JP4648023B2 - ジャガイモそうか病原因菌種の16SrRNA遺伝子若しくは16SrRNA遺伝子からITS領域間を増幅するための新規プライマー対、及びそれらを用いたジャガイモそうか病原因菌種の検出・識別方法 - Google Patents
ジャガイモそうか病原因菌種の16SrRNA遺伝子若しくは16SrRNA遺伝子からITS領域間を増幅するための新規プライマー対、及びそれらを用いたジャガイモそうか病原因菌種の検出・識別方法 Download PDFInfo
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現在までに、そうか病菌種の検出・識別法として、(i)病原細菌種間の基質利用性の違いに基づいた識別法(非特許文献5)、(ii)血清学的手法による識別法(前記非特許文献1及び非特許文献6)及び(iii)PCR(polymerase chain reaction)を用いた検出・識別法(前記非特許文献1及び6)が提案されている。
1)個々のプライマー配列のTm(melting temperature:融解温度)が大きく異なるため、一反応PCRによる検出・識別が不可能である。
2)S. scabieiを検出するためのフォワードプライマーが、S. scabieiに分類される細菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列とハイブリダイズしない場合がある。
3)S. acidiscabieiを検出するためのフォワードプライマーが、S. acidiscabieiに分類される細菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列にハイブリダイズしない場合がある。
4)S. acidiscabieiを検出するためのリバースプライマーがS. scabieiとS. acidiscabieiの両方の16S rRNA遺伝子の塩基配列にハイブリダイズする。
5)S. turgidiscabieiを検出するためのリバースプライマーは、系統分類学的に別種として再分類されたS. reticuliscabiei(前記非特許文献5)のITS領域遺伝子の塩基配列にもハイブリダイズする。
6)土壌試料からS. acidiscabieiの検出を行った場合、S. acidiscabieiのDNAに由来しない非特異的DNA増幅断片が多数検出される(前記非特許文献7)。
実用レベルでのそうか病菌種の特異的迅速タイピング技術の確立のためにはこれらの問題点を解決することが必要不可欠である。
1)ジャガイモそうか病菌種S. scabieiの16S rRNA遺伝子に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子からITS領域間を増幅するためのPCR用フォワードプライマー(Sca−F)と、当該菌種のITS領域に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子からITS領域間を増幅するためのPCR用リバースプライマー(Sca−R)からなる新規なプライマー対、
Sca−F:cggtggccya acccgtaag (5'→3') (y:t/u又はc)
Sca−R:ttccacaccc acaaggggta gt (5'→3')
2)そうか病菌種S. acidiscabieiの16S rRNA遺伝子に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子増幅のためのPCR用フォワードプライマー(Aci−F)と、当該菌種の16S rRNA遺伝子に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子増幅のためのPCR用リバースプライマー(Aci−R)からなる新規なプライマー対、
Aci−F:atatcactyc tgcctgcatg g (5'→3') (y:t/u又はc)
Aci−R:cctaccgaac tctagcctgc (5'→3')
3)そうか病菌種S. turgidiscabieiの16S rRNA遺伝子に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子からITS領域間を増幅するためのPCR用フォワードプライマー(Tur−F)と、当該菌種のITS領域に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子からITS領域間を増幅するためのPCR用リバースプライマー(Tur−R)からなる新規なプライマー対、
Tur−F:cggaaacatc cagagatggg tg (5'→3')
Tur−R:cttcaccgct tccctcatcg (5'→3')
5)ゲノムDNA含有物が、ジャガイモをはじめとする根菜類栽培の畑土壌、ジャガイモをはじめとする根菜類の塊茎若しくは葉の病斑組織、そうか病菌株の培養物の何れかである前記4)に記載のそうか病菌種のゲノムDNAの新規増幅方法、
6)核酸増幅反応方法がPCR方法である前記4)又は5)に記載のそうか病菌種のゲノムDNAの新規増幅方法、
7)前記4)又は5)に記載の核酸増幅反応を1回行い、得た増幅産物について、分子サイズ分析の結果に基づいて、そうか病菌種S. scabiei、S. acidiscabiei、及びS. turgidiscabieiからなる群の一菌種若しくは同時に複数の菌種を検出・識別することを特徴とするそうか病菌種の検出・識別方法、
を提供する。
本発明において使用する技術用語は、特別に断りがない限り、分子生物学、遺伝子工学、植物病理学の分野において現在使用されているものと同じ意味を有する。
“プライマー”とは、遺伝子増幅用(PCR用)オリゴヌクレオチドプライマーのことをいう。そしてフォワードプライマー(forward primer)、リバース(reverse primer)プライマーからなる。プライマー対とは、この両者の対をいう。
“1回”、“2回”のPCRを行うなどの表現における“回”とは、runningの意味である。そして、1回のPCRにおいては、少なくとも1サイクル(cycle)以上のPCRからなっている。
“ITS領域”とは“16S-23S内部転写スペーサー(internal transcribed spacer:ITS)領域”を意味するものとする。
“ハイブリダイズする”とは、ある一本鎖の核酸分子がそれに相補的な一本鎖の核酸分子と熱力学的に結合し二本鎖になることであり、プライマーがハイブリダイズするとは、標的核酸若しくは標的塩基配列、又は標的遺伝子中のプライマー配列に相補的な塩基配列に特異的に結合することを意味する。
“そうか病”は、ジャガイモそうか病を意味するものとする。
“特異的”とは菌種特有という意味である。
“分析する”とは、定性分析の他に、定量分析をも意味するものとする。
S. scabiei菌種については、フォワードプライマー(forward primer)がSca−F、リバースプライマー(reverse primer)がSca−Rなる名称が与えられている。
同様に、S. acidiscabiei菌種については、Aci−F及びAci−R、又、S. turgidiscabiei菌種については、Tur−F及びTur−Rなる名称が与えられている。
これらのプライマー対は、一種若しくは同時に複数のそうか病菌種、好ましくは表1に記載の3菌種の16S rRNA遺伝子及びITS領域間のゲノムDNAを核酸増幅方法、好ましくはPCR方法を用いて特異的に増幅できるものである。
上記のプライマーにより増幅されるゲノムDNA断片は、表1に記載されている通りである。又、GC含量、Tm値も表1に記載されているものである。
本発明では、既存のプライマー対(前記非特許文献1及び7)では不可能であった一反応PCRによるジャガイモそうか病菌種S. scabiei、S. acidiscabiei及びS. turgidiscabieiの特異的検出・識別を可能とする新規なプライマー対を設計・作製した(表1)。特に、本発明のプライマー対は、前記した従来のプライマー対の問題点を解決しており、従来のものとは明確に異なる新規なプライマー対である。
・一反応PCRによる検出・識別
・S. scabieiを正確に検出
・S. acidiscabieiを正確に検出
・S. turgidiscabieiを正確に検出
・土壌試料を用いた場合でも、S. acidiscabieiを検出するプライマーセット(Aci−F及びAci−R)は非特異的なDNA断片の増幅を抑制(実施例参照)
することを可能とした。
先ず、前記菌種の少なくとも一菌種のゲノムDNA(16S rRNA遺伝子若しくは16S rRNA遺伝子からITS領域間を含む。)含有物からなる一つの系に、前記三種類のプライマー対の少なくとも一対を添加し、一菌種のゲノムDNA若しくは同時に複数菌種のゲノムDNAについて、核酸増幅反応を行う。
前記ゲノムDNA含有物として、ジャガイモをはじめとする根菜類栽培の畑土壌、ジャガイモをはじめとする根菜類の塊茎若しくは葉の病斑組織、そうか病菌株の培養物の何れをも用いることが出来る。これらのゲノムDNA含有物をそのまま用いてもよいのであるが、好適には、通常の公知の方法で、前記のゲノムDNA含有物からゲノムDNAを抽出及び/又は精製して用いるのがよい。具体的には以下の実施例等で示した。
前記の核酸増幅方法で得られた増幅産物の分子サイズを分析することにより、本発明の目的、即ち、そうか病菌種の識別が可能となる。この分析は、通常・公知の方法でよい。好適には、電気泳動、キャピラリー電気泳動などを使用すればよい。それらを行う条件は、通常の公知の条件でよい。具体的な例は、実施例に示した。
更に、本発明方法は、次の手順からなる、内部標準遺伝子(制限酵素切断部位が挿入されている。)を用いたT-RFLP(Terminal restriction fragment length polymorphism)分析によるそうか病菌種の存在量を測定する方法でもある。
1)前記の本発明のプライマー対の少なくとも一方の5'末端部(5'末端を含む。)に蛍光標識したプライマー対を用いて、前記内部標準遺伝子とそうか病菌種のゲノムDNAとを競合的に前記のPCR方法で増幅する。
2)増幅産物を制限酵素処理する。
3)得られた末端断片の多型を、遺伝子解析システムを用いて分析する。
4)得られた結果に基づいて、一菌種若しくは同時に複数の菌種を検出・識別すると同時に得られた蛍光の変化量からそれぞれの制限酵素処理断片量を定量する。
5)当該定量値からそうか病菌種の存在量を決める。
本発明においては、DNA分子サイズの分析には、2%のアガロースゲル(タカラバイオ社製)を用いた電気泳動、キャピラリー電気泳動等を用いるのが好適である。
又、本発明において設計した各6種のプライマー配列は、同一かつ1回のPCR反応で適切なアニーリングが可能なTm(融解温度)となるように設計した。
本発明により設計した一種若しくは三種のプライマー対を用いたそうか病菌種の遺伝子タイピングとは、1回のPCR反応を行った後、1回(1レーン)のアガロース等のゲルを用いた電気泳動法或いはキャピラリーを用いた電気泳動法等により、異なる長さのDNA増幅断片を分離・検出することによって、試料中におけるそうか病菌種の存在の有無を判定するとともに、そうか病菌種を識別・特定することである。
1回のPCR反応によるそうか病菌株の遺伝子タイピングを適切に実施するため、反応条件の最適化を行なった。
使用したそうか病菌株はStreptomyces scabiei OBM-1株、Streptomyces acidiscabiei ATCC49003T株及びStreptomyces turgidiscabiei ATCC700248T株である。S. scabiei OBM-1株は長崎畑土壌から分離培養されたそうか病菌種であるが、その16S rRNA遺伝子配列が公共データベースに公開されているStreptomyces scabieiの配列と100%一致することを確認している。
細菌からのDNA抽出法は種々の方法があり、どの方法も好適に本発明に利用出来る。本発明においては、それらの中のFast Prep instrument(Q-BIOgene)を用いる手法を用いた。
各そうか病菌種のゲノムDNA溶液は純水で10μg/mlになるように調整し、それらを単独で、若しくは混合したものを適宜希釈し、PCR反応の鋳型DNAとして用いた。
1)そうか病菌ゲノムDNA鋳型の最適濃度は、終濃度で5ng/mlであった。これは20μlのPCR反応溶液に対して、0.1μg/mlの鋳型DNA混合溶液を1μl加えた条件に相当する。
2)プライマーセット混合溶液の濃度は20μlのPCR反応溶液に対して、プライマーセット混合溶液(各10nmol/ml)を1.6μl加えた条件が最適であった。
3)PCRのサイクル数は35サイクルが最適であった。
4)アニーリング温度は64.0℃が最適であった。
5)PCRバッファー溶液に含まれる塩の最適濃度は、終濃度でMgCl2が2.0mM、KClは25mMであった。
1チューブのPCR反応溶液量(表3)は20μlで行う。純水13.3μlに対して10×PCRバッファーは組成(150mM Tris−HCl pH8.0、20mM MgCl2、250mM KCl)のものを2μl添加し、dNTP混合溶液(dATP、dGTP、dCTP、dTTPを2mMずつ含む(市販のもの:例Applied Biosystems社製))を2μl添加する。プライマーセット混合溶液(各10nmol/mlプライマー溶液を混合)は1.6μl、鋳型DNA溶液(0.1μg/ml)は1μl添加する。AmpliTaq Gold DNA Polymerase溶液(Applied Biosystems社製)は0.1μl添加する。
尚、本発明の適用にあたっては、上述以外の機器、試薬ならびに反応条件に限定されるものではない。
実施例1.そうか病菌種のゲノムDNAを鋳型とした遺伝子タイピングの実施例
そうか病菌種より抽出したゲノムDNAに対する本発明技術(遺伝子タイピング技術)の適用例を示す。
先ず、従来の方法と同様に、3回の独立したPCR反応(1種のそうか病菌種のゲノムDNAを鋳型とし、1種のプライマー対を用いたPCRを3回行なうこと)により、それぞれのそうか病菌種をそれぞれ検出する実験を試みた(図1のレーン1〜3及び表4参照)。PCR反応の条件は、前述の最適条件とした。PCR反応終了後、反応液3μlを2%アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動槽はミニゲル泳動層i−mupid J(コスモバイオ)を用い、100V、25分間の電気泳動の後、エチジウムブロマイド溶液中にゲルを浸し、15分間染色を行った。染色後のゲルは紫外線照射によりバンドの有無及び位置を確認した(図1)。その結果、S. scabieiのゲノムDNAを鋳型とし、Sca−F及びSca−RによるPCR検出を行なったところ、予想サイズの増幅断片(252 又は 261 bp)が確認された(図1のレーン1)。同様に、S. acidiscabiei及びS. turgidiscabieiについても、それぞれのゲノムDNAを鋳型とし、それぞれに特異的なプライマー対(Aci−FとAci−Rの対及びTur−FとTur−Rの対)によるPCR検出を試みたところ、予想サイズの増幅断片(468 bp及び723 bp)を確認した(図1のレーン2及び3)。
尚、本手法は培養されたそうか病菌の簡易同定のみならず、培養された放線菌がそうか病菌であるかどうかの判別等にも適用可能である。
本発明の1回の反応PCRによる遺伝子タイピング技術がジャガイモ畑土壌ならびにジャガイモ病斑組織を対象とした遺伝子診断法として適用可能かどうかについて検証した。
土壌試料ならびにジャガイモ試料は、日本におけるジャガイモ生産量1位の北海道及び2位の長崎県において採取したものをそれぞれ用いた(図2の説明参照)。
長崎、北海道網走を含む3箇所のジャガイモ畑土壌試料とジャガイモ病班組織より抽出したDNAに対して、本発明技術に基づく遺伝子診断を行った結果である。
レーン1:長崎じゃがいも畑Aの土壌試料
レーン2:北海道網走じゃがいも畑Bの土壌試料
レーン3:北海道網走じゃがいも畑Cの土壌試料
レーン4:長崎じゃがいも畑Aのジャガイモ病班組織試料
レーン5:北海道網走じゃがいも畑Bのジャガイモ病班組織試料
レーン6:北海道網走じゃがいも畑Cのジャガイモ病班組織試料
レーン7:ポジティブコントロール(3種のそうか病菌種のゲノムDNAの等量混合試料)
尚、本発明技術は、ジャガイモ畑土壌及びジャガイモ組織に限定されるものではなく、様々な環境試料及び農作物組織に適用されうる。
Claims (5)
- ジャガイモそうか病(以下、単にそうか病という。)菌種Streptomyces scabieiの16S rRNA遺伝子に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子から16S-23S内部転写スペーサー(internal transcribed spacer:ITS)領域(以下、単にITS領域という。)間を増幅するためのPCR用フォワードプライマー(Sca−F)と、当該菌種のITS領域に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子からITS領域間を増幅するためのPCR用リバースプライマー(Sca−R)からなるプライマー対、
そうか病菌種Streptomyces acidiscabieiの16S rRNA遺伝子に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子増幅のためのPCR用フォワードプライマー(Aci−F)と、当該菌種の16S rRNA遺伝子に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子増幅のためのPCR用リバースプライマー(Aci−R)からなるプライマー対、並びに、
そうか病菌種Streptomyces turgidiscabieiの16S rRNA遺伝子に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子からITS領域間を増幅するためのPCR用フォワードプライマー(Tur−F)と、当該菌種のITS領域に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子からITS領域間を増幅するためのPCR用リバースプライマー(Tur−R)からなるプライマー対からなるそうか病菌種の遺伝子タイピング用オリゴヌクレオチドプライマーセット。
Sca−F:cggtggccya acccgtaag (5'→3') (y:t/u又はc)
Sca−R:ttccacaccc acaaggggta gt (5'→3')
Aci−F:atatcactyc tgcctgcatg g (5'→3') (y:t/u又はc)
Aci−R:cctaccgaac tctagcctgc (5'→3')
Tur−F:cggaaacatc cagagatggg tg (5'→3')
Tur−R:cttcaccgct tccctcatcg (5'→3') - そうか病菌種Streptomyces scabiei、Streptomyces acidiscabiei、及びStreptomyces turgidiscabieiの少なくとも一菌種のゲノムDNA(16S rRNA遺伝子若しくは16S rRNA遺伝子からITS領域間を含む。)含有物又はそれからの抽出物及び/又は精製物からなる一つの系に、請求項1に記載のプライマーセットを添加し、一菌種のゲノムDNA若しくは同時に複数菌種のゲノムDNAについて、核酸増幅反応を行うことを特徴とするそうか病菌種のゲノムDNAの増幅方法。
- ゲノムDNA含有物が、ジャガイモをはじめとする根菜類栽培の畑土壌、ジャガイモをはじめとする根菜類の塊茎若しくは葉の病斑組織、そうか病菌株の培養物の何れかである請求項2に記載のそうか病菌種のゲノムDNAの増幅方法。
- 核酸増幅反応方法がPCR方法である請求項2又は3に記載のそうか病菌種のゲノムDNAの増幅方法。
- 請求項2又は3に記載の核酸増幅反応を行い、得た増幅産物の分子サイズ分析の結果に基づいて、そうか病菌種Streptomyces scabiei、Streptomyces acidiscabiei、及びStreptomyces turgidiscabieiからなる群の一菌種若しくは同時に複数の菌種を検出・識別することを特徴とするそうか病菌種の検出・識別方法。
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