CN105925710A - 一种谷子粒黑穗病菌快速检测方法 - Google Patents

一种谷子粒黑穗病菌快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种谷子黑穗病害病原菌快速检测方法，属于生物检测技术领域。本发明通过提取粒黑穗病菌孢子基因组DNA，根据谷子黑穗病病原菌ITS序列与NCBI上其他黑粉菌属的ITS序列差异，设计PCR特异性引物，应用设计的谷子黑穗病菌特异性引物进行PCR扩增，扩增产物于1％的琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统照相，与标准分子量进行对照，来检测样品中是否存在黑穗病菌。经检测验证，本发明的检测体系具有操作简单、快速、检测结果准确的优点。

Description

一种谷子粒黑穗病菌快速检测方法
技术领域：
本发明属于农作物病害防治及植物检疫领域，具体涉及一种谷子粒黑穗病菌分子快速检测方法与应用，即利用聚合酶链式反应(PCR)分子生物学技术对谷子粒黑穗病原菌进行高灵敏度快速检测，用于谷子黑穗病菌侵染的检测。
背景技术：
谷子粒黑穗病病原菌为粟黑粉菌(Ustilago crameri)，属担子菌亚门黑粉菌科黑粉菌属。该病原菌以种子传染为主，在植株营养生长过程中表现不明显，在灌浆后期才开始表现出来，发病部位主要为穗部，多为全穗籽粒受害。在谷子收获脱粒时，污染其他谷子，造成来年发病，待播种后病原菌的冬孢子萌发随生长点在植株体内蔓延，进而侵入子房，到达穗部形成冬孢子，最后生成黑穗。该病害在我国的主要产区均有不同程度的发生，严重影响谷子的产量和品质。
以往的研究发现，谷子黑穗病的控制是困难的，成功的管理主要依赖于使用抗病品种或无病原种子和谷子检疫。传统的检测和鉴定病原体的方法常常依赖于可在选择性培养基中分离到的病原体，或通过生化、化学和免疫学分析。这些是诊断植物病原体存在的基本方法，然而它们依赖于耗时耗力的实验室技术及熟练的分类知识，比较费时，因而不利于及时控制病害的传播。
发明内容：
本发明的主要目的在于克服现有技术的不足，提供一种谷子粒黑穗病菌快速检测方法。
本发明通过下述技术方案实现：
一种引物，其中上游引物F1序列为5'-AGACGGGTTTACCACTCAAC-3'(SEQ ID NO：1)，下游引物R1序列为5'-AAGCCACGGTGAATGGCAAAG-3'(SEQ ID NO：2)。
一种谷子黑穗病害病原菌快速检测方法，包括以下步骤：
(1)提取谷子植株组织基因组DNA，并以其为模板与所述的引物进行PCR反应；
(2)用琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，当出现特异条带时，即样本中含有谷子粒黑穗病原菌。
所述步骤(1)中的谷子植株组织为谷子的穗梗或旗叶。
所述步骤(1)中提取谷子植株组织基因组DNA的方法为CTAB法。
所述步骤(1)中的PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。
与现有技术相比本发明的有益效果：本发明的检测体系具有操作简单、快速，特异性高的优点，有利于及时控制病害的传播。
附图说明：
图1为谷子黑穗病菌PCR检测方法特异性实验结果图，其中1-Marker2000、2-谷子粒黑穗病菌冬孢子、3-谷瘟病菌、4-谷子白发病菌孢子、5-玉米黑粉菌孢子、6-对照组谷子叶片、7-ddH2O。
图2为本发明灵敏度的检测结果图，其中1-7粒黑穗病菌基因组浓度分别为100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL和0.1pg/μL。
图3为本发明所述方法对不同样品的检测结果图，其中：a为拌菌晋谷21未发病植株的组织检测结果，b为拌菌长农35未发病植株的组织检测结果。
具体实施方式：
实施例1
PCR技术检测谷子黑穗病病原菌的方法：
1.PCR特异性引物的设计：根据谷子黑穗病病原菌ITS序列与NCBI上其他黑粉菌属的ITS序列差异，运用软件Primer Premier 5.0设计PCR特异性引物，上游引物F1序列为5'-AGACGGGTTTACCACTCAAC-3'，下游引物R1序列为5'-AAGCCACGGTGAATGGCAAAG-3'，并由生物工程(上海)股份有限公司合成。
2.引物特异性检测：将黑穗病菌孢子和供试病原菌及对照组谷子叶片的基因组DNA进行引物特异性检测。供试病原菌有谷子白发病菌孢子，玉米黑粉菌孢子，谷瘟病菌菌丝。
反应体系为20μL，包括：10×Buffer 2μL，dNTP 1.6μL，引物各0.4μL，DNA模板量0.4-1μL，Taq酶0.2μL，余下的用灭菌双蒸水补足。PCR扩增程序如下：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测引物特异性。结果(图1)显示仅谷子粒黑粉菌冬孢子基因组DNA作模板时能扩增出1条特异性条带，大小与目标片段(320bp)基本一致，其他供试菌株及对照组谷子叶片没有扩增产物，说明设计的引物对谷子粒黑穗病菌具有良好的特异性。
3.PCR检测谷子黑穗病病原菌的灵敏度：将粒黑穗病菌基因组DNA浓度分别调整为100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL和0.1pg/μL，作为PCR模板。结果(图2)显示PCR能够检测到的谷子粒黑穗病菌基因组DNA最低浓度为10pg/μL。
4.PCR检测方法的应用：谷子(晋谷21和长农35)于山西省长治市谷子研究所试验地，各品种均设谷种拌菌组与不拌菌对照组，待谷子生长至灌浆后期，采集拌菌组与对照组植株各5株，检测谷子植株组织黑穗病病原菌。
采用CTAB法提取待测植株组织(穗梗和旗叶)基因组DNA。
DNA提取步骤为：称取0.1g组织，加入液氮研磨，立即转入2.0mL离心管中，加入1mL CTAB预处理液(200mmol/L Tris-HCl pH8.0，50mmol/L EDTA pH8.0，250mmol/L NaCl，2％β-巯基乙醇，3％PVP)，充分摇匀，10000r/min离心10min，弃上清，再向管中重复加入一次预处理液。之后加入0.5mL 65℃预热的CTAB提取液(2％CTAB，1mol/L Tris-HClpH8.0，250mmol/L EDTA pH8.0，1.4mol/L NaCl，1％β-巯基乙醇，1％PVP)，65℃水浴50min，期间每隔10min摇动离心管。加入等体积的氯仿：异戊醇(V:V＝24:1)，混匀，静置5min，让其完全分层，4℃10000r/min离心10min。取上清，加入3μL RNaseA，充分混匀，37℃水浴40min。再重复加入一次氯仿：异戊醇。加入2倍体积的预冷异丙醇，混匀，-20℃过夜。4℃10000r/min离心10min，去上清，用预冷的75％乙醇漂洗2次，沉淀溶于20μL TE溶液中。
以植株穗梗和旗叶基因组DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳后用凝胶成像系统分析。
检测结果所示(图3)，以拌菌未发病植株穗梗和旗叶基因组DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，扩增产物电泳分析发现，晋谷21的5颗植株中有1株的穗梗及旗叶中扩增出特异性条带，有1株旗叶中扩增出条带穗梗中未扩增出条带，其余3颗植株的穗梗和旗叶中没有扩增产物；长农35有4株的穗梗和旗叶中检测出特异性条带，1株穗梗和旗叶中没有检出扩增产物，结果表明，长农35拌菌组植株中黑穗病菌检出率高于晋谷21。
利用本发明得到的检测结果与田间发病率数据基本一致，本发明所述方法具有较高的可行性。

Claims (5)

1.一种引物，其特征在于，上游引物F1序列为5'-AGACGGGTTTACCACTCAAC-3'，下游引物R1序列为5'-AAGCCACGGTGAATGGCAAAG-3'。
2.一种谷子黑穗病害病原菌快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取谷子植株组织基因组DNA，并以其为模板与权利要求1所述的引物进行PCR反应；
(2)用琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，当出现特异条带时，即样本中含有谷子粒黑穗病原菌。
3.如权利要求2所述的一种谷子黑穗病害病原菌快速检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中的谷子植株组织为谷子的穗梗或旗叶。
4.如权利要求2所述的一种谷子黑穗病害病原菌快速检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中提取谷子植株组织基因组DNA的方法为CTAB法。
5.如权利要求2所述的一种谷子黑穗病害病原菌快速检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中的PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。
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