CN111363849A - 一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包含：2019‑nCoV orf1ab/N RT‑PCR Buffer，2019‑nCoV orf1ab/N Enzyme Mix，2019‑nCoV orf1ab/N Positive Control，2019‑nCoV orf1ab/N Negative Control。该试剂盒用于2019新型冠状病毒感染患者的辅助诊断，具有可重复性强、灵敏度高、特异性好等优点。

Description

一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒及检测方法。
背景技术
冠状病毒属于单股正链RNA病毒，属于巢病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)，该病毒可分为α、β、γ和δ四个属，可以感染人、蝙蝠、狗、猪、老鼠、鸟、牛、鲸、马、山羊、猴子等许多动物物种。已知感染人的冠状病毒有6种(HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1和MERS-CoV)。本次引起病毒性肺炎暴发疫情为β属的一种新型冠状病毒，世界卫生组织(WHO)将其命名为2019-nCoV。人感染2019-nCoV后，主要表现为发热，乏力，呼吸道症状以干咳为主，并逐渐出现呼吸困难，严重者急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。部分患者起病症状轻微，可无发热。多数患者预后良好，少数患者病情危重，甚至死亡。
因此，亟需一种操作简单、可重复性强、灵敏度高、特异性好、检测结果快速客观的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及检测方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的第一目的在于提供一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，本发明能够同时检测出2019新型冠状病毒基因序列中的2019-nCoV orf1ab基因片段和2019-nCoV N基因片段，具有操作简单、可重复性强、灵敏度高、特异性好、检测结果快速客观等优点，可用于2019新型冠状病毒感染患者的辅助诊断。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，试剂盒包含：2019-nCoV orf1ab/N RT-PCRBuffer，2019-nCoV orf1ab/N Enzyme Mix，2019-nCoV orf1ab/N Positive Control，2019-nCoV orf1ab/N Negative Control，所述2019-nCoV orf1ab/N RT-PCR Buffer包括以下组分：
组分(1)：由一对检测2019-nCoV orf1ab基因片段引物和一条检测2019-nCoVorf1ab基因片段探针组成；
组分(2)：由一对检测2019-nCoV N基因片段引物和一条检测2019-nCoV N基因片段探针组成；
所述2019-nCoV orf1ab基因片段引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQID NO.2，所述2019-nCoV orf1ab基因片段探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3；
所述2019-nCoV N基因片段引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5，所述2019-nCoV N基因片段探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6。
通过采用上述技术方案，本发明的试剂盒采用双重荧光定量PCR技术，设计2019新型冠状病毒引物探针，在同一反应体系中通过同时检测2019-nCoV orf1ab和2019-nCoV N来判定是否感染2019新型冠状病毒。2019-nCoV orf1ab基因片段引物和2019-nCoV N基因片段引物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后可见位置正确的单一条带；2019-nCoV orf1ab基因片段探针和2019-nCoV N基因片段探针采用高效液相色谱法检测，纯度≥95％。
本发明进一步设置为：所述2019-nCoV orf1ab/N Enzyme Mix包括热启动酶和逆转录酶。
本发明进一步设置为：所述2019-nCoV orf1ab/N Positive Control为含2019-nCoV orf1ab/N片段的质粒。
本发明进一步设置为：所述2019-nCoV orf1ab/N Negative Control为浓度0.85％～0.9％的生理盐水。
针对现有技术存在的不足，本发明的第二目的在于提供一种新型冠状病毒核酸检测方法，同现有检测技术相比，具有操作简单，特异性佳的优点。
一种新型冠状病毒核酸检测方法，包括以下步骤：
S1.样本采集：采集病人发病时期的咽拭子样本，迅速将拭子浸入装有含病毒保存液的采样管中密封保存；
S2.核酸提取：实验室灭活后进行核酸提取，采用核酸提取试剂盒提取样本RNA；
S3.配置试剂：在PCR反应管加入含2019-nCoV orf1ab/N RT-PCR缓冲液，以及2019-nCoV orf1ab基因片段引物、2019-nCoV orf1ab基因片段探针、2019-nCoV N基因片段引物和2019-nCoV N基因片段探针制备成的2019-nCoV orf1ab/N RT-PCR Buffer；
然后在PCR反应管加入2019-nCoV orf1ab/N Enzyme Mix和步骤S2提取得到的样本RNA，盖紧管盖后离心得待测样品；
S4.待测样品扩增：将步骤S3得到的待测样品在荧光定量PCR扩增仪中扩增，在55℃采集荧光信号，通过观测荧光曲线进行结果判读。
通过采用上述技术方案，新型冠状病毒核酸检测试剂盒的检测方法操作简单，检测标准品灵敏度可达1000copies/mL：以2019-nCoV阳性质粒为模板，进行5个10倍梯度稀释，使用该试剂对各稀释梯度中的orf1ab基因和N基因进行双重检测，可稳定检出1000copies/mL。
本发明进一步设置为：步骤S2中实验室灭活温度为56℃，灭活时间为30min。
通过采用上述技术方案，将待测样本进行灭活处理，消除传染性样本对操作者的威胁，且试验过程采用闭管操作，可防止扩增产物气溶胶带来的污染，避免假阳性的产生。
本发明进一步设置为：所述步骤S3中2019-nCoV orf1ab/N RT-PCR缓冲液为的Tris-HCl缓冲液、脱氧核苷三磷酸、Mg2+的复配。
本发明进一步设置为：所述步骤S3中2019-nCoV orf1ab/N RT-PCR Buffer包括2019-nCoV orf1ab/N RT-PCR缓冲液600μL、2019-nCoV orf1ab基因片段引物19.2μL、2019-nCoV orf1ab基因片段探针4.8μL、2019-nCoV N基因片段引物19.2μL、2019-nCoV N基因片段探针4.8μL。
通过采用上述技术方案，参考WHO及CDC发布的序列合成引物和探针，单管双检，同时测定新型冠状病毒两个独立基因，排除非特异性干扰，2019-nCoV检测精度高。
本发明进一步设置为：所述步骤S4中的待测样品扩增包括以下步骤：将待测样品在50℃条件下孵育20min，然后升温至95℃孵育15min；然后在95℃的条件下孵育10s，降温至55℃孵育40s，共40个循环。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，能够在同一反应体系中同时检测出2019新型冠状病毒基因序列中的2019-nCoV orf1ab基因片段和2019-nCoV N基因片段，从而判断是否感染2019新型冠状病毒；
2.本发明提供新型冠状病毒核酸检测试剂盒具有操作简单、可重复性强、灵敏度高、特异性好、检测结果快速客观等优点，在2019新型冠状病毒体外诊断领域具有极大的应用前景；
3.本发明提供的新型冠状病毒核酸检测试剂盒的检测方法，同现有检测技术相比，具有操作简单，特异性佳、快捷等优点。
附图说明
图1为本发明新型冠状病毒核酸检测试剂盒检测2019新型冠状病毒的结果图；
图2为本发明新型冠状病毒核酸检测试剂盒检测临床样本结果图；
图3为灵敏度实验检测2019新型冠状病毒中2019-nCoV orf1ab片段结果图；
图4为灵敏度实验检测2019新型冠状病毒中2019-nCoV N片段结果图；
图5为特异性实验检测2019新型冠状病毒中2019-nCoV orf1ab片段示意图；
图6为特异性实验检测2019新型冠状病毒中2019-nCoV N片段结果图；
图7为本发明新型冠状病毒核酸检测试剂盒检测临床样本扩增图；
图8为上海伯杰医疗科技有限公司新型冠状病毒核酸检测试剂盒检测临床样本扩增图；
图9为本发明新型冠状病毒核酸检测试剂盒检测阳参扩增图；
图10为上海伯杰医疗科技有限公司新型冠状病毒核酸检测试剂盒检测阳参扩增图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。
实施例1、核酸的提取、引物及探针的制备
实验样品采集：采集病人发病3日内的咽拭子样本，用带有尼龙拭子头的一次性无菌的拭子适度用力擦拭患者双侧扁桃体及咽后壁，应避免触及舌部，迅速将咽拭子浸入装有3～5ml含病毒保存液的采样管中，在靠近顶端处折断签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，采集的样本可立即用于测试。
核酸的提取：首先在实验室中将采集到的样本在56℃灭活30min后再进行核酸提取，采用核酸提取试剂盒提取样本RNA，具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行，本实施例中核酸提取试剂盒采用深圳市梓健生物科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(备案号：粤深械备20180040号)，在其他实施例中核酸提取试剂盒可为其他。
引物及探针的制备：将设计的引物探针在NCBI上进行Blast(Blast是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似性比较的分析工具)，检测引物探针的特异性，2019-nCoVorf1ab基因片段引物包括2019-nCoV orf1ab-F和2019-nCoV orf1ab-R(分别参考序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)，2019-nCoV orf1ab基因片段探针为2019-nCoV orf1ab-P(参考序列表SEQ ID NO.3)，2019-nCoV N基因片段引物包括2019-nCoV N-F和2019-nCoV N-R(分别参考序列表SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5)，2019-nCoV N基因片段探针为2019-nCoVN-P(参考序列表SEQ ID NO.6)，引物及探针由通用生物系统(安徽)有限公司合成。
2019-nCoV orf1ab-F：5’-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3’；
2019-nCoV orf1ab-R：5’-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3’；
2019-nCoV orf1ab-P：
5’-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTA-BHQ1-3’；
2019-nCoV N-F：5’-ATTGGCATGGAAGTCACACC-3’；
2019-nCoV N-R：5’-TTATTCAGCAAAATGACTTGAT-3’；
2019-nCoV N-P：5’-CY5-GTTGACCTACACAGGTGCCATC–BHQ2-3’；
实施例2、本发明检测试剂盒的反应体系及鉴定方法
1)首先反应管加入2019-nCoV orf1ab/N RT-PCR缓冲液600μL、2019-nCoVorf1ab-F 9.6μL、2019-nCoV orf1ab-R 9.6μL、2019-nCoV orf1ab-P 4.8μL、2019-nCoV N-F 9.6μL、2019-nCoV N-R 9.6μL、2019-nCoV N-P 4.8μL和纯化水264μL制备成2019-nCoVorf1ab/N RT-PCR Buffer；
在每个PCR反应管加入上述制备好的2019-nCoV orf1ab/N RT-PCR Buffer 19μL/人和2019-nCoV orf1ab/N Enzyme Mix 1μL/人，然后在每个PCR反应管中分别加入实施例1采集得到的待测样本RNA 5μL/人、2019-nCoV orf1ab/N Positive Control 5μL、2019-nCoV orf1ab/N Negative Control 5μL盖紧管盖后瞬间离心，得待测样品；
2)将步骤1)得到的待测样品在荧光定量PCR扩增仪中扩增，将待测样品在50℃条件下孵育20min，升温至95℃孵育15min；然后在95℃的条件下孵育10s，降温至55℃孵育40s，40个循环，在55℃采集荧光信号，通过观测荧光曲线进行结果判读，扩增曲线参照图1。
本实施例中2019-nCoV orf1ab/N RT-PCR缓冲液为Tris-HCl缓冲液、脱氧核苷三磷酸、Mg2+的复配，本实施例中2019-nCoV orf1ab/N RT-PCR缓冲液来自上海翊圣生物科技有限公司出售的缓冲液，产品名称为Hifair VnCov Multiplex One Step RT-qPCR ProbeKit。
本实施例中2019-nCoV orf1ab/N Enzyme Mix为热启动酶和逆转录酶的复配，本实施例中2019-nCoV orf1ab/N Enzyme Mix来自上海翊圣生物科技有限公司。
本实施例中为2019-nCoV orf1ab/N Positive Control含2019-nCoV orf1ab/N片段的质粒。
本实施例中2019-nCoV orf1ab/N Negative Control为0.85％～0.9％的生理盐水。
实施例2待测样本核酸鉴定方法为：
本发明新型冠状病毒核酸检测试剂盒在正常的情况下进行结果分析。
1)阳性：待测样本检测结果FAM和CY5通道同为Ct≤37且曲线有明显扩增期，结果测定有效，可直接判断样本为阳性。
2)阴性：待测样本检测结果FAM和CY5通道Ct＞40，可直接判断样本为阴性。
3)可疑：待测样本检测结果FAM/CY5通道37＜Ct≤40，需重复一次，若此时Ct值仍≤40，且曲线有明显的扩增期，可判断样本为阳性，否则为阴性。待测样本检测结果FAM和CY5通道中只有一个通道Ct≤37且曲线有明显扩增期，另一个通道通道Ct＞40，需重新采样检测，对临床样本的检测结果见图2。
试验一、灵敏度实验
最低检出量参考品制备：最低检出限参考品1份，由通用生物系统(安徽)有限公司人工合成的含2019-nCoV orf1ab/N片段的RNA制备而成。
采用本发明新型冠状病毒核酸检测试剂盒对最低检出量参考品进行检测，参照图3和图4。
试验二、特异性实验
阳性参考品的制备：阳性参考品共5份，均由委托的生物公司人工合成含2019新型冠状病毒orf1ab/N片段的RNA制备而成。
阴性参考品的制备：阴性参考品共8份，为同种属、感染部位相同或感染症状相似的人工合成RNA或灭活病毒培养物，MRES、SARS、HKU1、NL63、229E、OC43、甲型流感病毒、乙型流感病毒。
采用本发明检测试剂盒对阳性参考品和阴性参考品进行检测。
参照图5和图6，检测结果表明：FAM通道仅对2019新型冠状病毒中的2019-nCoVorf1ab片段进行扩增(图5)，CY5通道仅对2019新型冠状病毒中的2019-nCoV N片段进行扩增(图6)。表明本检测试剂盒能特异性扩增2019新型冠状病毒中的2019-nCoV orf1ab片段和2019-nCoV N片段，而不与其他病毒核酸发生交叉反应。
试验三、对比实验
采用本试剂盒和上海伯杰医疗科技有限公司的“新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)”(国械注准20203400065)同时对临床样本以及阳参按说明书进行检测。
检测结果表明：本试剂盒相比于上海伯杰医疗科技有限公司的“新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)”，对临床样本和阳参的扩增效果更好，结果见图7～图10。
本发明与同类产品相比较具有：
1.高灵敏度，检测标准品灵敏度可达1000copies/mL：以2019-nCoV阳性质粒为模板，进行5个10倍梯度稀释，使用该试剂对各稀释梯度中的orf1ab基因和N基因进行双重检测，可稳定检出1000copies/mL。
2.防污染性能强，实验中采用闭管操作，可防止扩增产物气溶胶带来的污染，避免假阳性的产生。
3.多重检测，同一反应中可进行两个靶标的检测。
4.特异性强，参考WHO及CDC发布的序列合成引物和探针，单管双检，同时测定新型冠状病毒两个独立基因，排除非特异性干扰，2019-nCoV检测精度高。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳市梓健生物科技有限公司
<120> 一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒及检测方法
<130> 2020.2.12
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 2019-nCov orf1ab-F
<400> 1
ccctgtgggt tttacactta a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 2019-nCov orf1ab-R
<400> 2
acgattgtgc atcagctga 19
<210> 3
<211> 31
<212> PRT
<213> 2019-nCov orf1ab-P
<400> 3
Phe Ala Met Cys Cys Gly Thr Cys Thr Gly Cys Gly Gly Thr Ala Thr
1 5 10 15
Gly Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Gly Thr Thr Ala Asx His Gln
20 25 30
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 2019-nCov N-F
<400> 4
attggcatgg aagtcacacc 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 2019-nCov N-R
<400> 5
ttattcagca aaatgacttg at 22
<210> 6
<211> 27
<212> PRT
<213> 2019-nCov N-P
<400> 6
Cys Tyr Gly Thr Thr Gly Ala Cys Cys Thr Ala Cys Ala Cys Ala Gly
1 5 10 15
Gly Thr Gly Cys Cys Ala Thr Cys Asx His Gln
20 25

Claims (9)

1.一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征是：所述试剂盒包含：2019-nCoVorf1ab/N RT-PCR Buffer，2019-nCoV orf1ab/N Enzyme Mix，2019-nCoV orf1ab/NPositive Control，2019-nCoV orf1ab/N Negative Control，所述2019-nCoV orf1ab/NRT-PCR Buffer包括以下组分：
组分(1)：由一对检测2019-nCoV orf1ab基因片段引物和一条检测2019-nCoV orf1ab基因片段探针组成；
组分(2)：由一对检测2019-nCoV N基因片段引物和一条检测2019-nCoV N基因片段探针组成；
所述2019-nCoV orf1ab基因片段引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2，所述2019-nCoV orf1ab基因片段探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3；
所述2019-nCoV N基因片段引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，所述2019-nCoV N基因片段探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征是：所述2019-nCoVorf1ab/N Enzyme Mix包括热启动酶和逆转录酶。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征是：所述2019-nCoVorf1ab/N Positive Control为含2019-nCoV orf1ab/N片段的质粒。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征是：所述2019-nCoVorf1ab/N Negative Control为浓度0.85％～0.9％的生理盐水。
5.一种新型冠状病毒核酸检测方法，其特征是：包括以下步骤：
S1.样本采集：采集病人发病时期的咽拭子样本，迅速将拭子浸入装有含病毒保存液的采样管中密封保存；
S2.核酸提取：实验室灭活后进行核酸提取，采用核酸提取试剂盒提取样本RNA；
S3.配置试剂：在PCR反应管加入2019-nCoV orf1ab/N RT-PCR缓冲液，以及如权利要求1～4任一所述的2019-nCoV orf1ab基因片段引物、2019-nCoV orf1ab基因片段探针、2019-nCoV N基因片段引物和2019-nCoV N基因片段探针制备成2019-nCoV orf1ab/N RT-PCRBuffer；
然后在PCR反应管加入步骤S2提取得到的样本RNA和如权利要求1～4任一所述的2019-nCoV orf1ab/N Enzyme Mix，盖紧管盖后离心得待测样品；
S4.待测样品扩增：将步骤S3得到的待测样品在荧光定量PCR扩增仪中扩增，在55℃采集荧光信号，通过观测荧光曲线进行结果判读。
6.根据权利要求5所述的新型冠状病毒核酸检测方法，其特征是：步骤S2中实验室灭活温度为56℃，灭活时间为30min。
7.根据权利要求5所述的新型冠状病毒核酸检测方法，其特征是：所述步骤S3中2019-nCoV orf1ab/N RT-PCR缓冲液为的Tris-HCl缓冲液、脱氧核苷三磷酸、Mg2+的复配。
8.根据权利要求5所述的新型冠状病毒核酸检测方法，其特征是：所述步骤S3中2019-nCoV orf1ab/N RT-PCR Buffer包括2019-nCoV orf1ab/N RT-PCR缓冲液600μL、2019-nCoVorf1ab基因片段引物19.2μL、2019-nCoV orf1ab基因片段探针4.8μL、2019-nCoV N基因片段引物19.2μL、2019-nCoV N基因片段探针4.8μL。
9.根据权利要求5所述的新型冠状病毒核酸检测方法，其特征是：所述步骤S4中的待测样品扩增包括以下步骤：将待测样品在50℃条件下孵育20min，然后升温至95℃孵育15min；然后在95℃的条件下孵育10s，降温至55℃孵育40s，共40个循环。
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