CN102057055B

CN102057055B - 分支杆菌的快速检测

Info

Publication number: CN102057055B
Application number: CN200980121612.3A
Authority: CN
Inventors: C·阿诺德
Original assignee: Health Protection Agency
Current assignee: BMH
Priority date: 2008-04-09
Filing date: 2009-04-09
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2029-04-09
Also published as: GB0806431D0; EP2279269B1; JP2011518550A; CN102057055A; US20110097725A1; JP5750369B2; ZA201007010B; AU2009235168A1; WO2009125228A1; AU2009235168B2; CA2720754A1; EP2279269A1; US9150930B2

Abstract

本发明提供检测属于样品中的MTB复合体的分支杆菌的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与一对正向和反向寡核苷酸引物接触；其中所述正向引物杂交到位于分支杆菌散布重复单元(MIRU)重复因子内的靶核酸序列；和其中所述反向引物杂交到位于分支杆菌散布重复单元(MIRU)重复因子内的靶核酸序列；(b)延伸所述正向和反向引物生成扩增产物；和(c)检测所述扩增产物。

Description

分支杆菌的快速检测

本发明涉及样品中分支杆菌的快速检测方法和其试剂及试剂盒。

作为结核感染(TB)的病原体(aetiological agent)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(M.tuberculosis)是世界范围传染病死亡的主要原因——潜伏感染影响差不多三分之一的世界人口。世界卫生组织(WHO)估计全球每年几乎九百万的新的TB病例和几乎二百万的死亡出现。2005年中最大数量的新的TB病例出现在东南亚(全球34％的新发病例)，并且估计在撒哈拉以南非洲的发病率几乎为每100,000人群中350例病例。

然而，TB感染不限于发展中世界：自从20世纪80年代后期，UK已经观察到结核病的再现，并且目前每年超过8000例的新病例——每100,000人群中14.0例的比例。大约40％的这些新病例出现在伦敦地区，在这里的感染率为每100,000人群中44.8例。高度危险的人群包括一些移民群体、无家可归的人、犯人和问题药物使用者。

TB感染通常通过抗生素的6个月过程可以治疗；然而，患者对药物治疗的依从性改变，当它们的症状停止时患者通常停止治疗。另外，TB比例在移民人群中是高的，使得实行跟进的治疗困难。如果不治疗，活性TB疾病的每个人将在每年平均感染10到15个人之间。WHO认可的综合策略——称为“直接观察治疗短期过程(Directly ObservedTherapy Short-course)”(DOTS)是增加药物依从性和减少多药物抗性结核分枝杆菌菌株出现的一种方法。该WHO方法的一方面集中能够进行和促进研究，认识到TB的消除将依赖于新的诊断学、药物和疫苗。

因为最佳的患者管理需要药物治疗的尽早开始和尽可能快地隔离感染的个体，所以在现有技术中存在对快速和可靠的检测技术的需要。

然而，传统的TB感染的诊断方法或是长时间(生物培养)的，或者潜在地缺少灵敏性(抗酸性涂片镜检)。肺外TB的诊断由于使用已知技术获得足够的检测材料的困难性而变得复杂。

更具体地，检测分支杆菌的现有标准方法学需要熟练的技术人员并可能导致多达八周的诊断结果延迟。当前的WHO指导方针推荐具有可疑TB的人提交至少三份痰样品(在分开的场合产生)以增加检测活动性TB的可能性。

为了通过萋-尼染色(Ziehl Neelsen staining)检测痰中的分支杆菌，需要每毫升痰超过5,000个生物以通过光学显微镜看到杆菌。这样，“涂片”试验通常缺少灵敏度和特异性。而且，在患有活动性肺TB的患者中，只有估计的45％的感染通过痰显微镜方法检测到(Dye等人，2005)。

分支杆菌的培养仍然是诊断和药物敏感性测试的金标准，并且可以检测少至每毫升痰10个生物。然而，这种技术由于长的温育时间(多至数周用于诊断)和在野外执行的困难性而受到妨碍(Kent和Kubica，1985)。

结核分支杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex)(MTBc)包括五个种：结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、牛分支杆菌(M.bovis)、M.canetti和非洲分支杆菌(M.africanum)——它们是全世界范围内大多数结核分枝杆菌感染(TB)病例的病原体。在这些种之间的高水平的DNA序列同一性已经限制了使用DNA序列在MTBc的成员之间进行区分。

由于在诊断分支杆菌学领域中引入核酸扩增分析，所以已经发展了多种室内和商业分析。作为实例，Roche AMPLICOR MTB系统扩增所有分支杆菌共有的16S rRNA基因序列的584-bp区域。

目前检测和分型MTB复合群“MTBc”的分支杆菌的分子方法学包括转座因子IS6110的扩增(Thierry等人，1990；Yuen等人，1995)。然而，基于IS6110的方法具有不佳的再现性和不佳的灵敏度。

在这方面，IS6110的拷贝数在MTBc的成员之间不同，并且似乎是菌株依赖性的(Poulet和Cole，1995)。尽管MTBc的许多成员包含在整个基因组中分散的8-15个拷贝的IS6110，但是大约40％的结核分枝杆菌菌株仅具有该因子的一个或两个拷贝，而牛分支杆菌只包含(平均)单个拷贝。

在20世纪90年代晚期，报道了使用基于PCR技术、称为“间隔区寡核苷酸分型(spacer oligotyping)”(间隔区寡核苷酸分型法(spoligotyping))的技术，根据检测在MTBc菌株中广泛存在的36bp同向重复(DR)基因座内的25-41bp的43个已知的多态性“间隔”区域的存在或不存在，同时进行分支杆菌的检测和菌株区分(Kamerbeek等人，1997)。在基因组中的DRs总量以及特定间隔区域的存在或不存在方面，菌株存在变化。因此，像基于IS6110的方法一样，间隔区寡核苷酸分型法缺少区分能力。

“分支杆菌散布的重复单元”(Mycobacterial Interspersed RepetitiveUnits)(MIRUs)是分散在位于整个MTBc分支杆菌基因组的约41个基因座中的可变数量串联重复序列(VNTRs)。每个MIRU基因座包含可变数量的串联的MIRU重复序列元件(多至每个基因座约13个重复元件)。

Supply等人2001，描述了基于确定在结核分枝杆菌基因组中MIRU基因座处的串联重复的数量对结核分枝杆菌菌株进行基因分型的方法。Supply等人描述的方法包括使用对位于MIRU基因座侧翼的结核分枝杆菌基因组的区域特异的引物的PCR扩增。生成的扩增子的大小反映在每个MIRU基因座的重复的数量。

在本领域中存在对快速、简单、特异和高度灵敏的分子方法的需求，所述方法在低至单个基因组拷贝的水平下检测样品如痰和呼吸道样本中的分支杆菌——优选为“当场(on-the-spot)”技术，其被容易地被运输进入现场，例如在发展中世界。

本发明通过提供检测样品中属于MTB复合群的分支杆菌的方法来满足这种需求，所述方法包括：

使样品与一对正向和反向寡核苷酸引物接触；

其中所述正向引物与位于分支杆菌散布重复单元(MIRU)重复元件内的靶核酸序列杂交；和

其中所述反向引物与位于分支杆菌散布重复单元(MIRU)重复元件内的靶核酸序列杂交；

(b)延伸所述正向和反向引物以生成扩增产物；和

(c)检测所述扩增产物。

该方法有利地提供结核分枝杆菌复合群(MTBc)的分支杆菌诸如结核分枝杆菌或牛分支杆菌的高度灵敏、快速和耐用的分子诊断分析。

整个MTBc分支杆菌基因组中的MIRU重复的特定排列显著增加分析的灵敏性。

在一个实施方式中，有利地是，可以在两个小时以内从分析中获得结果。在一个实施方式中，有利地是，分析能够从痰直接进行单分子检测。在一个实施方式中，有利地是，可以从微体积的患者样品(例如，痰)直接获得结果而不需要耗时的核酸提取步骤。

因此，在一个实施方式中，所述分析显著地减少等待时间并且理论上允许近患者检验(near-patient testing)。

本要求保护的分析的进一步优势是它的简单性——它优选地可以通过非专家工作人员进行和读取，并且是非劳动密集型的。

MIRU重复元件包括对MTB复合群的成员特异的核酸序列。

因此，在一个实施方式中，本发明的检测方法基于该MTBCs-特异核酸序列的扩增。

在一个实施方式中，与正向引物杂交的靶核酸序列对于MTB复合群的分支杆菌特异。在一个实施方式中，与反向引物杂交的靶核酸序列对于MTB复合群的分支杆菌特异。

在一个实施方式中，正向和反向引物的延伸生成包括MTB复合群特异的核酸序列的扩增产物。

在一个实施方式中，检测包括MTB复合群特异的核酸序列的扩增产物。

在一个实施方式中，与正向引物杂交的靶核酸序列不位于MIRU4重复元件(也称为ETRD重复元件)内。在一个实施方式中，与反向引物杂交的靶核酸序列不位于MIRU4重复元件(也称为ETRD重复元件)内。在一个实施方式中，正向引物和反向引物都不与位于MIRU4重复元件内的靶核酸序列杂交。在一个实施方式中，扩增产物不包括MIRU4重复元件核酸序列。

在一个实施方式中，MIRU重复元件具有与选自以下的MIRU重复元件至少90％的序列同一性(优选为91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性)：MIRU2重复元件、MIRU10重复元件、MIRU16重复元件、MIRU23重复元件、MIRU24重复元件、MIRU26重复元件、MIRU27重复元件(也称为QUB5重复元件)、MIRU31重复元件(也称为ETRE重复元件)和MIRU39重复元件。

因此，在一个实施方式中，正向引物与位于MIRU重复元件内的靶核酸序列杂交，其中所述MIRU重复元件具有与选自以下的MIRU重复元件至少90％的序列同一性(优选为91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性)：MIRU2重复元件、MIRU10重复元件、MIRU16重复元件、MIRU23重复元件、MIRU24重复元件、MIRU26重复元件、MIRU27重复元件(也称为QUB5重复元件)、MIRU31重复元件(也称为ETRE重复元件)和MIRU39重复元件。在一个实施方式中，所述靶核酸序列对于MTB复合群的分支杆菌特异。

在一个实施方式中，反向引物与位于MIRU重复元件内的靶核酸序列杂交，其中所述MIRU重复元件具有与选自以下的MIRU重复元件至少90％的序列同一性(优选为91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性)：MIRU2重复元件、MIRU10重复元件、MIRU16重复元件、MIRU23重复元件、MIRU24重复元件、MIRU26重复元件、MIRU27重复元件(也称为QUB5重复元件)、MIRU31重复元件(也称为ETRE重复元件)和MIRU39重复元件。在一个实施方式中，所述靶核酸序列对于MTB复合群的分支杆菌特异。

作为实例，结核分枝杆菌的CDC1551菌株的基因组包括在MIRU2基因座处的3个串联重复元件、在MIRU10基因座处的5个串联重复元件、在MIRU16基因座处的3个串联重复元件、在MIRU23基因座处的5个串联重复元件、在MIRU24基因座处的1个串联重复元件、在MIRU26基因座处的5个串联重复元件、在MIRU27/QUB5基因座处的4个串联重复元件、在MIRU31/ETRE基因座处的3个串联重复元件和在MIRU39基因座处的2个串联重复元件。

因此，在一个实施方式中，正向引物与位于MIRU重复元件内的靶核酸序列杂交，其中所述MIRU重复元件具有与选自以下的MIRU重复元件(参照结核分枝杆菌的CDC1551菌株)至少90％的序列同一性(优选为91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性)：

MIRU2重复元件1、2和3；

MIRU10重复元件1、2、3、4和5；

MIRU16重复元件1、2和3；

MIRU23重复元件1、2、3、4和5；

MIRU24重复元件1；

MIRU26重复元件1、2、3、4和5；

MIRU27/QUB5重复元件1、2、3和4(优选为MIRU27/QUB5串联重复元件2、3和4)；

MIRU31/ETRE重复元件1、2和3(优选为MIRU31/ETRE重复元件2和3)；和

MIRU39重复元件1和2。

在一个实施方式中，反向引物与位于MIRU重复元件内的靶核酸序列杂交，其中所述MIRU重复元件具有与选自以下的MIRU重复元件(参照结核分枝杆菌的CDC1551菌株)至少90％的序列同一性(优选为91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性)：

MIRU2重复元件1、2和3；

MIRU10重复元件1、2、3、4和5；

MIRU16重复元件1、2和3；

MIRU23重复元件1、2、3、4和5；

MIRU24重复元件1；

MIRU26重复元件1、2、3、4和5；

MIRU31/ETRE重复元件1、2和3(优选为MIRU31/ETRE重复元件2和3)；和

MIRU39重复元件1和2。

在一个实施方式中，所述MIRU重复元件包括(并且可以由以下组成)具有与选自SEQ ID NOs：1-24的核苷酸序列(如在以下表1中显示)或其互补序列的至少90％序列同一性(优选为91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性)的核苷酸序列。

表1

MIRU重复元件核苷酸序列的变体可以可选地通过列举在变体序列和在以上表1中提供的参考MIRU重复元件核苷酸序列SEQ ID NO之间的不同的核苷酸的数量限定。因此，在一个实施方式中，MIRU重复元件包括(并且可以由以下组成)与SEQ ID NOs：1-24(或其互补序列)在不多于5个核苷酸位置处，优选地在不多于4、3、2或1个核苷酸位置处不同的核苷酸序列。

一般而言，反向引物被设计为与靶核酸的编码(有义)链内的靶核酸序列杂交，而正向引物被设计为与靶核酸的互补(即，反义)链内的靶核酸序列杂交。

术语“核酸序列的互补序列”指与参考核苷酸序列相比具有互补的核苷酸序列和反向方向的核酸序列。

正向引物与位于MIRU重复元件序列内的靶核酸序列(“正向引物靶序列”)杂交。

在一个实施方式中，正向引物靶序列具有如下范围的长度：MIRU重复元件的10-40个连续核苷酸，优选MIRU重复元件的至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个连续核苷酸，优选MIRU重复元件的多至38、35、32、30、29、28、27、26、25、24、23或22个连续核苷酸。更优选地，正向引物靶序列具有MIRU重复元件的17-27个连续核苷酸的长度，最优选地为MIRU重复元件的约22个连续核苷酸的长度。

在一个实施方式中，正向引物靶序列对MTB复合群的分支杆菌特异。

反向引物与位于MIRU重复元件序列内的靶核酸序列(“反向引物靶序列”)杂交。

在一个实施方式中，反向引物靶序列具有如下范围的长度：MIRU重复元件的10-40个连续核苷酸，优选为MIRU重复元件的至少11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸，优选为多至MIRU重复元件的38、35、32、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21或20个连续核苷酸。更优选地，反向引物靶序列具有MIRU重复元件的15-25个连续核苷酸的长度，最优选为MIRU重复元件的约20个连续核苷酸的长度。

在一个实施方式中，反向引物靶序列对MTB复合群的分支杆菌特异。

在一个实施方式中，正向引物与靶核酸序列杂交，所述靶核酸序列包括(或由以下组成)选自如在以下表2中示出的SEQ ID NOs：25-39的核苷酸序列的互补序列，或者与其具有至少90％同一性(优选为与其91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性)的核苷酸序列，或其片段。

表2

SEQ ID NO：正向引物靶核苷酸序列(5’→3’)

25 GGCGCCGCTCCTCCTCATCGCT

26 GGCGCCGCTCTCCCCCGCAAGT

27 GGCGCCGCTCCTCCTCATCGCT

28 GCCGCTCCTCCTCATCGCT

29 AGCGCCGCTCCTCCTCATCGCT

30 TGCGCCGCTCCTCCTCATCGCT

31 TGCGCCGCTCCTGCTCATCGCT

32 TGCGCCGCTCCTCTCATCGCT

33 GGCGCCGCTCCTCAGCATCGCT

34 AGCGCCGCTCCTCCTCATCGCT

35 GCGCCGCTCCTCCTCATCGCT

36 GGCGCCGCTCCTCCCCATCGCT

37 TGCGCCGCTCCTCCTCATCGCT

38 GGCGCCGCTCCTCCTCATCGCT

39 GCGCCGCTCCTCCTCATCGCT

在一个实施方式中，SEQ ID NOs：25-27、29-31、33-34或36-38的互补序列的片段(或如以上定义的其序列变体)具有其至少19、20或21个连续核苷酸。在一个实施方式中，SEQ ID NO：28的互补序列的片段(或如以上定义的其序列变体)具有其至少16、17或18个连续核苷酸。在一个实施方式中，SEQ ID NOs：32、35或39的互补序列的片段(或如以上定义的其序列变体)具有其至少18、19或20个连续核苷酸。

在一个实施方式中，反向引物与靶核酸序列杂交，所述靶核酸序列包括(或由以下组成)与选自SEQ ID NOs：40-46的核苷酸序列(如在以下表3中示出)至少90％同一性(优选为91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)的核苷酸序列，或其片段。

表3

SEQ ID NO：反向引物靶核苷酸序列(5’→3’)

40 GCTGTGCATCGTCGCTGGCG

41 GCTGTGCATCGTCGCCGGCG

42 GAGGTGCCCCCACCTCATGT

43 GCTCTGCATCGTCGCCGGCG

44 GCTCTGCATCGTCGTCGGCG

45 GCTCTGCATCGTCACCGGCG

46 GCTTTGCATCGTCGCCGGCG

在一个实施方式中，SEQ ID NOs：40-46(或如以上定义的其序列变体)的片段具有其至少17、18或19个连续核苷酸。

在一个实施方式中，正向引物为15-30个核苷酸长，优选为至少16、17、18、19、20、21或22个核苷酸长，优选多至29、28、27、26、25、24、23或22个核苷酸长。更优选地，正向引物为约20-24个核苷酸长，并且最优选为22个核苷酸长。

在一个实施方式中，反向引物为15-30个核苷酸长，优选为至少16、17、18、19或20个核苷酸长，优选多至29、28、27、26、25、24、23、22、21或20个核苷酸长。更优选地，反向引物为18-22个核苷酸长，和最优选为约20个核苷酸长。

在一个实施方式中，正向引物包括(或由以下组成)具有与选自SEQID NOs：25-39的核苷酸序列(如在以上表2中显示)至少80％同一性(优选至少82、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)的核苷酸序列。优选保守置换。

在一个实施方式中，反向引物包括(或由以下组成)具有与选自SEQID NOs：47或48的核苷酸序列(如在以下表4A中显示)至少80％同一性(优选为至少82、85、86、87、88、89、9091、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)的核苷酸序列。优选保守置换。

表4A

正向引物SEQ ID NO：序列

47 GGC GCC GCT CCT CCT CAT CGC T

48 GGC GCC GCT CCT CCC CAT CGC T

以上提供的特异正向引物序列的变体可以可选地通过列举在变体序列和在以上提供的特异正向引物参考序列SEQ ID NO之间不同的核苷酸数限定。因此，在一个实施方式中，正向引物可以包括(或由以下组成)与SEQ ID NOs：25-39或47-48在不多于4个核苷酸位置处，优选地在不多于3、2或1个核苷酸位置处不同的核苷酸序列。优选保守置换。

也可以使用以上提到的正向引物序列的片段(和如以上定义的其序列变体)。

在一个实施方式中，正向引物可以包括(或由以下组成)SEQ IDNOs：25-39、47或48的片段(和如以上定义的其序列变体)，其中所述片段优选包括其至少15个连续核苷酸，更优选包括其至少16、17、18、19、20或21个连续核苷酸。

在一个实施方式中，反向引物包括(或由以下组成)具有与选自如以上表3中显示的SEQ ID NOs：40-46的核苷酸序列的互补序列至少80％同一性(优选为82、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)的核苷酸序列。优选保守置换。

在一个实施方式中，反向引物包括(或由以下组成)具有与选自如在以下表4B中显示的SEQ ID NOs：49、50或51的核苷酸序列至少80％同一性(优选为85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)的核苷酸序列。优选保守置换。

表4B

反向引物SEQ ID NO：序列

49 CGC CGG CGA CGA TGC AGA GC

50 CGC CGG TGA CGA TGC AGA GC

51 CGC CGG CGA CGA TGC AAA GC

以上提供的特异的反向引物序列的变体可以可选地通过列举在变体序列和以上提供的特异反向引物参考序列SEQ ID NO之间不同的核苷酸数限定。在一个实施方式中，反向引物可以包括(或由以下组成)与SEQ ID NOs：49、50或51(或与SEQ ID NOs：40-46的互补序列)在不多于4个核苷酸位置处，优选地在不多于3、2或1个核苷酸位置处不同的核苷酸序列。在这点上，优选保守置换。

也可以使用以上提到的反向引物序列的片段(和如以上定义的其序列变体)。

在一个实施方式中，反向引物可以包括(或由以下组成)SEQ IDNOs：49-51的片段，或SEQ ID NOs：40-46的互补序列的片段(和如以上定义的其序列变体)，其中所述片段优选包括其至少15个连续核苷酸，更优选为其至少16、17、18或19个连续核苷酸。

使用常规软件诸如Primer Express(Applied Biosystems)基于期望参数的选择将本发明的正向和反向引物设计为与靶核苷酸序列结合。

正向引物优选为序列特异的和优选特异地与MIRU重复元件内的靶核酸序列杂交。反向引物优选为序列特异的并且优选特异地与MIRU重复元件内的靶核酸序列杂交。

术语“杂交”等同于术语“结合”并且可以与其互换。

优选地，结合条件是这样的，使得提供高水平的特异性。正向和反向引物的解链温度(Tm)优选为超过68℃并且最优选为大约72℃。

在一个实施方式中，在正向和反向引物的序列之间有核苷酸序列互补性的区域。这些互补序列区域使得引物通过互补碱基配对能够彼此杂交以形成“引物二聚体”。在一个实施方式中，这些引物-引物二聚体提供检测方法的内部对照。

在一个实施方式中，在正向和反向引物之间有1至10个互补碱基。因此，在一个实施方式中，正向和反向引物能够通过在1至10个位置处，优选地在1至10个连续核苷酸位置处的互补碱基配对彼此杂交。在一个实施方式中，正向和反向引物具有至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个互补碱基(优选为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续互补碱基)。互补碱基可以位于正向和反向引物内的任何地方，例如，朝向正向和反向引物的3′端。在一个实施方式中，最接近于正向和反向引物的3’末端的1-10个核苷酸是互补的。优选地，最接近于正向和反向引物的3’末端的2、3、4、5或6个核苷酸是互补的，最优选地，最接近于正向和反向引物的3’末端的3个核苷酸是互补的。

在一个实施方式中，正向和反向引物的引物-引物杂交形成15-45bp长，优选为至少20、25、30、31、32、33、34、35或36bp长，优选多至44、43、42、41、40、39、38、37或36bp长的二聚体。优选地，正向引物-反向引物二聚体为30-40bp长，更优选为约34-38bp长，最优选为约36bp长。

在一个实施方式中，正向引物和/或反向引物包括标记或标签。在一个实施方式中，当引物延伸时，所述标记或标签掺入扩增产物中。标记或标签优选地位于正向和/或反向引物的5’或3’端，最优选在反向引物的5’端。

合适的标签的实例包括可检测标签如放射性标签或荧光或有色的分子。作为实例，标签可以是地高辛、荧光素-异硫氰酸酯(FITC)或R-藻红蛋白。标签可以是报道分子，其被直接检测，如通过暴露于照相胶片或者X-射线胶片。可选地，标签不是直接可检测的，但是可以被间接地检测，例如，在两相系统中。间接的标签检测的一个实例是抗体与标签的结合。

合适的标记的实例包括生物素和链亲和素。其它示例性标记包括受体、配体、抗体、抗原、半抗原和表位。

样品优选为临床样品(或源自临床样品)，诸如痰、支气管肺泡灌洗液、气管吸痰、肺组织样品、脑脊液、考古学样品。

扩增可以使用本领域中已知的方法和平台进行，例如PCR，诸如实时PCR、分块PCR(block-based PCR)、连接酶链式反应、玻璃毛细管、包括环介导等温扩增的等温扩增方法、滚环扩增转录介导的扩增(rolling circle amplification transcription mediated amplification)、基于核酸序列的扩增、RNA技术的信号介导扩增、链置换扩增、等温多重置换扩增(isothermal multiple displacement amplification)、解旋酶依赖的扩增(helicase-dependent amplification)、单引物等温扩增(single primerisothermal amplification)和环解旋酶依赖扩增(circularhelicase-dependent amplification)。

在一个实施方式中，扩增可以使用任何扩增平台进行——因此，分析的这种实施方式的优势是它是独立且不依赖于何特定仪器的平台。

在合适的聚合酶和DNA前体(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)的存在下，正向和反向引物在5’至3’方向上延伸，由此开始合成与靶MTBc-特异的核酸的单个链互补的新核酸链。引物由此驱动MTBc-特异的核酸序列的扩增，由此生成包括所述MTBc-特异的核酸序列的扩增产物。本领域技术人员将能够确定促进扩增的合适条件。

在本申请中，表述“扩增产物”、“扩增核酸序列”和“扩增子”交替地使用并且具有相同的含义。

个体MIRU重复元件包括如本文定义的正向引物的靶序列和如本文定义的反向引物的靶序列。

因此，在一方面，正向和反向引物与位于相同MIRU重复元件内的靶核酸序列杂交。根据这个方面，正向和反向引物的延伸生成包括全部源自(即，整体位于)所述个体MIRU重复元件的核酸序列的扩增产物。

纯粹地作为实例，在一个实施方式中，正向和反向引物可以结合在MIRU10重复元件1内的它们的靶核酸序列。这些引物的延伸将生成包括全部源自MIRU10重复1的核酸序列的扩增产物。

在一个实施方式中，扩增产物为约30-55个核苷酸长，优选为至少约32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44个核苷酸长，优选为多至约54、53、52、51、50、49、48、47、46、45或44个核苷酸长。更优选地，扩增产物为40-50个核苷酸长，最优选为约44个核苷酸长。

在大部分的扩增初期循环中，正向和反向引物将与相同的MIRU重复元件杂交，并且因此将扩增位于单个MIRU重复元件内的核酸序列，如以上讨论的。

然而，在多重复MIRU基因座中，多个重复序列同时包括正向引物的靶核酸序列和反向引物的靶核酸序列。因此，每个多重复MIRU基因座包括正向和反向引物的多个靶核酸序列。

因此，MTB复合群分支杆菌的基因组包括正向引物的多个靶核酸序列和反向引物的多个靶核酸序列。

通过在5’到3’方向向杂交反向引物延伸杂交正向引物“下游”和在5’到3’方向向所述正向引物延伸所述杂交反向引物“上游”——即，引物向彼此延伸，成功进行扩增。在这点上，如果杂交正向引物点的3’端朝向反向引物靶序列，则反向引物靶序列被称为是正向引物靶序列的“下游”，并且所述杂交正向引物的5’到3’延伸是在朝向反向引物靶序列的方向上。同样地，如果杂交反向引物点的3’端朝向正向引物靶序列，则正向引物靶序列被称为反向引物靶序列的“上游”，并且所述杂交反向引物的5’到3’延伸是在朝向正向引物靶序列的方向上。

在一方面，正向和反向引物与在相同MIRU基因组处、位于不同MIRU重复元件内的靶序列杂交。

如在图1中图解，包含5个串联重复元件的MIRU基因座包括用于正向引物杂交的5个可能靶核酸序列和用于反向引物杂交的5个可能靶核酸序列。在这点上，MIRU基因座的重复4和5是重复3的“下游”并且MIRU基因座的重复1和2是重复3的“上游”。

因此，与5-重复基因座的重复1杂交的正向引物可以与杂交到重复1、2、3、4或5的反向引物配对用于扩增，而与5-重复基因座的重复3杂交的正向引物只可以与杂交到重复3、4或5的反向引物配对用于扩增。

然而，正向引物不能与在更上游杂交的反向引物成功配对用于扩增。在这点上，与5-重复基因座的重复3杂交的正向引物和与重复1或2杂交的反向引物将以相反方向彼此延伸离开，这将导致不成功的扩增。

作为实例(如在图1中图解)，可以通过与在5-重复MIRU基因座的第一重复中的其靶核酸序列杂交的正向引物的延伸以及与在5-重复基因座的第一、第二、第三、第四或第五重复中的其靶核酸序列杂交的反向引物的延伸，使扩增发生。

具体地，使用正向和反向引物靶核酸序列(在相同MIRU基因座内)的以下组合，可以发生成功的扩增：

根据发明的这个方面，正向和反向引物的延伸扩增跨越在相同基因座中的多于一个相邻MIRU重复元件的核酸序列。因此，根据发明的这个方面，扩增产物包括跨越在相同基因座中的多于一个相邻MIRU重复元件的核酸序列。

在一个实施方式中，杂交的正向和反向引物的延伸扩增跨越在基因座中的2个相邻MIRU重复元件的核酸序列。因此，根据这个实施方式，扩增产物包括跨越在相同基因座中的2个相邻MIRU重复元件的核酸序列。

在一个实施方式中，杂交的正向和反向引物的延伸扩增跨越基因座中多至所有的MIRU重复元件(例如，跨越基因座中的至少2、3、4或5个MIRU重复元件)的核酸序列。因此，根据这个实施方式，扩增产物包括跨越基因座中多至所有的MIRU重复元件(例如，跨越基因座中的至少2、3、4或5个MIRU重复元件)的核酸序列。

作为实例，在一个实施方式中，正向引物结合其在MIRU10重复1内的靶序列，并且反向引物结合其在MIRU10重复2、3、4或5内的靶序列。从这些引物的延伸将扩增跨越MIRU10重复1和2(如果反向引物在MIRU10重复2内结合)的核酸序列、或者跨越MIRU10重复1、2和3(如果反向引物在MIRU10重复3内结合)的核酸序列、或者跨越MIRU10重复1、2、3和4(如果反向引物在MIRU10重复4内结合)的核酸序列、或者跨越MIRU10重复1、2、3、4和5(如果反向引物在MIRU10重复5内结合)的核酸序列。

在一个实施方式中，跨越两个MIRU重复的扩增产物为70-120个核苷酸长，优选为至少约75、80、85、90、91、92、93、94、95、96或97个核苷酸长，优选为多至约110、105、104、103、102、101、100、99、98或97个核苷酸长。最优选地，跨越两个MIRU重复的扩增产物在90-105个核苷酸长的范围内，最优选为约97个核苷酸长。

在一个实施方式中，跨越三个MIRU重复的扩增产物是100-200个核苷酸长，优选为至少约105、110、115、120、125、130、135、140、145、146、147、148、149或150个核苷酸长，优选多至约195、190、185、180、175、170、165、160、155、154、153、152、151或150个核苷酸长。最优选地，跨越两个MIRU重复的扩增产物在135-165个核苷酸长的范围内，最优选为约150个核苷酸长。

在一个实施方式中，跨越四个MIRU重复的扩增产物是145-240个核苷酸长，优选为至少约150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、196、197、198、199、200、201、202或203个核苷酸长，优选多至约235、230、225、220、215、210、209、208、207、206、205、204或203个核苷酸长。最优选地，跨越两个MIRU重复的扩增产物为在185-225个核苷酸长的范围内，最优选为约203个核苷酸长。

在一个实施方式中，跨越五个MIRU重复的扩增产物是185-310个核苷酸长，优选为至少约190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、251、252、253、254、255或256个核苷酸长，优选多至约305、300、295、290、285、280、275、270、265、260、259、258、257或256个核苷酸长。最优选地，跨越两个MIRU重复的扩增产物是在235-285个核苷酸长的范围内，最优选为约256个核苷酸长。

在一方面，正向和反向引物与位于不同MIRU重复元件内的靶序列杂交。

在一个实施方式中，不同MIRU重复元件位于分散在整个MTBc分支杆菌基因组中的不同MIRU基因座中。根据发明的这个方面，从正向和反向引物的5’到3’延伸扩增跨越相邻MIRU基因座的MIRU重复元件的核酸序列。因此，根据发明的这个方面，扩增产物包括跨越相邻MIRU基因座的MIRU重复元件的核酸序列。

在一个实施方式中，扩增产物是非常大的分子，其可以超过2kb长，并且可以超过5kb长或者甚至超过10kb长(一般在11-12kb长的范围内)。在一个实施方式中，扩增产物是多联体分子(concatamericmolecule)。

这些多联体扩增产物的形成可以通过选择合适的扩增条件促进。

作为实例，多联体分子的形成可以通过选择限制引物与核酸杂交的扩增方案，由此减少所有潜在引物靶序列将变为被引物占据的可能性进行促进。通过减小引物与所有它们的潜在靶核酸序列杂交的可能性，扩增位于单个MIRU重复序列内的核酸序列的可能性也减小。

因此，在一方面，多联体分子的形成通过使用引物的亚饱和浓度进行促进。

在一方面，多联体分子的形成通过增加Tm促进。在一个实施方式中，退火Tm与延伸Tm(例如，约72℃)基本上相同。使用高的退火Tm是有利的，因为MTBc核酸是非常富含GC的。在高Tm(例如，约72℃)，极少的非特异延伸出现。

在一个实施方式中，进行引物延伸的时间减少(例如，减少到约2秒、1.5秒或甚至1秒)。减少引物延伸时间也可以减少引物-引物二聚体人为产物的出现。

在一方面，多联体分子的形成通过选择促进正向和/或反向引物的不完全延伸的扩增条件促进。

在这点上，我们已经观察到引物延伸产物(特别是变性的不完全/部分引物延伸产物)可以表现为随后的扩增循环中的长引物。作为实例，包括跨越3个MIRU重复的核酸序列的不完全延伸产物可以与包含2个MIRU重复的MIRU基因组退火并充当伸长的引物。通过不完全延伸产物/长引物的延伸生成的扩增产物将是跨越4个MIRU重复或5个MIRU重复的多联体产物(取决于长引物是否与2-重复MIRU基因座中的第一或第二个MIRU重复结合)。

在一方面(图2中图解)，正向引物的延伸产物(包括变性的部分延伸产物)在任何MIRU基因座处与MIRU重复内的正向引物靶序列杂交，并且充当为伸长的正向引物。

同样地，在一方面，反向引物的延伸产物(包括变性的部分延伸产物)在任何MIRU基因座处与MIRU重复内的反向引物靶序列杂交，并且充当伸长的反向引物。

通过这些伸长的引物的延伸产生的多联体扩增产物因此可以包括位于相同MIRU基因座和/或不同MIRU基因座的多个MIRU重复元件内的核酸序列。

检测步骤可以通过任何已知的方法进行。

在一方面，扩增产物被标记或贴标签，并且检测方法包括检测标记或标签。标记或标签优选地在扩增步骤期间掺入扩增产物中。在一个实施方式中，正向和/或反向引物包括标记或标签，并且在扩增步骤期间，当引物延伸时标记或标签掺入扩增产物中。标记或标签优选地位于正向或反向引物的5’或3’端，最优选地位于反向引物的5’端。

因此，在一个实施方式中，扩增产物被贴标签，并且分析包括检测标签(优选地在去除引物之后)和把标签的存在与扩增产物的存在相关联，并且因此与MTBc的分支杆菌的存在联系起来。标签可以包括可检测标签诸如放射性标签或荧光素或有色分子。作为实例，标签可以是地高辛、荧光素-异硫氰酸酯(FITC)或R-藻红蛋白。标签可以是报道分子，其被直接检测，如通过暴露于照相胶片或者X-射线胶片。可选地，标签不能够被直接检测，但是可以被间接地检测，例如，在两相系统中。间接标签检测的一个实例是抗体与标签的结合。

在一个实施方式中，扩增产物被标记，并且分析包括捕获标记(优选在去除引物后)和把标记的存在与扩增产物的存在相关联，和因此与MTBc的分支杆菌的存在相关联。在一个实施方式中，使用捕获分子捕获标记，所述捕获分子可以附着(例如，包被)于基底或固体载体之上，诸如膜或磁珠之上。

使用磁珠的捕获方法是有利的，因为使用本领域内已知的常规技术，磁珠(加上捕获、标记的扩增产物)可以容易地从样品中富集并分离。

合适标记的实例包括“补体/抗补体对”。术语“补体/抗补体对”表示在合适条件下形成非共价连接的、稳定对的不完全相同的部分。例如，生物素和抗生物素蛋白(链亲和素)是补体/抗补体对的成员。其它示例性补体/抗补体对包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对等等。当期望补体/抗补体对随后解离时，补体/抗补体对优选地具有小于10⁹M^-1的结合亲和力。

在一个实施方式中，标记选自生物素和链亲和素。在这点上，生物素标记可以使用链亲和素捕获，链亲和素可以包被于基底或载体诸如珠子(例如，磁珠)或膜之上。同样地，链亲和素标记可以使用生物素捕获，生物素可以包被于基底或载体诸如珠子(例如，磁珠)或膜之上。其它示例性标记和捕获分子对包括受体/配体对和抗体/抗原(或半抗原或表位)对。

因此，在一个实施方式中，扩增产物掺入生物素标记，并且检测步骤包括使样品与链亲和素包被的磁珠接触，所述链亲和素包被的磁珠捕获生物素标记的扩增产物。磁珠(加上捕获、标记的扩增产物)然后可以与样品分离，由此使扩增产物与样品分离。扩增产物然后可以通过任何已知方法进行检测。

在一个实施方式中，测定扩增产物的核酸序列。扩增产物的测序可以通过任何已知方法进行。例如(在DNA的未标记链用氢氧化钠溶解后)，可以使用比色测序系统，例如Trimgen Mutector^TM检测系统。

在一方面，扩增产物通过如下方法检测，所述方法包括使样品与寡核苷酸探针在允许探针和扩增产物之间的杂交复合物形成的条件下接触，并且检测所述杂交复合物。在一个实施方式中，探针对扩增产物特异。

探针优选为5-30个核苷酸长，优选为至少6、7、8、9或10个核苷酸长。优选地是，探针为多至25个核苷酸长，更优选为多至20、18、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸长。探针更优选为8-12个核苷酸长，并且最优选为约10个核苷酸长。在这点上，使用短探针能够使与靶核酸的退火更快。

在扩增产物中与探针杂交的靶核苷酸序列优选为至少5、6、7、8、9或10个核苷酸长。优选地是，探针的靶序列为多至30个核苷酸长，更优选为多至25、20、18、16、15、14、13、12或11个核苷酸长。探针靶序列更优选为8-12个核苷酸长，并且最优选为约10个核苷酸长。

在一个实施方式中，探针是PNA探针。

使用常规的软件，基于期望参数的选择，探针被设计为与扩增产物内它们的靶序列杂交。优选地是，结合条件是这样的，以使得提供高水平的特异性——即，探针与扩增产物的杂交在“严格条件”下发生。一般而言，严格条件被选择为低于特定序列在限定离子强度和pH下的热熔点(T_m)约5℃。T_m是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在限定离子强度和pH下)。在这点上，在约0.02M的盐浓度或小于pH7的条件下，本发明探针的T_m优选为60℃以上，更优选为约70℃。

预混合的结合溶液是可得的(例如，来自CLONTECH Laboratories，Inc.的EXPRESSHYB杂交溶液)，并且杂交可以根据厂家的说明书进行。可选地，本领域技术人员可以设计这些结合条件的合适变化。

优选地是，筛选探针以最小化自互补性和二聚体形成(探针-探针结合)。选择本发明的优选的探针，以与人DNA具有最小的同源性。选择方法可以包括将候选探针序列与人DNA进行比较，并且如果同源性大于50％，则丢弃该探针。这种选择方法的目的是减少探针与污染人DNA序列的退火并且因此使得分析的特异性提高。

在一个实施方式中，探针的序列与探针杂交的扩增产物的序列100％互补。可选地，在一个实施方式中，与扩增产物的核酸序列相比较，多至约30％(优选多至约25、22、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％)的探针核酸可以错配，然而尽管如此允许检测扩增产物的存在。

在一方面，寡核苷酸探针包括(并且由以下组成)与选自如下表3中显示的SEQ ID NOs：52-57的核苷酸序列具有至少80％同一性(优选为至少85、90、95或100％同一性)的核苷酸序列。在这点上，优选保守置换。

表3

探针SEQ ID NO：序列

52 CTG CGC TCT G

53 CTT CGC TCT G

54 CTT CGC TGT G

55 CTG CGC TTT G

56 GTG GGA GGT G

57 CTT TGC TCT G

限定变体探针序列的可选的方法是通过限定在变体序列和参考探针序列之间不同的核苷酸的数量。因此，在一个实施方式中，本发明的探针包括(或由以下组成)与SEQ ID NOs：52-57的不同不多于2个核苷酸，优选不多于1个核苷酸的核酸序列。在这点上，优选保守置换。

也可以使用以上提到的探针序列的片段，其中所述片段包括SEQID NOs：52-57的至少8或9个连续核苷酸。因此，在一个实施方式中，本发明的探针包括(或由以下组成)SEQ ID NOs：52-57(或如以上定义的其序列变体)的片段，其中所述片段优选地包括其至少8或9个连续核苷酸。

在结合后，在严格(优选为高度严格)条件下洗涤去除未结合的寡核苷酸。典型的严格洗涤条件包括：在55-65℃下，在具有0.1％SDS的0.5-2×SSC的溶液中洗涤。典型的高度严格清洗条件包括：在55-65℃下，在具有0.1％SDS的0.1-0.2×SSC的溶液中洗涤。技术人员可以容易地设计等价的条件——例如，通过用SSPE替换清洗液中的SSC。

在一个实施方式中，探针包括标签。因此，在一个实施方式中，在贴标签的探针与扩增产物杂交后，标签与结合的扩增产物相联。因此，在一个实施方式中，分析包括检测标签(优选在除去未结合的探针后)并且将贴标签的存在与结合的扩增产物的存在相关联，并且因此与MTBc的分支杆菌的存在相关联。

标签可以包括可检测的标签诸如放射性标签、荧光分子、酶标记或发色体标记——例如，当探针杂交时产生可见颜色变化的染料。作为实例，标签可以是地高辛、荧光素-异硫氰酸酯(FITC)或R-藻红蛋白。标签可以是报道分子，其被直接检测，诸如通过暴露于照相胶片或者X-射线胶片。可选地，标签不是直接可检测的，但是可以被间接地检测，例如，在两相系统中。间接标签检测的一个实例是抗体与标记的结合。

在一个实施方式中，探针包括标记。因此，在标记探针与扩增产物杂交后，标记与结合的扩增产物相联。因此，在一个实施方式中，分析包括捕获标记(优选在未结合探针去除后)和将标记的存在与结合的扩增产物的存在相关联，和因此与MTBc的分支杆菌的存在相关联。

在一个实施方式中，使用捕获分子捕获标记，所述捕获分子其可以附着(例如，包被)于基底或固体载体之上，诸如膜或磁珠之上。

使用磁珠的捕获方法是有利的，因为使用本领域中已知的常规技术，磁珠(加上与扩增产物结合的捕获、标记探针)可以容易地从样品中分离。

合适标记的实例包括生物素和链亲和素。在这点上，生物素标记可以使用链亲和素捕获，链亲和素可以包被于基底或载体诸如珠子(例如，磁珠)或膜之上。同样地，链亲和素标记可以使用生物素捕获，生物素可以包被于基底或载体诸如珠子(例如，磁珠)或膜之上。其它示例性标记和捕获分子对包括受体/配体对和抗体/抗原(或半抗原或表位)对。

因此，在一个实施方式中，探针用生物素标记，并且检测步骤包括使样品与链亲和素包被的磁珠接触，所述磁珠捕获结合到扩增产物的生物素标记的探针。磁珠(加上与扩增产物结合的捕获、标记的探针)然后与样品分离，由此从样品中分离扩增产物。然后可以通过任何已知的方法检测扩增产物。

在一方面，探针固定于载体或平台之上。固定探针提供探针的物理位置，并且可以用于在期望的位置固定探针和/或有利于探针的回收或分离。载体可以是例如由玻璃或塑料制成的刚性固体载体，诸如珠子(例如，磁珠)。可选地，载体可以是膜，例如尼龙或硝酸纤维素膜。3D基质也是用于本发明的合适载体——例如，聚丙烯酰胺或PEG凝胶。

固定到载体/平台可以通过各种常规的方法实现。作为实例，固定于载体诸如尼龙膜之上可以通过紫外线(UV)交联实现。生物素标记的分子(例如，探针)可以结合到链亲和素包被的基底(反之亦然)，并且用氨基连接体制备的分子可以固定于硅烷化的表面之上。固定探针的另一种方法是通过例如在3’或5’端处的poly-T尾部或poly-C尾部进行。

在一个实施方式中，探针与扩增产物杂交，但是不与引物-引物二聚体的序列杂交。在可选的实施方式中，探针与引物-引物二聚体杂交，但是与探针对扩增产物的结合亲和力相比具有较低的结合亲和力。

在一个实施方式中，在扩增产物内与探针杂交的靶核酸序列在引物二聚体的序列中不存在。在可选的实施方式中，在扩增产物内与探针杂交的靶核酸序列存在于引物二聚体的序列中，但是不易接近探针，优选为不可接近于探针。

因此，在一个实施方式中，探针的杂交使得扩增产物能够与引物二聚体区分开来。

在一个实施方式中，在扩增产物内与探针杂交的靶核酸序列包括(或由以下组成)位于正向和反向引物杂交的靶核苷酸序列之间的核苷酸序列。这个靶核酸序列优选地在引物二聚体的序列中是不存在的(或不易接近或不可接近该探针)。因此，在一个实施方式中，探针不与引物二聚体杂交(或者与扩增产物相比，以较低亲和力杂交)。

在一个实施方式中，在扩增产物内与探针杂交的靶核酸序列包括选自GCGC、TCGC、GGGA、ATTC或TTGC的核苷酸序列。

在一方面，扩增产物是双链核酸分子并且通过包括解链曲线分析的方法进行检测。解链曲线分析是在加热期间对双链核酸(例如，DNA)的解离特征的评估。解链曲线分析在图3、4、8和10-12中图解。在一个实施方式中，扩增产物具有90-95℃范围内的Tm，优选在92-93℃的范围，最优选为约92.5℃。

解链曲线分析也可以用于区分扩增产物和引物二聚体。因此，在一个实施方式中，引物二聚体的Tm不同于扩增产物的Tm。在一个实施方式中，引物二聚体具有82-89℃范围内的Tm，优选在84-88℃范围内，最优选约86℃。

在一方面，扩增产物通过这样方法检测，所述方法包括使样品与消化扩增产物的酶(例如限制性核酸内切酶)接触，并且识别消化产物。

在这方面，限制性核酸内切酶识别位于扩增产物的序列内的限制性位点。

限制性核酸内切酶消化也可以用于区分扩增产物和引物二聚体。在一个实施方式中，限制性核酸内切酶消化扩增产物，但是不消化引物二聚体。在一个实施方式中，限制性核酸内切酶识别位于扩增产物的序列内但是不存在于引物二聚体的序列中的限制性位点。可选地，限制性位点位于引物二聚体的序列内，但是对于限制性核酸内切酶是不易接近或不可接近的。

在一个实施方式中，扩增产物内的限制性位点位于与正向和反向引物杂交的靶核酸序列之间。该核酸序列优选地在引物二聚体的序列中不存在(或对于限制性核酸内切酶来说是不易接近或不可接近的)。

在一个实施方式中，限制性核酸内切酶识别并切割选自GCGC、TCGC、GCGA、CTTC、GAAG、GCAA、TTGC、CTTT或AAAG的靶序列。在一个实施方式中，限制性核酸内切酶是HhaI。

因此，在一个实施方式中，限制性核酸内切酶消化扩增产物，但是不消化引物二聚体。在这个实施方式中，消化产物的存在确认了扩增产物的存在，并且因此确认了MTBc分支杆菌的存在。相比之下，消化产物的不存在确认扩增产物不存在，并且因此确认MTBc分支杆菌的不存在。

在可选的实施方式中，限制性核酸内切酶同时消化扩增产物和引物二聚体，但是在不同位置进行消化。在这个实施方式中，限制性核酸内切酶的限制性位点同时存在于扩增产物和引物二聚体中，但是在不同位置。因此，扩增产物的消化产物和引物二聚体的消化产物是不同的，并且可以彼此区分开来。

消化产物可以通过任何已知方法进行检测，例如通过包括以上讨论的检测技术的任一种的方法。

在一个实施方式中，扩增产物的消化产物根据它们的大小，例如通过包括凝胶电泳的方法进行检测(和/或与引物二聚体或其消化产物区分开来)。

在一个实施方式中，扩增产物的消化产物在15-27个核苷酸长的范围内，优选为至少16、17、18、19或20个核苷酸长，和优选多至26、25或24个核苷酸长。优选地是，消化产物在20-25个核苷酸长的范围内，和更优选为约21、22或23个核苷酸长。

本发明的方法使得能够定量估计待测定的分支杆菌的负载。确定MTBc分支杆菌负载具有多种有用的应用，例如用于临床指导和用于确定治疗、用于患者管理以及评估疫苗效力。

在一方面，测量检测的扩增产物的量使得能够定量样品中MTBc核酸的量。

在一个实施方式中，扩增产物被贴标签并且扩增产物的量通过检测标签和测量标签的量进行测量。在一个实施方式中，扩增产物被标记并且扩增产物的量通过捕获标记和测量捕获标记的量进行定量。

在一个实施方式中，扩增产物与寡核苷酸探针杂交，并且扩增产物的量通过测量探针-扩增产物杂交复合物的量进行测量。在一个实施方式中，探针是被标记或被贴标签，并且探针-扩增产物杂交复合物的量通过检测标签或捕获标记以及测量标签或捕获的标记的量进行测量。

在一个实施方式中，扩增产物用限制性核酸内切酶消化，并且扩增产物的量通过检测扩增产物的消化产物以及测量消化产物的量进行测量。

因此，在一方面，本发明提供定量感兴趣样品中的MTBc分支杆菌负载(例如，结核分枝杆菌负载或牛分支杆菌负载)的体外方法，包括：(a)在所述感兴趣的样品上进行根据本发明的检测方法；和(b)在预先确定的已知MTB分支杆菌负载的测试样品上进行所述方法；和(c)比较检测的感兴趣样品的扩增产物的量与检测的测试样品的扩增产物的量；和由此定量感兴趣样品中的MTBc分支杆菌负载。

在另一方面，本发明的方法对于确定在一段时间期间中MTBc分支杆菌诸如结核分枝杆菌或牛分支杆菌的治疗过程例如药物治疗诸如疫苗治疗的过程的效力是有用的。

因此，在一方面，本发明提供确定抗MTBc分支杆菌药物(诸如抗结核分枝杆菌药物或抗牛分支杆菌药物)在药物治疗的时间段的过程内的效力的体外方法，包括：(a)在药物治疗期间之内或之前的第一时间点获得的第一样品上进行根据本发明的检测方法；(b)在药物治疗期间之内或之后的一个或多个稍后时间点获得的一个或多个样品上进行所述方法；和(c)比较检测的第一样品的扩增产物的量与检测的一个或多个稍后样品的扩增产物的量；和由此确定在药物治疗期间的过程中的药物效力。

在一个实施方式中，与检测的第一样品的扩增产物的量的相比，检测的一个或多个稍后样品的扩增产物的量的减少显示药物对MTBc分支杆菌的效力。

在另一方面，本发明对于确定疫苗对MTBc分支杆菌诸如结核分枝杆菌或牛分支杆菌的感染的效力是有用的。

因此，在一方面，本发明提供确定疫苗对MTBc分支杆菌的效力的体外方法，包括：(a)在接种疫苗之前的第一时间点从患者获得的第一样品上进行根据本发明的检测方法；(b)在接种疫苗之后并且用MTBc分支杆菌攻击之后的一个或多个稍后时间点从所述患者获得的样品上进行所述方法；和(c)比较检测的第一样品扩增产物的量与检测的一个或多个稍后样品扩增产物的量；和由此确定疫苗效力。

在一个实施方式中，与检测的第一样品扩增产物的量相比，检测的一个或多个稍后样品扩增产物的量的减少表明疫苗对MTBc分支杆菌感染(例如，结核分枝杆菌感染或牛分支杆菌感染)的效力。

本发明也提供用于本发明的以上描述的方法的试剂，诸如正向引物、反向引物、探针、它们的组合以及包括所述试剂的试剂盒。

在一个实施方式中，正向和/或反向寡核苷酸引物的序列不包括或由以下组成：全长MIRU重复元件的整个核酸序列，或其组合。

在一方面，本方面提供与位于MIRU重复元件内的靶核酸序列杂交的正向寡核苷酸引物。在一个实施方式中，所述靶核酸序列包括(或由以下组成)：与选自SEQ ID NOs：25-39的核苷酸序列的互补序列至少90％同一性(优选为91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)的核苷酸序列、或如以上所定义的其核苷酸片段。在一个实施方式中，所述靶核酸序列对于MTB复合群的分枝杆菌是特异的。

在一个实施方式中，正向引物包括(或由以下组成)与选自SEQ IDNOs：47或48的核苷酸序列具有至少80％同一性(优选为81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)的核苷酸序列。

在一个实施方式中，正向引物包括(或由以下组成)SEQ ID NOs：47或48的片段(或如以上定义的其序列变体)，其中所述片段包括其至少15个连续核苷酸。优选地是，所述片段包括其至少16、17、18、19、20或21连续核苷酸。

在一方面，本发明提供与位于MIRU重复元件内的靶核酸序列杂交的反向寡核苷酸引物。在一个实施方式中，所述靶核酸序列包括(或由以下组成)：与选自SEQ ID NOs：40-46的核苷酸序列至少90％同一性(优选为91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述靶核酸序列对于MTB复合群的分枝杆菌是特异的。

在一个实施方式中，反向引物包括(或由以下组成)与选自SEQ IDNOs：49-51的核苷酸序列具有至少80％同一性(优选为81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)的核苷酸序列，或如以上定义的其片段。

在一个实施方式中，反向引物包括(或由以下组成)SEQ ID NO：49、50或51的片段(或如以上定义的其序列变体)，其中所述片段包括其至少15个连续核苷酸。优选地是，所述片段包括其至少16、17、18或19个连续核苷酸。

在一个实施方式中，正向引物和/或反向引物包括如以上描述的标记或标签。

本发明进一步包括一对正向和反向寡核苷酸引物，其包括如上定义的正向引物和如上定义的反向引物。

本发明也提供检测样品中属于MTB复合群的分支杆菌的试剂盒，其包括如以上定义的一对正向和反向寡核苷酸引物。试剂盒任选地包括扩增MTB复合群特异的核酸序列的试剂。试剂盒任选地包括用于检测扩增产物的试剂。

在一个实施方式中，检测扩增产物的试剂包括如以上描述的寡核苷酸探针，其与所述扩增产物杂交。

在一个实施方式中，寡核苷酸探针的序列不包括以下或由以下组成：全长MIRU重复元件的完整的核酸序列，或其互补序列。

在一个实施方式中，所述探针包括(或以下组成)与选自SEQ IDNOs：52-57的核苷酸序列具有至少80％同一性(优选为至少85、90、95或100％同一性)的核苷酸序列，或具有其至少8或9个连续核苷酸的其片段。

在一个实施方式中，探针包括如以上定义的标记或标签。

在一个实施方式中，检测扩增产物的试剂包括消化如上描述的扩增产物的酶诸如限制性核酸内切酶(诸如HhaI)。

本发明通过以下描述的实施例和附图进行更详细地讨论。

图1图解在相同MIRU基因座处多至5个相邻MIRU重复元件的扩增，详述多个正向和反向引物靶序列以及包括跨越多至5个相邻MIRU重复元件的核酸序列的扩增产物的形成。

图2图解包括来自多个MIRU重复元件的核酸序列的多联体的扩增产物的生成。

图3和4图解解链曲线。相对于解链温度(Tm)测量荧光。阴性样品＝86℃解链，阳性样品＝92℃解链。图3是来自低显微术样品(lowmicroscopy sample)(每毫升痰约30-1000个细菌)的解链曲线，具有8个阳性解链。

图5图解实时PCR生成的产物的琼脂糖凝胶分析。泳道7图解约11kb的多联体。主要情况如下：

泳道 1 2 3 4 5 6 7 8

纯的 10^-6 10^-5 10^-4 阴性 10^-2 10^-1 阴性

Tm 92.6 86.5 92.9 93.2 86.2 92.6 92.6 86.11

Ct 16.7 34.6 33.2 30.1 36.0 23.7 20.3 35.1

图6图解(分块的(Block-based))痰扩增子的消化。主要情况如下：

泳道1＝痰a：1-10个杆菌Tb

泳道2＝痰b：＞90个杆菌Tb

泳道3＝痰c：＞90个杆菌Tb

泳道4＝痰d：1-10个杆菌Tb

泳道5＝海鱼分支杆菌(M.malmoense)(1-10个杆菌)

泳道6＝龟分支杆菌(M.chelonae)(10-90个杆菌)

泳道7＝H37R DNA

泳道8＝阴性

泳道9＝消化的PGem

泳道10＝痰b，未消化的

泳道11＝PGem，未消化的

图7图解痰扩增子的消化。主要情况如下：

泳道1＝痰6444

泳道2＝痰b

泳道3＝痰c

泳道4＝痰d

泳道5＝阴性(引物二聚体)

泳道6＝未消化的6444

泳道7＝消化的Pgem

泳道8＝未消化的PGem

图8图解低阳性显微术(low positive microscopy)痰样品的解链峰和扩增曲线数据(板包括50％阴性，50％阳性)：72℃退火1秒，上升速率1℃/s(没有延伸)。

图9图解相对于Tm的Ct(产物开始以足以检测的量积累的循环数)。

图10、11和12图解3个单独的分析中从低显微术阳性痰获得的解链曲线。

图13图解牛分支杆菌PCR产物的电泳。主要情况如下：

泳道1：低分子量梯状标准

泳道2：牛分支杆菌‘62’

泳道3：牛分支杆菌‘64’

泳道4：牛分支杆菌‘65’

泳道5：阴性对照

泳道6：Mtb阳性对照

泳道7：低分子量梯状标准

图14图解牛分支杆菌产物的限制性核酸内切酶消化。主要情况如下：

泳道1：低分子量梯状标准

泳道2：消化的牛分支杆菌‘62’

泳道3：未消化的牛分支杆菌‘62’

泳道4：消化的牛分支杆菌‘64’

泳道5：未消化的牛分支杆菌‘64’

泳道6：消化的牛分支杆菌‘65’

泳道7：未消化的牛分支杆菌‘65’

泳道8：消化的阴性对照

泳道9：未消化的阴性对照

泳道10：消化的Pgem载体对照

泳道11：未消化的Pgem载体对照

泳道12：低分子量梯状标准

图15图解显示具有约86℃的Tm的所有阴性对照和具有约93.5℃的阳性Tm的所有牛分支杆菌样品的解链曲线。

图16图解不同形式的牛分支杆菌组的解链曲线数据并且显示ct(产物开始以足以被检测的量积累的循环数)。

实施例

实施例1——结核分枝杆菌：扩增

痰样品由Newcastle Regional HPA laboratory和the Royal LondonHospital，UK友好赠送。

使用国家标准操作步骤方案处理痰。所有样品在III级实验室中的I类小操纵台内进行处理。1ml的痰加热至105℃持续10min，并且在从实验室移出之前，消毒试管外部。

以下引物由MWGEurofins Ltd.合成：

Mtb det反向：^5’CGC CGG CGA CGA TGC AGA GC^3’

Mtb det正向：^5’GGC GCC GCT CCT CCT CAT CGC T^3’

分块(block based)方法

PCR反应混合物由25μl ReadyMix^TM(终浓度：1.5U Taq聚合酶、10mM tris-HCl、50mM KCl、1.5mM MgCl₂、0.2mM dNTPs)(Sigma，UK)、5pmol反向引物、5pmol正向引物(MWGEurofins，UK)、200ng模板DNA或1μl的灭活痰以及不含核酸酶的水组成，总计50μl。

在Applied Biosystems 9700的热循环仪上的PCR循环参数如下：95℃持续12min，接着94℃持续30秒、64℃持续1分钟和72℃持续2分钟进行45个循环。

实时方法：

PCR反应混合物由10μl 2×Lightcycler 480 SYBR green I预制混合液(mastermix)(包含FastStart Taq聚合酶、dNTP混合物、SYBRgreenI染料和3.5mM MgCl₂)、0.5μM正向和0.5μM反向引物、5μl的模板DNA和不含核酸酶的水组合，总计20μl。

在Roche Lightcycler 480(LC480)上的PCR循环参数如下：95℃持续12min，然后95℃持续10秒、64℃持续1秒和72℃持续1分钟进行45个循环。温度上升(ramping)速率分别是4.4、2.2和4.4℃/s。

可选的PCT循环参数不包括分开的退火温度：在95℃持续12分钟的初始变性(4.4℃/s上升)后，实时循环参数是95℃持续10秒和72℃持续1秒进行45个循环；温度上升速率为每秒1℃。

实施例2——结核分枝杆菌：PCR产物的分析

分块(block based)分析

PCR产物通过在1.5％(w/v)琼脂糖凝胶(Invitrogen，UK)中进行电泳来分析。凝胶在200ml的1×TBE缓冲液(Invitrogen)中用20μl的SYBR green I核酸凝胶染色(10,000×；Sigma Aldrich，UK)染色30分钟，并且通过紫外照射(BioRad)可视化。

由于重复元件的性质，引物产生在凝胶上形成大的非特异性成片条带(smear)的扩增产物。

如在图1中图解，扩增产物可以源于单个MIRU重复元件(如果在相同的重复元件内两个引物都结合)，在这种情况下扩增产物为约44bp。

可选地，扩增产物可以是源自相同基因座内的数个相邻的MIRU重复元件，在这种情况下扩增产物可以是约680bp(对于具有13个拷贝的元件的基因座)。

然而，通过琼脂糖凝胶电泳判断，存在大得多的产物/多联体的扩增的证据。假设反应中的早期产物作为另外的引物，允许形成较大的产物(＞12Kb)，如在图2中图解。

如此，产物通过各种方法被进一步表征。

返回到图5，凝胶图片显示超过11kb的多联体。在用Hhal消化后，这种巨大的产物断裂成为预测的小的片段——参见图6和7。

阴性样品(引物二聚体)形成大约40bp大小的带。产物大小通过与1kb梯状标准(Promega，UK)直接比较确定。

实时分析

扩增曲线通过源自LC480软件的Absolute Quantification/2^ndDerivative Max方法分析。解链曲线分析使用LC480软件内的负一阶导数(-dF/dT)方法自动进行。

解链曲线方案是：99℃持续10秒、55℃持续20秒，最后再次加热到99℃，每℃获取5个数据。温度上升速度分别是4.4和2.2℃/s。

在图3、4、8和10-12中图解的结果是来自不同痰样品。结果显示阴性(引物二聚体)在大约86℃解链，而扩增产物在大约91℃解链。

图9中的表代表不同形式的解链曲线数据并且表明ct(产物开始以足以被检测的量积累的循环数)。

实施例3——牛分支杆菌：扩增

大约200ng提取的牛分支杆菌DNA用作以下实时PCR中的模板。

以下引物由MWGEurofins Ltd.合成：

Mtb det反向：^5’CGC CGG CGA CGA TGC AGA GC^3’

Mtb det正向：^5’GGC GCC GCT CCT CCT CAT CGC T^3’

实时方法：

PCR反应混合物由10μl 2×Lightcycler 480 SYBR green I预制混合物(包含FastStart Taq聚合酶、dNTP混合物、SYBR green I染料和3.5mM MgCl₂)、0.5μM正向和0.5μM反向引物、200ng的模板DNA和无核酸酶的水组成，总计20μl。

在Roche Lightcycler 480(LC480)上使用的可选PCR循环参数如下：95℃持续12分钟，接下来，95℃持续10秒和72℃持续1秒，进行45个循环。温度上升速度分别是4.4℃和1.0℃/s。

实施例4——牛分支杆菌：PCR产物的分析

PCR产物通过在2.0％EGel(Invitrogen，UK)中的电泳(65V持续30min)进行分析。凝胶通过紫外线照射(BioRad)可视化。

阴性样品(引物二聚体)形成大小约40bp的带。

由于重复元件的性质，引物生成在凝胶上形成大的非特异性成片条带的扩增产物(参见图13)。扩增产物表现为与如通过琼脂糖凝胶电泳判断的一样大的多联体。假设反应中的早期产物作为另外的引物，允许大得多的(＞12Kb)的产物形成。

PCR产物通过各种方法进一步地表征。返回图14，凝胶图片显示每个未消化的牛分支杆菌PCR产物为超过11kb的多联体。在用Hhal消化后，这种巨大的产物断裂成为预测的小片段。

实时分析

解链曲线方案是：99℃持续10秒、55℃持续20秒，最后再次加热到99℃，每℃获取5个数据。温度上升速度分别是4.4℃和2.2℃/s。

在图15中图解的结果来自牛分支杆菌的样品。它们显示显示阴性(引物二聚体)在大约86℃解链，而扩增产物在大约93.5℃解链。

图15中图解的结果如下显示为单独的解链温度：

牛分支杆菌组要求的Tm(解链温度)

位置名称 Tm1 Tm2

A1 牛分支杆菌 62 93.74

A2 牛分支杆菌 62 94.23

A3 牛分支杆菌 64 93.63

A4 牛分支杆菌 65 93.65

A5 纯的牛分支杆菌 65 93.10

A6 Mtb阳性对照 93.11

B1 牛分支杆菌 62 93.58

B2 牛分支杆菌 62 93.47

B3 牛分支杆菌 64 93.57

B4 牛分支杆菌 65 93.45

B5 阴性对照 85.96

B6 Mtb阳性对照 93.79

C1 牛分支杆菌 62 93.63

C2 牛分支杆菌 64 93.62

C3 牛分支杆菌 64 93.24

C4 牛分支杆菌 65 93.51

C5 阴性对照 85.76

D1 牛分支杆菌 62 93.69

D2 牛分支杆菌 64 93.23

D3 牛分支杆菌 64 86.19

D4 牛分支杆菌 65 93.54

D5 阴性对照 85.92

E1 牛分支杆菌 62 93.59

E2 牛分支杆菌 64 93.97

E3 牛分支杆菌 65 93.72

E4 牛分支杆菌 65 93.85

E5 阴性对照 85.89

F1 牛分支杆菌 62 93.56

F2 牛分支杆菌 64 93.20

F3 牛分支杆菌 65 93.48

F4 牛分支杆菌 65 93.44

F5 阴性对照 85.85

G1 牛分支杆菌 62 93.63

G2 牛分支杆菌 64 93.10

G3 牛分支杆菌 65 93.36

G4 纯的牛分支杆菌 62 92.94

G5 阴性对照 85.76

H1 牛分支杆菌 62 93.76

H2 牛分支杆菌 64 93.18

H3 牛分支杆菌 65 93.93

H4 纯的牛分支杆菌 64 N/A

H5 阴性对照 86.10

图16中的表代表不同形式中的牛分支杆菌组的解链曲线数据并且表明ct(产物开始以足以被检测的积累的循环数)。

参考文献：

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Claims

1.正向和反向寡核苷酸引物对在用于制备检测样品中属于MTB复合群的分支杆菌的核酸的试剂中的应用，

其中所述正向和反向寡核苷酸引物的长度为18-30个核苷酸；

其中所述正向寡核苷酸引物与位于分支杆菌散布重复单元(MIRU)重复元件内的靶核酸序列杂交，其中所述靶核酸序列是选自SEQNOs：25、27-30和34-39的核苷酸序列的互补序列；并且

其中所述反向寡核苷酸引物与位于分支杆菌散布重复单元(MIRU)重复元件内的靶核酸序列杂交，其中所述靶核酸序列选自SEQNOs：40、41和43-46；

并且其中，在杂交后，所述正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物可被延伸以生成可检测的扩增产物。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述靶核酸序列位于MIRU重复元件内，所述MIRU重复元件选自MIRU2重复元件、MIRU10重复元件、MIRU16重复元件、MIRU23重复元件、MIRU24重复元件、MIRU26重复元件、MIRU27重复元件、MIRU31重复元件和MIRU39重复元件。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述正向寡核苷酸引物为20-24个核苷酸长并且包括选自下列的核苷酸序列：

SEQ NOs：25、27-30、34-39、47或48。

4.根据权利要求3所述的应用，其中所述正向寡核苷酸引物包括SEQ ID NO：47的核苷酸序列。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述反向寡核苷酸引物为18-22个核苷酸长并且包括选自下列的核苷酸序列：

(i)SEQ NOs：40、41和43-46的互补序列；或

(ii)SEQ NOs：49-51。

6.根据权利要求5所述的应用，其中所述反向寡核苷酸引物包括SEQ ID NO：49的核苷酸序列。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物能够通过互补碱基配对彼此杂交以形成引物二聚体。

8.根据权利要求1或2所述的应用，其中：

(i)所述正向寡核苷酸引物具有SEQ ID NO：47的核苷酸序列；和

(ii)所述反向寡核苷酸引物具有SEQ ID NO：49的核苷酸序列。

9.根据权利要求1或2所述的应用，其中如果所述正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物与位于相同分支杆菌散布重复单元(MIRU)重复元件内的靶核酸序列杂交，则所述引物的延伸产生30-55个核苷酸长的可检测扩增产物。

10.根据权利要求9所述的应用，其中所述可检测扩增产物为44个核苷酸长。

11.根据权利要求1或2所述的应用，其中如果所述正向寡核苷酸引物和所述反向寡核苷酸引物与位于相同MIRU基因座内不同分支杆菌散布重复单元(MIRU)重复元件内的靶核酸序列杂交，则所述引物的延伸产生可检测的扩增产物，其包括来自所述相同MIRU基因座内的两个或更多个邻近MIRU重复元件的核酸序列。

12.根据权利要求1或2所述的应用，其中如果所述正向寡核苷酸引物和所述反向寡核苷酸引物与位于不同MIRU基因座内靶核酸序列杂交，则所述引物的延伸产生可检测的扩增产物，其包括来自所述不同MIRU基因座内的两个或更多个MIRU重复元件的核酸序列。

13.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述正向寡核苷酸引物和所述反向寡核苷酸引物可以延伸以产生多联体扩增产物，其包括来自相同或不同MIRU基因座的多个MIRU重复元件的多联体。

14.根据权利要求13所述的应用，其中所述多联体扩增产物超过2kb长。

15.根据权利要求13所述的应用，其中所述多联体扩增产物超过11kb长。

16.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述正向寡核苷酸引物和/或所述反向寡核苷酸引物包括标记或标签。

17.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述试剂进一步包括寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针与所述扩增产物杂交，其中所述寡核苷酸探针为5-30个核苷酸长。

18.根据权利要求17所述的应用，其中所述寡核苷酸探针为8-12个核苷酸长并且包括选自SEQ ID NOs：52-55和57的核苷酸序列。

19.根据权利要求17所述的应用，其中所述寡核苷酸探针包括标记或标签。

20.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述样品是临床样品。

21.根据权利要求20所述的应用，其中所述样品是痰样品。

22.正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物对，包括：

(i)正向寡核苷酸引物，其为18-30个核苷酸长并且在高特异性结合条件下与位于MIRU重复元件内的靶核酸序列杂交，其中所述靶核酸序列是选自SEQ ID NOs：25、27-30、和34-39的核苷酸序列的互补序列；和

(ii)反向寡核苷酸引物，其为18-30个核苷酸长并且在高特异性结合条件下与位于MIRU重复元件内的靶核酸序列杂交，其中所述靶核酸序列选自SEQ ID NOs：40、41和43-46。

23.根据权利要求22所述的正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物对，其中所述正向寡核苷酸引物为20-24个核苷酸长并且包括选自如下的核苷酸序列：SEQ ID NO：25、27-30、34-39、47或48。

24.根据权利要求23所述的正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物对，其中所述正向寡核苷酸引物包括SEQ ID NO：47的核苷酸序列。

25.根据权利要求22-24任一项所述的正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物对，其中所述反向寡核苷酸引物为18-22个核苷酸长并且包括选自下述的核苷酸序列：

(i)SEQ ID NOs：40、41和43-46的互补序列；或

(ii)SEQ ID NOs：49-51。

26.根据权利要求25所述的正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物对，其中所述反向寡核苷酸引物包括SEQ ID NO：49的核苷酸序列。

27.根据权利要求24或26所述的正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物对，其中所述正向引物包括SEQ ID NO：47的核苷酸序列，并且其中所述反向引物包括SEQ ID NO：49的核苷酸序列。

28.根据权利要求22所述的正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物对，其中所述引物对能够通过互补碱基配对彼此杂交。

29.检测样品中属于MTB复合群的分支杆菌的核酸的试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求22-28任一项所述的正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物对、扩增MTB复合体特异的核酸序列的试剂和/或检测扩增产物的试剂。

30.根据权利要求29所述的试剂盒，其中检测所述扩增产物的所述试剂包括与所述扩增产物杂交的寡核苷酸探针。

31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述探针为8-12个核苷酸长并且包括选自SEQ ID NOs：52-55和57的核苷酸序列。

32.根据权利要求29-31任一项所述的试剂盒，其中检测所述扩增产物的所述试剂包括消化所述扩增产物的酶。