RU2629604C1 - Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени - Google Patents

Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени Download PDF

Info

Publication number
RU2629604C1
RU2629604C1 RU2016125498A RU2016125498A RU2629604C1 RU 2629604 C1 RU2629604 C1 RU 2629604C1 RU 2016125498 A RU2016125498 A RU 2016125498A RU 2016125498 A RU2016125498 A RU 2016125498A RU 2629604 C1 RU2629604 C1 RU 2629604C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
tick
borrelia
rickettsia
primers
west nile
Prior art date
Application number
RU2016125498A
Other languages
English (en)
Inventor
Александра Олеговна Семенцова
Владимир Александрович Терновой
Елена Владимировна Чуб
Михаил Юрьевич Карташов
Валерий Борисович Локтев
Original Assignee
Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") filed Critical Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор")
Priority to RU2016125498A priority Critical patent/RU2629604C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2629604C1 publication Critical patent/RU2629604C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/113—Real time assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
    • G01N2333/183—Flaviviridae, e.g. pestivirus, mucosal disease virus, bovine viral diarrhoea virus, classical swine fever virus (hog cholera virus) or border disease virus
    • G01N2333/185—Flaviviruses or Group B arboviruses, e.g. yellow fever virus, japanese encephalitis, tick-borne encephalitis, dengue
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени. Изобретение обеспечивает набор праймеров и зондов для мультиплексной идентификации генетического материала четырех инфекционных патогенов, передающихся клещами. 4 ил., 4 табл., 2 пр.

Description

Изобретение относится к набору диагностических праймеров и зондов для одновременного выявления генетического материала вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий и может быть использовано в биотехнологии, в частности в генетической инженерии, в медицине для выявления генетического материала вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий в образцах клещей, в клинических или секционных пробах с целью постановки диагноза или коррекции лечения, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению клещевых инфекций, созданию диагностических, профилактических или лечебных препаратов.
На территории России широко распространены сочетанные очаги клещевых инфекций вирусной, бактериальной, риккетсиозной и протозойной природы. Имеются данные об инфицированности клещей одновременно несколькими патогенами, что ведет к возникновению микст-инфекций. Все это создает новую эпидемиологическую ситуацию, когда без решения вопросов дифференциальной диагностики невозможен успех в борьбе с этой большой группой заболеваний человека.
Клещевые инфекции поражают центральную нервную систему, различные органы и ткани. Неадекватная и запоздалая терапия может привести к развитию хронических заболеваний или инвалидности.
В настоящее время известны коммерческие наборы реагентов (аналоги) для обнаружения генетического материала возбудителей клещевых инфекций в исследуемых образцах:
- «АмплиСенс Borrelia burgdorferi sensu lato-FL». Набор предназначен для выявления 16S рРНК Borrelia burgdorferi sensu lato (B.burgdorferi sensu stricto, B.afzelii, B.garinii) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по конечной точке;
- «АмплиСенс TBE-FL». Набор реагентов для проведения реакции обратной транскрипции РНК и ПЦР-амплификации кДНК участка генома вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени;
- «АмплиСенс WNV-FL». Набор реагентов для выявления PНК вируса Западного Нила в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией;
- «РеалБест РНК ВКЭ», РУ № ФСР 2010/07633. Набор реагентов для выявления РНК вируса клещевого энцефалита методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени;
- «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi s.l.», РУ №ФСР2010/06780. Набор реагентов для выявления ДНК боррелий комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato (Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Borrelia burgdorferi sensu strictо) методом ПЦР в режиме реального времени.
Данные наборы реагентов обладают достаточной чувствительностью и специфичностью, и с их помощью возможно выявление генетического материала боррелий, вирусов клещевого энцефалита и лихорадки Западного Нила. Однако все указанные наборы имеют в своем составе праймеры и зонды, позволяющие идентифицировать генетический материал инфекционных патогенов, передающихся иксодовыми клещами, только в моноплексном варианте, что требует четырех отдельных постановок ПЦР для идентификации четырех инфекционных патогенов. Использование разработанного набора олигонуклеотидных праймеров и зондов позволяет одновременно в одной реакционной ПЦР-смеси выявлять генетический материал вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий, что сокращает время проведения диагностики и делает исследование более полным, поскольку иксодовые клещи могут являться переносчиками одновременно нескольких инфекций.
Известны методы обнаружения генетического материала клещевых инфекций, предложенные в работах:
- [Hanaoka N, Matsutani M, Kawabata H, Yamamoto S, Fujita H, Sakata A, Azuma Y, Ogawa M, Takano A, Watanabe H, Kishimoto T, Shirai M, Kurane I, Ando S. Diagnostic assay for Rickettsia japonica // Emerg Infect Dis. 2009 Dec; 15(12):1994-7], где представлен набор олигонуклеотидов для диагностики риккетсиозов;
- [Yeh JY, Lee JH, Seo HJ, Park JY, Moon JS, Cho IS, Lee JB, Park SY, Song CS, Choi IS. Fast duplex one-step reverse transcriptase PCR for rapid differential detection of West Nile and Japanese encephalitis viruses // J Clin Microbiol. 2010 Nov; 48(11):4010-4], где предлагается набор праймеров для мультиплексной идентификации вируса лихорадки Западного Нила и вируса Японского энцефалита, методом ПЦР с детекцией продуктов амплификации методом гель-электрофореза;
- [Schwaiger M, Cassinotti P. Development of a quantitative real-time RT-PCR assay with internal control for the laboratory detection of tick borne encephalitis virus (TBEV) RNA // J Clin Virol. 2003 Jul; 27(2):136-45], в которой представлен набор олигонуклеотидов для детекции РНК вируса клещевого энцефалита;
- [Courtney JW, Kostelnik LM, Zeidner NS, Massung RF. Multiplex real-time PCR for detection of Anaplasma phagocytophilum and Borrelia burgdorferi // J Clin Microbiol. 2004 Jul; 42(7):3164-8], где представлен метод идентификации клещевых бактериальных инфекций, основанный на мультиплексной ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов в режиме реального времени.
Однако описанные в этих работах методы диагностики клещевых инфекций подразумевают либо моноплексный формат проведения ПЦР, либо применение набора праймеров и зондов для детекции только двух инфекций, либо применение гель-электрофоретической детекции продуктов амплификации, что делает метод более трудоемким и повышает риск контаминации продуктами амплификации ДНК.
Результаты патентного поиска по выявлению генетического материала вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий позволили определить несколько зарубежных аналогов, которые все же значительно отличаются от предлагаемого изобретения.
Известна патентная заявка США №20100278866, касающаяся метода ELISA клещевого энцефалита (КЭ), а не ПЦР диагностике,  не позволяет проводить экспресс диагностику КЭ на ранних стадиях заболевания и является более затратным по времени постановки реакции и уступает методу ПЦР по чувствительности.
Известна патентная заявка США №20110143358, касается метода сравнения нуклеотидных последовательностей клещевых инфекций масс-спектрометрией и не может быть использована в практической лабораторной диагностике ввиду высокой стоимости.
Известна патентная заявка США №20120171679, касается использования мультиплексных биочипов в составе роботизированного комплекса для экспресс-диагностики инфекционных агентов, в том числе во время биотеррористических актов. Данный комплекс предусматривает использование дорогостоящего оборудования и не может быть доступен при выполнении простых диагностических задач.
Патенты Китая №CN101967513 и №CN101886113 касаются современного метода LAMP-PCR. Однако данный метод не может быть использован в лабораторной диагностике в настоящее время, поскольку предназначен для использования только в полевых условиях, не является количественным, и, кроме того, до настоящего времени ни одна LAMP-PCR тест-система не получила разрешения для использования в клинической лабораторной практике. Кроме того, метод LAMP-PCR является более дорогостоящим по сравнению с традиционным ПЦР и не может быть использован в формате мультиплексного ПЦР.
Изобретения по патенту Испании №ES2264642 и международной заявке №WO2004005479 касаются выявлению возбудителей трансмиссивных инфекций методом ПЦР, но не позволяет проводить выявления вирусов клещевого энцефалита и Западного Нила. Кроме того, данный набор не зарегистрирован и недоступен на территории Российской Федерации. Стоимость диагностических тест-систем, произведенных за рубежом, значительно выше российских, что делает их недоступными в лабораторной практике.
Патент Китая №CN101629215 касается тест-системы для выявления вируса Западного Нила методом ПЦР в формате мультиплекс с инфекционными агентами, передающимися не клещами, а комарами, не являющимися эндемичными на территории России. Кроме того, стоимость диагностических тест-систем, произведенных за рубежом, значительно выше российских, что делает их недоступными в лабораторной практике.
Наиболее близким аналогом (прототипом), по мнению заявителя, является коммерческий набор реагентов для выявления РНК/ДНК возбудителей инфекций, передающихся иксодовыми клещами: TBEV, Borellia burgdorferi sl, Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia chaffeensis / Ehrlichia muris, в биологическом материале методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией - «АмплиСенс TBEV, B.burgdorferi sl, A.phagocytophilum, E.chaffeensis / E.muris-FL». Применением данного набора реагентов возможно проведение мультиплексной ПЦР для идентификации нескольких инфекций (http://www.interlabservice.ru/upload/ iblock/44c/tbev_-b.-burgdoferi-sl_-a.-phagocytophilum_-e.-chaffeensis_e.-muris-_zaregistr_-_new_pm_010416.pdf).
Однако конструкция данного набора реагентов исключает возможность определения генетического материала вируса лихорадки Западного Нила и бактерий семейства Rickettsiae, являющихся возбудителями большой группы трансмиссивных острых лихорадочных заболеваний.
Техническим результатом заявляемого изобретения являлась разработка неизвесного ранее набора олигонуклеотидных праймеров и зондов для мультиплексной идентификации генетического материала четырех инфекционных патогенов, передающихся клещами: вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий в образцах клещей, в клинических и секционных образцах и вируссодержащих пробах (культуральная вируссодержащая жидкость и т.д.), методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
Указанный технический результат достигается тем, что создан набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени, включающий:
- последовательности, видоспецифичные для вируса клещевого энцефалита:
Праймеры:
Figure 00000001
Figure 00000002
Зонд:
Figure 00000003
- последовательности, видоспецифичные для вируса лихорадки Западного Нила:
Праймеры:
Figure 00000004
Figure 00000005
Зонд:
Figure 00000006
- последовательности, родоспецифичные для боррелий:
Праймеры:
Figure 00000007
Figure 00000008
Зонд:
Figure 00000009
- последовательности, родоспецифичные для риккетсий:
Праймеры:
Figure 00000010
Figure 00000011
Зонд:
Figure 00000012
где присутствие в нуклеотидной последовательности:
N=A или С или G или Т,
FAM, ROX, R6G или Су5 - флюоресцентный краситель,
Гс - флюоресцентный гаситель BHQ1 или BHQ2.
Изобретение иллюстрируется графиками на фиг. 1, представляющими собой кривые флуоресценции на четырех оптических каналах амплификатора Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия). Флуоресценция десятикратных последовательных разведений (1-8) в образцах, содержащих: генетический материал: фиг. 1, А - вируса клещевого энцефалита (FAM/Green), фиг. 1, Б - вируса лихорадки Западного Нила (R6G/Yellow), фиг. 1, В - боррелий (RED/Cy5) и фиг. 1, Г - риккетсий (ROX/Orange).
На начальном этапе для каждого из детектируемых инфекционных патогенов были подобраны и синтезированы пары специфических олигонуклеотидных праймеров и зонды. Для этого в базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) были выбраны консервативные участки геномов каждого из агентов: для каждого из детектируемых инфекционных патогенов подбирались олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые зонды на консервативные области геномов возбудителей (для вируса клещевого энцефалита - 5′-концевой участок гена, кодирующего белок С; для вируса Западного Нила - участок гена, кодирующего полимеразу; для боррелий - 23S рРНК; для риккетсий - 16S рРНК и оптимизацией условий проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
Подбор и анализ свойств олигонуклеотидных праймеров и зондов проводился с использованием программного обеспечения Vector NTI 9.0.0 (InforMax).
Причем при разработке представленных в настоящей заявке на изобретение диагностических праймеров было синтезировано несколько пар праймеров с различной первичной структурой, с каждой из которых были проведены соответствующие исследования. Эмпирическим путем была определена наиболее подходящая пара праймеров, обладающая наибольшей аналитической чувствительностью и 100%-ной специфичностью на панели заявленных образцов. Надо отметить, что структура данных праймеров отличалась от наиболее оптимальной структуры, рассчитанной с использованием программы (VectorNTI).
Поскольку одна часть праймеров видоспецифична (вирус клещевого энцефалита, вирус лихорадки Западного Нила), а другая - родоспецифична (риккетсии и боррелии) и предназначены для идентификации генетического материала патогенов, относящихся к различным родам и видам, то вместо известных нуклеотидных последовательностей были использованы последовательности генов, полученных путем множественного выравнивания с использованием различных алгоритмов, что требует квалифицированных научных исследований, что подтверждает новизну и изобретательский уровень предлагаемого технического решения.
В работе, помимо дизайна структуры праймеров и олигонуклеотидного зонда, получены положительные контрольные образцы, представляющие собой рекомбинантные плазмиды со встройкой целевого гена-мишени (рекомбинантную плазмиду, несущую фрагмент гена, являющийся матрицей для амплификации спецефических ДНК-фрагментов). С использованием положительного контроля эмпирическим путем подобрана оптимальная температура отжига диагностических праймеров, которая отличается от теоретической, рассчитанной с использованием компьютерных программ. Также эмпирическим путем установлена аналитическая чувствительность данных пар праймеров/зонд для идентификации детектируемых патогенов (вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий), что также подтверждает новизну и изобретательский уровень предлагаемого технического решения.
Последовательности праймеров и зондов, полученные в результате научных и экспериментальных исследований, представлены в таблице 1 и в приложении к заявке.
Таблица 1
Праймеры и зонды для детекции вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий
Агент Праймеры и зонды Структура олигонуклеотидной последовательности
Вирус клещевого энцефалита
(TBE)		 F69 GTGTTGAGAAAAAAGACAGCTTAGGAGA
R249 TCAACACNAGNCCATTTGGCAT
Z162 Кр*-TCTTTCGACACTCGTCTAGGTGGACCGC- Гс**
Вирус лихорадки Западного Нила (WNV) F1 AATCCTGGAGAGTTCGGNAATGC
R237 TCCCATCCNGCNGTGTCATC
Z28 Кр*-CAGCAGTGCCATCTGGTTCATGTG- Гс**
Боррелии
(Borrelia sp.)		 F666 CGAGTCTTAAANGGGCGATTTAGT
R787 GCTTCAGCCTGGCCATAAATAG
Z763 Кр*-AGATGTGGTAGACCTGAAGCCGAGTG- Гс**
Рикктесии
(Rickettsia sp.)		 F380 TCTCATCCTATGGCTATTATGCTT
R639 ATAAATATNTTATTAAGAGCATTTTTTATT
Z470 Кр*-AACTTATTGCTATTAGAATGATTGCTAAGATACC- Гс**
Примечание: Кр*- краситель; Гс**-гаситель.
Пример 1. Создание положительных контрольных образцов и проверка аналитической чувствительности набора
Для контроля амплификации были получены синтетические положительные контрольные образцы, представляющие собой рекомбинантные плазмиды, несущие вирусспецифические ДНК фрагменты, являющиеся матрицей для амплификации со специфических праймеров.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pCR2.1® (Invitrogen, США), обеспечивающая в ПЦР синтез ДНК-ампликонов, соответствующих участкам геномов вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий, характеризуется следующими признаками:
- имеет молекулярную массу 2878,3 kDa;
- имеет размер 4435 пар оснований (п.о.);
- состоит из плазмиды pCR2.1® (Invitrogen, США) размером 3931 п.о. с фрагментом LacZα, полилинкером, T7 промотером, участками f1 ori и pUC ori, генами устойчивости к канамицину и ампицилину [Invitrogen. TOPO TA Cloning® Five-minut cloning of Taq polymerase-amplified PCR products. User Manual. Version U. 10 April 2006];
- содержит фрагмент ДНК, специфичный для одного из детектируемых патогенов (вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий).
Фрагменты ДНК размером 180, 236, 121, 259 п.о., комплиментарные участкам детектируемых патогенов получали в ПЦР c праймерами (таблица 1) и кДНК вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки западного Нила, боррелий, риккетсий. Результат реакции учитывали методом электрофореза в 3%-агарозном геле. Полученные в ПЦР ДНК-фрагменты очищали из агарозного геля и использовали для получения рекомбинантных плазмид. Подготовку pCR2.1® Vector и проведение ТА-клонирования осуществляли с использованием набора TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, США) в соответствии с инструкцией производителя [Invitrogen. TOPO TA Cloning® Five-minut cloning of Taq polymerase-amplified PCR products. User Manual. Version U. 10 April 2006]. Рекомбинантные плазмиды использовали для трансформации клеток Е.coli штамма Top 10 (Invitrogen, США). Плазмидную ДНК выделяли из ампицилин-устойчивых колоний. Методом ПЦР осуществляли анализ эффективности молекулярной трансформации.
Для проведения ПЦР в режиме реального времени в качестве анализируемых образцов использовали рекомбинантные плазмидные ДНК, полученные выделением из компетентных бактериальных клеток E. coli, включающие вставки ДНК, соответствующие детектируемым участкам геномов.
Условия проведения амплификации оптимизировались по следующим параметрам: концентрация ионов магния в реакционной смеси; концентрация праймеров и зондов в реакционной смеси; температура отжига праймеров.
Для определения аналитической чувствительности метода из концентрированного раствора плазмидной ДНК для каждого детектируемого патогена были приготовлены последовательные 10-кратные разведения. Определение концентрации ДНК в разведениях при исследовании чувствительности осуществляли при помощи флуориметра QUBIT (Invitrogen, США) и наборов реагентов производителя Quant-iT dsDNA HS Assay Kit.
ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в приборе Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) по каналам FAM /Green (470 nm /510 nm), R6G/Yellow (530nm/555nm), RED/Cy5 (625-660), ROX/Orange (558-610) и в приборе CFX96 (Bio-Rad, США).
Минимальное количество ДНК-матриц, детектируемое с применением полученных праймеров и зондов, после оптимизации условий проведения реакции, выраженное в ГЭ (геномных эквивалентах) в 30 мкл реакционной смеси, представлено в таблице 2.
Таблица 2
Аналитическая чувствительность ПЦР в режиме реального времени
Название агента Геномные эквиваленты (ГЭ)
ВКЭ 3×102
ВЗН 2×102
Боррелии 3×102
Риккетсии 2×102
Пример 2. Определение генетического материала вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий в образцах клещей
Оценку эффективности выявления генетического материала вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий проводили на образцах клещей (сывороток крови, спинномозговой жидкости от больных, или КВЖ), из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
Предварительную инактивацию образцов и выделение ДНК/РНК проводили в условиях, регламентированных Методическими указаниями МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
Процедуру выделения ДНК/РНК из исследуемого материала проводили с использованием набора «Комплект реагентов для выделения ДНК/РНК из сыворотки или плазмы крови» (НПФ Литех, Россия) в соответствии с инструкцией по применению.
Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора реагентов «Реверта-L» (ЦНИИЭ, Россия) или набора для обратной транскрипции MMLV RT Kit (Евроген, Россия) в соответствии с инструкцией по применению.
Мультиплексную ПЦР в режиме реального времени проводили в реакционной смеси следующего состава (на 1 исследование):
кДНК 5 мкл
10×Taq буфер без Mg2+(Медиген) 3 мкл
100 mM раствор MgCl2 1 мкл
5 mM раствор dNTP 1 мкл
Смесь праймеров
(концентрация каждого 10-15 мкмол/л) 8 мкл
Зонды (концентрация 5-10 мкмол/л) 4 мкл
SmartTaq ДНК-полимераза (Медиген) 0,3 мкл
Вода для ПЦР 7,7 мкл
____________________________________________
Общий объем 30 мкл
В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли ТЕ-буфер.
ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в приборе Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) по следующей программе:
Температура (°С) Время (минуты:секунды) Количество циклов
95 05:00 1
95 00:10 45
54 00:20 (Flu)
72 00:20
Детекцию сигнала флуоресценции осуществляли при шаге циклирования 54°С, для вируса клещевого энцефалита – по каналу FAM/Green; для вируса лихорадки Западного Нила - по каналу RED/Cy5; для риккетсий - по каналу ROX/Orange; для боррелий - по каналу R6G/Yellow.
Результаты интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат считали положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную «сигмовидную» форму и пересекала пороговую линию. При этом значение Ct для данного образца было не больше 40 (фиг. 1).
Таким образом, вышеприведенное описание подтверждает достижение заявляемого технического результата, а именно: разработан неизвесный ранее набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для мультиплексной идентификации генетического материала четырех инфекционных патогенов, передающихся клещами: вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий в образцах клещей, в клинических и секционных образцах и вируссодержащих пробах (культуральная вируссодержащая жидкость и т.д.), методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

Claims (29)

  1. Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени, включающий:
  2. - последовательности, видоспецифичные для вируса клещевого энцефалита:
  3. Праймеры:
  4. 5' GTGTTGAGAAAAAAGACAGCTTAGGAGA 3'
  5. 5' TCAACACNAGNCCATTTGGCAT 3'
  6. Зонд:
  7. FAM-TCTTTCGACACTCGTCTAGGTGGACCGC-Гс
  8. - последовательности, видоспецифичные для вируса лихорадки Западного Нила:
  9. Праймеры:
  10. 5' AATCCTGGAGAGTTCGGNAATGC 3'
  11. 5' TCCCATCCNGCNGTGTCATC 3'
  12. Зонд:
  13. Cy5-CAGCAGTGCCATCTGGTTCATGTG-Гс
  14. - последовательности, родоспецифичные для боррелий:
  15. Праймеры:
  16. 5' CGAGTCTTAAANGGGCGATTTAGT 3'
  17. 5' GCTTCAGCCTGGCCATAAATAG 3'
  18. Зонд:
  19. R6G-AGATGTGGTAGACCTGAAGCCGAGTG-Гс
  20. - последовательности, родоспецифичные для риккетсий:
  21. Праймеры:
  22. 5' TCTCATCCTATGGCTATTATGCTT 3'
  23. 5' ATAAATATNTTATTAAGAGCATTTTTTATT 3'
  24. Зонд:
  25. ROX-AACTTATTGCTATTAGAATGATTGCTAAGATACC-Гс,
  26. где присутствие в нуклеотидной последовательности:
  27. N=A, или С, или G, или Т,
  28. FAM, ROX, R6G или Су5 - флюоресцентный краситель,
  29. Гс - флюоресцентный гаситель BHQ1 или BHQ2.
RU2016125498A 2016-06-24 2016-06-24 Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени RU2629604C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016125498A RU2629604C1 (ru) 2016-06-24 2016-06-24 Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016125498A RU2629604C1 (ru) 2016-06-24 2016-06-24 Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2629604C1 true RU2629604C1 (ru) 2017-08-30

Family

ID=59797476

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016125498A RU2629604C1 (ru) 2016-06-24 2016-06-24 Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2629604C1 (ru)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2715617C1 (ru) * 2019-05-21 2020-03-02 Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 2 генотипа
RU2715625C1 (ru) * 2019-05-21 2020-03-02 Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 1 генотипа
RU2726420C1 (ru) * 2019-12-05 2020-07-14 Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для идентификации "886-84-подобных" штаммов вируса клещевого энцефалита
RU2737396C1 (ru) * 2020-04-03 2020-11-30 Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 4 генотипа (west nile virus lineage 4)
RU2744187C1 (ru) * 2019-12-26 2021-03-03 Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) Способ выявления вируса клещевого энцефалита методом ОТ-ПЦР в реальном времени
RU2744665C1 (ru) * 2020-06-02 2021-03-12 Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ "РосНИПЧИ "Микроб" Роспотребнадзора) Способ выявления рнк вируса луйо методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени
RU2763595C1 (ru) * 2021-07-10 2021-12-30 Юрий Юрьевич Комаровский Набор реагентов для обнаружения возбудителей клещевых боррелиозов

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2057811C1 (ru) * 1990-12-17 1996-04-10 Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций Государственного комитета санитарно-эпидемиологического надзора РФ Набор для идентификации флавивирусов
US20110104696A1 (en) * 2005-06-17 2011-05-05 Instituto De Salud Carlos Iii Kit for detection of bacterial species by means of dna analysis

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2057811C1 (ru) * 1990-12-17 1996-04-10 Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций Государственного комитета санитарно-эпидемиологического надзора РФ Набор для идентификации флавивирусов
US20110104696A1 (en) * 2005-06-17 2011-05-05 Instituto De Salud Carlos Iii Kit for detection of bacterial species by means of dna analysis

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ЗИНИН В. Уникальные тест-системы диагностики инфекций зарегистрируют сибирские ученые в 2014 году. ИТАР-ТАСС Сибирь. 4 февраля 2014, 10:55 [Найдено 05.05.2017] [он-лайн], Найдено из Интернет: URL: http://tass.ru/sibir-news/936133. *
ЗИНИН В. Уникальные тест-системы диагностики инфекций зарегистрируют сибирские ученые в 2014 году. ИТАР-ТАСС Сибирь. 4 февраля 2014, 10:55 [Найдено 05.05.2017] [он-лайн], Найдено из Интернет: URL: http://tass.ru/sibir-news/936133.US 2011104696 A1, 05.05.2011.RU 2057811 C1, 10.04.1996. *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2715617C1 (ru) * 2019-05-21 2020-03-02 Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 2 генотипа
RU2715625C1 (ru) * 2019-05-21 2020-03-02 Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 1 генотипа
RU2726420C1 (ru) * 2019-12-05 2020-07-14 Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для идентификации "886-84-подобных" штаммов вируса клещевого энцефалита
RU2744187C1 (ru) * 2019-12-26 2021-03-03 Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) Способ выявления вируса клещевого энцефалита методом ОТ-ПЦР в реальном времени
RU2737396C1 (ru) * 2020-04-03 2020-11-30 Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 4 генотипа (west nile virus lineage 4)
RU2744665C1 (ru) * 2020-06-02 2021-03-12 Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ "РосНИПЧИ "Микроб" Роспотребнадзора) Способ выявления рнк вируса луйо методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени
RU2763595C1 (ru) * 2021-07-10 2021-12-30 Юрий Юрьевич Комаровский Набор реагентов для обнаружения возбудителей клещевых боррелиозов

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2629604C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени
Venkatesan et al. Multiplex PCR for simultaneous detection and differentiation of sheeppox, goatpox and orf viruses from clinical samples of sheep and goats
RU2504585C1 (ru) Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда для идентификации рнк коронавируса человека, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом
Tian et al. Development of a SYBR green I-based duplex real-time PCR assay for detection of pseudorabies virus and porcine circovirus 3
CN112921122A (zh) 猫常见病毒多重pcr快速检测试剂盒及其引物组
RU2473702C1 (ru) Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов для идентификации рнк коронавирусов видов 229е, nl63, ос43, hku1 методом гибридизационно-флуоресцентной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции
Kim et al. Differential diagnosis of Brucella abortus by real-time PCR based on a single-nucleotide polymorphisms
Monazah et al. Evaluation of a rapid detection for Coxsackievirus B3 using one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP)
Chen et al. A multiplex PCR for the identification of Echinococcus multilocularis, E. granulosus sensu stricto and E. canadensis that infect human
RU2550257C2 (ru) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ТИПИЧНЫХ И АТИПИЧНЫХ ШТАММОВ Yersinia pestis СРЕДНЕВЕКОВОГО БИОВАРА МЕТОДОМ ПЦР С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ
RU2515911C1 (ru) Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации рнк и дифференциации вируса парагриппа человека 1, 2, 3 и 4 типов
RU2511440C2 (ru) Способ количественного определения фиксированного вируса бешенства штамма "москва 3253"
RU2615465C2 (ru) Диагностическая система для выявления днк провирусов лейкоза и иммунодефицита крупного рогатого скота методом мультиплексной полимеразной цепной реакции
RU2715625C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 1 генотипа
RU2715617C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса западного нила 2 генотипа
Kowalczyk et al. Duplex PCR for Detection of Aleutian Disease Virus from Biological and Environmental Samples
RU2486252C1 (ru) СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ Yersinia pseudotuberculosis ОТ Yersinia pestis И Yersinia enterocolitica
RU2525937C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации рнк вируса мачупо методом полимеразной цепной реакции в реальном времени
RU2822037C1 (ru) Способ дифференциации генома вакцинного штамма "ВНИИЗЖ" от полевых изолятов вируса бешенства методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков температур плавления ампликонов и применением асимметричного красителя SYBR Green
Pourhosein et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for the rapid diagnosis of viruses
RU2756924C2 (ru) Способ ранней пцр-диагностики вируса алеутской болезни норок carnivore amdoparvovirus
RU2731716C1 (ru) Набор для дифференциации пестивирусов крупного рогатого скота и способ дифференциации пестивирусов крупного рогатого скота
RU2744665C1 (ru) Способ выявления рнк вируса луйо методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени
RU2741887C1 (ru) Тест-система для выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCov19) у приматов
RU2541772C2 (ru) Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк бокавируса человека