KR101334850B1 - 버크홀데리아 글루메 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

버크홀데리아 글루메 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 벼의 세균병원균인 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)의 검출용 프라이머 세트, 이를 이용한 버크홀데리아 글루메의 검출방법, 이를 포함하는 버크홀데이라 글루메 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 벼의 세균병원균인 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)를 신속하고 정확하게 검출할 수 있어 벼의 세균병의 감염 여부를 효과적으로 진단할 수 있으므로, 벼의 세균병을 예방하고 방제하는데 기여할 수 있다.

Description

버크홀데리아 글루메 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법 {Primer set for detecting Burkholderia glumae and method for detecting using the same}
본 발명은 벼의 세균병원균인 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)의 검출용 프라이머 세트, 이를 이용한 버크홀데리아 글루메의 검출방법, 이를 포함하는 버크홀데이라 글루메 검출용 키트에 관한 것이다.
세균에 의한 벼알마름병은 1955년 일본의 후쿠오카에서 처음 보고된 이후 한국, 중국, 태국, 말레이시아 등 주로 아시아 지역의 벼 재배지에서 보고되고 있다. 우리나라에서는 1986년에 처음 보고된 이래 전국적으로 발병이 확산 되고 있다. 이 병은 Burkholderia glumae라는 그람음성 세균에 의해서 발병되고 병징은 벼의 생육시기에 따라 다르게 나타난다.
주로 유묘기에는 유묘의 생장이 정상적이지 못하고 변색하여 부패하는 증상을 나타내고 잎에는 잎말림 현상, 출수기에는 백화현상으로 인한 벼알마름 현상이 나타나고 감염된 현미는 중간 부위에 갈색 줄무늬를 띄게 된다. 이삭에 발병된 벼 알은 겉으로는 건전한 것처럼 보이지만 수확 후 미질에 심각한 피해를 초래한다. 이 병은 주로 종자 감염되어 전염원 역할을 하고 유묘기 발병 후 잠복하여 출수기에 고온 다습한 환경이 조성되면 2차 감염을 일으키고 등숙기를 지나 수확기까지 계속 진행된다. 최근 우리나라 여름이 아열대성 기후와 유사해지면서 본 병의 발생이 확산되고 있다. 병의 발병율이 수확 감소에 적은 영향을 주는 경우도 있지만 벼알마름병은 출수기 때 이삭에 발병하면 발병율이 곧 수확량 감소율과 직결되는 무서운 병 중에 하나이다. 앞으로 기후 변화에 따라 발병이 더욱 심해질 것으로 예측되고 적절한 환경이 조성되면 광범위한 지역에서 대량 발생할 수 있는 소지를 지닌 병이다. 특히, 세균에 의한 병이기 때문에 농약을 사용한 방제 수단이 극히 미흡하여 병 발생에 대비할 수 있는 효과적인 방법이 현재로는 없는 실정이고, 종래 기술로는 Burkholderia glumae의 벼와 세균의 상호 작용에 중요한 역할을 하는 effector 단백질들의 기능을 연구한 것이 있다(Burkholderia glumae 유전체 정보를 이용한 병원성 유전자 기능 연구 및 저항성 벼 개발).
이에 본 발명자들은 벼알마름병 원인균의 효과적인 검출방법에 관하여 연구를 거듭하던 중, 유전자(DNA) 수준에서 생물종을 식별하는 방법을 이용하여 벼알마름병을 신속하고 정확하게 진단하고자 하였다.
JP 공개번호 2000-342261　
본 발명은 벼의 세균병원균인 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)를 유전자 수준에서 효과적으로 검출할 수 있는 PCR용 프라이머 세트, 상기 프라미어 세트를 이용한 버크홀데리아 글루메의 검출 방법 및 상기 프라미어 세트를 포함하는 검출 키트를 제공하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1의 핵산서열 및 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머로 이루어진 버크홀데리아 글루메 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 식물체 검체로부터 추출한 DNA를 PCR 증폭하여 증폭산물의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는 버크홀데리아 글루메의 검출 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 버크홀데리아 글루메 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 벼의 세균병원균인 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)를 신속하고 정확하게 검출할 수 있어 벼의 세균병의 감염 여부를 효과적으로 진단할 수 있으므로, 벼알마름병을 예방하고 방제하는데 기여할 수 있다.
도 1은 버크홀데리아 글루메로부터 rhs family 유전자의 BLASTN search의 결과이다.
도 2는 species-specific BG1F/R 프라이머 세트를 사용하여 버크홀데리아 글루메로부터 rhs family 유전자의 PCR증폭에 관한 것이다(Lane M, Size marker(1Kb plus DNA ladder; Gibco BRL TM); 표 1에 Lanes 1-29가 기재됨. Lane 30, 증류수).
도 3은 도 1에서 사용한 프라이머 쌍을 이용하여 real-time PCR로 민감도를 측정한 결과이다.
도 4는 도 1에서 사용한 프라이머 쌍을 이용하여 버크홀데리아 글루메에 감염된 벼 한알을 멸균수에 침지 후 침지한 물로부터 특이 DNA단편의 검출 여부를 real-time PCR로 조사한 결과이다.
본 발명은 서열번호 1의 핵산서열 및 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머로 이루어진 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
서열번호 1 및 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머는 각각 버크홀데리아 글루메의 138bp 크기의 핵산 단편을 증폭시키기 위한 정방향(BG1F) 및 역방향(BG1R) 프라이머이다.
본 발명자들은 본 발명의 실시예에서 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 blastn 및 blastx 프로그램을 이용하여 버크홀데리아 글루메를 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 서열정보를 탐색하고, 상기 특이 핵산 서열을 검출할 수 있는 프라이머를 제작하였다. 제작한 프라이머 세트를 이용하여 일반 PCR 및 Real-tim PCR 증폭 반응을 수행한 결과, 본 발명에 따른 프라이머 세트가 버크홀데리아 글루메만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
버크홀데리아 글루메는 벼의 세균병원균이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 벼의 세균병원균인 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 이를 이용하면 진단하고자 하는 식물체 검체의 벼의 세균병의 감염 여부를 정확하게 진단할 수 있다.
따라서 본 발명은 서열번호 1의 핵산서열 및 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 식물체 검체로부터 추출한 DNA를 PCR 증폭하여 증폭 산물의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는 버크홀데리아 글루메의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 식물체 검체로부터 추출한 DNA를 PCR 증폭시킨 결과 버크홀데리아 글루메에 특이적인 핵산 증폭산물이 존재하면, 해당 식물체 검체는 벼의 세균병에 감염된 것으로 진단할 수 있다.
본 발명에 있어서 “식물체 검체”란 버크홀데리아 글루메의 감염 여부를 확인하고자 하는 대상 식물체를 의미하며, 예를 들어 벼일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
식물체 검체로부터 DNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있으며, 이는 당업자가 적절히 선택 가능하다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 PCR 증폭은 통상적인 PCR 증폭 반응을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 PCR 증폭 반응(conventional PCR) 또는 리얼타임 PCR 증폭 반응(real-time PCR)을 이용할 수 있고, 리얼타임 PCR 증폭 반응을 이용하는 경우 실시간으로 정량적인 분석이 가능하다. 컨벤셔널 PCR 증폭 반응은 특정 DNA를 증폭한 후에 특정 DNA의 증폭 여부를 확인하는 단계를 추가로 수행하여야 하는 통상의 PCR 증폭 반응을 의미하며, 상기 특정 DNA의 증폭 여부를 확인하는 단계는 전기영동 등을 통하여 증폭된 DNA 산시물의 크기를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다. 구체적인 PCR 증폭 방법은 당업자에 의해 적절히 선택되어 수행될 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 핵산서열 및 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 버크홀데리아 글루메 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 검출용 키트는 상기 프라이머 세트 외에도 시료 내에서 버크홀데리아 글루메를 검출하기 위해 필요한 반응완충용액, 중합효소, dNTP, 안정화제 및 모든 생물학적 또는 화학적 시약, 사용설명서 등을 포함할 수 있다. 이러한 키트의 다른 구성은 당업자에 의하여 적절히 선택될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 >
1. Bacterial strain 과 배양 조건
본 실험에 사용된 Burkholderia glumae을 포함한 기타 미생물은 국립농업과학원 유전자원센터의 Korean Agricultural Culture Collection (KACC)와 미국의 American Type Culture Collection(ATCC), 벨기에의 the Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (BCCMTM) 및 영국의 National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB)에서 분양 받았고, 표 1에 정리되어 있다. Burkholderia 균주는 NA배지(D-(+)-glucose 2.0%, CaCO3 2.0%, Yeast extract 1.0% :1L)에서 배양하였다.
Figure 112011074753541-pat00001
(LMG, The Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms (BCCMTM), Belgium; NCPPB, National Collection of Plant Pathogenic Bacteria; KACC, Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea; ATCC, The American Type Culture Collection.)
2. Total DNA 의 추출
배양된 균주의 총 DNA는 CTAB 방법으로 추출하였으며, 다른 미생물의 총 DNA는 Qiagen(Hilden, Germany)사의 genomic DNA 추출 키트(Genomic-tips)을 이용하여 추출하였다.
3. 특이 염기서열 정보 탐색을 위한 blastn 프로그램 이용 분석
Burkholderia glumae를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트의 제작을 위해 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 Burkholderia glumae 유전체 정보 (등록번호: GenBank Accession No. CP001504, gi|237878166:303868-308145) 유전체 정보 중 rhs family 유전자를 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인하고 primer를 제작하였다.
4. 특이 프라이머 제작
Burkholderia glumae에서 138bp 크기의 단편을 증폭하는 BG1F 프라이머와 BG1R 프라이머 세트를 제작하였다. 프라이머의 서열은 다음과 같다.
BG1F 프라이머 : 5'-CCGC GCTG TTCA TGAG GGAT AA-3' 22mer (서열번호 1)
BG1R 프라이머 : 5'-CGGG CGGA ACGA CGGT AAGT-3' 20mer (서열번호 2)
상기 프라이머는 GenBank등록된 각각의 rhs family gene의 서열정보를 blastn 프로그램을 통해 특이성을 확인 후 제작되었다.
5. PCR 증폭 반응
138bp 크기의 단편을 증폭하는 BG1F (5'-CCGC GCTG TTCA TGAG GGAT AA -3') (서열목록 2: 22mer) 와 BG1R (5'-CGGG CGGA ACGA CGGT AAGT -3') (서열목록 3: 20mer) 프라이머는 NCBI의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 (등록번호: GenBank Accession No. CP001504, gi|237878166:303868-308145) rhs family gene의 서열정보를 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인 후 제작되었다.
PCR 증폭 반응은 PTC-200TM thermocycler(MJ research, Watertown, mass)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 Tris-HCl 20 mM, KCl 100 mM, 50% Glycerol, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween20, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM PMSF, dNTP는 각각 0.2mM, primer는 각각 20pM, Taq polymerase 2unit(SolGent, Deajeon, Repulic of Korea)을 함유하는 PCR 혼합액으로 총50㎕의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 몇몇 미생물의 genomic DNA 양은 약 50ng이었다. 반응은 954℃에서 5분간 변성하고 94℃ 60초, 63℃ 30초, 72℃ 60초로 35회 반복시킨 후 72℃에서 10분간 반응한다. 증폭반응 후 10㎕의 PCR 산물을 1.5%농도의 아가로스 젤(agarose gel)에서 전기영동한 후 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 착색시켜 UV transilluminator에서 확인하였다.
6. 감염 종자 Real - time PCR 증폭 반응
이병 종자로부터의 real-time PCR 진단 감도를 측정하기 위하여 이병된 벼 잎 일부(약 1cm x 1cm)을 30-40분간 1.0ml 멸균수에 담근 뒤 2ul 샘플 침지액을 취한 다음 real-time PCR을 실시하였다. Real-time PCR 증폭 반응은 CFX96 real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 iQTM SYBR® Green Supermix, primer는 각각 10pM을 함유하는 SYBR green PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 몇몇 미생물의 genomic DNA 양은 약 5ng이었다. 반응은 95℃에서 3분간 변성하고 95℃ 10초, 63℃ 20초로 45회 반복시킨 후 65℃에서부터 0.5℃씩 간격으로 10초간 반응 후 증가시키면서 95℃까지 반응시키면서 melting 커브와 melting 피크를 실시하였다. 그 결과 도 2과 3, 4 에 나타난 바와 같이 이병된 종자 모두에서 각각의 특이 커브와 피크를 각각 확인하였다.
도 3은 본 발명의 프라이머 BG1F와 BG1R을 사용하여, Burkholderia glumae에 대하여 real-time PCR 기법을 실시한 후 사진으로, 1 레인은 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae) genomic DNA, 5 ~ 7 레인은 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)에 이병되지 않은 벼알이며, 2 ~ 4 레인은 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)에 이병된 벼알이며, 8 레인은 증류수만 넣은 네가티브 컨트롤이다. 여기에서 보면, 레인 1 ~ 4에서는 각각의 버크홀데리아 글루메에 해당하는 증폭이 있고, 레인 5 ~ 8에서는 증폭이 일어나지 않는 것을 확인할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

  1. 서열번호 1의 핵산서열 및 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머로 이루어진 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)의 rhs family 유전자 검출용 프라이머 세트.
  2. 1) 식물체 검체를 멸균수에 담그는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)의 침지액에 서열번호 1의 핵산서열 및 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭하여 증폭 산물의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는 버크홀데리아 글루메의 rhs family 유전자 검출 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 식물체 검체는 벼인 것을 특징으로 하는 버크홀데리아 글루메의 rhs family 유전자 검출 방법.
  4. 서열번호 1의 핵산서열 및 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 버크홀데리아 글루메의 rhs family 유전자 검출용 키트.
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