CN103602760B - 病毒样颗粒内标实时荧光rt-pcr检测新城疫病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了病毒样颗粒内标实时荧光RT-PCR检测新城疫病毒的方法，根据新城疫病毒基因序列，在6997到7092之间的位点设计特异性引物和TaqMan探针；根据扩增目标片段的特点，设计内标探针序列。上述特异性引物的上游引物序列为：tgcagagatc actcacactc at；上述特异性引物的下游引物序列为：gatggaacgc agagtagaaa ag；上述TaqMan；探针的目标探针序列为：FAM-cctgttgcag atgtccggagcac-BHQ1;上述TaqMan探针的内标探针序列为：VIC-gctcattcgg ctcgacgggc aat-BHQ2。本发明的优点在于快速、特异性强、灵敏度高，应用于临床，能在3小时内准确的对新城疫进行诊断，为动物疫病治疗方案的制定提供依据，提高科学养殖水平。

Description

病毒样颗粒内标实时荧光RT-PCR检测新城疫病毒的方法
技术领域
本发明涉及一种病毒样颗粒内标实时荧光RT-PCR检测新城疫病毒的方法，属于生物技术领域。
背景技术
核酸诊断技术是对新城疫病毒进行确诊最有效的手段，目前主要采用普通RT-PCR和荧光RT-PCR技术，普通RT-PCR方法虽能够对新城疫病毒进行检测,但存在检测过程繁琐、易造成假阳性、假阴性、污染严重等问题；实时荧光RT-PCR技术以重复性好、灵敏度高、特异性强、操作简单、所需时间短、无污染等优点被广泛应用于各种病原的快速检测。因荧光RT-PCR检测技术要求高，试剂容易失效，加上检测新城疫所用双拭子或组织样本成分复杂，一些样本中可能含有抑制RT-PCR扩增的物质，造成检测结果出现假阴性，采用病毒样颗粒内标监控整个实验过程，能有效控制假阴性结果的出现。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种病毒样颗粒内标实时荧光RT-PCR检测新城疫病毒的方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的。
一种病毒样颗粒内标实时荧光RT-PCR检测新城疫病毒的方法，根据新城疫病毒基因序列，在6997到7092之间的位点设计特异性引 物和TaqMan探针；根据扩增目标片段的特点，设计内标探针序列。
上述特异性引物的上游引物序列为：tgcagagatc actcacactc at
上述特异性引物的下游引物序列为：gatggaacgc agagtagaaa ag
上述TaqMan探针的目标探针序列为：FAM-cctgttgcag atgtccggagcac-BHQ1;
上述TaqMan探针的内标探针序列为：VIC-gctcattcgg ctcgacgggcaat-BHQ2。
通过人工合成、克隆、表达过程制备了监控提取和反应的病毒样颗粒内标，所制备的内标序列包含新城疫引物识别序列和特有的内标探针识别序列，内标荧光报告基团用VIC标记，可对检测进行全过程监控，有效防止假阴性出现。
本发明的有益效果：本发明提供了一种快速、特异性强、灵敏度高、能监控整个检测过程的新城疫检测方法，应用于临床，能在3小时内准确的对新城疫进行诊断，为动物疫病治疗方案的制定提供依据，提高科学养殖水平。
具体实施方式
下面根据实施例对本发明作进一步详细说明。
实施案例： 
具体设计与操作步骤：
1、检测用引物与探针的设计
根据新城疫基因全序列，设计上、下游引物和目标探针序列；根据目标探针序列，设计内标探针序列如下：特异性引物的上游引物序 列为：tgcagagatc actcacactc at 
特异性引物的下游引物序列为：gatggaacgc agagtagaaa ag
TaqMan探针的目标探针序列为：FAM-cctgttgcag atgtccggagcac-BHQ1;
TaqMan探针的内标探针序列为：VIC-gctcattcgg ctcgacgggcaat-BHQ2。
2、病毒样颗粒内标的制备
（1）MS2噬菌体包裹蛋白基因片段的扩增。MS2上游引物序列为：atggatcctg ggaccccttt cggggtcctg ct,MS2下游引物序列为：gcaagctttc aatacataaa gagttgaact tct,扩增片段长度为1798bp，引物首尾分别含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。以MS2噬菌体RNA为模板，一步法RT-PCR扩增,扩增产物分别用琼脂糖凝胶电泳和双酶切鉴定。
（2）PET-32a-MS2重组质粒的构建。将以上扩增产物纯化,纯化产物和PET-32a载体双酶切后，再用DNase Ligase连接，转化大肠杆菌BL21，采用双酶切和PCR筛选阳性质粒，获得重组质粒PET-32a-MS2。
（3）内标片段的合成与PCR扩增。扩增的内标片段包括HindⅢ和NotⅠ两个酶切位点、上游引物序列、下游引物互补序列、内标探针序列。先分段化学合成内标片段，每段78bp，每片段首尾之间存在互补区域，采用Klenow酶对所合成的片段进行连接，再采用以下两条引物下两条引物扩增：引物1：gcaagctttg cagagatcac tcaca引物2：cagcggccgc gatggaacgc agagt；对PCR扩增产物进行纯化，获得99bp的内标片段序列如下：gcaagctttg cagagatcac tcacactcat cgttagctca  ttcggctcga cgggcaatcg attgccctct tttctctctg cgttccatcg cggccgctg。
(4)内标片段的克隆。将PCR扩增产物纯化，纯化产物和PET-32a-MS2重组质粒分别采用HindⅢ和NotⅠ双酶切，再用DNase Ligase连接，转化大肠杆菌BL21,采用双酶切和PCR筛选阳性质粒，获得重组质粒PET-32a-MS2-IC。
（5）重组质粒PET-32a-MS2-IC的原核表达。挑取重组菌（含重组质粒PET32a-MS2-IC）的一个单菌落，接入2mL含Amp（100ug/ml）的LB液体培养基中，37℃静置培养过夜；取500μL过夜培养物接入50mL含Amp（100ug/ml）的LB液体培养基中，37℃振荡培养2.0h至细菌对数生长期；在培养物中加入诱导剂IPTG至终浓度为1.0mmol/L，37℃继续振荡培养；诱导16h后取出。
（6）原核表达产物的前处理。将诱导后的菌液移至10ml离心管，5000rpm收集菌体，每10ml菌液用3mlPBS和3ml DNase Buffer(10mMTris-HCl;2.5mM MgCl2;0.5mMCaCl2)各悬浮清洗一次，最后用1mlDNase Buffer悬浮菌体；将悬浮菌于-80℃反复冻融三次，按10ug/ulRNase量对冻融物进行37℃消化2h，12000rpm离心5min，取上清；将上清分装，按100ul/管进行分装，每管加入5U的DNase于37℃条件下消化3h。
（7）病毒样颗粒内标耐核酸酶的鉴定。取10ul以上用DNase消化后的上清，补水至100ul，采用Trizol经典法提取核酸，荧光RT-PCR检测提取产物（反应体系为25μL，上游引物浓度为0.25μM,下游引 物浓度为0.30μM，内标探针浓度0.20μM,内标探针浓度为0.20μM，dNTP浓度为0.30mM，Mg+浓度5mM，RNA溶解液10μL；反应条件为：反应程序为52℃25min，95℃3min；95℃5sec，62℃45sec，在62℃时设定VIC荧光信号，40个循环）。分别设加AMV和不加AMV的对照，用以检测DNA和RNA的含量，检测结果表明耐核酸酶病毒样颗粒内标的制备成功。
3、病毒样颗粒内标实时荧光RT-PCR检测新城疫病毒具体操作
（1）核酸提取。将咽喉拭子或泄殖腔拭子置于500μLPBS液内（含青霉素1000IU/mL，链霉素1000IU/mL）30min，2000rpm离心10min，取190μL以上经过处理的上清液和前处理过的内标液10μL，加入600μLTrizol裂解液，用移液器反复吹打混匀5-10次，静置裂解5min；加入200μL氯仿，震荡混匀15秒，静置2min，12000rpm，4℃条件下离心10min；吸取上清于一新的离心管中，加入等体积于-20℃已经预冷的异丙醇，颠倒混匀10次，置-20℃条件下冷却10min，12000rpm，4℃条件下离心10min；吸弃上清，加入500μL75%的乙醇，颠倒洗涤；5000rpm，4℃条件下离心5min，弃上清，室温干燥3min。加入30μLTE溶解RNA。
（2）PCR扩增。反应体系为25μL，上游引物浓度为0.30μM,下游引物浓度为0.35μM，目标探针浓度0.22μM,内标探针浓度为0.18μM，dNTP浓度为0.35mM，Mg+浓度6mM，RNA溶解液10μL；反应条件为：52℃25min，95℃3min；95℃5sec，62℃45sec，在62℃时设定检测FAM和VIC荧光信号，40个循环。
（3）检测结果判断。根据仪器软件判定结果。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.病毒样颗粒内标实时荧光RT-PCR检测新城疫病毒的方法，其特征在于，根据新城疫病毒基因序列，在6997到7092之间的位点设计特异性引物和TaqMan探针；根据扩增目标片段的特点，设计内标探针序列，
上述特异性引物的上游引物序列为：tgcagagatc actcacactc at；
上述特异性引物的下游引物序列为：gatggaacgc agagtagaaa ag；
上述TaqMan探针的目标探针序列为：FAM-cctgttgcag atgtccggagcac-BHQ1; 
上述TaqMan探针的内标探针序列为：VIC-gctcattcgg ctcgacgggcaat-BHQ2。
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