RU2525937C1 - Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации рнк вируса мачупо методом полимеразной цепной реакции в реальном времени - Google Patents
Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации рнк вируса мачупо методом полимеразной цепной реакции в реальном времени Download PDFInfo
- Publication number
- RU2525937C1 RU2525937C1 RU2013135815/10A RU2013135815A RU2525937C1 RU 2525937 C1 RU2525937 C1 RU 2525937C1 RU 2013135815/10 A RU2013135815/10 A RU 2013135815/10A RU 2013135815 A RU2013135815 A RU 2013135815A RU 2525937 C1 RU2525937 C1 RU 2525937C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- machupo virus
- species
- rna
- virus
- polymerase chain
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение касается набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченного зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации РНК вируса Мачупо методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Представленный набор включает последовательности олигонуклеотидов, видоспецифичные для вируса Мачупо и имеющие следующую структуру:
внешний: 5΄→3΄ 5΄ TCCTCYTCACCCCTTTTGTTCTTTCT 3΄
внутренний: 5΄→3΄ 5΄ CGCACAGTGGATCCTAGGCA 3΄
зонд: R6G - TGAGTCCACCGRAAGCTGGGRATYTCYTT - BHQ1. Охарактеризованное решение может быть использовано в медицинской практике для выявления генетического материала вируса Мачупо в клинических или секционных образцах. 2 ил., 1 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к наборам олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации РНК вируса Мачупо методом полимеразной цепной реакции в реальном времени и может быть использовано в медицинской практике для выявления генетического материала вируса Мачупо в клинических или секционных образцах для уточнения диагноза, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению свойств вируса Мачупо, созданию диагностических, профилактических или лечебных препаратов против вируса Мачупо. Использование специфичных праймеров и зондов позволяет выявлять генетический материал вируса Мачупо в исследуемых образцах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
Вирус Мачупо является представителем рода Arenavirus семейства Arenaviridae (http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=2011). Вирусный геном сегментирован (L- и S-сегменты) и представлен одноцепочечной РНК.
Вирус Мачупо является возбудителем Боливийской геморрагической лихорадки - острого инфекционного заболевания, характеризующегося природной очаговостью; аспирационным (воздушно-пылевой путь), фекально-оральным и контактным механизмами передачи возбудителя; тяжелым течением с общеинтоксикационным синдромом, экзантемой, геморрагическим синдромом, поражением сердечно-сосудистой и нервной системы.
Эндемичной территорией для вируса Мачупо являются сельскохозяйственные районы на северо-востоке Боливии и севере Парагвая. Вспышки заболевания регистрируются с 1959 года с интервалом в несколько лет. Последняя крупная вспышка (более 200 заболевших) произошла в 2008 году [Aguilar P.V., Camargo W., Vargas J. et al. Reemergence of Bolivian hemorrhagic fever, 2007-2008. // Emerg. Infect. Dis. - 2009. - 15(9). - P.1526-28]. Переносчиком вируса Мачупо и источником заражения для человека являются грызуны Calomys callosus. Люди инфицируются в результате контактов с инфицированными животными, их экскрементами и мочой, содержащими вирус. Заболевание регистрируется чаще у жителей сельских районов. Кроме этого возможна вторичная передача вируса Мачупо от человека человеку [Charrel R.N., Lamballerie X. Arenaviruses other than Lassa virus. // Antiviral Research. - 2003. - 57(1-2). - P.89-100].
Летальность при заболевании боливийской геморрагической лихорадкой составляет примерно 20 % [Bradfute S.B., Stuthman K.S., Shurtleff A.C., Bavari S. A STAT-1 knockout mouse model for Machupo virus pathogenesis. // Virol. J. - 2011. - 8:300. - doi: 10.1186/1743-422X-8-300].
Актуальность своевременной диагностики лихорадки Мачупо в странах, не являющихся эндемичными территориями, связана с возможностью завоза этой инфекции из Южной Америки.
Известна тест-система для раннего выявления заболевания, вызываемого вирусом Мачупо, на основе метода ИФА с возможностью определения наличия специфических иммуноглобулинов класса М [ S., H., T. et al. Serological Assays Based on Recombinant Viral Proteins for the Diagnosis of Arenavirus Hemorrhagic Fevers // Viruses. - 2012. - 4(10). - P.2097-114].
Однако иммуноглобулины класса М появляются на 10-20 сут после заражения, что приводит к поздней диагностики заболевания.
Известны наборы праймеров для флуоресцентной количественной ПЦР-диагностики вируса Мачупо (патент Китая № CN101805802, МПК C12Q1/68; C12Q1/70; G01N21/64, опубл. 2010-08-18). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является методом ранней диагностики аренавирусных инфекций и позволяет обнаруживать РНК вируса Мачупо с первых дней появления клинических признаков.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является ПЦР тест-система для выявления РНК вируса Мачупо методом обратной транскрипции в режиме реального времени. [Vieth S., Drosten Ch., Charrel R., et al. Establishment of conventional and fluorescence resonance energy transfer-based real-time PCR assays for detection of pathogenic New World arenaviruses // J. Clin. Virol. - 2005. - 32. - P.229-35].
Однако чувствительность тест-систем выше приведенного аналога и прототипа составляла около 50 ТЦД50/реакцию, а аналитическая чувствительность - около 100 геномных эквивалентов/реакцию.
Техническим результатом изобретения является разработка более чувствительного набора специфичных олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления генетического материала вируса Мачупо в клинических образцах и биологических жидкостях, образцах внешней среды и других вируссодержащих пробах (культуральная вируссодержащая жидкость и др.) методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
Указанный технический результат достигается тем, что набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации РНК вируса Мачупо методом полимеразной цепной реакции в реальном времени включает последовательности олигонуклеотидов, видоспецифичные для вируса Мачупо и имеющие следующую структуру:
внешний:
5΄→3΄ 5΄ TCCTCYTCACCCCTTTTGTTCTTTCT 3΄
внутренний:
5΄→3΄ 5΄ CGCACAGTGGATCCTAGGCA 3΄
зонд:
R6G - TGAGTCCACCGRAAGCTGGGRATYTCYTT - BHQ1
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг.1 и 2 представлены кривые флуоресценции на канале R6G/Yellow (530 nm/555 nm) амплификатора Rotor Gene 6000.
В приложении приведены олигонуклеотидные последовательности, видоспецифичные РНК вируса Мачупо.
Методика получения набора праймеров и зонда. Диагностические праймеры и флуоресцентно-меченый зонд конструировались для участка S-сегмента генома вируса Мачупо и оптимизации концентраций компонентов реакционной смеси и условий проведения ПЦР. Для контроля амплификации были получены рекомбинантные плазмиды, несущие вирусспецифический участок ДНК-матрицы.
На начальном этапе был проведен анализ нуклеотидных последовательностей геномов вируса Мачупо, имеющихся в базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), и определены консервативные участки. В качестве мишени для диагностических праймеров и зонда был выбран находящийся в S-сегменте вирусного генома участок гена N, кодирующего нуклеокапсидный белок.
Анализ свойств олигонуклеотидных праймеров и зондов проводился с использованием программы Vector NTI 9.0.0 (InforMax).
Для идентификации генетического материала вируса Мачупо методом ПЦР в реальном времени были подобраны праймеры и зонд, представленные ниже:
| F/MACHV | TCCTCYTCACCCCTTTTGTTCTTTCT |
| R/MACHV | CGCACAGTGGATCCTAGGCA |
| Z/MACHV | (R6G)-TGAGTCCACCGRAAGCTGGGRATYTCYTT-(BHQ1) |
Пример 1. Проверка аналитической чувствительности набора праймеров и зондов.
Для контроля амплификации были получены положительные контрольные образцы (ПКО), представляющие собой рекомбинантные плазмиды, несущие вирусспецифические вставки, являющиеся матрицей для амплификации вирусспецефических ДНК-фрагментов.
Для проведения ПЦР в режиме реального времени, в качестве анализируемых образцов использовали рекомбинантную плазмидную ДНК, включающую вставку ДНК, соответствующую детектируемому участку генома вируса Мачупо.
Условия проведения амплификации оптимизировались по следующим параметрам: концентрация ионов магния в реакционной смеси; концентрация праймеров и зонда в реакционной смеси; температура отжига праймеров.
Для определения аналитической чувствительности из концентрированного раствора плазмидной ДНК были приготовлены последовательные 10-кратные разведения. Определение концентрации ДНК осуществляли при помощи флуориметра QUBIT (Invitrogen, США) и наборов реагентов того же производителя.
ПЦР в режиме реального времени для детекции генетического материала вируса Мачупо проводили в приборе Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия), детекцию результатов амплификации (рисунок 1) осуществляли по каналу R6G/Yellow (530 nm/555 nm).
Минимальное количество ДНК-матриц, детектируемое в ПЦР после оптимизации условий проведения реакции, выраженное в ГЭ (геномных эквивалентах), составило 10 ГЭ в образце.
На фиг.1 представлены кривые флуоресценции на канале R6G/Yellow (530 nm/555 nm) амплификатора Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия). Стрелкой обозначена кривая флуоресценции, соответствующая ПКО. Обозанчение образцов, содержащих разные концентрации ДНК-матрицы: 1 - 1010 ГЭ; 2 - 109 ГЭ; 3 - 108 ГЭ; 4 - 107 ГЭ; 5 - 106 ГЭ; 6 - 105 ГЭ; 7 - 104 ГЭ; 8 - 103 ГЭ; 9 - 102 ГЭ; 10 - 10 ГЭ в образце.
Пример 2. Определение РНК вируса Мачупо в вируссодержащих образцах.
Для проверки специфичности использовали культуральную вируссодержащую жидкость (КВЖ) с титром вируса Мачупо 4,2 × 105 БОЕ/мл. Для проведения реакции использовали 20 мкл КВЖ.
Инактивацию образцов и выделение РНК проводили в условиях, регламентированных Методическими указаниями МУ 1.3. 2569 -09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности».
Процедуру выделения РНК из исследуемого материала проводили с использованием набора реагентов «Рибо-сорб» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией по применению.
Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора реагентов «Реверта-L» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией по применению.
ПЦР в режиме реального времени проводили в реакционной смеси следующего состава (на 1 исследование):
| кДНК | 5 мкл |
| 10×Taq буфер без Mg2+ | 3 мкл |
| 100 mM раствор MgCl2 | 1 мкл |
| 5 mM раствор dNTP | 1 мкл |
| Смесь праймеров и зондов (по 2 о.е. каждого) | по 1 мкл каждого |
| Smart Taq DNA-Полимераза 5 ед/ мкл | 0,3 мкл |
| Вода для ПЦР | до 30 мкл общего объема |
ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в приборе Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) по следующей программе, представленной в таблице 1.
Таблица 1. Программа проведения ПЦР
| Температура (оС) | Время (минуты:секунды) | Количество циклов |
| 95 | 05:00 | 1 |
| 95 | 00:10 | 45 |
| 54 | 00:20 | |
| 72 | 00:20 |
Измерение флуоресценции осуществляли при температуре 54 С на канале R6G/Yellow.
Результаты интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов.
На фиг 2 приведены кривые флуоресценции образцов, содержащих вирус Мачупо, на канале R6G/Yellow (530 nm/555 nm) амплификатора Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия), из которых видно, что используемые праймеры и зонд выявляли РНК вируса Мачупо в образце, кривая накопления флуоресценции имела характерную «сигмовидную» форму и пересекала пороговую линию при значение Ct не больше 10.
Таким образом, минимальное количество РНК вируса, детектируемое в ПЦР после оптимизации условий проведения реакции, выраженное в ГЭ (геномных эквивалентах), составило 10 ГЭ в образце, вследствие чего чувствительность заявляемых праймеров значительно выше прототипа.
Приложение
<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный
научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"» (ФБУН
ГНЦ ВБ "Вектор")
<120> Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации РНК вируса Мачупо методом полимеразной цепной реакции в реальном времени
<210> 1
<223> Последовательности олигонуклеотидов видоспецифические к вирусу Мачупо,
<400> 1 для выявленя РНК вируса Мачупо:
внешний:
5΄→3΄ 5΄ TCCTCYTCACCCCTTTTGTTCTTTCT 3΄ (26 н)
внутренний:
5΄→3΄ 5΄ CGCACAGTGGATCCTAGGCA 3΄ (20 н)
зонд:
R6G - TGAGTCCACCGRAAGCTGGGRATYTCYTT - BHQ1 (29 н)
Claims (1)
- Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации РНК вируса Мачупо методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, включающий последовательности олигонуклеотидов, видоспецифичные для вируса Мачупо и имеющие следующую структуру:
внешний:
5΄→3΄ 5΄ TCCTCYTCACCCCTTTTGTTCTTTCT 3΄
внутренний:
5΄→3΄ 5΄ CGCACAGTGGATCCTAGGCA 3΄
зонд:
R6G - TGAGTCCACCGRAAGCTGGGRATYTCYTT - BHQ1
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013135815/10A RU2525937C1 (ru) | 2013-07-30 | 2013-07-30 | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации рнк вируса мачупо методом полимеразной цепной реакции в реальном времени |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013135815/10A RU2525937C1 (ru) | 2013-07-30 | 2013-07-30 | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации рнк вируса мачупо методом полимеразной цепной реакции в реальном времени |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2525937C1 true RU2525937C1 (ru) | 2014-08-20 |
Family
ID=51384673
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013135815/10A RU2525937C1 (ru) | 2013-07-30 | 2013-07-30 | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации рнк вируса мачупо методом полимеразной цепной реакции в реальном времени |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2525937C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2699525C2 (ru) * | 2017-07-17 | 2019-09-05 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Штамм С/2014 вируса Мачупо - возбудителя Боливийской геморрагической лихорадки, предназначенный для лабораторной оценки эффективности медицинских средств защиты в отношении данного возбудителя |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101805802A (zh) * | 2010-04-12 | 2010-08-18 | 中国检验检疫科学研究院 | 荧光定量pcr检测马秋波病毒的方法 |
-
2013
- 2013-07-30 RU RU2013135815/10A patent/RU2525937C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101805802A (zh) * | 2010-04-12 | 2010-08-18 | 中国检验检疫科学研究院 | 荧光定量pcr检测马秋波病毒的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Simon Vieth et al., Establishment of conventional and fluorescence resonance energy transfer-based real-time PCR assays for detection of pathogenic New World arenaviruses, Journal of Clinical Virology, 2005, Vol.32,p.p.229–235. О.В.Мельникова и др., Санитарная охрана территории от завоза и распространения особо опасных вирусных инфекций. Сообщение 6. Аргентинская и Боливийская геморрагические лихорадки, ЭПИДЕМИОЛОГИЯ, Проблемы особо опасных инфекций, 2010, вып. 104, стр.29-34 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2699525C2 (ru) * | 2017-07-17 | 2019-09-05 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Штамм С/2014 вируса Мачупо - возбудителя Боливийской геморрагической лихорадки, предназначенный для лабораторной оценки эффективности медицинских средств защиты в отношении данного возбудителя |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yapar et al. | Rapid and quantitative detection of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus by one-step real-time reverse transcriptase-PCR | |
| RU2629604C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени | |
| Borm et al. | A universal avian endogenous real-time reverse transcriptase–polymerase chain reaction control and its application to avian influenza diagnosis and quantification | |
| CN111286559B (zh) | 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒 | |
| RU2473702C1 (ru) | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов для идентификации рнк коронавирусов видов 229е, nl63, ос43, hku1 методом гибридизационно-флуоресцентной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции | |
| JP4950656B2 (ja) | 核酸検出 | |
| CN102676697B (zh) | 检测小反刍兽疫病毒的引物和探针及试剂盒 | |
| Orlowska et al. | Comparison of real-time PCR and heminested RT-PCR methods in the detection of rabies virus infection in bats and terrestrial animals | |
| RU2525937C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации рнк вируса мачупо методом полимеразной цепной реакции в реальном времени | |
| RU2515911C1 (ru) | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации рнк и дифференциации вируса парагриппа человека 1, 2, 3 и 4 типов | |
| RU2586527C1 (ru) | Олигонуклеотидные праймеры, флюоресцентный зонд и способ для выявления генома вируса эпизоотической диареи свиней методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции | |
| CN108411042A (zh) | 一种检测乙型脑炎病毒的荧光定量pcr引物及试剂盒 | |
| JP2010252659A (ja) | 鳥インフルエンザウイルスのｎａ亜型判定用プライマーセット | |
| Suarez | Molecular diagnostic techniques: can we identify influenza viruses, differentiate subtypes and determine pathogenicity potential of viruses by RT-PCR? | |
| RU2525938C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации рнк вируса хунин методом полимеразной цепной реакции в реальном времени | |
| CN206768111U (zh) | 一种检测杯状病毒的巢式pcr检测试剂盒 | |
| Wu et al. | Development of Taqman RT-nested PCR system for clinical SARS-CoV detection | |
| CN111363849A (zh) | 一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒及检测方法 | |
| RU2822161C1 (ru) | Способ выявления РНК вируса Хендра вида Hendra henipavirus методом ОТ-ПЦР в реальном времени | |
| KR20150066859A (ko) | 에볼라 및 마버그 바이러스 검출용 프로브 및 프라이머 세트를 이용한 원 스텝 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 방법 | |
| Nemoto et al. | Evaluation of cobas Influenza A/B & RSV Test for Diagnosis of Equine Influenza | |
| RU2552795C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации рнк вируса лихорадки долины рифт методом от пцр в реальном времени | |
| RU2761481C1 (ru) | Тест-система для выявления SARS-CoV-2, Influenza virus A, Influenza virus B методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией | |
| CN102559924B (zh) | 手足口病EV71病毒real-time RT-PCR检测试剂盒及其非诊断检测方法 | |
| RU2816270C2 (ru) | Способ выявления вируса Nipah методом ОТ-ПЦР в реальном времени |