RU2715617C1 - Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 2 генотипа - Google Patents
Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 2 генотипа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2715617C1 RU2715617C1 RU2019115620A RU2019115620A RU2715617C1 RU 2715617 C1 RU2715617 C1 RU 2715617C1 RU 2019115620 A RU2019115620 A RU 2019115620A RU 2019115620 A RU2019115620 A RU 2019115620A RU 2715617 C1 RU2715617 C1 RU 2715617C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- wnv
- west nile
- 2type
- fluorescence
- genotype
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к области молекулярной биологии. Разработан набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса Западного Нила 2 генотипа методом ПЦР, обладающих активностью прямого и обратного праймеров, и зонда, сконструированного по типу «молекулярного маяка», обеспечивающего флуоресцентную детекцию продукта амплификации размером 116 п.н. в реальном времени. Изобретение позволяет в короткий срок с высокой специфичностью выявлять указанный вирус и может быть использован при проведении эпидемиологического надзора за лихорадкой Западного Нила. 1 ил., 1 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано для идентификации вируса Западного Нила 2 генотипа West Nile virus lineage 2 в пробах биологического материала и клеточных культурах специалистами клинической лабораторной диагностики, службы Роспотребнадзора и в научных исследованиях.
Вирус Западного Нила (ВЗН, West Nile virus) принадлежит к семейству Flaviviridae, роду Flavivirus, антигенному комплексу вирусов японского энцефалита (Japanese encephalitis virus group). По принятой в Российской Федерации классификации патогенных биологических агентов ВЗН относят к вирусам II группы патогенности.
ВЗН является возбудителем природно-очаговой арбовирусной инфекции с трансмиссивным механизмом передачи, называемой лихорадкой Западного Нила (ЛЗН). Клинические проявления ЛЗН варьируют от гриппоподобного синдрома до развития тяжелых осложнений в форме менингита и менингоэнцефалита. Летальность при ЛЗН, в зависимости от иммунного статуса заболевших, составляет от 4 до 10%. С 1999 года лабораторно подтвержденные случаи ЛЗН на территории России регистрируют ежегодно. Ареалы ВЗН занимают огромные территории в пределах экваториального, тропического и умеренного климатических поясов в Африке, Европе, Америке, Азии и Австралии. В России ареал распространения ВЗН охватывает территории юга европейской части, регионы Сибири и Дальнего Востока.
По современным данным штаммы ВЗН разделены на 9 генотипов (генетических линий). В России достоверно зарегистрирована циркуляция 1, 2 и 4 генотипов ВЗН, имеющих разное эпидемическое значение. Так, штаммы ВЗН генотипов 1 и 2 являются высокопатогенными для человека, а патогенность ВЗН 4 генотипа для млекопитающих пока не установлена. Имеются данные, что инфицирование некоторыми штаммами ВЗН субгенотипа 1а, приводит к появлению более тяжелых нейроинвазивных форм ЛЗН. Это, по-видимому, свидетельствует о более высокой вирулентности некоторых штаммов ВЗН субгенотипа 1а по сравнению со штаммами субгенотипа 1b и генотипа 2.
Генотипирование - комплексный анализ уникального для каждого живого организма генотипа на основе изучения его генома. Циркуляция разных генетических линий вируса на территории Российской Федерации диктует необходимость разработки и совершенствования диагностических методов и тест-систем для выявления и дифференциации штаммов возбудителя лихорадки Западного Нила.
Одним из перспективных подходов выявления генотипа ВЗН в пробах биологического материала с высокой чувствительностью и специфичностью является использование полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР). ОТ-ПЦР является прямым методом выявления РНК ВЗН. В основе метода ОТ-ПЦР лежит последовательное осуществление двух процессов: реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. Реакция обратной транскрипции представляет собой синтез цепи комплементарной ДНК (кДНК) по матрице РНК посредством фермента ревертазы. Метод ПЦР заключается в амплификации целевых участков полученной кДНК посредством фермента ДНК-полимеразы и праймеров, фланкирующих участки уникальных кДНК-мишеней, существующих только у определенных генотипов вируса.
Для эффективного проведения ОТ-ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфичные для каждого генотипа возбудителя. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК специфичного фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфичного участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой.
При детекции продуктов амплификации использование специальных флуоресцентных меток позволяет отказаться от стадии электрофореза, что не только сокращает время проведения анализа, но и снижает риск контаминации продуктами ПЦР и, соответственно, нивелирует ложноположительные результаты. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе реакции амплификации, весь анализ можно проводить в двух зонах лаборатории силами одного сотрудника. Этот подход позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм.
Известен способ обнаружения вируса лихорадки Западного Нила, предусматривающий проведение реакции обратной транскрипции с РНК вируса и последующей двойной амплификацией (патент РФ №2199589 от 27.02.2003 г.), а также набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени (патент РФ №2629604 от 30.08.2017 г.). Однако предложенные в данных патентах олигонуклеотиды не позволяют определять генотип ВЗН.
В настоящее время известны зарегистрированные на территории РФ коммерческие наборы реагентов для обнаружения РНК ВЗН в биологическом материале: «АмплиСенс WNV-FL» (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), «ОМ-скрин ЛЗН/ЛДР-РВ» (ЗАО «Синтол», Россия), «ГенНил-РЭФ» (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора, Россия). Данные наборы реагентов обладают достаточной чувствительностью и специфичностью, однако с их помощью возможно только выявление генетического материала ВЗН без дифференциации его генетических линий.
Разработаны олигонуклеотидные праймеры для идентификации 1a, 1b, 2 и 4 генотипов ВЗН методом секвенирования фрагментов генома [Жуков, К.В. Эпидемиологическая характеристика лихорадки Западного Нила и молекулярно-генетические особенности изолятов, циркулирующих на территории Волгоградской области: диссертация кандидата медицинских наук: 14.02.02 / Жуков Кирилл Вадимович. - Волгоград, 2013. - 133 с.]. Для определения полногеномной нуклеотидной последовательности штаммов ВЗН 2 генотипа методом секвенирования по Сенгеру известны специфичные праймеры, предложенные Прилиповым А.Г. [Прилипов, А.Г. Генетическая характеристика штаммов вируса Западного Нила: диссертация доктора биологических наук: 03.01.03 / 03.02.02 / Прилипов Алексей Геннадьевич. - М., 2015. - 213 с.]. Однако способ генотипирования основанный на секвенировании может быть реализован только для образцов с высокой концентрацией вирусной РНК. Большинство клинических образцов имеет низкую вирусную нагрузку, что снижает эффективность применения секвенирования для определения генотипа ВЗН в нативном материале.
Наиболее близким аналогом является подход одновременного выявления и дифференциации вируса Западного Нила 1 и 2 генотипов, а также вируса Усуту, методом количественной мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени с применением технологии «TaqMan» [Javier Del Amo et al. A novel quantitative multiplex real-time RT-PCR for the simultaneous detection and differentiation of West Nile virus lineages 1 and 2, and of Usutu virus // J. Virol. Methods. 189 (2013) 321-327]. Однако в данной работе дифференциацию осуществляли только с помощью зондов, а для получения ампликонов использовали универсальную пару праймеров для обоих генотипов ВЗН, что может снижать специфичность реакции.
Целью настоящего изобретения является разработка набора специфичных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса Западного Нила 2 генотипа методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.
Цель достигается созданием набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса Западного Нила 2 генотипа методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, комплементарных фрагментам гена полипротеина вируса Западного Нила 2 генотипа, обладающих активностью прямого и обратного праймеров, и зонда, сконструированного по типу «молекулярного маяка», обеспечивающего флуоресцентную детекцию продукта амплификации размером 116 п.н. в реальном времени, имеющих следующую структуру:
5'-GCTATGCTGAGTCTGATTG-3' - WNV-2type-F
5'-CCTCTCCATCTGTCCAG-3' - WNV-2type-R
5'-(ROX)CCCAATACGTTTCGTGTTGGCTCTTTGGG(BHQ2)-3' - WNV-2type-P
Где:
ROX - карбокси-Х-родамин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого сотавляет 580 нм, а длина волны флуоресценции - 605 нм;
BHQ2 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 550-650 нм.
Характеристика олигонуклеотидных праймеров, зонда и кДНК мишени для идентификации вируса Западного Нила 2 генотипа
Основываясь на данных, представленных в генетической базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США), для идентификации ВЗН 2 генотипа методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией были подобраны праймеры, обозначенные WNV-2type-F/WNV-2type-R, комплементарные фрагменту гена полипротеина ВЗН (flavivirus polyprotein gene). Расчетная длина специфичного фрагмента, фланкируемого разработанными праймерами, составила 116 п.н.
Для детекции продуктов ОТ-ПЦР в режиме реального времени был сконструирован зонд формата «молекулярный маяк», обозначенный WNV-2type-P, на концах которого расположены флуорофор и гаситель флуоресценции. Подобная структура зонда обеспечивает максимальный эффект тушения и низкую фоновую флуоресценцию, поскольку молекулы флуорофора и гасителя сближены в пространстве.
Апробацию разработанного набора олигонуклеотидов осуществляли с использованием проб биологического материала, инфицированного ВЗН 1, 2 и 4 генотипов. Пробы были получены из Референс-центра по мониторингу за возбудителем лихорадки Западного Нила, функционирующего на базе ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора. Генотип ВЗН во всех использованных образцах дополнительно подтверждали методом секвенирования. В качестве положительного контроля использовали РНК ВЗН 2 генотипа.
Для обнаружения ВЗН 2 генотипа методом ОТ-ПЦР в реальном времени оценена возможность использования сконструированного набора праймеров и зонда при анализе различного клинического материала - кровь, сыворотки крови, моча, ткани головного мозга, а также суспензий комаров. Показано, что в реакции амплификации возбудитель детектировали во всех образцах биологического материала, инфицированных ВЗН 2 генотипа.
Примеры конкретного выполнения
Пример 1. Методика конструирования набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации кДНК ВЗН 2 генотипа методом ОТ-ПЦР и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.
На основе множественного выравнивания in silico полногеномных нуклеотидных последовательностей различных штаммов ВЗН 2 генотипа, депонированных в генетических базах данных (GenBank, EMBL, DDBJ) для конструирования прямого WNV-2type-F и обратного WNV-2type-R праймеров, предназначенных для идентификации вируса Западного Нила 2 генотипа, была выбрана последовательность гена, кодирующего полипротеин ВЗН (flavivirus polyprotein gene), длина которой составляет 10293 нуклеотида (GenBank NCBI, GeneID: 912267). Размеры специфичных праймеров WNV-2type-F и WNV-2type-R составили 19 и 17 нуклеотидов, соответственно. Расчетная длина фрагмента кДНК ВЗН, фланкируемого предлагаемыми праймерами - 116 п.н.
При использовании компьютерной программы PerlPrimer v1.1.21 была проанализирована структура выбранной пары праймеров WNV-2type-F / WNV-2type-R (образование димеров, шпилек и других вторичных структур) и показана их теоретическая пригодность для успешной инициации реакции амплификации.
Для флуоресцентной детекции продуктов ОТ-ПЦР в режиме реального времени сконструирован специфичный флуоресцентно-меченый олигонуклеотидный зонд, обозначенный WNV-2type-P, размером 29 нуклеотидов, который гибридизуется на участке ампликона между прямым WNV-2type-F и обратным WNV-2type-R праймерами. Комплементарные концевые последовательности зонда образуют «шпильку» по принципу «молекулярного маяка». В качестве метки использовали флуорофор ROX на 5'-конце зонда и гаситель флуоресценции BHQ2 - на 3'-конце. В онлайн-режиме с использованием программы Mfold на интернет-сайте http://unafold.rna.albany.edu оценивали вторичную структуру и термодинамические параметры разработанного зонда.
Характеристика сконструированных олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления кДНК вируса Западного Нила 2 генотипа представлена в таблице 1.
Сконструированные праймеры и зонд были проанализированы с помощью компьютерной программы BLAST на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) для установления гомологии между ними и нуклеотидными последовательностями близкородственных вирусов и гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (GenBank, EMBL, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.
Пример 2. Амплификация и детекция специфичных фрагментов кДНК ВЗН с помощью разработанного набора праймеров WNV-2type-F / WNV-2type-R и флуоресцентно-меченого зонда WNV-2type-P для идентификации вируса Западного Нила 2 генотипа методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
Работу с образцами биологического материала проводили согласно требованиям СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами 1-Й групп патогенности (опасности)» и МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение РНК ВЗН из биологических образцов осуществляли с помощью наборов реагентов «РИБО-золь-С» и «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкциями к наборам.
Для проведения ОТ-ПЦР в режиме реального времени готовили реакционную смесь, в состав которой помимо анализируемой РНК ВЗН, входили: разработанные праймеры WNV-2type-F / WNV-2type-R и флуоресцентно-меченый зонд WNV-2type-P, а также дезоксирибонуклеозид-трифосфаты, буферный раствор, раствор хлорида магния, фермент ревертаза MMlv и фермент Taq-F-ДНК-полимераза. В качестве отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили равный объем дистиллированной воды. В качестве положительного контроля использовали РНК ВЗН 2 генотипа.
Обратную транскрипцию и ПЦР проводили в одной пробирке. Объем реакционной смеси составлял 25 мкл.
Условия проведения реакции: этап обратной транскрипции при 50°С - 30 мин; этап предварительной денатурации при 95°С - 15 мин; первое циклирование (5 повторений) - денатурация при 95°С - 5 с; отжиг праймеров при 56°С - 25 с; элонгация цепи при 72°С - 15 с; второе циклирование (40 повторений) - денатурация при 95°С - 5 с; отжиг праймеров при 56°С - 25 с; элонгация цепи при 72°С - 15 с. Детекцию накопления продуктов реакции осуществляли по каналу Orange на этапе второго циклирования при температуре 56°С.
Анализ продуктов ОТ-ПЦР осуществляли в режиме реального времени на амплификаторе «Rotor-Gene Q» («QIAGEN», Германия). Регистрацию результатов проводили в табличной и графической форме с помощью программного обеспечения к прибору. Результаты оценивали по наличию или отсутствию пересечения кривой накопления флуоресценции с пороговой линией, что определяется значением порогового цикла «Ct - cycle threshold)) в соответствующей графе в таблице результатов. Положительными считали образцы, для которых значение порогового цикла не превышало 33 на этапе второго циклирования.
Пример 3. Определение специфичности реакции амплификации с помощью разработанного набора олигонуклеотидных праймеров WNV-2type-F / WNV-2type-R и флуоресцентно-меченого зонда WNV-2type-P для идентификации вируса Западного Нила 2 генотипа методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
Специфичность ОТ-ПЦР с разработанными праймерами и зондом оценивали при исследовании образцов РНК, выделенных из проб биологического материала, инфицированных вирусом Западного Нила 1, 2 и 4 генотипов. В качестве биологического материала, инфицированного ВЗН 1 генотипа, использовали клинические образцы (4 пробы суспензий головного мозга, 1 пробу цельной крови, 1 пробу сыворотки крови) и 1 пробу суспензии комаров Culex pipiens. Образцами биологического материала, инфицированного ВЗН 2 генотипа, являлись клинические образцы (2 пробы суспензий головного мозга, 2 пробы цельной крови, 1 проба сыворотки крови, 1 проба мочи) и 1 проба суспензии комаров Culex pipiens. В качестве образцов биологического материала, инфицированного ВЗН 4 генотипа использовали 7 проб суспензий комаров Uranotaenia unguiculata. Генотип ВЗН во всех использованных образцах был подтвержден методом секвенирования.
Пробоподготовку и постановку реакции ОТ-ПЦР осуществляли, как описано в примере 2. При тестировании исследуемых образцов с использованием разработанного набора олигонуклеотидных праймеров WNV-2type-F / WNV-2type-R и зонда WNV-2type-P положительный результат ОТ-ПЦР в режиме реального времени был получен для всех проб, инфицированных вирусом Западного Нила 2 генотипа. С образцами биологического материала, инфицированными вирусом Западного Нила генотипов 1 и 4, в реакции ОТ-ПЦР с разработанным набором праймеров WNV-2type-F / WNV-2type-R и зонда WNV-2type-P получен отрицательный результат в 100% случаев.
На рисунке 1 представлен график кривых нарастания флуоресценции, полученный при исследовании проб биологического материала методом ОТ-ПЦР в реальном времени с помощью сконструированного набора олигонуклеотидных праймеров WNV-2type-F / WNV-2type-R и флуоресцентно-меченого зонда WNV-2type-P. Цифрами 1-7 обозначены пробы, инфицированные ВЗН 2 генотипа (1-2 - пробы суспензий головного мозга, 3 - проба суспензии комаров Culex pipiens, 4-5 - пробы цельной крови, 6 - проба мочи, 7 - проба сыворотки крови). Цифрой 8 отмечен положительный контроль. Отрицательный контроль, а также пробы, инфицированные ВЗН 1 и 4 генотипов, располагаются ниже пороговой линии.
Таким образом, разработанный набор олигонуклеотидных праймеров WNV-2type-F / WNV-2type-R и флуоресцентно-меченого зонда WNV-2type-P позволяет в короткий срок с высокой специфичностью выявлять вирус Западного Нила 2 генотипа в биологическом материале и может быть использован при проведении эпидемиологического надзора за лихорадкой Западного Нила.
Claims (7)
- Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса Западного Нила 2 генотипа методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, комплементарных фрагментам гена полипротеина вируса Западного Нила 2 генотипа, обладающих активностью прямого и обратного праймеров, и зонда, сконструированного по типу «молекулярного маяка», обеспечивающего флуоресцентную детекцию продукта амплификации размером 116 п.н. в реальном времени, имеющих следующую структуру:
- 5'-GCTATGCTGAGTCTGATTG-3' - WNV-2type-F
- 5'-CCTCTCCATCTGTCCAG-3' - WNV-2type-R
- 5'-(ROX)CCCAATACGTTTCGTGTTGGCTCTTTGGG(BHQ2)-3' - WNV-2type-P
- где:
- ROX - карбокси-Х-родамин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 580 нм, а длина волны флуоресценции - 605 нм;
- BHQ2 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 550-650 нм.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019115620A RU2715617C1 (ru) | 2019-05-21 | 2019-05-21 | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 2 генотипа |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019115620A RU2715617C1 (ru) | 2019-05-21 | 2019-05-21 | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 2 генотипа |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2715617C1 true RU2715617C1 (ru) | 2020-03-02 |
Family
ID=69768244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019115620A RU2715617C1 (ru) | 2019-05-21 | 2019-05-21 | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 2 генотипа |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2715617C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2744096C1 (ru) * | 2020-04-03 | 2021-03-02 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Штамм бактерий Escherichia coli JM 109 2-428 - продуцент рекомбинантной плазмиды pWNV2protC, несущей последовательность 5'-нетранслируемой области и участка гена полипротеина West Nile virus 2 генотипа, кодирующего капсидный белок |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005075686A1 (en) * | 2004-02-10 | 2005-08-18 | Roche Diagnostics Gmbh | New primers and probes for the detection of parvovirus b19 |
| RU2629604C1 (ru) * | 2016-06-24 | 2017-08-30 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени |
-
2019
- 2019-05-21 RU RU2019115620A patent/RU2715617C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005075686A1 (en) * | 2004-02-10 | 2005-08-18 | Roche Diagnostics Gmbh | New primers and probes for the detection of parvovirus b19 |
| RU2629604C1 (ru) * | 2016-06-24 | 2017-08-30 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BAKONYI T. et al. Lineage 1 and 2 Strains of Encephalitic West Nile Virus, Central Europe, Emerging Infections Diseases, 2006, Vol.12, No.4, pp.618-623. * |
| BAKONYI T. et al. Lineage 1 and 2 Strains of Encephalitic West Nile Virus, Central Europe, Emerging Infections Diseases, 2006, Vol.12, No.4, pp.618-623. БАТУРИН А.А. и др. Генодиагностика лихорадки Западного Нила и генотипирование возбудителя в 2015 году, Медицинский академический журнал, 2016, Т.16, N 4, С.99-100. * |
| БАТУРИН А.А. и др. Генодиагностика лихорадки Западного Нила и генотипирование возбудителя в 2015 году, Медицинский академический журнал, 2016, Т.16, N 4, С.99-100. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2744096C1 (ru) * | 2020-04-03 | 2021-03-02 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Штамм бактерий Escherichia coli JM 109 2-428 - продуцент рекомбинантной плазмиды pWNV2protC, несущей последовательность 5'-нетранслируемой области и участка гена полипротеина West Nile virus 2 генотипа, кодирующего капсидный белок |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rahman et al. | Polymerase chain reaction (PCR): a short review | |
| Belák | Molecular diagnosis of viral diseases, present trends and future aspects: A view from the OIE Collaborating Centre for the Application of Polymerase Chain Reaction Methods for Diagnosis of Viral Diseases in Veterinary Medicine | |
| Bhudevi et al. | Fluorogenic RT–PCR assay (TaqMan) for detection and classification of bovine viral diarrhea virus | |
| RU2506317C2 (ru) | Способ выявления кишечных вирусов в клинических образцах и воде методом мультиплексной пцр с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления | |
| CN107849618A (zh) | 鉴别和检测水生生物传染病致病病毒的遗传标记以及使用其的致病病毒鉴别和检测方法 | |
| JP6574703B2 (ja) | 糞便サンプル中のヘリコバクターピロリｄｎａを検出するための方法 | |
| US11149322B2 (en) | Methods and compositions for human papillomaviruses and sexually transmitted infections detection, identification and quantification | |
| Wu et al. | Establishment of a fluorescent polymerase chain reaction method for the detection of the SARS-associated coronavirus and its clinical application | |
| JP2018108054A (ja) | ノロウイルスｇ１型を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ | |
| RU2715617C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 2 генотипа | |
| US20080090224A1 (en) | Nucleic acid detection | |
| RU2715625C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 1 генотипа | |
| JP2016019495A (ja) | 核酸増幅法 | |
| JP2018108055A (ja) | ノロウイルスｇ２型を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ | |
| CN106471135B (zh) | 肠道病毒和双埃柯病毒的分子检测 | |
| Saeed et al. | Real-time polymerase chain reaction: applications in diagnostic microbiology | |
| RU2550257C2 (ru) | СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ТИПИЧНЫХ И АТИПИЧНЫХ ШТАММОВ Yersinia pestis СРЕДНЕВЕКОВОГО БИОВАРА МЕТОДОМ ПЦР С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ | |
| Liu et al. | Development of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Batai virus in cattle and mosquitoes | |
| RU2737396C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 4 генотипа (west nile virus lineage 4) | |
| JP6592697B2 (ja) | 血清型２のデングウイルス検出用キット、血清型３のデングウイルス検出用キット及びデングウイルス検出用キット | |
| RU2739333C1 (ru) | Штамм бактерий Escherichia coli JM 109 4-162 - продуцент рекомбинантной плазмиды pWNV4protC, несущей последовательность участка гена полипротеина West Nile virus 4 генотипа, кодирующего капсидный белок | |
| Tan et al. | Diagnostic value of real-time capillary thermal cycler in virus detection | |
| CN114214455A (zh) | 乙肝病毒DNA快速定量引物探针及其CRISPR/Cas12b检测系统 | |
| EP4281589A1 (en) | Compositions, kits and methods for detection of viral variant sequences | |
| Nemoto et al. | Loop-mediated isothermal amplification assays for detection of Equid herpesvirus 1 and 4 and differentiating a gene-deleted candidate vaccine strain from wild-type Equid herpesvirus 1 strains |