CN102417935B

CN102417935B - 新城疫病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及探针

Info

Publication number: CN102417935B
Application number: CN201110335627.9A
Authority: CN
Inventors: 胡萌; 王业富; 周康平; 邱杨; 赵丽
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Hubei Vanderui Life Science Technology Co ltd
Priority date: 2011-10-31
Filing date: 2011-10-31
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2031-10-31
Also published as: CN102417935A

Abstract

本发明公开了一种新城疫病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针，属于生物技术领域。本发明试剂盒包括PCR反应液，其中包括DEPC处理水、Taq酶、M-MLV反转录酶、RNase抑制剂、dNTP Mix、10×一步法RT-PCR Buffer、MgCl₂溶液、新城疫病毒正向引物：5'-GRCTTAARGAGAGCATYG-3'、新城疫病毒反向引物：5'-CTGCCACTGMTAGTTGYG-3'、新城疫病毒LNA探针5'-accAatGarGctGtgca-3'；试剂盒中还包括RNA提取液、阴性质控品、工作标准品、阳性质控品和临界阳性质控品。本发明采用实时荧光定量PCR技术定量检测新城疫病毒核酸，具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。

Description

新城疫病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及探针

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种新城疫病毒核酸定量检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

新城疫病毒（Newcastle Disease Virus, NDV），又称禽副黏病毒-1，侵染多种禽类并发生引发高度死亡，也可感染人，1926年首次爆发于印度尼西亚和英国，病原体于次年分离确定，世界范围分布并曾形成四次大流行。上世纪90年代以来，虽然没有出现世界性ND大流行，但局部地区的流行和暴发时常发生(如台湾、西欧、南非等地)。近年来．我国呈地方性流行和散发的ND时有发生。新城疫病毒可以感染绝大部分鸟类，对于一些易感染的家禽其是极易传播并且致死的。新城疫在世界各地频发，每年都造成巨大损失，因而其是最重要的禽类传染病之一。由于新城疫病毒种类的不同，新城疫在禽类身上的临床表现存在巨大差异。致命的毒株其临床表现主要可以分为3类：（1）嗜内脏型强毒，急性致死感染，死亡的鸟类伴有肠损伤性出血；（2）嗜神经性强毒，高致死率并伴有呼吸和神经性疾病，但通常没有肠道疾病；（3）中等毒力，引起呼吸和神经性感染症状，但致死率低。致命性毒株在家禽的出现需要处理和控制，即使是地方性传播也是必须的，否则其会对禽类的经济生产和国际贸易带来巨大冲击。

自首发以来，每次大流行均与NDV新的基因型出现有关，说明病毒的分子进化与病毒的致病流行存在着重要的相关性。对NDV毒株进行有效的区别和鉴定可为深入研究NDV提供重要的依据。新城疫病毒为副黏病毒科，禽腮腺病毒属，单分子负链病毒目，只有一个血清型。病毒粒子有囊膜，直径100-300nm，基因组为单股负链不分节段的RNA组成，编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶（HN）和大蛋白（L）。P蛋白经过RNA修饰可以额外产生非结构蛋白V和W。目前，针对NDV的核酸检测目标基因主要为融合基因（Fusion Gene, F）及血凝素-神经氨酸酶基因（hemagglutinin-neuraminidase Gene, HN）。本研究确定检测的目标基因为F基因，该基因编码的蛋白为病毒表面的纤突结构之一，是病毒重要的宿主保护性抗原，在新城疫的发病过程中起着很重要的作用，参与病毒的穿透，细胞融合以及溶血等过程，为NDV致病性的主要影响因子。同时，研究该基因对将要提到的病毒流行病学的研究也至关重要。

现有技术中新城疫病毒的快速检测方法如下：

1、病毒分离法

为病毒性疾病诊断最常用以及高度敏感的方法之一。分离出的病毒再经电子显微镜、免疫学技术或分子生物学进一步鉴定。大致操作为获取病毒分离的样品、病毒分离操作、接种后观察或其他方法。分离出的病毒可用于长期保存，抗原性、基因特性或药物敏感性等分析，但也存在一定的使用限制。目前最常用的分离病毒的组织系一般为MDCK，而鸡胚则是最常用的活体。大多数毒株均可适应于该细胞，将病料或其它处理，接种到细胞系上，3~4 天可见CPE，表明病毒分离。总体而言，病毒分离认为检测病毒的一种经典、准确、敏感的病原学诊断金标准，特异性和敏感性均较高，但较为费时。

2、电子显微镜技术

电镜已成为病毒研究的常规手段之一，可以很直观地显示病毒粒子的形态结构、病毒在寄主细胞内的存在状态、寄主细胞的结构变化、以及病毒的复制和装配等过程。电子显微镜技术分常规电镜和免疫电镜。可用电子显微镜直接观察到新城疫病毒颗粒或感染部位组织。常规电镜法样品用量小、制样速度快、观察比较直观，但观察灵敏度较低，要求样品的病毒量大。而免疫电镜法较常规电镜法的敏感性高，但样品制备过程较复杂，对操作者的技能要求较高。在此基础上还研究开发出了一些新方法及技术，如免疫电子显微镜或固相免疫电子显微镜，这些方法是利用抗原抗体反应并通过负染色在电子显微镜下进行观察，灵敏度相对提升了许多，但相应的样品制备过程较复杂，对操作者的技能要求较高。

3、血清学实验

血清学检测方法主要是检测甲病毒感染过程中产生的抗原抗体免疫标志物，主要包括免疫过氧化物单层试验（IPMA）、免疫荧光试验（IFA）、酶免疫法(EIA)和血清中和试验等。血清学测定的灵敏度高于电子显微镜，但其特异性低，实验室诊断方面局限性较大。此外，由于该技术建立于病毒抗原识别的基础之上，病毒的抗原多样性会对该技术的应用产生影响。操作上较为简单快速，但现有的方法缺乏足够的敏感性和特异性，如不能准确区分甲型H1N1流感病毒与季节性流感，且不能检测新变异的毒株。

免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA），广泛用于疫病病毒诊断，敏感性和特异性都比较好。可用于病毒抗原检测、病毒鉴定及血清抗体检测。间接荧光抗体试验间接荧光抗体试验(indirect fluorescent anti-body test, IFA)，为标记荧光素在抗原抗体上进行抗原抗体反应。新报道的微球免疫法即将利用结合于聚苯乙烯微球的抗体鉴定病毒，敏感性和特异性均相当高，并且，由于该微球系统可发出不同颜色的荧光，因此，理论上可同时检测100种不同的抗体，且试剂用量极少。该法是国际上检测疫病病毒阳性抗体通用而且比较敏感的血清检测方法。IFA特异性可达99%。IFA可以确定抗体的滴度，抗体滴度达到16或20的可以判为阳性。关于EIA，其应用最广的技术为酶联免疫吸附试验 (ELISA)，其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，再加底物显色，最后根据色泽深浅推算待测抗原或抗体的含量。检测方法分为有多种形式，如间接ELISA、捕捉ELISA、阻断ELISA、夹心ELISA 等。抗原检测ELISA特异性较强，操作快速简便，可应用于大批量样本检测，并且抗体侦测的反应谱比抗原更广。而血清中和试验(serum neutralization test, SNT)，分常量和微量两种，基本原理为利用完整的病毒来检测中和抗体，WHO推荐使用微量中和法，其敏感性大大高于血凝抑制（HI）试验，但中和抗体在血清中出现比较迟，不适用于早期诊断。该法特异性很强，可区别不同毒力的病毒株型。此法是评价猪群免疫保护水平的唯一客观可信的方法，为经典方法，但操作繁琐、费时费料，对安全及检验技术要求高，现在已较少使用。另外还有SPRIA法、MEIA法、琼脂凝胶扩散试验（agar gel immunodiffusion, ACID）、血凝抑制（HI）试验、免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)等。

4、分子生物学方法

病毒的核酸检测敏感度高，检测周期短，目前应用较为广泛。分子诊断中使用最多的3种技术为PCR法、NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）及DNA芯片。

PCR法是通过两段特异性寡核甘酸引物，在体外经DNA聚合酶催化，扩增与两引物互补的DNA序列之间的区段，检测样品中是否有该序列。PCR较血清学方法更敏感，但特异性和重复性较低，若结合斑点杂交、微孔板杂交、滤膜核酸探针杂交等核酸杂交方法和酶联免疫等方法对PCR产物进行分析，灵敏度和特异性均可大大提高。

随着现代核酸技术的发展，建立在基因水平上的核酸扩增技术PCR及相关技术，由于其高敏感性和高特异性，在病毒的临床检测中得到广泛应用，成为实验室诊断的主要方法。这些以PCR为基础的检测方法，都需要花费时间对PCR扩增产物进行后处理，PCR扩增产物中高浓度的目标DNA分子会以气溶胶的形式污染整个实验空间，由于PCR的高度灵敏性，甚至可以检测出反应体系中10个拷贝的模板浓度，从而可能给今后的PCR实验带来严重的假阳性；常规PCR方法是终点检测法，由于PCR反应具有平台期，无法依据终产物对起始模板进行精确定量检测。在此基础上研发出竞争PCR（competitive PCR），巢式PCR（nested PCR），半巢式PCR（semi-nested PCR），多重巢式PCR（multiplex nested PCR），限制片段长度多态性PCR（RELP-PCR），多重PCR等。

逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR法）是一种灵敏度很强的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR 广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。建立病毒RT-PCR 检测方法的原则是扩增病毒特异而保守的基因片段，具有很高的特异性和敏感性。的灵敏度可能因样本中存在其抑制物而低于预期，目前已逐步发展为病毒检测的“金标准”。在所有常规方法中，该反应最为灵敏。

逆转录实时荧光定量PCR法，该法在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，分一步法和两步法两种，具高通量，可定量，单位检测成本较低，稳定性、精确性、重复性好，以及自动化程度高等特点。并且单管封闭检测且不需后续处理而大大减小交叉污染的可能。检测周期短。敏感性为传统RT-PCR的10~100倍。而使用特异性的探针可进一步极高检测的效率及限制，据研究报道使用TaqMan探针的RRT-PCR方法的检测限可达0.006 TCID₅₀/ml~0.2 TCID₅₀/ml (50% tissue culture infectious dose，半数组织培养感染剂量)。而应用MGB探针可减少背景荧光，进一步提高敏感性，检测限可达0.08 EID₅₀或0.006 TCID₅₀(约5个RNA拷贝)，线性范围为5~5×10⁸ copy/ml。探针的应用使假阳性最小化。

依赖核酸序列的扩增 (Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)是一种快速、等温的RNA扩增技术，整个反应有赖于AMV逆转录酶、T7 RNA多聚酶和核酸酶H (RNase H)共同协作而完成，不需特殊仪器，不需温度循环，是以转录为基础，单链核苷酸的连续扩增，其反应产物是单链RNA。扩增产物与磁珠上的捕捉探针及钌标记的电化学发光寡棱苷酸探针(ECL探针)杂交后，形成复合物，经NucliSens阅读器直接检测电化学发光强度。该法周期较短，灵敏度与鸡胚培养相当。NASBA扩增不要需要复杂的温度变化，其扩增效率高于传统的PCR，其敏感性要高于传统PCR，但现有的敏感性评估均为体外实验结果，需要进行直接检测临床样品的彻底评估。在NASBA技术上进一步发展出来的实时NASBA技术，使检测的敏感性和特异性大大提高，达到~0.1 TCID，相当于RRT-PCR。检测临床样品的阳性率高于细胞培养法及直接免疫荧光法多达64％。NASBA技术拥有RRT-PCR相似的优点，且因为不需要变性DNA，即便有基因组DNA污染也可以特异性扩增出目的RNA；而且还是一种高通量的方法，可以同时检测50个样本。非常适用于大规模样品的筛查。NASBA技术的扩增产物为RNA分子，使用者可以根据需要选择不同的检测方法，如电化学发光法和酶联法等。而且，与PCR的产物DNA分子不同，RNA分子不易对实验仪器和环境造成污染，避免了产物交叉污染实验仪器、操作环境导致的假阳性结果。但缺点是单位均检测成本要高于RRT-PCR，所以有条件的实验室，最适合的技术还是RRT-PCR。

基因芯片技术(gene chips)，又称DNA芯片(DNA chips)或生物芯片(biological chips)。其原理是将大量特定的寡核苷酸或基因片段作为探针，有规律地和高密度地排列，固定在一块很小的支持物如硅片、玻片等，然后与待检的荧光标记样品核酸按碱基配对原则杂交，经洗涤后通过激光共聚焦荧光系统检测杂交信号强度，再经计算机分析处理数据从而获取样品的生物信息。将特异探针固定在载玻片上，在PCR扩增NDV PCR产物带有荧光，通过将PCR产物与NDV芯片杂交后某型处的杂交点出现荧光而确定。将RT-PCR获得的病毒各种基因的cDNA或合成的特异性寡核苷酸探针固化于芯片，利用核酸杂交技术可构建检测病毒血清型或亚型的芯片平台，CY3、CY5标记待检的cDNA或扩增的DNA，与芯片杂交，检测病毒核酸或进一步鉴别混合体系中扩增产物。理论上单次杂交可以检测多种病毒，并有潜力进行成千上万种核酸序列的筛选。可用于NDV病毒的基因变异、基因分型的检测。该技术具有自动化程度高、灵敏度高、检测目的分子量少、效率高等优点，但也存在成本高、假阳性率偏高、重复性差等缺陷。目前基因芯片技术在流感的检测中还远远低于其它检测方法，且检测成本及硬件要求均较高．离实际应用还有很长的路要走。

此外还有原位核酸分子杂交技术(in situ hybridization, ISH)、核酸探针法、环介导的等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）等。

发明内容

本发明目的是提供一种新城疫病毒核酸定量检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明首先提供一种新城疫病毒核酸定量检测引物和探针，包括如下的序列组：

1）包括下述正向引物，反向引物和荧光探针的一组序列：

正向引物：5'-GRCTTAARGAGAGCATYG-3'，

反向引物：5'-CTGCCACTGMTAGTTGYG-3'，

荧光探针：5'- accAatGarGctGtgca -3'，下标为LNA修饰。

2）上述1）中序列的5’端和/或3’端有延长的核苷酸片段的一组序列；

3）与上述1）或2）中序列的同源性大于85%，且具有特异性的一组序列；

4）与上述1）或2）或3）中序列的碱基互补的一组序列；

5）上述1）、2）和3）中任何三个或多个序列形成的具有正向引物、反向引物以及与之向对应的荧光探针的序列组；

其中，所述序列中Y为C或T，R为A或G，M为A或C；所述荧光探针的5’端和3’ 端分别用荧光基团FAM、BHQ1修饰。其中荧光探针的5’端修饰的荧光染料可选自：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5；3’端修饰的荧光染料选自：TAMRA、Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL。

进一步，本发明提供一种含有上述引物及探针的新城疫病毒核酸定量检测试剂盒。

上述试剂盒还进一步包括以下试剂中的一种或多种：

（1）PCR反应液；

（2）RNA提取液；

（3）阴性质控品，为不含新城疫病毒Fusion基因的pUC57载体质粒DNA片段；

（4）阳性质控品，为含1.0×10⁶ copy/ml新城疫病毒基因组DNA片段；

（5）临界阳性质控品，为含1.0×10⁴ copy/ml新城疫病毒基因组DNA片段；以及

（6）工作标准品。

其中，所述PCR反应液，包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的HotStart Taq DNA聚合酶、M-MLV反转录酶、RNase抑制剂、dNTP Mix、10×一步法PCR Buffer、MgCl₂溶液，所述引物及探针溶于PCR反应液中。

所述PCR反应液各组分含量的配比为：DEPC处理水23.1 μl；5 U/μl的热启动Taq酶0.4 μl；200 U/μl M-MLV反转录酶1 μl; Rnase抑制剂0.5 μl；10 mmol/l 的dNTP Mix 2 μl；10×一步法RT-PCR Buffer 5 μl；25 mmol/l的 MgCl₂溶液用量9 μl；10 μmol/l的新城疫病毒正向引物用量1.5 μl；浓度为10 μmol/l的新城疫病毒反向引物用量1.5 μl；浓度为10 μmol/l的新城疫病毒探针用量1 μl。

其中，RNA提取液分为溶液1，溶液2，溶液3，溶液4以及溶液5。溶液1为Trizol试剂，溶液2为氯仿，溶液3为异丙醇，溶液4为75%乙醇，溶液5为DEPC处理水。

所述Trizol试剂主要成分为苯酚，另外还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等；所述氯仿为三氯甲烷，纯品；异丙醇为纯品；所述乙醇浓度为75%；所述DEPC处理水为0.1%DEPC水，经高压灭菌，同时也灭活了有毒性的DEPC。

其中，所述工作标准品，为含有新城疫病毒的致病机理相关决定基因Fusion基因的78个碱基对的核苷酸片段的pUC57（Amp+）重组质粒，该质粒在大肠杆菌DH5α中增殖；具体包括：

a、工作标准品1，含有约1.0×10⁷ copy/ml的新城疫病毒 Fusion基因的非传染性DNA片段；

b、工作标准品2，含有约1.0×10⁶ copy/ml的新城疫病毒 Fusion基因的非传染性DNA片段；

c、工作标准品3，含有约1.0×10⁵ copy/ml的新城疫病毒 Fusion基因的非传染性DNA片段；

d、工作标准品4，含有约1.0×10⁴ copy/ml的新城疫病毒 Fusion基因的非传染性DNA片段。

本发明实施范例还提供利用所述的试剂盒检测新城疫病毒核酸的检测方法，包括下列步骤：

（1）样品预处理：样本可为血清、鼻咽拭子、咽拭子或是其他组织；

具体可按以下方式进行样品的预处理：

血清样品：收集5 ml静脉血置10 ml带垫圈的螺口塑料离心管中（不含抗凝剂），以1,000 g离心10 min，在无菌条件下吸取血清，并分装到若干个1 ml带垫圈的螺口塑料血清管中（100μl/管），于48 h内冷藏（4～8℃）运输到实验室。

咽拭子和鼻咽拭子标本：先用生理盐水将棉拭子沾湿（不要用含有青霉素的标本运输液，以防过敏），鼻咽拭子采集是将棉签平行于上颚插入鼻孔，停留几秒钟，吸收分泌物，拭抹双侧鼻孔；咽拭子采集是用棉签适度用力擦拭双侧咽后壁部位，应避免触及舌部。采完咽拭子和鼻咽拭子后，迅速将拭子放入含有3 ml标本运输液的10 ml带垫圈的螺口塑料离心管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖。在48 h内冷藏（4～8℃）运输到实验室。如无病毒保存液，也可用生理盐水替代。

病料组织：采集新鲜病料，如猪的内脏，大小1～2 cm见方即可，存放在消毒过的容器内，若用于病理组织学检查，则要采集病灶及临近正常组织，并存放于10% 福尔马林溶液中。采集的样品于24 h内送达实验室。

长期保存血清样品存于-20 oC以下冰箱，拭子和病料组织保存于-70 oC或以下冰箱。

（2）RNA提取：取已处理的样本200 μl，加600 μl溶液1，充分震荡混匀，室温静置10 min；加150 μl溶液2，再次充分震荡混匀，室温静置5 min，13,000 rpm离心15 min，取上清置等体积预冷的溶液3中，温和颠倒混匀，静置10 min，12,000 rpm离心10 min，弃上清，加入1,000 μl 75%溶液4洗涤沉淀2次，8,000 rpm离心5 min。去上清，干燥 2～5 min，加15～30 μl溶液5溶解，-80℃保存；

（3）加样：向装有45 μl PCR 反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品，阴性质控品，阳性质控品，临界阳性质控品，工作标准品各5 μl，盖好管盖，5,000 rpm离心10 s；

（4）PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，按下列条件进行PCR扩增；

42℃ 60 min，1个循环；

94℃ 5 min，1个循环;

94℃ 30 s ，58℃ 45 s，5个循环；

94℃ 30 s ，58℃ 45 s，35个循环；收集荧光信号，在反应程序的第四步的终了读取荧光值。

（5）分析判断：Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于或等于28且小于或等于32的为临界阳性。

当需要绘制标准曲线时，另取4个反应管，直接加入不同浓度梯度的工作标准品5 μl，5，000 rpm离心10 s，同样本一起进行荧光定量PCR反应。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明试剂盒利用特异性的LNA探针来检测新城疫病毒，检测完成后无需开盖电泳，避免了产物污染及对实验室人员的伤害。

本发明使用LNA探针，也可用MGB探针，AllGlo^TM探针来代替。

本发明实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时检测克服了扩增产物终点检测所存在的“平台效应”对产物定量的影响，它具有高度的特异性、灵敏度与准确性（如图5、图6所示），且技术操作简便、自动化程度高，由于采用闭管操作，不需要PCR产物后处理，有效解决PCR污染问题等特点，结果可靠。同时，采用将逆转录及荧光定量PCR法结合起来，大大简化了实验步骤，在实际操作及推广上具有重大意义。

附图说明

图1是本发明实施例2的扩增曲线；

图2是本发明实施例3的扩增曲线；

图3是用工作标准品制作的标准曲线；

图4是本发明实施例4的扩增曲线；

图5、图6分别是本发明实施例5的扩增曲线和标准曲线；

图7是质粒pUC57构建图谱。

图中：图1、图2、图4、图5的横坐标表示：表示循环数（Cycle number），纵坐标表示：荧光值（Delta Rn）；图3、图6纵坐标表示：Ct值。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例1 试剂盒的组成

该试剂盒含有：PCR反应液，其包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的HotStart Taq DNA聚合酶、M-MLV反转录酶、dNTP Mix、10×一步法PCR Buffer、MgCl₂溶液、新城疫病毒正向引物、新城疫病毒反向引物、新城疫病毒LNA探针；RNA提取液分为溶液1，溶液2，溶液3，溶液4及溶液5。溶液1为Trizol试剂，溶液2为氯仿，溶液3为异丙醇，溶液4为75%乙醇，溶液5为DEPC处理水；阴性质控品，为不含新城疫病毒Fusion基因的质粒DNA片段；阳性质控品，为高浓度新城疫病毒基因组DNA片段；临界阳性质控品，为低浓度新城疫病毒基因DNA片段；工作标准品，为含有新城疫病毒Fusion基因的78个碱基对的核苷酸片段的pUC57（Amp+）重组质粒，该质粒在大肠杆菌DH5α中增殖；

试剂盒的制造：

1．试剂

本试剂盒制造过程中所用的试剂主要购至生工生物工程（上海）有限公司以及江苏硕世生物科技有限公司。

2．PCR反应液制备

（1）引物及探针设计与合成：

选择新城疫病毒特异性保守基因Fusion基因作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心（NCBI） (序列http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，选取并下载有代表性的新城疫病毒Fusion基因的39条序列，使用MAGA 4.0软件进行比对分析，在基因区选择一段相对保守序列，序列如序列表中SEQ ID NO.4所示：

GGCTTAAGGAGAGCATTGCTGCAACCAATGAAGCTGTGCATGAAGTCACCGACGGATTATCACAACTATCAGTGGCAG，利用实时TaqMan荧光定量PCR的专业设计软件Beacon Designer 7.0设计引物、探针序列，引物、探针序列不仅要满足软件中各项指标，而且要确保新城疫病毒引物、探针序列在NCBI上BLAST比对匹配结果前100条序列为100%，前500条序列尽可能趋于100%（可使用简并碱基）。在本发明中，新城疫病毒探针的5’端修饰的荧光染料可选自：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5；3’端修饰的荧光染料可选自：TAMRA、Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL。本实施例中荧光报告基团设计为FAM，FAM的激发波长为495 nm，接收波长为521 nm，淬灭集团设计为BHQ1。

设计结果如下表所示：

引物名称	碱基	纯化方式	引物序列（5’-3’）
				新城疫病毒-F	21bp	PAGE	GRCTTAARGAGAGCATYG
新城疫病毒-R	21bp	PAGE	CTGCCACTGMTAGTTGYG
				新城疫病毒-P	17 bp	PAGE	accAatGarGctGtgca

注：“Y”为兼并碱基，Y=(C/T)、R=（A/G），M=（A/C）。

表中：F：forward，正向；新城疫病毒-F表示新城疫病毒正向引物。

R：reverse，反向；新城疫病毒-R表示新城疫病毒反向引物。

P：probe，探针；新城疫病毒-P表示新城疫病毒探针，探针既可为TaqMan-MGB探针也可为LNA探针，本例中为LNA探针，下划线处为LNA修饰。

FAM：荧光报告基团。

BHQ 1：荧光淬灭基团。

按照上表的设计结果，委托江苏硕世生物科技有限公司合成引物和探针。

（2）PCR反应液配制：DEPC处理水23.1 μl；5 U/μl的热启动Taq酶0.4 μl；200 U/μl M-MLV反转录酶1 μl; Rnase抑制剂0.5 μl；10 mmol/l 的dNTP Mix 2 μl；10×一步法RT-PCR Buffer 5 μl；25 mmol/l的 MgCl₂溶液用量9 μl；10 μmol/l的新城疫病毒正向引物用量1.5 μl；浓度为10 μmol/l的新城疫病毒反向引物用量1.5 μl；浓度为10 μmol/l的新城疫病毒探针用量1 μl，配制成PCR反应液。

3.阴性质控品制备：不含新城疫病毒Fusion基因的pUC57质粒DNA片段

取不含新城疫病毒Fusion基因溶液于样本准备区预处理，定量稀释至浓度为1×10⁷copy/ml（比浊法），吸取质粒溶液于离心管中，混匀，直接吸取5 μl作模板。

4.阳性质控品制备：高浓度新城疫病毒基因组DNA片段

取含新城疫病毒MDCK细胞悬浮液，200μl，提取RNA，逆转录为cDNA，使用分光光度计测A₂₆₀定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×10⁶ copy/ml，即可作为阳性质控品模板。

5.临界阳性质控品制备：低浓度新城疫病毒基因组DNA溶液

取含新城疫病毒MDCK细胞悬浮液，200μl，提取RNA，逆转录为cDNA，使用分光光度计测A₂₆₀定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×10⁴ copy/ml，即可作为临界阳性质控品模板。

6. RNA提取液分为溶液1，溶液2，溶液3，溶液4及溶液5。溶液1为Trizol试剂，溶液2为氯仿，溶液3为异丙醇，溶液4为75%乙醇，溶液5为DEPC处理水。；

7.工作标准品1，含有约1.0×10⁷ copy/ml的新城疫病毒 Fusion基因的非传染性DNA片段；

8.工作标准品2，含有约1.0×10⁶ copy /ml的新城疫病毒 Fusion基因的非传染性DNA片段；

9.工作标准品3，含有约1.0×10⁵ copy /ml的新城疫病毒 Fusion基因的非传染性DNA片段；

10.工作标准品4，含有约1.0×10⁴ copy /ml的新城疫病毒 Fusion基因的非传染性DNA片段；

工作标准品，为含有新城疫病毒的致病机理相关决定基因Fusion基因的78个碱基对的核苷酸片段（SEQ ID NO.4）的pUC57（Amp+）重组质粒（质粒委托上海生工生物科技有限公司合成，质粒图谱如图7所示），该质粒在大肠杆菌DH5α中增殖碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，分光光度计定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×10⁹ copy/ml，-20℃保存。贮存浓度为1.0×10⁹ copy/ml，使用前用无菌生理盐水或0.01 mol/l PBS 10倍倍比稀释。工作浓度分别为1.0×10⁷ copy/ml，1.0×10⁶ copy/ml，1.0×10⁵ copy/ml以及1.0×10⁴ copy/ml，反应前，12,000 rmp离心30 s，取上清液作模板。

本发明的试剂盒可以按照下表进行配置（24人份/盒）：

组分名称	规格	数量	主要生化组成成分
				PCR反应液	45 μl/管	24	新城疫病毒引物、探针以及Taq酶、M-MLV反转录酶、RNase抑制剂、10×一步法PCR Buffer、MgCl₂溶液及dNTP Mix系列
溶液1	1.5 ml/管	2	主要成分为苯酚，另外还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等；
				溶液2	700 μl/管	1	氯仿；
溶液3	500 μl/管	1	异丙醇；
				溶液4	500 μl/管	1	75%乙醇（使用DEPC处理水配制）；
溶液5	150 μl/管	1	DEPC处理水；
				阴性质控品	100 μl/管	1	不含新城疫病毒Fusion基因的pUC57（Amp+）载体质粒DNA片段；
阳性质控品	50 μl/管	1	高浓度新城疫病毒基因组DNA片段；
				临界阳性质控品	50 μl/管	1	低浓度新城疫病毒基因组DNA片段；
工作标准品1	20 μl/管	1	含有约1.0×10⁷copy/ml的新城疫病毒基因的非传染性DNA片段；
				工作标准品2	20 μl/管	1	含有约1.0×10⁶ copy /ml的新城疫病毒基因的非传染性DNA片段；
工作标准品3	20 μl/管	1	含有约1.0×10⁵ copy /ml的新城疫病毒基因的非传染性DNA片段；
				工作标准品4	20 μl/管	1	含有约1.0×10⁴ copy /ml的新城疫病毒基因的非传染性DNA片段；
说明书	—	1份	白卡纸

本发明的试剂盒在-10℃±5℃避光储存，避免反复冻融；有效期6个月。

适用仪器（ABI7500，ABI7300，Bio-Rad iQ5^TM，Stratagene Mx3000P、Stratagene Mx3005P，达安7000）等。

实施例2

用本发明的试剂盒在ABI 7300荧光定量PCR仪上检测新城疫病毒核酸的方法

（1）采集样品：采集血清、鼻咽拭子、咽拭子或是病料组织；

（2）RNA提取：取已处理的样本200 μl，加600 μl溶液1，充分震荡混匀，室温静置10 min；加150 μl溶液2，再次充分震荡混匀，室温静置5 min，13,000 rpm离心15 min，取上清置等体积预冷的溶液3中，温和颠倒混匀，静置10 min，12,000 rpm离心10 min，弃上清，加入1,000 μl 75%溶液4洗涤沉淀2次，8,000 rpm离心5 min。去上清，干燥2～5 min，加15～30 μl溶液5溶解，-80℃保存；

（3）加样：向装有45 μl PCR 反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品5 μl，盖好管盖，5,000 rpm离心10 s；

DEPC处理水23.1 μl；5 U/μl的热启动Taq酶0.4 μl； 200 U/μl M-MLV反转录酶1 μl; Rnase抑制剂0.5 μl；10 mmol/l 的dNTP Mix 2 μl；10×一步法RT-PCR Buffer 5 μl；25 mmol/l的 MgCl₂溶液用量9 μl；10 μmol/l的新城疫病毒正向引物用量1.5 μl；浓度为10 μmol/l的新城疫病毒反向引物用量1.5 μl；浓度为10 μmol/l的新城疫病毒探针用量1 μl;

新城疫病毒 FQ-PCR反应体系如下表：

试剂名称及浓度	加入量/人份（μl）	终浓度
			10×一步法PCR buffer	5.0	1×PCR buffer
MgCl₂ (25 mmol/l)	9.0	4.50 mmol/l
			dNTP Mix(10 mmol/l)	2.0	0.20 mmol/l
新城疫病毒 FP(10 μmol/l)	1.5	0.30 μmol/l
			新城疫病毒 RP(10 μmol/l)	1.5	0.30 μmol/l
新城疫病毒Probe(10 μmol/l)	1.0	0.20 μmol/L
			Taq酶(5U/μl)	0.4	0.04 U/μl
M-MLV(200U/μl)	1.0	4 U/μl
			Rnase抑制剂（2,000 U/μl）	0.5	20 U/μl
模板	5.0	—
			加水	23.1	—
总体积	50.0	—

（4）PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，选择要用的LNA探针（本产品荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ），定义样品孔：阴性质控品选NTC；待检样品、阳性质控品及临界阳性质控品选Unknown。

在反应程序的第三步的终了读取荧光值；

（5）分析判断：

Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于和等于28且小于和等于32的为临界阳性。本发明实施例2的试验结果如图1所示，具体检测结果见下表：

序号	Ct
		1	Undet.
2	5.07488
		3	Undet
4	9.22692
		5	Undet.
6	8.85773
		7	24.3669
8	30.2781
		9	7.39095
10	21.0064

其中，样本2，4， 6，7，9，10在阳性范围内，为阳性样本；样本8在临界阳性范围内，为临界阳性样本；样本1，3，5在阴性范围内，为阴性样本。

实施例3

用本发明的试剂盒按照实施例2的方法检测临床确诊样本的新城疫病毒核酸。样本来源××医院病人确诊的样品，本发明实施例3的试验结果如图2所示，检测结果见下表：

序号	Ct
		1	22.9361
2	17.4666
		3	34.06
4	Undet
		5	21.0174
6	Undet
		7	21.0506
8	Undet
		9	22.1374
10	Undet

范例中临床确诊样本1、2、3、5、7、9为阳性，4、6、8、10为阴性，本研究结果与之相符，准确率为100%。

实施例4

利用本发明的试剂盒进行定量检测时，需绘制标准曲线，除8个样本反应管外，另取3个反应管分别为阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品，还有4个反应管，给每个反应管中对应加入试剂盒中不同浓度梯度的工作标准品5 μl，5,000 rpm离心10 s，以工作标准品为模板，按照实施例1的方法配制反应体系，然后放入仪器样品槽进行PCR扩增。工作标准品选Standard。对于Standard，需要在Quantity栏中分别输入1.0×10⁷ copy/ml、1.0×10⁶ copy/ml、1.0×10⁵ copy/ml、1.0×10⁴ copy/ml。

使用仪器ABI 7300参照结果：

a. 如果扩增曲线不呈S型或Ct值＞32，判定样品新城疫病毒DNA含量小于检测下限；

b. 如果扩增曲线S型不明显或28≤Ct值≤32，则样品新城疫病毒 DNA含量处于临界阳性范围；

c. 如果扩增曲线呈S型且Ct值﹤28，则按以下方法进行定量：

若样品的C（ “C” 表示样本浓度或含量）＜5.0000E+01，则该样品的新城疫病毒 DNA总含量＜50基因拷贝；

若样品的5.0000E+01≤C≤5.0000E+07，则该样品的新城疫病毒DNA总含量=C基因拷贝；

若样品的C＞5.0000E+07，则该样品的新城疫病毒DNA总含量＞5.0000E+07基因拷贝，将样品稀释至线性范围内再检测；

根据下表绘制的标准曲线如图3所示，■是标准品。

工作标准品	Ct	C（初始浓度）
			1.0e+007	12.0407	1.0e+007
1.0e+006	15.0577	1.0e+006
			1.0e+005	19.1431	1.0e+005
1.0e+004	22.3168	1.0e+004
			slope	-3.491370	—
intercept	36.342117	—
			R²	0.996693	— 。

本发明实施例4的扩增曲线如图4所示，本实施例工作标准品和8个样本在一起检测，根据扩增后得到的Ct值，查图3的标准曲线，再经换算，最终得到8个样本的的初始浓度如下表。

检测结果见下表：本发明的数据精确到0.01。

序号	Ct
		阳性质控品	15.0577
临界阳性质控品	22.3168
		阴性质控品	Undet
1	20.9854
		2	23.5205
3	21.959
		4	Undet.
5	29.7367
		6	23.9831
7	27.9599
		8	25.1915

实验例5

基本同实施例4，浓度调为1.0×10⁹ copy/ml、1.0×10⁸ copy/ml、1.0×10⁷ copy/ml、1.0×10⁶ copy/ml、1.0×10⁵ copy/ml、1.0×10⁴ copy/ml、1.0×10³ copy/ml。

根据下表绘制的标准曲线如图6所示

工作标准品	Ct	C（初始浓度）
			1.0e+009	3.6076	1.0e+009
1.0e+008	6.1082	1.0e+008
			1.0e+007	9.9921	1.0e+007
1.0e+006	13.8503	1.0e+006
			1.0e+005	18.0794	1.0e+005
1.0e+004	21.6511	1.0e+004
			1.0e+003	25.363	1.0e+003
slope	-3.622833	—
			intercept	35.687248	—
R²	0.996135	—

扩增曲线均呈光滑"S"型，标准曲线为一条直线，Ct值在3～26之间，每个浓度梯度的Ct值差约为3.3。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 新城疫病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及探针

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> R为A或G

<222> (8)..(8)

<223> R为A或G

<222> (17)..(17)

<223> Y为C或T

<400> 1

grcttaarga gagcatyg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> M为A或C

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> Y为C或T

<400> 2

ctgccactgm tagttgyg 18

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> R为A或G

<400> 3

accaatgarg ctgtgca 17

<210> 4

<211> 78

<212> DNA

<213> Newcastle Disease Virus

<400> 4

ggcttaagga gagcattgct gcaaccaatg aagctgtgca tgaagtcacc gacggattat 60

cacaactatc agtggcag 78

Claims

1.一种新城疫病毒核酸定量检测引物和探针，其序列如下：

正向引物：5'-GRCTTAARGAGAGCATYG-3'，

反向引物：5'-CTGCCACTGMTAGTTGYG-3'，

荧光探针：5'-ACCAATGARGCTGTGCA-3'，下标为LNA修饰，

其中，所述序列中Y为C或T，R为A或G，M为A或C；其中荧光探针的5’端修饰的荧光染料选自：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5；3’端修饰的荧光染料选自：TAMRA、Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL。

2.含有权利要求1所述引物和探针的新城疫病毒核酸定量检测试剂盒。

3.根据权利要求2所述的新城疫病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种：

（1）PCR反应液；

（2）RNA提取液；

（4）阳性质控品，为含1.0×10⁶copy/ml新城疫病毒基因组DNA片段；

（5）临界阳性质控品，为含1.0×10⁴copy/ml新城疫病毒基因组DNA片段；

（6）工作标准品。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其中，PCR反应液包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的热启动Taq DNA聚合酶、M-MLV反转录酶、RNase抑制剂、dNTP Mix、10×一步法PCR Buffer、MgCl₂溶液，所述引物及探针溶于PCR反应液中。

5.根据权利要求3所述的新城疫病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述RNA提取液分为溶液1，溶液2，溶液3，溶液4及溶液5，其中溶液1为Trizol试剂，溶液2为氯仿，溶液3为异丙醇，溶液4为75%乙醇，溶液5为DEPC处理水。

6.根据权利要求3所述的新城疫病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括：

a、工作标准品1，含有1.0×10⁷copy/ml的新城疫病毒Fusion基因的非传染性DNA片段；

b、工作标准品2，含有1.0×10⁶copy/ml的新城疫病毒Fusion基因的非传染性DNA片段；

c、工作标准品3，含有1.0×10⁵copy/ml的新城疫病毒Fusion基因的非传染性DNA片段；

d、工作标准品4，含有1.0×10⁴copy/ml的新城疫病毒Fusion基因的非传染性DNA片段。

7.根据权利要求4所述的新城疫病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液各组分含量的配比为：DEPC处理水23.1μl；5U/μl的热启动Taq酶0.4μl；200U/μl M-MLV反转录酶1μl;RNase抑制剂0.5μl；10mmol/l的dNTP Mix2μl；10×一步法RT-PCR Buffer5μl；25mmol/l的MgCl₂溶液用量9μl；10μmol/l的新城疫病毒正向引物用量1.5μl；浓度为10μmol/l的新城疫病毒反向引物用量1.5μl；浓度为10μmol/l的新城疫病毒探针用量1μl。