TWI723675B

TWI723675B - 用於檢測登革熱病毒的方法以及套組

Info

Publication number: TWI723675B
Application number: TW108145591A
Authority: TW
Inventors: 潘永歷; 張憲彰; 王憲威; 彭貴春; 顏克倫; 俊義劉
Original assignee: 國立成功大學
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2019-12-12
Publication date: 2021-04-01
Also published as: TW202122797A

Abstract

本發明揭示一種套組，其包括分別用於檢測登革熱病毒血清型1至4的四種血清型-特異性引子組中的至少一者，以及用於檢測登革熱病毒的一種物種-特異性引子組。本發明亦揭示一種使用該等引子組中的至少一者來檢測存在於一生物樣品中之登革熱病毒的方法。

Description

用於檢測登革熱病毒的方法以及套組

本發明是有關於一種用於檢測登革熱病毒(DENV)的套組。本發明亦是有關於一種使用該套組來檢測存在於一生物樣品中之DENV的方法。

登革熱病毒(Dengue virus,DENV)是黃病毒屬(Flavivirus)的一成員，它主要是經由蚊媒介埃及斑蚊(Aedes aegypti)來傳播。DENV是一種具有一長度約為10.7kb之基因組的正鏈單股RNA病毒(positive-sense single-stranded RNA virus)，可編碼轉譯出三個結構性蛋白(structural proteins)[亦即，核鞘蛋白質(nucleocapsid protein)(C)、膜前驅蛋白質(membrane precursor protein)(prM)，以及外套蛋白質(envelope protein)(E)]以及七個非-結構性(NS)蛋白[non-structural(NS)proteins](亦即，NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B以及NS5)。目前已有四種抗原-可辨識的DENV血清型

(antigenically-distinguishable DENV serotypes)[亦即DENV-1、DENV-2、DENV-3以及DENV-4]，而各種血清型包括在種系上(phylogenetically)不同的基因型。據估計，每年有超過300百萬人被DENV感染，特別是在熱帶與亞熱帶地區，諸如非洲、亞洲、太平洋、澳洲，以及美洲。

這四種血清型中之任一者的感染會產生一連串的臨床疾病，從輕度的登革熱(dengue fever,DF)到嚴重且致命的登革出血熱(dengue hemorrhagic fever,DHF)以及出血性休克症候群(hemorrhagic shock syndrome,DSS)。DENV感染的症狀包括高燒、嚴重的頭痛、嚴重的關節、肌肉以及骨的疼痛、皮疹(rash)、持續嘔吐、嚴重的腹部疼痛，以及出血性表現(hemorrhagic manifestations)，諸如腹水(ascites)、胸膜積水(pleural effusions)、內臟出血(bleeding of internal organs)或出血性休克(hemorrhagic shock)。

已被注意到的是，一種血清型的感染會導致對抗同型的再感染(homotypic reinfection)之終身保護，但在對抗異型的感染(heterotypic infection)上只有暫時的交叉保護(cross-protection)。已有研究顯示異型的續發感染(heterotypic secondary infection)與罹患DHF以及DSS的高風險有關聯。因此，提供一種用於快速、靈敏並且有效地檢測或鑑定DENV的方法是重要的，這對於病患的管理以及立即的媒介控制措施是有益的，俾以防止一大規模的流行(large-scale epidemic)。

用於檢測DENV的傳統方法[諸如血清學的診斷(serological diagnosis)，以及培養、生理學或生物化學的鑑定]是相當耗費時間的。現今，用以檢測病毒基因組RNA序列的分子技術[例如，憑藉反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、定量即時RT-PCR(quantitative real-time RT-PCR,qRT-PCR)、RT-環媒介等溫擴增反應(RT-loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)等]已逐漸地被接受作為用於檢測DENV的新標準技術。

已有報導指出DENV的血清型-特異性區域(serotype-specific regions)[諸如3’-非轉譯區(3’-untranslated region,3’-UTR)]已被使用作為用於診斷以及流行病學研究的擴增標的。例如，Teoh B.T.等人基於DENV基因組的3’-UTR而設計出一組9條DENV-特異性引子(DENV-specific primers)，而這些引子可被用於RT-LAMP分析，以供檢測在臨床樣品中的所有4種DENV血清型以及它們的不同基因型(Teoh B.T.et al.(2013),BMC Infectious Diseases,13：387)。

此外，Hu S.F.等人揭示四組用於RT-LAMP以標靶不同DENV血清型的血清型-特異性引子組(serotype-specific primer sets)(每組包括6條引子)，該等引子組分別是藉由檢驗DENV-1的非-結構性蛋白(NS)2A、DENV-2的NS4B、DENV-3的NS4A以及DENV-4的3’-UTR的多重序列比對(multiple sequence alignments)而被設計出。檢測結果顯示，沒有觀察到四種血清型的交叉反應(cross-reaction)，這表示所設計出的引子組是適用於對DENV進行血清型分類(serotyping)(Hu S.F.et al.(2015),BMC Microbiology,15：265)。

雖然已存在有上述文獻報導，本領域的相關研究人員仍在努力尋找更令人滿意的核酸，以用於快速且準確的檢測DENV，以及區分(differentiation)登革熱病毒血清型1至4。

發明概要

於是，在第一個方面，本發明提供一種用於檢測存在於一生物樣品中之登革熱病毒(DENV)的方法，其可以減少先前技術中的至少一個缺點。該方法包括：令該生物樣品中的核酸進行一種使用一反應混合物的核酸擴增反應，該反應混合物包括至少一用於擴增登革熱病毒的一目標核酸之引子組；以及檢測一得自於該核酸擴增反應的擴增產物的存在與否，其中該擴增產物之存在表示在該生物樣品中有登革熱病毒之存在；該至少一引子組是選自於由下列所構成的群組：(a)一用於擴增登革熱病毒血清型1(DENV-1)的NS5基因中之一區域的第一血清型-特異性引子組，該第一血清型-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：1所示的核苷酸序列之第一前向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：2所示的核苷酸序列之第一反向外部引子；(b)一用於擴增登革熱病毒血清型2(DENV-2)的NS5基因中之一區域的第二血清型-特異性引子組，該第二血清型-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之第二前向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：8所示的核苷酸序列之第二反向外部引子；(c)一用於擴增登革熱病毒血清型3(DENV-3)的NS5基因中之一區域的第三血清型-特異性引子組，該第三血清型-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：13所示的核苷酸序列之第三前向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：14所示的核苷酸序列之第三反向外部引子；(d)一用於擴增登革熱病毒血清型4(DENV-4)的NS5基因中之一區域的第四血清型-特異性引子組，該第四血清型-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：19所示的核苷酸序列之第四前向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：20 所示的核苷酸序列之第四反向外部引子；以及(e)一用於擴增登革熱病毒的3’ UTR中之一區域的物種-特異性引子組，該物種-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：25所示的核苷酸序列之第五前向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：26所示的核苷酸序列之第五反向外部引子。

在第二個方面，本發明提供一種用於檢測登革熱病毒(DENV)的套組，其可以減少先前技術中的至少一個缺點。該套組包含有上面所述之用於擴增登革熱病毒的一目標核酸的引子組中的至少一者。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中：圖1顯示使用血清型-特異性引子組1的反轉錄環媒介等溫擴增反應(RT-LAMP)之DENV血清型1的檢測，其中：上圖是RT-LAMP反應產物的凝膠電泳分析結果的一數位影像，其中膠徑M=250-10000bp大小的標記，以及膠徑NTC=無模版對照(水)；以及下圖是使用酚紅的比色分析結果的一數位影像；圖2顯示使用血清型-特異性引子組2的RT-LAMP之DENV血清型2的檢測，其中：上圖是RT-LAMP反應產物的凝膠電泳分析結果的一數位影像，其中膠徑M=250-10000bp大小的標記，以及膠徑NTC=無模版對照(水)；以及下圖是使用酚紅的比色分析結果的一數位影像；圖3顯示使用血清型-特異性引子組3的RT-LAMP之DENV血清型3的檢測，其中：上圖是RT-LAMP反應產物的凝膠電泳分析結果的一數位影像，其中膠徑M=250-10000bp大小的標記，以及膠徑NTC=無模版對照(水)；以及下圖是使用酚紅的比色分析結果的一數位影像；圖4顯示使用血清型-特異性引子組4的RT-LAMP之DENV血清型4的檢測，其中：上圖是RT-LAMP反應產物的凝膠電泳分析結果的一數位影像，其中膠徑M=250-10000bp大小的標記，以及膠徑NTC=無模版對照(水)；以及下圖是使用酚紅的比色分析結果的一數位影像；以及圖5顯示使用物種-特異性引子組的RT-CAMP之DENV的通用檢測，其中：上圖是RT-CAMP反應產物的凝膠電泳分析結果的一數位影像，其中膠徑M=100-3000bp大小的標記，以及膠徑NTC=無模版對照(水)；以及下圖是使用酚紅的比色分析結果的一數位影像。

發明的詳細說明

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。為表清楚，下面的界定被使用於本文中。

如本文中所用的，“核酸”、“核酸序列”與“核苷酸序列”等術語意指一藉由磷酸二酯鍵聯(phosphodiester linkages)而被連結之核苷酸的序列，並且可以是一個呈單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸(DNA)分子或核糖核苷酸(RNA)分子。該核酸可以包含有天然存在的核苷酸(naturally occurring nucleotides)及其已知的類似物(analogues)，以及在糖和/或磷酸部分上被修飾的核苷酸。這個術語亦涵括含有經修飾的主鏈殘基(backbone residues)或鍵聯(linkages)的核酸，該等核酸是合成的、天然存在的(naturally occurring)以及非天然存在的，該等核酸具有如同參考核酸之相似的結合性質，且該等核酸以一相似於參考核苷酸的方式被代謝。如本文中所用的，術語“核酸”與術語“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸(oligo-nucleotide)”以及“聚核苷酸(polynucleotide)”可被交換地使用。

如本文中所用的，術語“DNA片段”意指一種DNA聚合物(DNA polymer)，該DNA聚合物是呈一獨立節段(separate segment)的形式或者是作為一較大的DNA建構物(DNA construct)的一組分(component)，其可以是衍生自經分離的DNA(isolated DNA)或是諸如藉由在別處所揭示的方法而被化學地或酵素地合成。

除非另有指明，一核酸序列除了於本文中所揭示的特定序列外，亦涵蓋其互補序列(complementary sequences)，以及它們的守恆性類似物(conservative analogs)、相關的自然存在的結構變異體和/或合成的非天然存在的類似物。

除非另有指明，每當表示一核酸序列時，將被瞭解的是，核苷酸從左到右是呈5’至3’的順序，而“A”表示去氧腺苷(deoxyadenosine)或其類似物，“C”表示去氧胞苷(deoxycytidine)或其類似物，“G”表示去氧鳥苷 (deoxyguanosine)或其類似物，以及“T”表示去氧胸苷(deoxythymidine)或其類似物。

術語“3’”意指在一聚核苷酸或寡核苷酸中的一個區域(region)或位置(position)是要比同一聚核苷酸或寡核苷酸的另一個區域或位置更加3’的[亦即，下游(downstream)]。術語“5’”意指在一聚核苷酸或寡核苷酸中的一個區域或位置是要比同一聚核苷酸或寡核苷酸的另一個區域或位置更加5’的[亦即，上游(upstream)]。如此處用於一核酸分子的術語“3’-端(3’-end)”與“3’-末端(3’-terminus)”意指該核酸的末端，其包含有一接附至末端五碳醣(terminal pentose sugar)之3’碳上的自由羥基(free hydroxyl group)。如此處用於一核酸分子的術語“5’-端(5’-end)”與“5’-末端(5’-terminus)”意指該核酸的末端，其包含有一接附至末端五碳醣之5’碳上的自由羥基或磷酸基(free hydroxyl or phosphate group)。

如本文中所用的，術語“引子(primer)”意指一限定序列的寡核苷酸，其是被設計用於與一目標聚核苷酸序列(target polynucleotide sequence)之互補的(complementary)、引子-特異性的(primer-specific portion)部分雜交並且進行引子延伸反應(primer extension)。該引子可以作用為使用一聚合酶(polymerase)來進行之核苷酸的酶聚合(enzymatic polymerization)之起始點。該引子的長度應足以防止其自身黏合(annealing)至互補部分以外的序列。通常地，該引子的長度是介於10至50個核苷酸之間。較佳地，該引子的長度是介於13至30個核苷酸之間。

本文中所用的引子亦可被用於核酸擴增反應(nucleic acid amplification)。如本文中所用的，術語“擴增反應(amplification)”可以意指一目標序列(target sequence)[諸如一基因或一基因的片段(fragment)]或該目標序列的一互補序列的複本數目的一增加。一“複本(copy)”或“擴增產物(amplicon)”不一定意味著與模版序列(template sequence)具有完美的序列互補性(complementarity)或相同性(identity)。例如，複本可以包括諸如次黃嘌呤核苷(deoxyinosine)的核苷酸類似物(nucleotide analogs)、有意圖的序列改變(intentional sequence alterations)(諸如經由一引子導入的序列改變，該引子包括一可雜交但不互補於模版的序列)，和/或在擴增反應的過程中發生的序列錯誤(sequence errors)。而一擴增反應的產物被稱為擴增產物(amplification products)。

該核酸擴增反應可以使用本領域已知的任何方法來進行，例如，一在擴增反應的過程中採用多個熱循環(heat cycles)的方法，或一在一恆定溫度(constant temperature)下所進行的方法 [亦即，等溫擴增反應(isothermal amplification)]。需要熱循環之活體外擴增反應(in vitro amplification)的一個實例是聚合酶鏈反應(PCR)，其中令一樣品(諸如一來自於一個體的生物樣品)與一對寡核苷酸引子接觸，並且在允許該等引子雜交至該樣品中的一核酸分子的條件下進行。該等引子在合適的條件下被延伸，從模版中被分離(dissociated)，然後被重新黏合(re-annealed)、延伸以及分離，俾以擴增該核酸分子的複本數目。活體外擴增反應技術的另一個實例包括，但不限於：PCR、定量PCR(quantitative PCR,qPCR)、反轉錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)、定量RT-PCR(quantitative RT-PCR,RT-qPCR)、巢式聚合酶鏈反應(nested polymerase chain reaction)、熱啟動聚合酶鏈反應(hot-start polymerase chain reaction)、多重聚合酶鏈反應(multiplex polymerase chain reaction)、連接酶鏈反應(ligase chain reaction,LCR)、缺口連接酶鏈反應(gap ligase chain reaction,gLCR)等。

在另一個方面，等溫擴增反應可在一恆定溫度下而被進行，或者該擴增反應過程大體上在一恆定溫度下發生，亦即，沒有明顯的溫度變化。因此，實質上(substantially)是在大約相同的單一溫度下而被執行。在一些實例中，等溫擴增反應實質上是等溫的，例如，可包括些微的溫度變化，諸如在擴增反應的期間溫度變化不超過大約1℃至3℃。

如本文中所用的，“目標序列(target sequence)”與“目標核酸(target nucleic acid)”等術語可被交換地使用，並且意指一被檢測和/或擴增的特定核酸序列。較佳地，目標序列包括在一PCR反應中與引子雜合的核酸序列。目標序列亦可包括一探針雜交區域(probe hybridizing region)，其在所欲的條件下會與一檢測探針(detection probe)形成一穩定的雜交物(hybrid)。將如本技藝中具有通常技術者所認可的，一目標序列可以是單-股的(single-stranded)或雙-股的(double-stranded)。在本揭露的內容中，感興趣的目標序列可以在DENV的NS5基因或3’-非轉譯區(3’-UTR)中。

如本文中所用的，一“物種-特異性引子(species-specific primer)”能夠與多於一種之血清型的DENV的的目標序列進行雜交。

如本文中所用的，“雜交(hybridization)”與“黏合(annealing)”等術語可被交換地使用，並且意指相互互補的核酸股反應形成一“雜交物(hybrid)”或“雙螺旋(duplex)”的過程，其是經由在核苷酸殘基的鹼基之間的氫鍵而被穩固。氫鍵可藉由華特生- 克里克鹼基配對(Watson Crick base pairing)、胡斯坦結合(Hoogsteen binding)或任何其他序列特異性的方式而存在。

如本文中所用的，“雜交物(hybrid)”與“雙螺旋(duplex)”等術語可被交換地使用，並且意指由兩個序列互補的核酸雜交而形成的一結構。這種雙螺旋可以藉由兩個DNA片段彼此互補結合、兩個RNA片段彼此互補結合，或一個DNA片段與一個RNA片段互補結合而形成。該雙螺旋的任一個或兩個成員可以包括經修飾的核苷酸和/或核苷酸類似物以及核苷類似物(nucleoside analogues)。如本文中所揭露的，這種雙螺旋是由一或多種探針與一樣品序列的結合而形成。

依據本發明，一種用於檢測存在於一生物樣品中之登革熱病毒(DENV)的方法被揭露。該方法包括：令該生物樣品中的核酸進行一種使用一反應混合物的核酸擴增反應，該反應混合物包括至少一用於擴增登革熱病毒的一目標核酸之引子組；以及檢測一得自於該核酸擴增反應的擴增產物的存在與否。該擴增產物之存在表示在該生物樣品中有登革熱病毒之存在。

該用於擴增登革熱病毒的目標核酸的引子組中的至少一者包括：(a)一用於擴增登革熱病毒血清型1(DENV-1)的NS5基因中之一區域的第一血清型-特異性引子組，該第一血清型-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：1所示的核苷酸序列之第一前向外部引子(outer primer)，以及一具有一如序列辨識編號：2所示的核苷酸序列之第一反向外部引子；(b)一用於擴增登革熱病毒血清型2(DENV-2)的NS5基因中之一區域的第二血清型-特異性引子組，該第二血清型-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之第二前向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：8所示的核苷酸序列之第二反向外部引子；(c)一用於擴增登革熱病毒血清型3(DENV-3)的NS5基因中之一區域的第三血清型-特異性引子組，該第三血清型-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：13所示的核苷酸序列之第三前向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：14所示的核苷酸序列之第三反向外部引子；(d)一用於擴增登革熱病毒血清型4(DENV-4)的NS5基因中之一區域的第四血清型-特異性引子組，該第四血清型-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：19所示的核苷酸序列之第四前向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：20所示的核苷酸序列之第四反向外部引子；以及(e)一用於擴增登革熱病毒的3’ UTR中之一區域的物種-特異性引子組，該物種-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：25所示的核苷酸序列之第五前向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：26所示的核苷酸序列之第五反向外部引子。

當該物種-特異性引子組與該等血清型-特異性引子組是以組合而被使用時，本發明的方法可以在同一樣品中同時測定不同的目標序列，特別是DENV特異性的目標序列[亦即，將DENV從黃病毒屬(Flavivirus)(例如，JEV與ZIKV)與阿爾法病毒屬(Alphavirus)(例如，CHIKV)的其他蟲媒病毒(arbovirus)中區分出來]以及DENV的不同血清型特異性的目標序列，以進行DENV血清型測定。為了檢測不同的DENV血清型，不同目標序列的擴增反應可以在分開的反應混合物或在同一個反應混合物中並行地進行，並且被獨立地檢測。

依據本發明，可先從該樣品中萃取出於該樣品中的核酸(例如，DENV的病毒基因組RNA)，接著進行擴增反應。有關萃取核酸的操作程序與條件是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內(例如，參見Teoh B.T.et al.(2013)，同上述以及Hu S.F.et al.(2015)，同上述)。

依據本發明，該核酸擴增反應可藉由使用下列方法學之至少一者而被進行：聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction)、定量聚合酶鏈反應(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)、反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、反轉錄定量聚合酶鏈反應(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)、巢式PCR(nested PCR)、熱啟動PCR(hot-start PCR)、多重PCR(multiplex PCR)、原位PCR(in situ PCR)、單細胞PCR(single cell PCR)、遞減PCR(touchdown PCR)、連接酶鏈反應(ligase chain reaction,LCR)、缺口連接酶鏈反應(gap ligase chain reaction,gLCR)以及等溫擴增反應(isothermal amplification)。

在某些具體例中，該核酸擴增反應是一種使用任何可用於此目的之各種不同天然或基因工程的酵素的等溫擴增反應，例如，使用在等溫條件下具有強的鏈-置換活性(strand-displacement activity)之DNA聚合酶，藉此免去熱循環(thermal cycling)的需求。這種聚合酶是本技藝所熟知的，並且可以包括嗜熱菌(thermophilic bacteria)[諸如脂肪嗜熱芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)(Bst)、史氏芽孢桿菌(Bacillus smithii)(Bsm)、土芽孢桿菌屬物種M(Geobacillus sp.M)(GspM)與印度熱脫硫桿菌(Thermodesulfatator indicus)(Tin)]的DNA聚合酶長片段(LF)，以及由此衍生的工程變異體(engineered variants)，如同Taq DNA聚合酶變異體(Taq DNA polymerase variants)。可被用來執行本發明揭示之方法的聚合酶的非限制性實例包括Bst DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)、Bst 2.0 DNA聚合酶(Bst 2.0 DNA polymerase)、Bst 2.0 WarmStart^TM DNA聚合酶(Bst 2.0 WarmStart^TM DNA polymerase)(New England Biolabs,Ipswich,Mass.)、GspM LF DNA聚合酶(GspM LF DNA polymerase)、GspSSD LF DNA聚合酶(GspSSD LF DNA polymerase)、Tin exo-LF DNA聚合酶(Tin exo-LF DNA polymerase)以及SD DNA聚合酶(SD DNA polymerase)、Phi29 DNA聚合酶(Phi29 DNA polymerase)、Bsu DNA聚合酶(Bsu DNA polymerase)、OmniAmp^TM DNA聚合酶(OmniAmp^TM DNA polymerase)(Lucigen,Middleton,Mich.)、Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)、Vent^®與Deep Vent^® DNA聚合酶(Vent^® and Deep Vent^® DNA polymerases)(New England Biolabs)、9°Nm^TM DNA聚合酶(9°Nm^TM DNA polymerase)(New England Biolabs)、DNA聚合酶I的克列諾片段(Klenow fragment of DNA polymerase I)、PhiPRD1 DNA聚合酶(PhiPRD1 DNA polymerase)、噬菌體M2 DNA聚合酶(phage M2 DNA polymerase)、T4 DNA聚合酶(T4 DNA polymerase)，以及T5 DNA聚合酶(T5 DNA polymerase)，它們普遍地在50-75℃下被使用，更普遍地在55至65℃下被使用。在一些實例中，大約1至20U(諸如大約1至15U、大約2至12U、大約10至20U、大約2至10U，或大約5至10U)的DNA聚合酶被包括於反應中。在一些實例中，所使用的聚合酶具有鏈-置換活性以及缺少5’-3’核酸外切酶活性(5’-3’ exonuclease activity)。在一非限制性實例中，所使用的DNA聚合酶是Bst 2.0 WarmStart^TM DNA聚合酶，例如，每次反應為大約8U的Bst 2.0 WarmStart^TM DNA聚合酶。

該等溫擴增反應的實例可包括，但不限於：鏈-置換擴增反應(strand-displacement amplification,SDA)、滾-環擴增反應(rolling-circle amplification,RCA)、交叉-引子擴增反應(cross-priming amplification,CPA)、以核酸序列為基礎的擴增反應(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)、重組酶聚合酶擴增反應(recombinase polymerase amplification,RPA)、解旋酶-依賴性擴增反應(helicase-dependent amplification,HDA)、轉錄媒介擴增反應(transcription-mediated amplification)、環媒介等溫擴增反應(loop-mediated amplification,LAMP)，以及競爭性黏合媒介等溫擴增反應(competitive annealing mediated isothermal amplification,CAMP)。

當要被擴增或檢測的核酸是RNA時，在進行目標序列的等溫擴增反應之前一反轉錄(reverse transcription)被進行。反轉錄可使用任何合適的反轉錄酶(reverse transcriptase,RT)來進行。RT是本技藝中所熟知的並且可包括，但不限於：禽骨髓母細胞增多性病毒(Avian Myeloblastosis Virus,AMV)RT以及莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia virus,MMLV)RT。反轉錄與DNA擴增反應可在包含有作用之DNA聚合酶以及RT酵素的同一反應混合物中被執行。此外，本發明揭示的方法可使用一具有強的置換活性以及RT活性這兩者的DNA聚合酶，諸如Pyrophage 3173 DNA聚合酶(Pyrophage 3173 DNA polymerase)。

在某些具體例中，該核酸擴增反應是藉由RT-LAMP而被進行，而其中不需要DNA模版的變性反應(denaturation)，因此該LAMP反應可以在等溫條件(例如，落在60℃至67℃的範圍內)下被進行。

LAMP方法的原理被揭示於T.Notomi et al.(2000),Nucleic acids research,28：E63中。簡言之，反應是藉由一對“環-形成(loop-forming)”引子[亦即，前向內部引子(forward inner primer,FIP)以及反向內部引子(backward inner primer,BIP)]的黏合與延伸反應(extension)而被起始，繼而以一對側翼引子(flanking primers)[亦即，前向外部引子(forward outer primer, F3)以及反向外部引子(backward outer primer,B3)]來進行黏合與延伸反應。這些引子的延伸反應會造成該環-形成要素(loop-forming elements)的鏈-置換，其會折疊以形成末端髮夾-環結構(terminal hairpin-loop structures)。一旦出現這些關鍵結構，該擴增反應方法開始自給自足，並在一恆定溫度下以一連續且指數的(exponential)方式(而非像是PCR的循環方式)來進行。選擇性地，可包括一對額外的環引子[亦即，前向環引子(forward loop primer,LF)以及反向環引子(backward loop primer,LB)]來加速反應。

在某些具體例中，用於LAMP分析的第一血清型-特異性引子組包含有該第一前向與反向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：3所示的核苷酸序列之第一前向內部引子與一具有一如序列辨識編號：4所示的核苷酸序列之第一反向內部引子。該第一血清型-特異性引子組可進一步包含有下列中的一者：一具有一如序列辨識編號：5所示的核苷酸序列之第一前向環引子、一具有一如序列辨識編號：6所示的核苷酸序列之第一反向環引子，以及它們的組合，俾以加速LAMP的反應。

在某些具體例中，用於LAMP分析的第二血清型-特異性引子組包含有該第二前向與反向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：9所示的核苷酸序列之第二前向內部引子與一具有一如序列辨識編號：10所示的核苷酸序列之第二反向內部引子。該第二血清型-特異性引子組可進一步包含有下列中的一者：一具有一如序列辨識編號：11所示的核苷酸序列之第二前向環引子、一具有一如序列辨識編號：12所示的核苷酸序列之第二反向環引子，以及它們的組合，俾以加速LAMP的反應。

在某些具體例中，用於LAMP分析的第三血清型-特異性引子組包含有該第三前向與反向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：15所示的核苷酸序列之第三前向內部引子與一具有一如序列辨識編號：16所示的核苷酸序列之第三反向內部引子。該第三血清型-特異性引子組可進一步包含有下列中的一者：一具有一如序列辨識編號：17所示的核苷酸序列之第三前向環引子、一具有一如序列辨識編號：18所示的核苷酸序列之第三反向環引子，以及它們的組合，俾以加速LAMP的反應。

在某些具體例中，用於LAMP分析的第四血清型-特異性引子組包含有該第四前向與反向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：21所示的核苷酸序列之第四前向內部引子與一具有一如序列辨識編號：22所示的核苷酸序列之第四反向內部引子。該第四血清型-特異性引子組可進一步包含有下列中的一者：一具有一如序列辨識編號：23所示的核苷酸序列之第四前向環引子、一具有一如序列辨識編號：24所示的核苷酸序列之第四反向環引子，以及它們的組合，俾以加速LAMP的反應。

在某些具體例中，該核酸擴增反應是藉由CA MP而被進行。該CAMP方法的原理被揭示於Rui Mao,et al.(2018),The Royal Society of Chemistry,143：639-642中。如同LAMP，該CAMP方法仰賴使用具有鏈置換活性的DNA聚合酶的自動-循環DNA合成(auto-cycling DNA synthesis)，並且可能只需要一對特異性設計的引子，亦即，一個前向內部引子以及一個反向內部引子。為供CAMP，額外的外部引子與環引子(們)可被設計與選擇，它們可藉由加速等溫擴增反應以及縮短檢測時間來增進擴增反應的效率(efficiency)與靈敏度(sensitivity)。在該CAMP反應中額外添加的外部引子、環引子以及這兩者分別被稱為O-CAMP、L-CAMP以及OL-CAMP。

在某些具體例中，用於CAMP的物種-特異性引子組包含有一具有一如序列辨識編號：27所示的核苷酸序列之第五前向內部引子與一具有一如序列辨識編號：28所示的核苷酸序列之第五反向內部引子。該用於CAMP的物種-特異性引子組可進一步包含有該第五前向與反向外部引子和/或一具有一如序列辨識編號：29所示的核苷酸序列之第五環引子。

在某些具體例中，用於LAMP或CAMP反應的反應混合物進一步包含有一合適的緩衝液[諸如一磷酸緩衝液(phosphate buffer)或Tris緩衝液]。該緩衝液亦可包括額外的組分(component)，諸如鉀鹽和/或鈉鹽(諸如KCl或NaCl)、鎂鹽和/或錳鹽(例如，MgCl₂、MgSO₄、MnC₁₂，和/或MnSO₄)，和/或銨鹽[例如，(NH₄)₂SO₄)]、清潔劑(detergents)(例如，TWEEN^®-20、TRITON^®-X100)，或其它添加物[諸如甜菜鹼(betaine)或二甲基亞碸(dimethylsulfoxide)]。熟悉此技藝者可以使用常規方法來選擇一適當的緩衝液與任何的添加物。在一非限制性實例中，該緩衝液(pH 8.8)包含有50mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、0.1% TWEEN^®-20、4mM MgSO₄，以及0.8M甜菜鹼。示範性商業上可獲得的反應緩衝液包含有1×等溫擴增反應緩衝液(Isothermal Amplification Buffer)(New England Biolabs,Ipswich,Mass.)、LoopAmp反應混合液(LoopAmp Reaction Mix)(Eiken Chemical Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)，以及ILLUMIGENE反應緩衝液(ILLUMIGENE reaction buffer)(Meridian Bioscience,Inc.,Cincinnati,Ohio)。該反應混合物亦包含有核苷酸或核苷酸類似物。在一些實例中，包含有一dATP、dCTP、dGTP以及dTTP的等莫耳混合物(被稱為dNTPs)。

在某些具體例中，一個可偵測的標記(detectable label)可使用熟習此技藝者所熟知的技術而被附接或結合至依據本發明的引子(們)以定量檢測目標登革熱病毒。適用於本發明之可偵測的標記的實例包括，但不限於：一半抗原標記(hapten label)，例如，生物素(biotin)以及地高辛(digoxigenin)；一化學螢光標記(chemiluminescent label)，例如，吖錠酯(acridinium esters)、硫酯(thioesters)、類磺胺(orsulfonamides)、發光胺(luminol)、異發光胺(isoluminol)、菲啶鎓酯(phenanthridinium esters)，以及類似之物；一螢光標記(fluorescent label)，例如，螢光素(fluorescein)、玫瑰紅(rhodamine)、FAM、TET、HEX、JOE、TAMA、NTB、TAMRA、ROX、VIC、NED、花青基苷(cyanin)染料、德州紅(Texas Red)、DABCYL、DABSYL、孔雀綠(malachite green)、AlexaFluor染料、LC-Red染料、PromoFluor染料，以及它們的衍生物；一放射性標記(radioactive label)，例如，³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C，或³²P；一酵素標記(enzymatic label)，例如，辣根過氧化氫酶(horse radish peroxidase)、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)，以及類似之物；一顆粒標記(particle label)，例如，金膠體(gold colloids)、量子點(quantum dot)等；以及一比色標記(colorimetric label)，例如，有色的玻璃(colored glass)或塑膠珠粒(plastic beads)[例如，聚苯乙烯(polystyrene)、聚丙烯(polypropylene)、乳膠(latex)等]。

依據本發明，藉由在該等引子的5’和/或3’末端上加入至少一個核苷酸殘基，或藉由從該等引子的5’和/或3’末端刪除至少一個核苷酸殘基，而使該等引子可被修飾成具有15至35個核苷酸的長度。

依據本發明，該擴增產物可以使用本技藝中所熟知之可用於此目的之各種不同的方法中的至少一者而被檢測。例如，該檢測方法可以是混濁性測量(turbidity measurement)、螢光偵測(fluorescence detection)、生物冷光偵測(bioluminescence detection)、凝膠電泳(gel electrophoresis)、比色偵測(colorimetric detection)、免疫酵素偵測(immunoenzymatic detection)、電化學偵測(electrochemical detection)，以及它們的組合。該檢測可以是半-定量的(semi-quantitative)或定量的(quantitative)。該檢測亦可以是即時檢測(real-time detection)，其在該核酸擴增反應的期間，對由該擴增產物之存在所產生的訊號進行測量以監測特異性擴增產物的累積。

當該擴增反應(諸如LAMP)產生大量的焦磷酸鎂(magnesium pyrophosphate)(一白色沉澱物)與dsDNA時，可以使用混濁性測量，其允許目視檢查(visual inspection)結果或使用一濁度計(turbidimeter)。

該螢光偵測可以使用DNA嵌入染料(DNA intercalating dyes)、螢光分子信標探針(fluorescent molecular beacon probes)或一螢光金屬指示劑(fluorescence metal indicator)[諸如鈣黃綠素(calcein)]。

該生物冷光偵測可以透過量測在使用酵素ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)而使核酸合成至ATP的期間化學計量地(stoichiometrically)產生之耦合轉化(coupled conversion)的無機焦磷酸鹽(inorganic pyrophosphate)的生物冷光輸出(bioluminescent output)。

該比色偵測可以使用一針對鹼性金屬離子(alkaline metal ions)的呈色指示劑(colored indicator)，諸如羥基萘酚藍(hydroxy naphthol blue,HNB)(參見Goto et al.,BioTechniques,2009 Mar,46(3)：167-72)和/或一在pH為7.5±1.1的範圍內具有顯著顏色變化之能力的pH指示劑，諸如酚紅(phenol red)(pH 6.8-8.2)、中性紅(neutral red)(pH 6.8-8.0)、甲酚紅(cresol red)(pH 7.2-8.8)等。

該電化學偵測可以使用一pH測定儀(pH meter)來直接測量在該擴增反應(諸如LAMP)的期間所釋放的氫離子，或使用集成的電極(integrated electrodes)來測量因電化學-活性DNA結合的氧化還原報導子(electrochemically-active DNA-binding redox reporters)[諸如亞甲藍(Methylene Blue)]與擴增產物的結合增加所導致之電流的降低。

該免疫酵素偵測包括酵素結合免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)以及基於使用特異性探針的側流免疫分析(lateral flow immunoassays)(參見，例如Hashimoto M.et al.,Malar J.,2018 Jun 19,17(1)：235；Sun Yu-Ling et al.,J.Vet Med Sci.,2014 Apr,76(4)：509-516)。

如本文中所用的，該“生物樣品(biological sample)”是一得自於一生物體(organism)(諸如，動物個體)或該生物體的組分(components)(諸如，細胞以及組織)的樣品。該生物樣品的實例包括，但不限於：一血液樣品(blood sample)、一血漿樣品(plasma sample)、一血清樣品(serum sample)、一角膜組織樣品(corneal tissue sample)、一淚液樣品(tear sample)、一唾液樣品(saliva sample)、一腦脊髓液樣品(cerebrospinal fluid sample)、一糞便樣品(feces sample)、一活體組織切片(tissue biopsy)、一手術檢體(surgical specimen)、一尿液樣品(urine sample)、一細針吸出物(fine needle aspirate)，以及它們的組合。

依據本發明，一種用於檢測登革熱病毒(DENV)的套組被提供，並且包括上面所述之引子組中的至少一者。

在某些具體例中，該套組進一步包含有針對鹼性金屬離子的呈色指示劑、pH指示劑或它們的組合。該套組亦可進一步包含有一用於監測該DNA擴增產物的核酸染料。該核酸染料的實例包括，但不限於：溴化乙錠(ethidium bromide,EtBr)、SYBR GREEN I、SYBR GREEN II、SYBR Orange、SYBR GOLD、碘化丙錠(Phopidium Iodide,PI)、SYTOX Blue以及SYPRO Ruby等。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。

實施例

一般實驗材料：

1.在下面實驗中所使用的引子是由Genomics Co.,Ltd.來合成。

2.在下面實驗中所使用的病毒被列示於表1中。

3.在實施例中所使用的Vero細胞(Vero cells)是購自於美國類型培養物收集中心(ATCC,Manassas,Va.,USA)。

4.在實施例中所使用的1kb DNA RTU階梯(DNA RTU Ladder)(250-10 k)(Cat.No.BR341-500,Biomate^TM)以及100 bp+3 K DNA RTU階梯(100-3 k)(Cat.No.BR332-500,Biomate^TM)皆是購自於Rainbow Biotechnology Co.,Ltd.。

一般方法：

1.RNA的萃取(extraction of RNA)：

病毒的RNA是依據製造商的操作指南使用Direct-zolTM RNA MiniPrep(Cat.No.R2052,Unimed Healthcare Inc.)而被萃取。

實施例1. 用於檢測DENV血清型1至4的血清型-特異性引子組(serotype-specific primer sets)

NS5蛋白質是一種涉及基因組複製(genome replication)的RNA-依賴性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)。所有四種DENV血清型的NS5基因皆是由美國的國家衛生研究院(National Institutes of Health,USA)所維護的GenBank資料庫(GenBank database)所分析。所參考的NS5基因的守恆區域(conserved region)是橫跨DENV-1的全長基因組序列(Genbank登錄編號NC_001477.1)中的核苷酸7839至8029處、DENV-2的全長基因組序列(Genbank登錄編號NC_001474.2)中的核苷酸9769至10011處、DENV-3的全長基因組序列(Genbank 登錄編號NC_001475.2)中的核苷酸7565至7881處，或DENV-4的全長基因組序列(Genbank登錄編號NC_002640.1)中的核苷酸9549至9826處。

用於檢測與區分DENV血清型1至4的引子對(primer pairs)與環引子對(loop primer pairs)是基於各別DENV血清型的NS5基因的守恆區域使用PrimerExplorer V4軟體(PrimerExplorer V4 software)而被設計出。該等引子對與環引子對的專一性是藉由可在NCBI網站之GenBank上使用的BLAST分析而被分析(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。

因此，為了各種DENV血清型的特異性擴增(specific amplification)而製得了一針對DENV-1的血清型-特異性引子組1(serotype-specific primer set 1)，其包含有2組引子對(被命名為DGI-Opti-B F3/DGI-Opti-B B3與DGI-Opti-B FIP/DGI-Opti-B BIP)以及1組環引子對(被命名為DGI-Opti-B LF/DGI-Opti-B LB)；一針對DENV-2的血清型-特異性引子組2(serotype-specific primer set 2)，其包含有2組引子對(被命名為DGII-Opti-C F3/DGII-Opti-C B3與DGII-Opti-C FIP/DGII-Opti-C BIP)以及1組環引子對(被命名為DGII-Opti-C LF/DGII-Opti-C LB)；一針對DENV-3的血清型-特異性引子組3(serotype-specific primer set 3)，其包含有2組引子對(被命名為 DGIII-Opti F3/DGIII-Opti B3與DGIII-Opti FIP/DGIII-Opti BIP)以及1組環引子對(被命名為DGIII-Opti LF/DGIII-Opti LB)；以及一針對DENV-4的血清型-特異性引子組4(serotype-specific primer set 4)，其包含有2組引子對(被命名為DGIV-Opti F3/DGIV-Opti B3與DGIV-Opti FIP/DGIV-Opti BIP)以及1組環引子對(被命名為DGIV-Opti LF/DGIV-Opti LB)。

上面所述之引子對與環引子對的詳細資訊已被整合於表2-5中。

實施例2. 用於檢測DENV的物種-特異性引子組(species-specific primer set)

用於檢測所有四種DENV血清型的通用引子對(universal primer pairs)與環引子是基於DENV血清型1-4的3’-UTR的守恆區域使用PrimerExplorer V4軟體而被設計出。該等通用引子對與環引子的專一性是藉由在NCBI網站之GenBank上可用的BLAST分析而被分析(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。因此，一包含有2組引子對(被命名為CAMP-B F2/CAMP-B B2與CAMP-B NF/CAMP-B NR)以及1個環引子(被命名為CAMP-B LFr)的物種-特異性引子組被獲得。上面所述之引子對與環引子的詳細資訊已被整合於表6中。

實施例3. 依據本發明的血清型-特異性引子組對於DENV血清型1至4的檢測與區分效用之評估

為了確定血清型-特異性引子組1-4對於四種DENV血清型的檢測與區分效用，反轉錄環媒介等溫擴增反應(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)被進行。

實驗方法：

在依據供應商的操作指南適當培養表1中所示的7個病毒之後，由此所得到之各個病毒的細胞培養物被拿來進行在“一般方法”的第1項當中所述的RNA的萃取。所得到之各個病毒的總RNA被使用作為一模版(template)並分別使用於表2-5當中所述的各組血清型-特異性引子組1-4來進行RT-LAMP。該RT-LAMP的反應條件被顯示於表7中。

在反應管中反應混合物的顏色變化是以肉眼來觀察，該反應混合物的顏色會因應在核酸擴增反應期間的pH變化而從紅色變成黃色。所得到的產物呈黃色表示DENV的RNA擴增是成功的。為了確認該顏色變化是否歸因於目標RNA擴增，所得到的產物被拿來進行2%瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)，俾以驗證擴增產物(amplicons)的存在。

結果：

圖1至4分別顯示血清型-特異性引子組1-4對於DENV血清型1-4的檢測與區分效用。如圖1所示，凝膠電泳分析顯示使用血清型-特異性引子組1，在相對應的目標病毒(即DENV-1)中觀察到一階梯型條帶圖樣(ladder-like banding pattern)。此外，在DENV-1中以肉眼觀察到一呈黃色之RT-LAMP擴增的產物。在非-目標病毒(即DENV-2、DENV-3、DENV-4，以及非-DENV病毒)中沒有觀察到階梯型條帶圖樣以及顏色變化。另外，關於血清型-特異性引子組2-4則觀察到相似的結果(參見圖2-4)。

這些結果顯示，本發明的血清型-特異性引子組1-4能夠分別被用於專一性地且有效地檢測DENV血清型1-4。

實施例4. 依據本發明的物種-特異性引子組對於DENV的通用檢測效用之評估

為了確定物種-特異性引子組對於所有四種DENV血清型的通用檢測效用，反轉錄競爭性黏合媒介等溫擴增反應(reverse transcription competitive annealing mediated isothermal amplification,RT-CAMP)被進行。

實驗方法：

在實施例3中所得到的JEV、ZIKV、CHIKV、DENV-1、DENV-2、DENV-3以及DENV-4的各個總RNA分別被使用作為一模版並使用於表6當中所述的物種-特異性引子組來進行RT-CAMP。該RT-CAMP的反應條件與表7中所述者相似，不同之處在於：該等溫擴增反應是在61℃下被進行歷時90分鐘，以及該等引子的最終濃度是如下所示：CAMP-B F2(0.2μM)/CAMP-B B2(0.2μM)、CAMP-B NF(1.6μM)/CAMP-B NR(1.6μM)，以及CAMP-B LFr(0.8μM)。依據在實施例3當中所述的方法來對所得到的產物進行比色分析(colorimetric assay)以及瓊脂糖凝膠電泳分析。

結果：

圖5顯示物種-特異性引子組對於DENV血清型1-4的通用檢測效用。從圖5可見，在所有四種DENV血清型中皆有觀察到一階梯型條帶圖樣以及一呈黃色之RT-CAMP擴增的產物。在非-目標病毒(即JEV、ZIKV以及CHIKV)中沒有觀察到階梯型條帶圖樣以及顏色變化。

這些結果顯示，本發明揭示的物種-特異性引子組能夠被用於通用地且有效地檢測DENV。

實施例5. 依據本發明的上述五組引子組對於在血漿檢體中檢測DENV的效用評估

實驗材料：

A.血漿檢體的製備：

血漿檢體是得自於14位由國立成功大學醫學院附設醫院(National Cheng Kung University Hospital)(台南，台灣)所招募之經臨床診斷具有DENV-2感染的病患(11位男性，平均年齡為53歲；3位女性，平均年齡為51歲)。該血漿檢體是經由國立成功大學醫學院附設醫院的研究倫理審查會(Institutional Review Board,IRB)/醫學倫理與人體試驗委員會(Committee of Medical Ethics and Human Experiments)(台南，台灣)的核准而被收集。涉及人類受試者的所有程序皆遵守赫爾辛基的宣言(Declaration of Helsinki)。

實驗方法：

各個病患的血漿檢體於Vero細胞中被培養與繼代1次(培養條件：37℃與5% CO₂)。所得到之各個培養物的上澄液被收集，繼而依據“一般方法”的第1項來進行RNA的萃取。

由此所得到之各個病患的血漿檢體的總RNA(5ng)被使用作為一模版並依據在實施例3當中所述的方法來進行RT-LAMP分析，以供用於檢測與區分DENV血清型1-4。

為供比較，使用在B.T.Teoh et al.(2013),BMC In.fect.Dis.,doi：10.1186/1471-2334-13-387當中所述的1組習知引子組來進行相同的實驗。該習知引子組的引子是由Genomics Biosci & Tech(台北，台灣)來合成。該習知引子組的詳細資訊已被整合於表8中。

此外，各個病患的血漿檢體的總RNA(5ng)被使用作為一模版並依據在實施例4當中所述的方法來進行RT-CAMP分析，以供用於DENV的通用檢測。

結果：

表9顯示上述6組引子組對於DENV的檢測效用。從表9可見，所有的血漿檢體藉由使用血清型-特異性引子組2或在B.T.Teoh et al.(2013)當中所述的習知引子組的RT-LAMP分析而被檢測出對於DENV-2呈陽性(positive)。此外，所有的血漿檢體藉由使用物種-特異性引子組的RT-CAMP分析而被檢測出對於DENV呈陽性。至於血清型-特異性引子組1、3以及4中沒有一個可與DENV-2的RNA反應，這表示這些引子組皆不會與DENV-2交叉反應。

這些結果顯示，本發明的血清型-特異性引子組1-4與物種-特異性引子組可以達到快速且準確的檢測DENV，以及區分登革熱病毒血清型1至4。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

<110> 國立成功大學

<120> 用於檢測登革熱病毒的方法以及套組

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型1的DGI-Opti-B F3引子

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型1的DGI-Opti-B B3引子

<400> 2

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型1的DGI-Opti-B FIP引子

<400> 3

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型1的DGI-Opti-B BIP引子

<400> 4

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型1的DGI-Opti-B LF引子

<400> 5

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型1的DGI-opti-B LB引子

<400> 6

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型2的DGII-Opti-C F3引子

<400> 7

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型2的DGII-Opti-C B3引子

<400> 8

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型2的DGII-Opti-C FIP引子

<400> 9

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型2的DGII-Opti-C BIP引子

<400> 10

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型2的DGII-Opti-C LF引子

<400> 11

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型2的DGII-Opti-C LB引子

<400> 12

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型3的DGIII-Opti F3引子

<400> 13

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型3的DGIII-Opti B3引子

<400> 14

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型3的DGIII-Opti FIP引子

<400> 15

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型3的DGIII-Opti BIP引子

<400> 16

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型3的DGIII-Opti LF引子

<400> 17

<210> 18

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型3的DGIII-Opti LB引子

<400> 18

<210> 19

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型4的DGIV-Opti F3引子

<400> 19

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型4的DGIV-Opti B3引子

<400> 20

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型4的DGIV-Opti FIP引子

<400> 21

<210> 22

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型4的DGIV-Opti BIP引子

<400> 22

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型4的DGIV-Opti LF引子

<400> 23

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒血清型4的DGIV-Opti LB引子

<400> 24

<210> 25

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒的CAMP-B F2引子

<400> 25

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒的CAMP-B B2引子

<400> 26

<210> 27

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒的CAMP-B NF引子

<400> 27

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒的CAMP-B NR引子

<400> 28

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒的CAMP-B LFr引子

<400> 29

<210> 30

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒的F3/134引子

<400> 30

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒的F3/2引子

<400> 31

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒的B3/123引子

<400> 32

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒的B3/4引子

<400> 33

<210> 34

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒的FIP/123引子

<400> 34

<210> 35

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒的FIP/4引子

<400> 35

<210> 36

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒的BIP/123引子

<400> 36

<210> 37

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒的BIP/4引子

<400> 37

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測登革熱病毒的BLP/1234引子

<400> 38

Claims

一種用於檢測存在於一生物樣品中之登革熱病毒(DENV)的方法，其包括：令該生物樣品中的核酸進行一種使用一反應混合物的核酸擴增反應，該反應混合物包括下列用於擴增登革熱病毒的一目標核酸之引子組：一用於擴增登革熱病毒的3’ UTR中之一區域的物種-特異性引子組，該物種-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：25所示的核苷酸序列之第五前向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：26所示的核苷酸序列之第五反向外部引子；以及檢測一得自於該核酸擴增反應的擴增產物的存在與否，其中該擴增產物之存在表示在該生物樣品中有登革熱病毒之存在；
如請求項1的方法，其中該反應混合物進一步包括下列的至少一引子組：(a)一用於擴增登革熱病毒血清型1(DENV-1)的NS5基因中之一區域的第一血清型-特異性引子組，該第一血清型-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：1所示的核苷酸序列之第一前向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：2所示的核苷酸序列之第一反向外部引子；(b)一用於擴增登革熱病毒血清型2(DENV-2)的NS5基因中之一區域的第二血清型-特異性引子組，該第二血清型-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之第二前向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：8所示的核苷酸序列之第二反向外部引子；(c)一用於擴增登革熱病毒血清型3(DENV-3)的NS5基因中之一區域的第三血清型-特異性引子組，該第三血清型-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：13所示的核苷酸序列之第三前向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：14所示的核苷酸序列之第三反向外部引子；以及(d)一用於擴增登革熱病毒血清型4(DENV-4)的NS5基因中之一區域的第四血清型-特異性引子組，該第四血清型-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：19所示的核苷酸序列之第四前向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：20所示的核苷酸序列之第四反向外部引子。
如請求項1的方法，其中該核酸擴增反應是藉由使用下列方法學之至少一者而被進行：聚合酶鏈反應、定量聚合酶鏈反應(qPCR)、反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、反轉錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)、巢式聚合酶鏈反應、熱啟動聚合酶鏈反應、多重聚合酶鏈反應、原位PCR、單細胞PCR、遞減PCR、連接酶鏈反應(LCR)、缺口連接酶鏈反應(gLCR)以及等溫擴增反應。
如請求項2的方法，其中該反應混合物進一步包含有一反轉錄酶以及一DNA聚合酶。
如請求項4的方法，其中該核酸擴增反應是藉由使用環媒介等溫擴增反應(LAMP)而被進行。
如請求項5的方法，其中該第一血清型-特異性引子組進一步包含有一具有一如序列辨識編號：3所示的核苷酸序列之第一前向內部引子，以及一具有一如序列辨識編號：4所示的核苷酸序列之第一反向內部引子。
如請求項6的方法，其中該第一血清型-特異性引子組進一步包含有下列中的一者：一具有一如序列辨識編號：5所示的核苷酸序列之第一前向環引子、一具有一如序列辨識編號：6所示的核苷酸序列之第一反向環引子，以及它們的組合。
如請求項5的方法，其中該第二血清型-特異性引子組進一步包含有一具有一如序列辨識編號：9所示的核苷酸序列之第二前向內部引子，以及一具有一如序列辨識編號：10所示的核苷酸序列之第二反向內部引子。
如請求項8的方法，其中該第二血清型-特異性引子組進一步包含有下列中的一者：一具有一如序列辨識編號：11所示的核苷酸序列之第二前向環引子、一具有一如序列辨識編號：12所示的核苷酸序列之第二反向環引子，以及它們的組合。
如請求項5的方法，其中該第三血清型-特異性引子組進一步包含有一具有一如序列辨識編號：15所示的核苷酸序列之第三前向內部引子，以及一具有一如序列辨識編號：16所示的核苷酸序列之第三反向內部引子。
如請求項10的方法，其中該第三血清型-特異性引子組進一步包含有下列中的一者：一具有一如序列辨識編號：17所示的核苷酸序列之第三前向環引子、一具有一如序列辨識編號：18所示的核苷酸序列之第三反向環引子，以及它們的組合。
如請求項5的方法，其中該第四血清型-特異性引子組進一步包含有一具有一如序列辨識編號：21所示的核苷酸序列之第四前向內部引子，以及一具有一如序列辨識編號：22所示的核苷酸序列之第四反向內部引子。
如請求項12的方法，其中該第四血清型-特異性引子組進一步包含有下列中的一者：一具有一如序列辨識編號：23所示的核苷酸序列之第四前向環引子、一具有一如序列辨識編號：24所示的核苷酸序列之第四反向環引子，以及它們的組合。
如請求項4的方法，其中該物種-特異性引子組進一步包含有一具有一如序列辨識編號：27所示的核苷酸序列之第五前向內部引子，以及一具有一如序列辨識編號：28所示的核苷酸序列之第五反向內部引子。
如請求項14的方法，其中該核酸擴增反應是藉由使用競爭性黏合媒介等溫擴增反應(CAMP)而被進行。
如請求項15的方法，其中該物種-特異性引子組進一步包含有一具有一如序列辨識編號：29所示的核苷酸序列之第五環引子。
如請求項1至16中任一項的方法，其中檢測該擴增產物的存在與否是藉由使用下列方法學之至少一者而被進行：混濁性測量、螢光偵測、生物冷光偵測、凝膠電泳、比色偵測、免疫酵素偵測、電化學偵測，以及它們的組合。
如請求項1至16中任一項的方法，其中在至少一引子組中的引子之至少一者被標記以一可偵測的標記。
如請求項1的方法，其中該生物樣品是選自於由下列所構成的群組：一血液樣品、一血漿樣品、一血清樣品、一角膜組織樣品、一淚液樣品、一唾液樣品、一腦脊髓液樣品、一糞便樣品、一活體組織切片、一手術檢體、一尿液樣品、一細針吸出物，以及它們的組合。
一種用於檢測登革熱病毒(DENV)的套組，其包含有下列用於擴增登革熱病毒的一目標核酸的引子組：一用於擴增登革熱病毒的3’ UTR中之一區域的物種-特異性引子組，該物種-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：25所示的核苷酸序列之第五前向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：26所示的核苷酸序列之第五反向外部引子。
如請求項20的套組，其進一步包含有下列的至少一者：(a)一用於擴增登革熱病毒血清型1(DENV-1)的NS5 基因中之一區域的第一血清型-特異性引子組，該第一血清型-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：1所示的核苷酸序列之第一前向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：2所示的核苷酸序列之第一反向外部引子；(b)一用於擴增登革熱病毒血清型2(DENV-2)的NS5基因中之一區域的第二血清型-特異性引子組，該第二血清型-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：7所示的核苷酸序列之第二前向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：8所示的核苷酸序列之第二反向外部引子；(c)一用於擴增登革熱病毒血清型3(DENV-3)的NS5基因中之一區域的第三血清型-特異性引子組，該第三血清型-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：13所示的核苷酸序列之第三前向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：14所示的核苷酸序列之第三反向外部引子；(d)一用於擴增登革熱病毒血清型4(DENV-4)的NS5基因中之一區域的第四血清型-特異性引子組，該第四血清型-特異性引子組包含一具有一如序列辨識編號：19所示的核苷酸序列之第四前向外部引子，以及一具有一如序列辨識編號：20所示的核苷酸序列之第四反向外部引子；以及
如請求項21的套組，其中在各引子組中的引子之至少一者被標記以一可偵測的標記。
如請求項21的套組，其中該第一血清型-特異性引子組進一步包含有一具有一如序列辨識編號：3所示的核苷酸序列之第一前向內部引子，以及一具有一如序列辨識編號：4所示的核苷酸序列之第一反向內部引子。
如請求項23的套組，其中該第一血清型-特異性引子組進一步包含有下列中的一者：一具有一如序列辨識編號：5所示的核苷酸序列之第一前向環引子、一具有一如序列辨識編號：6所示的核苷酸序列之第一反向環引子，以及它們的組合。
如請求項21的套組，其中該第二血清型-特異性引子組進一步包含有一具有一如序列辨識編號：9所示的核苷酸序列之第二前向內部引子，以及一具有一如序列辨識編號：10所示的核苷酸序列之第二反向內部引子。
如請求項25的套組，其中該第二血清型-特異性引子組進一步包含有下列中的一者：一具有一如序列辨識編號：11所示的核苷酸序列之第二前向環引子、一具有一如序列辨識編號：12所示的核苷酸序列之第二反向環引子，以及它們的組合。
如請求項21的套組，其中該第三血清型-特異性引子組進一步包含有一具有一如序列辨識編號：15所示的核苷酸序列之第三前向內部引子，以及一具有一如序列辨識編號：16所示的核苷酸序列之第三反向內部引子。
如請求項27的套組，其中該第三血清型-特異性引子組進一步包含有下列中的一者：一具有一如序列辨識編號：17所示的核苷酸序列之第三前向環引子、一具有一如序列辨識編號：18所示的核苷酸序列之第三反向環引子，以及它們的組合。
如請求項21的套組，其中該第四血清型-特異性引子組進一步包含有一具有一如序列辨識編號：21所示的核苷酸序列之第四前向內部引子，以及一具有一如序列辨識編號：22所示的核苷酸序列之第四反向內部引子。
如請求項29的套組，其中該第四血清型-特異性引子組進一步包含有下列中的一者：一具有一如序列辨識編號：23所示的核苷酸序列之第四前向環引子、一具有一如序列辨識編號：24所示的核苷酸序列之第四反向環引子，以及它們的組合。
如請求項20的套組，其中該物種-特異性引子組進一步包含有一具有一如序列辨識編號：27所示的核苷酸序列之第五前向內部引子，以及一具有一如序列辨識編號：28所示的核苷酸序列之第五反向內部引子。
如請求項31的套組，其中該物種-特異性引子組進一步包含有一具有一如序列辨識編號：29所示的核苷酸序列之第五環引子。
如請求項20至32中任一項的套組，其進一步包含有下列中的一者：一針對鹼性金屬離子的呈色指示劑、一pH指示劑，以及它們的組合。