农业科学院动物卫生研究所 用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的引物和探针

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101724714A (zh) * 2009-12-30 2010-06-09 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增试剂盒
CN102399909A (zh) * 2011-12-13 2012-04-04 华南农业大学 一种检测日本乙型脑炎病毒的rt-lamp可视化试剂盒及其应用
CN103695561A (zh) * 2013-11-29 2014-04-02 华南农业大学 检测日本乙型脑炎病毒的rt-lamp核酸试纸条试剂盒及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101724714A (zh) * 2009-12-30 2010-06-09 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增试剂盒
CN102399909A (zh) * 2011-12-13 2012-04-04 华南农业大学 一种检测日本乙型脑炎病毒的rt-lamp可视化试剂盒及其应用
CN103695561A (zh) * 2013-11-29 2014-04-02 华南农业大学 检测日本乙型脑炎病毒的rt-lamp核酸试纸条试剂盒及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU H ET AL.: "Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Japanese encephalitis virus in swine and mosquitoes", 《VECTOR BOME ZOONOTIC DIS》 *
张亮等: "日本脑炎病毒I型与III型复合RT-PCR鉴别方法的建立", 《中国兽医学》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101758609B1 (ko) 2015-09-08 2017-07-17 대한민국 일본뇌염바이러스 검출 및 유전자형 판별용 조성물
CN107937615A (zh) * 2017-12-20 2018-04-20 广东省农业科学院动物卫生研究所 用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的引物和探针
CN107937615B (zh) * 2017-12-20 2021-06-25 广东省农业科学院动物卫生研究所 用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的引物和探针

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111394511B (zh) 2019新型冠状病毒的检测引物组、探针组及检测试剂盒
CN106947838B (zh) 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
Arola et al. Identification of enteroviruses in clinical specimens by competitive PCR followed by genetic typing using sequence analysis
CN113817868A (zh) 一种用于检测新型冠状病毒及其变异株的引物、探针组合物及试剂盒
CN115466800A (zh) 一种检测猴痘病毒及其亚型的多重荧光定量pcr试剂盒
CN112739833A (zh) 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用
CN112094944A (zh) 一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒
CN105907890A (zh) 一种快速区分HP-PRRS疫苗GDr180株与野毒株的引物、探针及方法
Ji et al. Rapid and visual detection of novel astroviruses causing fatal gout in goslings using one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification
CN111518955A (zh) 快速鉴别猫肠道冠状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的hrm引物对、试剂盒及方法
CN111676316B (zh) 一种快速区分非洲猪瘟病毒基因ii型与其它基因型的引物、探针及其检测方法
CN109182493A (zh) 人16p11.2微缺失综合征检测的引物和试剂盒及其检测方法
CN104388591A (zh) 一种鉴别日本乙型脑炎病毒基因ⅰ型和基因ⅲ型的rt-lamp方法
CN111471800B (zh) 检测新型冠状病毒的试剂盒及其扩增引物组合物
CN105154584A (zh) 一种快速区分prrsv经典毒株和变异毒株的hrm非标记探针方法及其引物和探针
CN112011650A (zh) 中华蜜蜂囊状幼虫病毒rt-rpa检测引物和探针及试剂盒
CN102586433B (zh) 一种聋病易感基因12S rRNA 1494C＞T荧光检测试剂盒及其应用
CN107937615B (zh) 用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的引物和探针
CN106244728A (zh) 一种pedv和tgev双重rt‑pcr检测方法及其探针引物组合与试剂盒
CN103484563A (zh) 检测绵羊痘病毒的试剂盒
RU2715625C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 1 генотипа
RU2715617C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 2 генотипа
Titov et al. Genotyping of classical swine fever virus using high-resolution melt analysis
CN111549175B (zh) 一种检测口岸输入2019新型冠状病毒多重荧光rt-pcr检测试剂
Chung et al. The application of a novel 5-in-1 multiplex reverse transcriptase–polymerase chain reaction assay for rapid detection of SARS-CoV-2 and differentiation between variants of concern

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150304