JP5754100B2 - エンテロウイルス71rnaの検出方法および検出試薬 - Google Patents
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Description
この中で、手足口病は、口腔および四肢末端に発疹ができることを特徴とした疾患であり、主に夏季に乳幼児を中心として流行する、きわめてありふれたエンテロウイルス感染症である。
また、PCR工程は、原則的に熱変性、プライマー・アニール、伸長反応からなる急激な温度サイクルを必要とし、システム化を考える場合に簡素化および低コスト化のための大きな障壁となっている。
手足口病のおもな原因ウイルスは、EV71とCA16であるため、リスク管理の目的として、これらの血清型を、特異性よく鑑別する必要がある。さらに、EV71は、多様な遺伝子群(ジェノグループ)が存在することが知られており、現在、ジェノグループA、ジェノグループB1から4、ジェノグループC1から4の分類が提唱されている。(非特許文献1)。また、報告数に差は見られるものの、全てがヒトに対する病原性を有するため、これらの多様な遺伝子群を全て検出することが必要である。
(1)エンテロウイルス71RNA中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーが前記RNAにハイブリダイズし、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なcDNAを合成し、前記RNAとのRNA−DNA2本鎖を生成する工程、
(2)リボヌクレアーゼH(RNaseH)活性を有する酵素により、前記RNA−DNA2本鎖のRNAを分解する工程(1本鎖DNAの生成)、
(3)該1本鎖DNAに、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーがハイブリダイズし(ここで前記第二または第一のプライマーのいずれか一方はその5’末端にRNAポリメラーゼのプロモーター配列が付加されてなる)、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のRNAを転写可能なプロモーター配列を含む2本鎖DNAを生成する工程、
(4)RNAポリメラーゼ活性を有する酵素により前記2本鎖DNAを鋳型とするRNA転写産物を生産する工程、
(5)該RNA転写産物が、前記(1)の反応におけるcDNA合成の鋳型となることで、連鎖的にRNA転写産物を生成する工程、
(6)前記RNA転写産物量を測定する工程、
からなることを特徴とする、第一の発明から第五の発明に記載のエンテロウイルス71スRNAの検出方法である。
(1)EV71 RNA中の特定塩基配列を鋳型とし、第一のプライマー及び第二のプライマー、DNAポリメラーゼなどの核酸重合酵素を用いて、前記特定塩基配列を含む核酸を増幅する工程、
(2)該核酸増幅産物を測定する工程、
からなるEV71 RNAの検出方法において、前記第一のプライマー配列番号1および6に記載の配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた少なくとも1種類以上のオリゴヌクレトチドからなり、かつ第二のプライマーが配列番号8に記載の配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列から選ばれた少なくとも1種類以上のオリゴヌクレトチドからなることを特徴としている。
本発明中の試料とは、食品、飲料水、環境水、糞便および嘔吐物、鼻腔および咽頭等のぬぐい液、血液、その他の分泌液、体液、組織洗浄液などである。
(2)リボヌクレアーゼH(RNaseH)活性を有する酵素により、前記RNA−DNA2本鎖のRNAを分解する工程(1本鎖DNAの生成)、
(3)該1本鎖DNAに、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーがハイブリダイズし(ここで前記第二または第一のプライマーのいずれか一方はその5’末端にRNAポリメラーゼのプロモーター配列が付加されてなる)、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のRNAを転写可能なプロモーター配列を含む2本鎖DNAを生成する工程、
(4)RNAポリメラーゼ活性を有する酵素により前記2本鎖DNAを鋳型とするRNA転写産物を生産する工程、
(5)該RNA転写産物が、前記(1)の反応におけるcDNA合成の鋳型となることで、連鎖的にRNA転写産物を生成する工程、
(6)前記RNA転写産物量を測定する工程、
からなるEV71RNAの検出方法である。
後述の実施例で使用したEV71 RNAおよびCA16 RNA(以降、ともに標準RNAと表記)は(1)から(2)に示す方法で調製した。
(2)(1)で調製した2本鎖DNAを、定法に従い、pUC19プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入し、大腸菌JM109株を形質転換した。
(3)(2)の形質転換大腸菌の培養物からプラスミドを抽出し、挿入DNAの3’末端側を制限酵素で消化し、直鎖状のDNAを調製した。
(4)(3)で調製したDNAを鋳型として、SP6 RNAポリメラーゼを用いてインビトロ転写を実施し、引き続きDNase I処理により前記2本鎖DNAを完全消化した後、RNAを精製し、標準RNAを調製した。該RNAは260nmにおける吸光度を測定して定量した。
インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブを調製した。非特許文献9に記載の方法で、
配列番号21に記載の配列の5’末端から11番目のAと12番目のAの間、
配列番号22に記載の配列の5’末端から9番目のGと10番目のCの間、
配列番号23に記載の配列の5’末端から8番目のGと9番目のCの間、
配列番号24に記載の配列の5’末端から7番目のGと8番目のAの間、
配列番号25に記載の配列の5’末端側から11番目のGと12番目のCとの間、
のリン酸ジエステル部分に、それぞれリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させたオキサゾールイエロー標識核酸プローブを調製した(図1)。
表2に示した組み合わせの第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ(以降、INAFプローブと表記)、切断用オリゴヌクレオチドを用いて、(1)から(4)に示す方法で、標準RNAの測定を行い、検出性能、特異性等について評価を行った。
(2)以下の組成の反応液20μLを0.5mL容量PCR用チューブ(Individual Dome Cap PCR Tube、SSI製)に分注し、これに前記RNA試料5μLを添加した。
60mM Tris−HCl緩衝液(pH8.6)
17mM 塩化マグネシウム
110mM 塩化カリウム
1mM DTT
各0.25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP
各2.8mM ATP、CTP、UTP、GTP
3.6mM ITP
各0.5μM 第一のプライマー:該プライマーは、各配列番号記載の塩基配列の5’末端にT7プロモータ配列(配列番号26)が付加されている
0.5μM 第二のプライマー
各10nM INAFプローブ:該プローブは実施例2で調製したもの
各0.08μM 切断用オリゴヌクレオチド:該オリゴヌクレオチドの3’末端の水酸基はアミノ基で修飾されている
6U リボヌクレアーゼインヒビター(タカラバイオ製)
10.4% DMSO
酵素液の組成:反応時(30μL中)の最終濃度
2.0% ソルビトール
6.4U AMV逆転写酵素 (ライフサイエンス製)
142U T7 RNAポリメラーゼ (インビトロジェン製)
3.6μg 牛血清アルブミン
表1に記載の8株のEV71(8種類の遺伝子群)、および1株のCA16をエンテロウイルス感受性培養細胞に感染させ、十分にウイルスが増殖したものから抽出したRNAを、上記のEV71 RNA検出試薬で測定を実施した。
上記試薬の測定結果は、表6に示した通りであり、EV71は,測定した全てのウイルス株が8分以内に検出された。一方、CA16は検出されなかった。
Claims (2)
- (1)エンテロウイルス71RNA中の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーが前記RNAにハイブリダイズし、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なcDNAを合成し、前記RNAとのRNA−DNA2本鎖を生成する工程、
(2)リボヌクレアーゼH(RNaseH)活性を有する酵素により、前記RNA−DNA2本鎖のRNAを分解する工程(1本鎖DNAの生成)、
(3)該1本鎖DNAに、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーがハイブリダイズし、ここで前記第二または第一のプライマーのいずれか一方はその5’末端にRNAポリメラーゼのプロモーター配列が付加されてなり、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のRNAを転写可能なプロモーター配列を含む2本鎖DNAを生成する工程、
(4)RNAポリメラーゼ活性を有する酵素により前記2本鎖DNAを鋳型とするRNA転写産物を生産する工程、
(5)該RNA転写産物が、前記(1)の反応におけるcDNA合成の鋳型となることで、連鎖的にRNA転写産物を生成する工程、
(6)前記RNA転写産物量を測定する工程、
からなる試料中のエンテロウイルス71RNAの特定塩基配列を増幅し検出する方法であって、
前記(6)の工程が、前記RNA転写産物と相補的2本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的2本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計されたインターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブの存在下、連鎖的にRNA転写産物を生成し、蛍光特性の変化を測定する工程であり、
前記第一のプライマーが配列番号5および7に記載の塩基配列に相補的であるオリゴヌクレオチドであり、
前記第二のプライマーが配列番号10に記載の塩基配列に相補的であるオリゴヌクレオチドであり、
前記インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブが配列番号24および25に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、前記方法。 - 請求項1に記載の方法において、前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の5’末端部位と重複して該部位から5’方向に隣接する領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドとRNase Hにより前記特定塩基配列の5’末端部位で前記RNAを切断する工程を、5’末端にプロモーター配列を付加した前記第一のプライマー、前記第二のプライマー、さらにRNA依存性DNAポリメラーゼ、RNase H、およびDNA依存性DNAポリメラーゼにより、プロモーター配列と該プロモーター配列下流に前記特定塩基配列を含む2本鎖DNAを生成する工程の前に行ない、
かつ前記切断用オリゴヌクレオチドが、配列番号17および19に記載の塩基配列に相補的であるオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、前記方法。
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