JPWO2005001097A1 - Sarsコロナウイルスの検出法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)配列番号1で示されるSARSコロナウイルスのRNAポリメラーゼ塩基配列の、41番〜256番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
(2)SARSコロナウイルスのRNAポリメラーゼ塩基配列から選ばれた配列番号2〜13で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する15塩基を含む(1)記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(3)SARSコロナウイルスの標的核酸上の3’末端側からF3c、F2c、F1cという塩基配列領域を、5’末端側からR3、R2、R1という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をF3、F2、F1、そしてR3c、R2c、R1cとしたときに、以下の(a)〜(d)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする(1)〜(2)記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)標的核酸のF2領域を3’末端側に有し、5’末端側に標的核酸のF1c領域を有する塩基配列。
(b)標的核酸のF3領域を有する塩基配列。
(c)標的核酸のR2領域を3’末端側に有し、5’末端側に標的核酸のR1c領域を有する塩基配列。
(d)標的核酸のR3領域を有する塩基配列。
(4)SARSコロナウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、5’末端から3’末端に向かい以下の(e)〜(h)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする(1)〜(3)記載のオリゴヌクレオチプライマー。
(e)5’−(配列番号2の塩基配列に相補的な塩基配列)−(塩基数0〜50の任意の塩基配列)−(配列番号3の塩基配列)−3’
(f)5’−(配列番号5の塩基配列)−(塩基数0〜50の任意の塩基配列)−(配列番号6の塩基配列に相補的な塩基配列)−3’
(g)5’−(配列番号8の塩基配列に相補的な塩基配列)−(塩基数0〜50の任意の塩基配列)−(配列番号9の塩基配列)−3’
(h)5’−(配列番号11の塩基配列)〜(塩基数0〜50の任意の塩基配列)−(配列番号12の塩基配列に相補的な塩基配列)−3’
(5)(1)〜(4)記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、SARSコロナウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするSARSコロナウイルスの検出方法。
(6)SARSコロナウイルスの標的核酸領域の増幅反応がLAMP法であることを特徴とする(5)記載のSARSコロナウイルスの検出方法。
(7)(1)〜(4)記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてSARSコロナウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、SARSコロナウイルス感染の有無を診断することを特徴とする重症急性呼吸器症候群の診断方法。
(8)重症急性呼吸器症候群の診断方法において、(1)〜(4)記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
以下、本発明を詳細に説明する。
(プライマーセットA)
IPF−A:5’−TACATCAAAGCCAATCCACGCAATATGTTTATCACCCGCGAAGA−3’ (配列番号14)
OPF−A:5’−ACCAAGTCAATGGTTACCCT−3’ (配列番号4)
IPR−A:5’−
GCTGTCATGCAACTAGAGATGCTACAGCTACTAAGTTAACACCTG−3’ (配列番号15)
OPR−A:5’−GTGTCAACATAACCAGTCGG−3’ (配列番号16)
LPF−A:5’−ACGAACGTGACGAATAGCT−3’ (配列番号20)
LPR−A:5’−GTACTAACCTACCTCTCCAGC−3’ (配列番号21)
(プライマーセットB)
IPF−B:5’−TGCATGACAGCCCTCGAAGAAGCTATTCGTCAC−3’ (配列番号17)
OPF−B:5’−CTAATATGTTTATCACCCGC−3’ (配列番号10)
IPR−B:5’−GCTGTGGGTACTAACCTACCTGTCAACATAACCAGTCGG−3’ (配列番号18)
OPR−B:5’−CTCTGGTGAATTCTGTGTT−3’ (配列番号19)
LPF−B:5’−AAAGCCAATCCACGC−3’ (配列番号22)
LPR−B:5’−CCAGCTAGGATTTTCTACAGG−3’ (配列番号23)
核酸合成で使用する酵素や逆転写酵素は、ウイルスや細菌などから精製されたものでも良く、遺伝子組み換え技術によって作製されたものでも良い。またこれらの酵素はフラグメント化やアミノ酸の置換などの改変をされたものでも良い。
実施例1.検出感度の確認
LAMP法と、PCR法との検出感度の比較を行った。
1.試料及び試薬の調製
1)試料
SARSコロナウイルスのRNAポリメラーゼの配列より選ばれた配列番号1のRNAをYeast RNA(Ambion社製)溶液(50ng/μL)に溶解し、1μLあたり10コピーから104コピーまでの希釈液と、2.5、5、10コピーの希釈液を作製し、試料溶液とした。また同Yeast RNA溶液を0コピーの試料溶液とした。
PCR法で使用するSARSコロナウイルス検出用プライマーとして、RNAポリメラーゼゲノムの195bpを増幅する配列番号24および25で示される塩基配列からなる2種類のプライマーを使用した、非特許文献4記載の方法に準じて行った。
cDNAの合成反応溶液組成
・5×First Strand Buffer(Invitrogen) 4μL
・10mM dNTPs 1μL
・0.1M DTT 2μL
・Random primer(50ng/μl,TAKARA) 1μL
・RNase Inhibitor(40U/μl,Invitrogen) 1μL
・SuperScriptII(200U/μl,Invitrogen) 1μL
・Distilled water 5μL
・試料溶液 5μL
PCR反応溶液組成
・10×Ex Taq buffer(Mg free)(TAKARA) 5μL
・25mM MgCl2 4μL
・2.5mM dNTPs 4μL
・10pmol/μLプライマー 各1μL
・Ex Taq(5U/μL,TAKARA) 0.5μL
・Distilled water 33.5μL
・cDNA合成溶液 1μL
プライマーセットAを用いたLAMP法による増幅のため、最終反応溶液25μL中の各試薬濃度が下記になるよう調製した。
反応溶液組成
・20mM Tris−HCl pH8.8
・10mM KCl
・8mM MgSO4
・1.4mM dNTPs
・10mM(NH4)2SO4
・0.8M Betaine(Sigma)
・0.1% Tween20
・1.6μM IPF及びIPR
・0.2μM OPF及びOPR
・0.8μM LPF及びLPR
・AMV Reverse Transcriptase 0.625U(Invitrogen)
・Bst DNA polymerase 8U(New England Biolabs)
・0.25μg/mL EtBr(ニッポンジーン)
プライマーセットBを用いた反応ではAMV Reverse Transcriptase 0.625Uに代えてCloned AMV Reverse Transcriptase(Invitrogen)2Uを用いた。
1)PCR法による反応
cDNA合成反応は、標的配列0または10〜103コピーを含む試料溶液5μLを上記のcDNA合成反応溶液に加え、42℃50分その後70℃15分で行った。PCR反応は、上記PCR反応溶液に、cDNA合成した溶液1μLを加え、最終反応溶液50μLとし、0.2mLの専用チューブ内でサーマルサイクラーPTC−200(MJリサーチ社製)を用い、熱変性95℃30秒、アニーリング56℃30秒、ポリメラーゼ伸長反応72℃30秒を1サイクルとして計40サイクル行った。所要時間は約1時間だった。反応終了後の反応溶液5μLを2%アガロースゲルで電気泳動を行った。
2)LAMP法による反応
プライマーセットAを用いたLAMP用試薬に、標的配列0または10〜103コピーを含む試料溶液1μLを加え、最終反応溶液25μLとし、0.2mLの専用チューブ内で、63℃で60分LAMP反応を行った。反応終了後の反応溶液5μLを2%アガロースゲルで電気泳動を行った。
3.電気泳動法による各増幅反応の検出感度の比較結果
PCR法の電気泳動の結果を図1に、プライマーセットAを用いたLAMP法の電気泳動の結果を図2に示す。その結果、PCR法、LAMP法とも増幅産物の確認ができた。PCR法では、102コピーまでは195bpの特異的バンドが明瞭に認められたが、10コピーでは薄いバンドとして観察された。これに対しLAMP法では、10コピーまで特異的増幅のラダー状のバンドを確認することができた。
プライマーセットAを用いたLAMP法の検出時間の検討は、実施例1.のLAMP法の組成25μLを用い、リアルタイム蛍光測定装置PRISM 7700(Applied Biosystems社製)によって反応温度を63℃に固定して行った。図3に結果を示す。
この結果、0コピーでは60分でも蛍光の増加は見られず、10コピー以上では20分以内に蛍光の増加が確認され、20分で10コピーの存在を検出できた。
プライマーセットBを用いたLAMP法の検出時間の検討は、リアルタイム濁度測定装置LA−200(テラメックス社製)を用いてリアルタイム濁度測定法によって行った。実施例1.のLAMP法の組成25μLを用い、反応温度を63℃に固定して行った。図4に結果を示す。
この結果、0コピーでは60分でも濁度の増加は見られず、2.5コピー以上では35分以内に濁度の増加が確認され、35分で2.5コピーの存在を検出できた。
Claims (8)
- 配列番号1で示されるSARSコロナウイルスのRNAポリメラーゼ塩基配列の、41番〜256番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
- SARSコロナウイルスのRNAポリメラーゼ塩基配列から選ばれた配列番号2〜13で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する15塩基を含む請求項1記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
- SARSコロナウイルスの標的核酸上の3’末端側からF3c、F2c、F1cという塩基配列領域を、5’末端側からR3、R2、R1という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をF3、F2、F1、そしてR3c、R2c、R1cとしたときに、以下の(a)〜(d)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項1〜2記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(a)標的核酸のF2領域を3’末端側に有し、5’末端側に標的核酸のF1c領域を有する塩基配列。
(b)標的核酸のF3領域を有する塩基配列。
(c)標的核酸のR2領域を3’末端側に有し、5’末端側に標的核酸のR1c領域を有する塩基配列。
(d)標的核酸のR3領域を有する塩基配列。 - SARSコロナウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、5’末端から3’末端に向かい以下の(e)〜(h)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項1〜3記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
(e)5’−(配列番号2の塩基配列に相補的な塩基配列)−(塩基数0〜50の任意の塩基配列)〜(配列番号3の塩基配列)−3’
(f)5’−(配列番号5の塩基配列)−(塩基数0〜50の任意の塩基配列)−(配列番号6の塩基配列に相補的な塩基配列)−3’
(g)5’−(配列番号8の塩基配列に相補的な塩基配列)−(塩基数0〜50の任意の塩基配列)−(配列番号9の塩基配列)−3’
(h)5’−(配列番号11の塩基配列)−(塩基数0〜50の任意の塩基配列)−(配列番号12の塩基配列に相補的な塩基配列)−3’ - 請求項1〜4記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、SARSコロナウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするSARSコロナウイルスの検出方法。
- SARSコロナウイルスの標的核酸領域の増幅反応がLAMP法であることを特徴とする請求項5記載のSARSコロナウイルスの検出方法。
- 請求項1〜4記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてSARSコロナウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、SARSコロナウイルス感染の有無を診断することを特徴とする重症急性呼吸器症候群の診断方法。
- 重症急性呼吸器症候群の診断方法において、請求項1〜4記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
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